מאמר שיטה

הכלאה של RNA באתרה עם אימונופלואורסצנציה של חלבון רציף בבדיקת טנדם

914 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68615

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט הכלאה של RNA באתרו עם אימונופלואורסצנציה של חלבון עוקב ברקמה על פלטפורמה אוטומטית לאפיון אומיקס מרובה מרחבי ממוקד ברמת התא.

תקציר

הפונקציונליות של תאים בתוך מארח אינה תלויה באותות מבודדים. במקום זאת, כל המרכיבים, ממולקולות הרנ"א הקטנות ביותר ועד לחלבונים הגדולים ביותר, חייבים לפעול בהרמוניה ובתיאום בתוך גוף האדם. ככזה, החשיבות של גישות המשלבות חקירות מרחביות ברמת התא על פני אומיקס מרובה היא בעלת חשיבות עליונה להבנת אינטראקציות תא-תא והתקדמות המחלה. ניתוח הפרוטאום והטרנסקריפטום באותה בדיקה מרחבית עוזר לנו להבין כיצד לא רק מה שהתא מקבל הוראה לבצע (RNA), אלא גם כיצד הוא מבצע את ההוראות הללו בהקשר של הנישה המיקרו-סביבתית בה הוא מוצא את עצמו (חלבון). כתב יד זה מתמקד בשילוב אימונופלואורסצנציה רציפה (SeqIF) עם היברידיזציה של RNA באתרו (ISH) עם מערכת מונעת מיקרופלואידיקה על הרקמה לחקירת חלבון ו-RNA בתפוקה גבוהה בהקשר מרחבי (seqRNA-ISH+seqIF) שתאפשר עד 12 מטרות RNA ו-24 חלבונים בריצה אחת עם מטרות חלבון נוספות שניתן להוסיף באמצעות ריצות עוקבות. שיטה זו מספקת פלטפורמת מולטיומיקס ממוקדת רציפה שאינה דורשת התחשבות בתאימות פלואורופור ואופטימיזציה נרחבת עבור פלקסינג גבוה יותר. זה מאפשר להבין אילו מסרים התא מכין או שולח למיקרו-סביבה שלו. גישה ממוקדת זו עוזרת לאמת שיטות טרנסקריפטום שלם תוך בחינת האינטראקציות בין ה-RNA לחלבונים בצורה מדויקת יותר.

מבוא

התפקוד המורכב של תאים בגוף האדם מסתמך על משחק גומלין מורכב של אותות, ממולקולות RNA קטנות ועד חלבונים גדולים, כולם פועלים בתיאום1. אינטראקציה זו מדגישה את החשיבות של גישות אינטגרטיביות הבוחנות אינטראקציות מרחביות ברמת התא על פני שכבות אומיקס שונות 2,3. מתודולוגיות כאלה חיוניות להבנת המורכבות של אינטראקציות תא-תא והתקדמות המחלה. שיטות מסורתיות רבות, כגון זרימה ציטומטרית4 וריצוף תאבודד 5, מבודדי תאים משמשים לחקירת דגימות מפורקות כדי לזהות יחסים בתפזורת של פנוטיפים הקיימים בתוך דגימה ספציפית. עם זאת, בידוד תאים לניתוח עלול לגרום להפעלה או לשינויים פנוטיפיים שעשויים שלא לשקף במדויק את הביולוגיה והתפקוד הטבעיים שלהם באתרם6. שיטות מתקדמות בביולוגיה מרחבית מציעות אסטרטגיות חדשות לחקר תאים והמיקרו-סביבה שלהם מבלי להתפשר על ההקשר של ארכיטקטורת רקמות ויחסים מרחביים עם תאים שכנים על פני סוגים מולקולריים מרובים 2,7.

שילוב ניתוחי טרנסקריפטום ופרוטאום באותה בדיקה מרחבית, מבלי לבודד תאים בודדים, מציע מבט מקיף על תפקוד התא8. שיטה זו מתבססת עלשיטות היברידיזציה של RNA פלואורסצנטי (FISH) של מולקולה אחת, אך אינה כוללת עיכול פרוטאינאז המסבך חקירות חלבון עוקבות8. הגמישות של הגישה לשימוש בקטע בודד מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ופחות עיבוד תמונה לשילוב ויישור קטעים. גישה זו מספקת תובנות הן לגבי ההוראות המתקבלות על ידי תא (RNA) והן לגבי ביצוען (חלבון) בתוך הנישה המיקרו-סביבתית הספציפית שלו. על ידי שילוב שכבות המידע הללו, חוקרים יכולים לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי התנהגות ותקשורת תאית.

