מחקר זה מבסס מודל מעודן לדלדול עצב תחושתי בקרנית באמצעות בופיבקאין, וחושף את השפעתו על הידבקות עצב הקרנית והחיידקים. המודל מדמה מצבים נוירופתיים, מספק תובנות לגבי אינטראקציות נוירואימוניות בזיהומים בעיניים ומציע יישומים באספקת תרופות, הגנה עצבית, אפנון חיסוני ומחקרי שינוי גנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דלדול עצבי תחושתי ממוקד בקרנית באמצעות הזרקה תת-לחמית: מודל לחקירת הידבקות חיידקים ואינטראקציות נוירואימוניות
במאמר זה
סיכום
תקציר
עצבי תחושת הקרנית ממלאים תפקיד מרכזי בתמיכה בשלמות פני העין ובמנגנוני ההגנה החיסונית. אובדן עצבוב זה נקשר לפגיעות מוגברת לפלישה מיקרוביאלית, אך התרומה המדויקת של דלדול העצבים להידבקות חיידקים בקרנית נותרה לא מאופיינת מספיק. כאן, אנו מציגים שיטה ניתנת לשחזור ומבוקרת זמנית לדיכוי עצבי תחושתי סלקטיבי בקרנית באמצעות בופיבקאין, חוסם תעלות נתרן ארוך טווח. על ידי שילוב של מסלולי אספקה תת-לחמית ואקטואליים, אסטרטגיית יישום כפולה זו משיגה ניתוק עצבים חזק ומתמשך, ומאפשרת חקירה מדויקת של האופן שבו קלט חושי משתנה משפיע על רגישות האפיתל של הקרנית להתיישבות חיידקים.
באמצעות מודל זה, אנו חוקרים כיצד ניתוק עצבים חושי משפיע על דינמיקת הידבקות מיקרוביאלית עבור Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ו-Pseudomonas aeruginosa שלושה פתוגנים רלוונטיים קלינית עם מנגנוני הידבקות מובחנים. חיסון חיידקים סטנדרטי בשיטת ספיגת מגבונים במעבדה מבטיח שקיעה אחידה על פני הקרנית, ואחריה הערכה כמותית של הידבקות חיידקים. דלדול עצבי הנגרמת על ידי בופיבקאין נמצא בקורלציה עם צפיפות עצבים מופחתת בקרנית והידבקות מוגברת של חיידקים, מה שמאשר קשר תפקודי בין דלדול תחושתי לרגישות מיקרוביאלית.
על ידי הדמיית מצבים נוירופתיים כגון נוירופתיה סוכרתית וקרטיטיס נוירוטרופית, גישה זו מספקת מסגרת חדשה לחקר אינטראקציות נוירואימוניות בזיהומים עיניים. מעבר למודלים של זיהום, אסטרטגיית הזרקה תת-לחמית זו מציעה פלטפורמה רב-תכליתית לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות עיניים, התערבויות נוירו-פרוטקטיביות ואפנון חיסוני. יתר על כן, ניתן להתאים אותו למחקרי שינוי גנים, כולל אספקה תת-לחמית של מבני CRISPR/Cas או וקטורים ויראליים, ולהרחיב את יישומיו במחקר עיניים וטיפולים.
מבוא
עצבוב חושי בקרנית ממלא תפקיד קריטי בשמירה על שלמות פני העין והומאוסטזיס חיסוני. הקרנית היא אחת הרקמות העצבניות הצפופות ביותר בגוף, המסופקת בעיקר על ידי חלוקת העיניים של העצב הטריגמינלי1. עצבים תחושתיים אלה לא רק מתווכים רפלקסים של כאבים ומצמוץ, אלא גם מווסתים את התפשטות האפיתל, ריפוי פצעים ומעקב חיסוני 2,3. כל הפרעה בעצבוב החושי עלולה, אם כן, לפגוע במחסום הקרנית, לשנות את המיקרו-סביבה של פני העין ולהגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים.
תפקוד לקוי של הקרנית קשור למצבים מערכתיים כגון סוכרת ותורם לפתולוגיות עיניים, כולל מחלת עין יבשה, קרטופתיה סוכרתית, קרטיטיס נוירוטרופית וסיבוכים לאחר ניתוח 3,4,5,6,7,8,9,10 . ליקוי עצבי תחושתי מוביל להפחתת ייצור הדמעות, דילול אפיתל וריפוי פצעים מאוחר, כל אלה מקלים על קולוניזציה של חיידקים11,12. עם זאת, הקשר המכניסטי המדויק בין דלדול עצב תחושתי להידבקות חיידקים נותר לא מובן מספיק. בעוד שמחקרים הראו הידבקות מוגברת של חיידקים בעקבות ניתוק עצבים בקרנית, חסרים מודלים סטנדרטיים המאפשרים חקירה מבוקרת של קשר זה.
כדי להתמודד עם פער זה, פיתחנו מודל ממוקד של דלדול עצב תחושתי בקרנית באמצעות בופיבקאין, חוסם תעלות נתרן ארוך טווח המחקה נוירופתיה קלינית מבלי לגרום לנזק עצבי קבוע 13,14,15. גישה פרמקולוגית זו מספקת שיטה מבוקרת וניתנת לשחזור לחקר דלדול עצב הקרנית והשפעותיה על פני העין15. על ידי שילוב מודל זה עם מבחני הידבקות חיידקים, אנו יכולים להעריך באופן שיטתי את ההשפעה של דלדול עצב תחושתי על קולוניזציה מיקרוביאלית, תוך חיקוי היבטים מרכזיים של קרטופתיה סוכרתית וקרטיטיס נוירוטרופית.
הידבקות מיקרוביאלית היא אירוע מוקדם קריטי בזיהומים בקרנית, המושפע מהרכב סרט הדמעות, תכונות פני השטח של האפיתל ותגובות חיסוניות של המארח. בין הפתוגנים המגוונים המסוגלים ליישב את פני העין, S. aureus, S. epidermidis ו- P. aeruginosa מייצגים שלושה חיידקים בעלי משמעות קלינית עם מנגנוני הידבקות מובחנים. P. aeruginosa, חיידק גראם-שלילי אלים ביותר, משתמש בפילי, דגל וגורמי אלימות המופרשים כדי להיצמד במהירות לתאי אפיתל הקרנית ולפלוש אליהם, מה שמוביל לעתים קרובות לדלקת קרטיטיס כיבית חמורה16,17. לעומת זאת, S. epidermidis, חיידק קומנסלי גרם חיובי, מנצל בעיקר משטחי אפיתל משובשים ושינויים בסרט הדמעות כדי לבסס ביופילמים, מה שתורם לזיהומים מתמשכים ולעתים קרובות תת-קליניים18,19. ההבדלים באסטרטגיות ההדבקה בין מינים אלה מדגישים את הצורך להבין כיצד דלדול עצב הקרנית משנה את המיקרו-סביבה של העין לטובת קולוניזציה של חיידקים.
אתגר מרכזי בחקר הידבקות חיידקים הוא הבחירה במודל חיסון מתאים. מודל פגיעת השריטות הקונבנציונלי, המשמש לעתים קרובות במחקרי זיהום, יוצר פגמים באפיתל כדי להקל על היצמדות חיידקים. בעוד שגישה זו יעילה בהדמיית זיהומים הנגרמים מטראומה, היא מציגה משתנים מבלבלים משמעותיים, כולל נזק מוגזם לרקמות ותגובה דלקתית מוגזמת, שאינם מייצגים במדויק את השלבים המוקדמים של קולוניזציה חיידקית בקרניות נוירופתיות. בנוסף, השונות בפגיעה מכנית מקשה על השגת תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נדרשת שיטת חיסון חיידקים מבוקרת ורלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית.
טכניקת ניגוב המעבדה מציעה גישה סטנדרטית לשקיעת חיידקים, ומבטיחה היצמדות חיידקים אחידה מבלי לשבש את מחסום האפיתל20. שיטה זו מחקה מקרוב תרחישי רגישות בעולם האמיתי, שבהם הידבקות חיידקים מתרחשת בהיעדר טראומה מכנית גלויה אך בתנאים של שינוי בהרכב הקרעים והומאוסטזיס האפיתל. על ידי ביטול השונות הקשורה לפגיעה מכנית, שיטת ניגוב המעבדה מספקת הערכה מדויקת יותר של דינמיקת הידבקות מיקרוביאלית בקרניות נוירופתיות. יתר על כן, הוא מאפשר הערכה מבוקרת של תרומות סרט הדמעות להתיישבות חיידקים, מה שרלוונטי במיוחד במקרים של תפקוד תחושתי לקוי בקרנית שבהם הפרשת הדמעות נפגעת.