בעוד שקיימות שיטות ידניות, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות אומיקס מרחבי אפשרה ניתוחים מורכבים יותר עם מספר גדול יותר של סמנים פרוטאומיים שנבדקו באמצעות ריבוב ידני9. גישות אלו כללו התקדמות הן במבחני חלבון והן במבחני RNA-ISH 10,11,12,13,14, ומתודולוגיות אוטומטיות הדורשות נוגדנים מצומדים ספציפיים למערכת 15,16,17, הדמיה של ציטומטריית מסה (IMC)18,19,20 ומתודולוגיות פרוטאומיות עוקבות פלואורסצנטיות אוטומטיות אחרות המשתמשות באנטיבודיות ראשוניות ומשניות מהמדף 2,21,22. טכנולוגיות אלו אפשרו פרוטאומיקה או שילוב של טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה באמצעות גישות ממוקדות ובדרך כלל מדמות את ה-RNA באמצעות בדיקות וחלבונים באמצעות נוגדנים המבוססים על צימודים דומים, מה שמאפשר לזהות RNA וחלבון בו-זמנית או עוקבים באמצעות אותה מתודולוגיה או מכשירים. על ידי מתן מבט מקיף על הפעילות התאית, גישות מסוג זה שואפות לשפר את ההבנה שלנו לגבי תקשורת תאית בין תאים למיקרו-סביבה שלהם. הוא מציע כלי רב ערך לפענוח המורכבות של אינטראקציה תאית, ועשוי לחשוף תובנות חדשות לגבי תהליכים פיזיולוגיים נורמליים ומנגנוני מחלה.

פרוטוקול זה מספק הנחיות לשילוב היברידיזציה של RNA במקום (ISH) עם אימונופלואורסצנציה רציפה (SeqIF) עם מערכת מונעת מיקרופלואידיקה על הרקמה. זה מספק כלי בעל תפוקה גבוהה לחקירת RNA וחלבון בהקשר המרחבי המקורי שלהם. שיטה זו (seqRNA-ISH+seqIF) תאפשר עד 12 RNA ו-24 מטרות חלבון בריצה אחת, עם מטרות חלבון נוספות שניתן להוסיף באמצעות ריצות עוקבות. בעוד שפרוטוקול זה מתמקד במערכת מיקרופלואידית ספציפית אחת, ניתן להתאים את הטיפול ברקמות, אבטחת איכות RNA והנחיות בחירת נוגדנים וטיטרציה הניתנות למתודולוגיות אחרות. עם זאת, שיטה זו משתמשת באחזור אנטיגן pH 9.0 לאחזור אפיטופים יעיל ונטול פרוטאז, ומשפרת את יציבות הפרוטאומיקה תוך מתן כמה טרנסקריפטומיקה ממוקדת, בניגוד ל-RNA-ISH מסורתי ב-pH 6.0 עם פרוטאז כדי להגביר את הנגישות לבדיקת RNA אך לא מצליחה לשמר את הפרוטאום8. שיטת seqRNA-ISH+seqIF מתוארת ויזואלית באיור 1, ומדגימה את הגברת ה-RNA FISH ואחריה הדבקה לפני שימוש בשיטת זיווג נוגדנים ראשוניים-משניים המשתמשת בהסרה כימית עדינה של ראשוניים ומשניים. האופי הרציף של seqIF והזיהוי מתגבר על רבות מהמגבלות הקשורות לתאימות פלואורופור על ידי שימוש במתודולוגיות עוקבות23. זה מפחית את הצורך באופטימיזציה נרחבת הדרושה לצביעה בו-זמנית במתודולוגיות פלקס גבוהות הדורשות פיצוי על חפיפה ספקטרלית23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה משתמש בקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין (FFPE) שנאספו מחולות קרצינומה שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה שעברו ניתוח ציטורדוקטיבי ראשוני. כל הנתונים הקליניים התקבלו ממאגר סרטן השחלות של המחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית ורפואת רבייה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טקסס. הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים התקבלה על ידי צוות דלפק הקבלה, והמחקרים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוכרות.

הערה: כל הריאגנטים, אלא אם צוין אחרת, מדוללים במים נטולי יונים ללא נוקלאז.

1. תקן והטמע דוגמאות

הערה: הבחירה של משך הקיבוע והקיבוע משפיעה מאוד על ביצועי הבדיקות, ובאופן כללי בדיקות מרחביות נעשות לרוב עם FFPE מכיוון שהוא משמר ארכיטקטורה פתולוגית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ברקמת FFPE, ולכן הפרוטוקול הבא מוצע עבור דגימות רקמת FFPE. עם זאת, איכות ה- RNA מושפעת מתהליכי הקיבוע, וכך גם אפיטופים של חלבון, אך במידה פחותה. שיטות קיבוע אלה, קיבוע לא שלם ופירוק דגימה יכולים להגביר את הקישור הלא ספציפי בפרוטאומיקה מבוססת נוגדנים. שלישית, הקרינה המכוננת בדרך כלל מרווה במהלך עיבוד FFPE, אך חלק מהפלואורופורים ימשיכו להתקיים במידה בינונית וידרשו בדיקה כדי לוודא שהם מרווים.

  1. חתכו את הרקמה לעובי של ≤ 5 מ"מ כדי להבטיח קיבוע אחיד ולמנוע מחסומי דיפוזיה הנגרמים על ידי שומן. תקן מיד את החלקים בפורמלין 10% חוצץ פוספט (pH 7.0) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לייעל את ה-RNA והחלבון24.
  2. עיבוד רקמות קבועות במעבד רקמות או עיבוד ידני באמצעות השלבים הבאים
    1. לייבש קטעי רקמה באתנול בדרגה מולקולרית במים נטולי נוקלאז מ (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x למשך שעה כל אחד).
    2. לאחר מכן, טבלו את הרקמה בקסילן פעמיים למשך שעה אחת כל אחת בטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס).
  3. מחממים שעוות פרפין ל 60 מעלות צלזיוס. טבלו את קופסת הרקמות בשעוות פרפין פעמיים למשך שעה כל אחת.
  4. מניחים רקמות מנופחות ומכוונים רקמות בתבנית, ממלאים בשעוות פרפין טרייה ומצננים במהירות ל-4 מעלות צלזיוס25.
    הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור RNA יתקבלו על ידי השלמת כל השלבים תוך 48 שעות.

2. הערכת איכות RNA

  1. השתמש בשלושה חלקים טוריים, הפעל את כל שלושת השקופיות במקביל או הרצת שקופיות בקרה לפני הפאנל הממוקד כדי להבטיח שהחסימה מספיקה. בדיקות הבקרה החיוביות הזוגיות מכוונות לגנים של משק בית כדי להעריך את איכות הרקמה ושלמות המרחב על פני הרקמה, מה שיכול להיות מושפע מהבדלי התמדה. בקרות נפוצות כוללות UBC (גן בעל ביטוי גבוה), PPIB (ביטוי בינוני) ו-POLR2A (ביטוי נמוך)26. השתמש בערכות בדיקה בקרה שלילית, כגון Dab1 (RNA של חיידקי קרקע) בכל ערוץ זיהוי. לחלופין, כלול את כל בדיקות הבקרה החיוביות והשליליות באותה דגימה לצד בדיקות המטרה. בהגדרה זו, מקם פקדים שליליים של Dab1 בערוצים T2-T4, הקצה פקדים חיוביים מהביטוי הנמוך ביותר לגבוה ביותר ל-T1, T5 ו-T9, וודא שבדיקות היעד תופסות את הערוצים הנותרים.
    אופציונלי: בנוסף, עבור דגימות עם איכות RNA לא ידועה, זה יכול להיות שימושי לקבוע ערך הפצה 200 (ציון DV200). מומלץ מאוד לקבל ציוני DV200 מעל 30, עם דגימות באיכות גבוהה יותר של 50 ומעלה עדיפות27. ציון זה הוא אינדיקציה לאיכות ה-RNA, ואיכות דגימה גבוהה יותר מגדילה את הסבירות ש-RNA-ISH יעבוד ביעילות27.

3. אמצעי זהירות ותכשירים של RNA

הערה: מומלץ לטהר את אזור ה-RNases ולנגב אותו ולאחר מכן לרסס את אזור העבודה ב-70% אתנול לפני העיבוד בנוסף לשימוש באזור נטול RNase, ללבוש תמיד כפפות נקיות, מעיל מעבדה ומסכה כדי למזער את החדרת RNases מהעור או מהנשימה. השתמש רק במים ובחומרים מתכלים ללא RNase והימנע מלהגיע לשקיות אספקה. אמצעי זהירות אלה, כמו גם שמירה על רקמות/מגלשות קרירות ויבשות, חיוניים לשמירה על שלמות ה-RNA במהלך הניסויים.