בהתחשב בתפקידם הקריטי של עצבי תחושת הקרנית בוויסות ייצור הדמעות והומאוסטזיס האפיתל, חיוני להקים מודל הניתן לשחזור לחקר ההשלכות של דלדול עצב תחושתי על הידבקות מיקרוביאלית. מחקר זה נועד לחדד פרוטוקול לדלדול עצב תחושתי ממוקד בקרנית באמצעות בופיבקאין, חומר הרדמה מקומי ארוך טווח, כדי להעריך את השפעותיו על הפרשת דמעות והידבקות חיידקים. על ידי שימוש בשילוב של יישום תת-לחמית ויישום מקומי של בופיבקאין, גישה זו מבטיחה דלדול חושי מקומי ומתמשך בנקודת זמן מוגדרת של יעילות שיא. באמצעות מודל זה, אנו חוקרים כיצד ניתוק עצבים חושי משנה את דינמיקת ההדבקה של S. aureus, S. epidermidis ו-P. aeruginosa, ומספק תובנות חשובות לגבי הקשר בין דלדול עצבים, שינויים בסרט הדמעות ורגישות מיקרוביאלית. לממצאים אלה יש השלכות רחבות יותר להבנת הרגישות לזיהום במצבים נוירופתיים כגון קרטופתיה סוכרתית וקרטיטיס נוירוטרופית ומציעים בסיס למחקרים עתידיים על אינטראקציות נוירו-אימוניות בעיניים והתערבויות טיפוליות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת ניו אינגלנד לאופטומטריה ודבקו במדיניות PHS לגבי טיפול ושימוש הומני בחיות מעבדה. עכברים זכרים ונקבות בני שישה עד שמונה שבועות C57BL/6J (סוג פראי; זן מס' 000664) התקבלו ממעבדת ג'קסון, ועכברים גודלו בשעון ביולוגי רגיל (מחזור אור/חושך של 12 שעות) וסופקו להם מזון ומים. שמור על טכניקה סטרילית לאורך כל ההליכים.
1. הכנת בעלי חיים להזרקה תת-לחמית
- לגרום להרדמה באמצעות 2-3% איזופלורן בחמצן באמצעות וופורייזר מכויל. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי בדיקת היעדר תגובה רפלקסיבית לצביטה עדינה בבוהן.
- התבונן ברציפות בבעל החיים לאיתור סימנים של אי נוחות או מצוקה חמורה.
- אם נצפתה מצוקה, יש לגרום להרדמה עמוקה עם איזופלורן 5% ולאשר חוסר תגובה.
- בצע פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד.
- אחרת, בצע מיד הוצאה באמצעות מלקחיים מעוקלים לניתוחים במורד הזרם.
2. חסימת עצב הקרנית באמצעות הזרקה תת-לחמית
הערה: הטמיעו פרוטוקול דו-שלבי הכולל הזרקה תת-לחמית ומריחה מקומית של בופיבקאין כדי להשיג דלדול ממוקד של עצב תחושתי בקרנית. השלם זריקות תת-לחמית ויישומים מקומיים תוך 15 דקות כדי למזער את החשיפה להרדמה מערכתית.
- הכנת האתר וחתך
- צור חתך קטן (~0.5 מ"מ) באזור הלימבלי הסופר-טמפורלי באמצעות מחט של 30 גרם. הימנע מכלי דם ומזער טראומה לרקמות. השתמש בחתך כדי לגשת לחלל התת-לחמית למתן תרופות מבוקר.
- הזרקת בופיבקאין
- הכן תמיסת בופיבקאין הידרוכלוריד 0.5% בתנאים סטריליים.
- טען 5 מיקרוליטר מהתמיסה למזרק המילטון 10 מיקרוליטר המצויד במחט קהה רכזת קטנה של 33 גרם (סגנון נקודה 3).
- הזרקת התמיסה לחלל התת-לחמית בזווית של 15-20 מעלות כדי למזער ריפלוקס ולהבטיח פיזור אחיד.
- התבונן בהיווצרות בלב באתר ההזרקה; הניחו לו להימשך 5-10 שניות ולהתפזר בתוך הכיס התת-לחמית עד לספיגה מלאה.
- חיזוק מקומי של רגישות בקרנית
- יש למרוח 5 מיקרוליטר נוספים של 0.5% בופיבקאין ישירות על מרכז הקרנית מיד לאחר ההזרקה התת-לחמית.
הערה: השתמש בשלב זה כדי לשפר את הרגישות של עצב פני השטח ולהאריך את אפקט ההרדמה המקומית.
- יש למרוח 5 מיקרוליטר נוספים של 0.5% בופיבקאין ישירות על מרכז הקרנית מיד לאחר ההזרקה התת-לחמית.
- קבוצת ביקורת
- יש לתת 5 מיקרוליטר של מי מלח עם פוספט (PBS) באמצעות הזרקה תת-לחמית ומריחה מקומית בנקודות זמן זהות עבור חיות ביקורת. התאם את השלבים הפרוצדורליים והנפח כדי לקחת בחשבון את ההשפעות הקשורות להזרקה.
- משך הטיפול וניתוח נקודת הסיום
- יש לתת טיפול בבופיבקאין אחת ליומיים למשך 15 יום כדי להשיג דלדול עצבי תחושתי מתמשך תוך מזעור הרעילות.
- ביום ה-15, המתת חסד של עכברים 4 שעות לאחר הטיפול האחרון בבופיבקאין באמצעות איזופלורן 5% בחמצן באמצעות מכשיר אידוי מכויל, ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם.
- אסוף מיד קרניות מקבוצה אחת של עכברים (ראה שלב 5.5.) להערכת שינויים בצפיפות העצבים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (ראה איור 1 וסעיף 6 של הפרוטוקול), ומקבוצה אחרת לניתוח הידבקות חיידקים (ראה איור 1 וסעיף 5 של הפרוטוקול).
3. הכנת בעלי חיים לחיסון חיידקים
- יש לתת קטמין תוך-צפקי (80-100 מ"ג/ק"ג) ודקסמדטומידין (0.25-0.5 מ"ג/ק"ג) כדי להרדים עכברים ארבע שעות לאחר הזרקת הבופיבקאין האחרונה ומריחה מקומית ביום ה-15.
- אשר הרדמה עמוקה על ידי אימות היעדר תגובות רפלקסיביות לצביטה בבוהן.
- שטפו את פני העין פי 3 באמצעות פיפטה עם 5 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי להסיר שאריות נוזל דמעות ופסולת, מה שמבטיח משטח קרנית נקי למחקרי הידבקות חיידקים (ראה איור 1)
- בקבוצת הניסוי הייעודית, השתמש בניגוב מעבדה נטול מוך כדי למחוק את פני הקרנית בצורה סטנדרטית.
- קפלו את נייר הטישו כדי להבטיח אחיזה בטוחה.
- נגב בעדינות את הקרנית של העכבר המורדם 4x, החל ממרכז הקרנית ובאמצעות תנועה סיבובית ימינה ושמאלה כדי לכלול את האזורים ההיקפיים20.
הערה: הפעל לחץ מינימלי כדי למנוע פגיעה מכנית תוך הסרה יעילה של נוזל הדמעות כדי להקל על הידבקות חיידקים.
4. הכנת חיסון חיידקים וחיסון קרנית
- תרבית חיידקים והכנה
- תרבית S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 ו-P. aeruginosa O1 על אגר סויה טריפטי (TSA) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מים סטריליים המונחים בחממה כדי לשמור על לחות.
- קצור מושבות בודדות והשהה בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). צנטריפוגה בתרחיף ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות פעם אחת להסרת תאים מתים ותוצרי לוואי מטבוליים.
- השעו מחדש את גלולת החיידקים ב-PBS והתאימו את הריכוז ל-~10¹¹ CFU/mL כדי להבטיח עומס חיידקי גבוה למחקרי הידבקות.
- פרוטוקול חיסון קרנית
- יש למרוח מינון של 5 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים המוכן על פני הקרנית אחת לשעה למשך 4 שעות בהרדמה מתמשכת.