  1. חותכים את החלקים על שקופיות זכוכית טעונות חיובית עם מיקרוטום ומניחים את אזור העניין במרכז השקופית, שמתואם עם אזור ההדמיה (משתנה לפי מערכת; כאן, זה בערך 12.5 מ"מ על 12.5 מ"מ).
    הערה: זכור כי העובי האידיאלי לכל קטע הוא בין 4-6 מיקרומטר עבור רקמות FFPE.
  2. אופים שקופיות FFPE בתנור יבש ללא RNAse, רקמות כלפי מעלה, בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות ועד לילה לרקמות שומן או רקמות המועדות אחרת לניתוק.
  3. טיפול מקדים אופציונלי
    הערה: בעוד שטיפול מקדים הוא אופציונלי, שלבים מסוימים הם אופציונליים בנוסף כמתואר להלן.
    1. הכן 3% מי חמצן: בצינור חרוטי של 50 מ"ל, הוסף 5 מ"ל של 30% מי חמצן ל-45 מ"ל של 1x PBS. אחסן את מי החמצן הנותרים בטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס), המכסה מאובטח בפרפילם, עד שלושה חודשים.
      הערה: מי חמצן הוא מחמצן חזק. הרחק מחומרים דליקים, מקורות חום ומתכות. יש להשתמש באזור קולט אדים כימי עם ציוד מגן אישי (PPE; למשל, משקפי מגן, כפפות וחלוק מעבדה). יש להימנע ממגע עם העור, העיניים ושאיפה. יש לשטוף את העור במים למשך 15 דקות אם הוא חשוף. פנה לעזרה רפואית במקרה של בליעה או שאיפה. ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לכוויות קשות ועלולים להתלקח או להתפוצץ עם חומרים אורגניים או מתכות מסוימות. הוסף תמיד מי חמצן למים כדי למנוע תגובות אלימות.
    2. הכן 3.7% פורמלדהיד: במכסה אדים כימי, הוסף 1 מ"ל של 16% פורמלדהיד לכל 3.3 מ"ל של 1x PBS. אחסן פורמלדהיד עטוף בפרפילם עד שלושה חודשים.
      הערה: פורמלדהיד עלול לגרום לנזק חמור לעיניים, גירוי בדרכי הנשימה וחשוד כגורם לסרטן. חשיפה ממושכת או חוזרת עלולה להוביל לרגישות בעור ולתגובות אלרגיות. יש להשתמש רק במכסה אדים כימי וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, משקפי מגן/מגן פנים, מסכה, מעיל מעבדה וכו'). הימנע ממגע עם העור, מגע עיניים ושאיפה. הרחק ממקורות חום ולהבות פתוחות. השלך פרפורמלדהיד וחומרים מזוהמים כפסולת מסוכנת, והכן רק את הכמות הדרושה לשימוש מיידי במידת האפשר.
    3. דה-פרפין על ידי שטיפת שקופית הטישו על ידי הנחתה בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל המכילים את הדברים הבאים: קסילן (40 מ"ל) ל-3 כביסות ב-5 דקות כל אחת במכסה אדים כימי.
      אופציונלי: במקום קסילן, ניתן להשתמש בחומר ניקוי היסטולוגי על בסיס שאינו קסילן, אך הוא עלול להשאיר שאריות מפרפין ולהשפיע על איכות התמונה. זה כרוך בהנחת הפרוסות בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל המכילים את הדברים הבאים: חומר ניקוי היסטולוגי על בסיס שאינו קסילן (40 מ"ל) לשתי שטיפות ב-15 דקות כל אחת. קטעים מבלוקים העשויים משעוות דבורים יכולים להיות קשים להסרת שעווה עם שאינו קסילן. עבור תערובות שעווה/פרפין לא ידועות, מומלץ להשתמש בקסילן עם אמצעי הזהירות הנכונים. קסילן הוא חומר מסוכן ודליק, וחשיפה ממושכת עלולה לגרום נזק למערכת העצבים המרכזית, לכבד ולכליות. יש להשתמש רק בקולט אדים כימי וללבוש ציוד הגנה אישי (למשל, כפפות, מסכות וחלוקי מעבדה). השלך קסילן וחומרים מזוהמים כפסולת מסוכנת. במקרה של חשיפה, פנה לטיפול רפואי מיידי.
    4. לחות מחדש על ידי שטיפת שקופית רקמות על ידי הנחת צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל את הדברים הבאים: 100% אתנול (40 מ"ל) ל-2 כביסות למשך 3 דקות כל אחת; 95% אתנול (40 מ"ל) לשתי כביסות ב-3 דקות כל אחת; 70% אתנול (40 מ"ל) לשתי כביסות ב-3 דקות כל אחת; 50% אתנול (40 מ"ל), לשתי כביסות ב -3 דקות כל אחת; 30% אתנול (40 מ"ל) לשתי כביסות ב -3 דקות כל אחת; 1x כביסה PBS (40 מ"ל) לכביסה אחת תוך 2 דקות.
    5. פרוקסידאז חוסם רקמה על ידי הנחתו בתא לחות בטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס) וכיסוי הרקמה בכ-100-200 מיקרוליטר של 3% מי חמצן, לכביסה אחת ב-10 דקות ואז לשטוף טישו עם שטיפת PBS אחת (40 מ"ל), ל-2 כביסות ב-2 דקות כל אחת.
      הערה: חסימת פרוקסידאז היא אופציונלית ומרווה אנזימי פרוקסידאז שיוריים ברקמה כדי להפחית צביעה לא ספציפית ועשויה להפחית אוטופלואורסצנטיות ברקמות. זה חשוב במיוחד עבור רקמות בעלות אוטופלואורסצנטיות גבוהה, כגון מח עצם, כליות, כבד, ריאות, מעיים ומוח, שבהן אותות רקע חזקים יכולים להפריע להדמיה ברצועות הפליטה TRITC ו-FITC 28,29,30,31,32.
    6. בצע קיבוע פורמלדהיד על ידי הנחת רקמה בתא לחות בטמפרטורת החדר וכיסוי הרקמה בכ-100-200 מיקרוליטר של פורמלדהיד 3.7%, לכביסה אחת ב-10 דקות, ולאחר מכן לשטוף טישו עם שטיפת PBS אחת (40 מ"ל), למשך 2 כביסות ב-2 דקות כל אחת.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ עבור רקמות עתירות שומן או רקמות אחרות שיש להן בעיות בהיצמדות למגלשות זכוכית.