- מקם את העכברים בשיפוע קל כדי למנוע נגר ולהבטיח חשיפה עקבית לחיסון.
- חזור על החיסון במרווחי זמן של שעה כדי לחקות חשיפה חיידקית מתמשכת הרלוונטית לתרחישי זיהום קליניים.
- המתת חסד לאחר חיסון והערכת הידבקות חיידקים
- לאחר 4 שעות, יש לתת זריקה תוך צפקית של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג) כדי להבטיח הרדמה עמוקה.
- בצע פריקת צוואר הרחם כדי להמית את העכברים בצורה אנושית.
- הסירו את העיניים באמצעות מלקחיים סטריליים בעלי קצה מעוקל תוך שמירה על תנאים אספטיים קפדניים למניעת זיהום.
- שטפו את משטח העין פי 5-6 עם 2 מ"ל סטרילי של PBS בצלחת פטרי באמצעות ניעור עדין להסרה יסודית של חיידקים שאינם נדבקים.
- הומוגניזציה של העיניים הגרעיניות ב-1 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות הומוגנייזר רקמות מכני כדי להבטיח התאוששות חיידקים עקבית ולשמור על תנאים אספטיים למניעת זיהום.
- בצע דילול סדרתי פי שישה של ההומוגנאט ב-PBS סטרילי.
- יש להצמיד את כמות הצלחות של כל דילול על צלחות TSA ולדגור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צמיחת מושבה.
- ספרו יחידות יוצרות מושבה (CFUs) והביעו תוצאות כ-log CFU לכל קרנית להשוואה כמותית.
5. אימונוהיסטוכימיה
- המתת חסד של עכברים באמצעות פריקת צוואר הרחם ביום ה-15 לאחר הטיפול.
- יש להוציא בזהירות את העיניים ולשטוף פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר בסיבוב עדין.
- יש לקבע את העיניים המנוקבות ב-2% פרפורמלדהיד (PFA) למשך שעה אחת כדי לשמור על שלמות המבנית
- שטפו את העיניים הקבועות 3 x 10 דקות ב-1 מ"ל PBS בסיבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- עקוב אחר פרוטוקול דיסקציה של הקרנית שתואר קודם לכן21,22
- מנתחים את הקרניות בתוך צלחת פטרי ברוחב 35 מ"מ מלאה בכמות מינימלית של PBS.
- השתמש במלקחיים בקצה ישר כדי לייצב את העין הגרעינית ובמספריים כירורגיים כדי ליצור חתך קטן בהיבט האחורי של הגלובוס.
- השתמש בנקודת החתך הקטנה כדי לחתוך בזהירות לאורך ההיבט האחורי 360°.
- השליכו את רשתית העכבר, עצב הראייה, העדשה, פיגמנט הקשתית וכל מבני רקמה נוספים שאינם הקרנית.
- הסר את כל הרקמה העודפת באמצעות מלקחיים ישרים או על ידי חיתוך זהיר במספריים כירורגיים תוך שמירה על הקרנית שלמה.
- שטפו את הקרניות המנותחות 3 x 10 דקות ב-1 מ"ל PBS המונח בצינורות מיקרו-צנטריפוגה בסיבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- דגרו את הקרניות ב-1 מ"ל של תמיסת חסימה (3% BSA + Triton X-100 ב-PBS) למשך שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב רציף.
- שפר את חדירות הרקמות על ידי דגירה של קרניות ב-1 מ"ל של 20% EDTA למשך שעה נוספת באותם תנאים.
- דגרו את הקרניות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני נגד β-טובולין III של ארנב בסיבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- למחרת, דגרו את הרקמות עם נוגדן משני IgG מצומד עז Alexa Fluor 488 ו-DAPI לצביעה גרעינית למשך 2-3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
- שטפו את הקרניות 3X10 דקות עם PBS בסיבוב עדין.
- עקוב אחר פרוטוקול ההרכבה השטוחה של הקרנית שתואר קודם לכן21,22
- הרכיבו שטוח את הקרניות המוכתמות על שקופיות זכוכית על ידי הנחת הקרנית בקצה המגלשה כדי להסיר עודפי נוזלים.
- מקם מחדש את הקרנית במרכז שקופית המיקרוסקופ כשצד האפיתל פונה כלפי מטה, במגע עם משטח ההחלקה.
- בצע ארבעה חתכים ישרים (1-2 מ"מ אורך) מהקצה ההיקפי לכיוון המרכז באמצעות להב נוצה כירורגי ליצירת חצי רבעים.
- מרחו 20 מיקרוליטר של תושבת והניחו כיסוי זכוכית 8 מ"מ מעל הקרנית.
- לחץ בעדינות כלפי מטה על הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר ולמנוע קמטים של הקרנית.
- אחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר בחושך לייבוש.
- אטום את שולי הכיסוי עם מגן ציפורניים שקוף למניעת ייבוש באוויר, ואחסן את השקופיות בחושך עד שהן מוכנות להדמיה.
6. הדמיה
- בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דו-פוטוני זקוף עם מטרת טבילה במים של 20x/1.00 NA.
- הנח את הדגימות המותקנות שטוחות על המיקרוסקופtagה והגדר את עדשת האובייקט לטבילה במים 20x/1.00 NA.
- עמעמו את אורות החדר וכסו את המיקרוסקופ במטלית שחורה אטומה כדי למזער הפרעות אור חיצוניות במהלך ההדמיה.
- דמיין את עצבי הקרנית באמצעות תעלת הלייזר Alexa Fluor 488 ננומטר וזיהוי גרעיני תאים באמצעות ערוץ הלייזר DAPI 405 ננומטר.
- הגדר את גודל המסגרת ל-1,536 x 1,536, את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת (AU) ואת מהירות הסריקה ל-1.02 מיקרון. אפשר סריקה דו-כיוונית והחל ממוצע פי 2.
- כוונן את הרווח הראשי (~750 וולט) ומזער את עוצמת הלייזר כדי למנוע פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות תוך הבטחת לכידת תמונה ברורה.
- בצע הדמיית Z-stack כדי ללכוד את עובי הקרנית המלא. הגדר את מישור המוקד הראשון בהיבט הקדמי ביותר ואת האחרון בהיבט האחורי ביותר של הדגימה.
- רכשו ערימות Z במרווחי צעדים של 0.8 μm או 1.0 μm, ולוכדים כ-60 - 80 ערימות בסך הכל לכל דגימה.
- הערכת צפיפות עצבים בקרנית
- ניתוח צפיפות עצבי הקרנית באמצעות תוכנת Imaris.
- אשר את עובי התמונה המלא על ידי בדיקת מידות עוצמת הקול.
- הפעל את אפשרות עיבוד אמצעי האחסון כדי ליצור שחזור תלת-ממדי.
- צור הקרנה בעוצמה מקסימלית כדי להמיר את מחסנית ה-Z לתצוגה דו-ממדית להדמיה וכימות.
- דרג את צפיפות העצבים בקרנית בסולם 0-10 על ידי מעריכים עיוורים כדי להבטיח הערכה אובייקטיבית.
7. ניתוח סטטיסטי
- הערכת התפלגות הנתונים באמצעות מבחני שפירו-וילק וקולמוגורוב-סמירנוב.
- אם רוב הנתונים עוקבים אחר התפלגות נורמלית, הצג את התוצאות כממוצע ± סטיית תקן (SD).
- להשוואה בין שתי קבוצות, החל את מבחן ה-t של הסטודנט, והשתמש ב-ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי לניתוחים הכוללים שלוש קבוצות או יותר.
- קחו בחשבון ערך p < 0.05 מובהקות סטטיסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אלא אם צוין אחרת, כל הניסויים בוצעו באופן עצמאי בשלושה עותקים, כאשר כל שכפול כלל 3-4 עכברים לקבוצה.
ירידה משמעותית בצפיפות עצבי הקרנית לאחר טיפול בבופיבקאין
כדי להעריך באופן שיטתי את ההשפעה של דלדול עצב תחושתי ממוקד בקרנית, צפיפות עצב הקרנית הוערכה באמצעות תיוג חיסוני ומיקרוסקופיה קונפוקלית. עכברים קיבלו זריקות תת-לחמית לסירוגין של בופיבקאין למשך 15 יום, לבד או בשילוב עם מריחה מקומית, כדי להשוות את היעילות של דרכי אספקה שונות בוויסות שלמות עצב הקרנית. הזריקות התת-לחמית היו ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עצבים תחושתיים בקרנית ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות פני העין, ויסות הומאוסטזיס אפיתל ומווסת תגובות חיסוניות. דלקת עצב הקרנית, המאופיינת בניוון עצבי ודלקת, נצפית בדרך כלל במצבים מערכתיים כמו סוכרת, כאשר היפרגליקמיה כרונית תורמת לנוירופתיה היקפית, כולל אובדן עצב בקרנית. מחקרים הראו כי נוירופתיה סוכרתית מובילה לרגישות מופחתת בקרנית, עין יבשה, פגיעה בריפוי פצעים וסיכון מוגבר לקרטופתיה נוירוטרופית 8,9,10,24, מצב המאופיין במומים אפיתל מתמשכים ורגישות לזי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת בופיבקאין הידרוכלוריד 0.5% | פייזר בע"מ ארה"ב | NDC 00409-1162-01 | |
| מחט 30 גרם | יצרן: BD Biosciences, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב | 305106 | |
| 33 G מחט קהה רכזת קטנה (סגנון נקודה 3) | חברת המילטון, רינו, נבדה, ארה"ב | 7803-05 | |
| 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | D1306 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב | א7906 | |
| עכברי C57BL/6J (סוג בר) | מעבדת ג'קסון | . 000664 | |
| מסובב קנטריפוגה | מחסן המעבדה בע"מ (דוסונוויל, ג'ורג'יה, ארה"ב) | ₪2020 | |
| מגן ציפורניים שקוף | רטוב ופראי | לא ישים | |
| מיקרוסקופ ניתוח (מיקרוסקופ סטריאו SMZ-160-TLED (ניתוח) עם יציאה טרינוקולרית) | Stellar Scientific (בולטימור, מרילנד, ארה"ב) | 1.1002E+12 | |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב | E6511 | |
| עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488 | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | א-11008 | |
| המילטון 10-μ מזרק L | חברת המילטון, רינו, נבדה, ארה"ב | 7635-01 | |
| מספריים מיקרו לניתוח דיוק גבוה | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | 08-953-1ב | |
| איזופלורן | פטרסון וטרינריה, ארה"ב | 07-890-8115 | |
| וופורייזר איזופלורן | קנט סיינטיפיק, ארה"ב | VETFLO1205S | |
| קטמין הידרוכלוריד | Dechra Veterinary Products, אוברלנד פארק, קנזס, ארה"ב | DP00050 | |
| נייר טישו ללא מוך של Kimwipe | קימברלי-קלארק פרופשיונל, רוזוול, ג'ורג'יה, ארה"ב | 34155 | |
| מיקרו-חיתוך מלקחיים קדמיים מעוקלים (להוצאה) | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב | F4142-1EA | |
| מיקרו-חיתוך מלקחיים ישר קדימה | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב | F4017 | |
| צלחות פטרי (100 מ"מ) | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | 263991 | |
| צלחות פטרי (35 מ"מ) | Avantor, באמצעות VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב). | 25373-041 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט | תומאס סיינטיפיק, סוודסבורו, ניו ג'רזי, ארה"ב | C987D24 | |
| תושבת זהב אנטי-דהייה ProLong | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | עמ' 36930 | |
| ארנב אנטי-&בטא;-טובולין III | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) | T2200 | |
| כיסוי עגול זכוכית גרמנית (8 מ"מ) | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | 50-949-314 | |
| ידיות אזמל | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) | S2896-1EA | |
| שקופיות, מיקרוסקופ | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) | S8902-1PAK | |
| Snap Cap צינורות מיקרוצנטריפוגה עם שמירה נמוכה | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B צנטריפוגה ספסלית | תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב | 3367898 | |
| להבי נוצה כירורגיים | World Precision Instruments (סרסוטה, פלורידה, ארה"ב) | 504169 | |
| אגר סויה טריפטי | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) | 22091 | |
| קסילזין | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב | 1236-20-8 |
מקורות
- Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
- Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
- Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
- Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
- Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
- Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
- Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
- Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
- Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
- Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
- Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
- Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
- Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
- Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
- Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
- Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
- Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
- Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
- Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
- Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
- Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
- Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
- Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
- Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
- O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
- Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
- Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
- Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
- Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