4. אחזור אנטיגן

הערה: שיטת הסרת השעווה ואחזור האנטיגן המומלצת ומתוארת כאן שונה מהשיטה המומלצת עבור seqRNA-ISH+seqIF על ידי היצרן, המשתמשת במכשיר אחזור אנטיגן חום מבוקר בעל קיבולת גדולה.

  1. אחזור אנטיגן המושרה בחום (HEIR) באמצעות מיקרוגל
    1. באמצעות מיקרוגל מנוטר טמפרטורה הוסף מספיק תמיסת חיץ pH 9.0 HEIR זמינה מסחרית (כ-250 מ"ל) כדי לכסות שקופיות במחזיק השקופיות מתחת למדחום אם רלוונטי.
      הערה: אחזור אנטיגן ל-RNA נעשה בדרך כלל ב-pH 6.0, אולם המתודולוגיות הבאות מיועדות ל-pH 9.0 ליעילות גבוהה יותר של קשירת נוגדנים.
  2. הכנס את השקופיות בתמיסת חיץ למיקרוגל ואיזן את כל התאים הריקים אם רלוונטי עם מים מזוקקים כפולים. חום מחליק במיקרוגל למשך 15 דקות בטמפרטורה של 107 מעלות צלזיוס (הזמן הכולל הוא בדרך כלל 30 דקות עד שמאגר HEIR מגיע לטמפרטורה).
  3. מצננים שקופיות על ידי הנחתן מתחת למכסה אדים כימי בטמפרטורת החדר למשך כ-20 דקות.
  4. שטפו שקופיות ב-1x PBS בצינור חרוטי של 50 מ"ל (40 מ"ל), לכביסה אחת למשך 2 דקות.
  5. אחסן שקופיות בדואר שקופיות עם מכסה הברגה או בצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-1x PBS (או מאגר רב-מכתים מסחרי) והמשך מיד, או אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים, אך באופן אידיאלי פחות מ-72 שעות לפני שתמשיך עם seqRNA-ISH+seqIF.

5. הכן פתרונות מלאי

  1. הכנת מאגר הדמיה של 40x RNA
    1. הכן מאגר הדמיה של 40x RNA על ידי שילוב של 400 מ"ג של מאגר הדמיית RNA אבקה ו-25 מ"ל של מים נטולי יונים ללא נוקלאז
    2. מערבולת את התמיסה המתקבלת עד להמסה מלאה ולאחר מכן לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (1 מ"ל לצינור)
    3. מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים, תוך הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה.
  2. הכן 20x מאגר מלח-נתרן ציטראט (SSC)
    1. ממיסים 157.3 גרם נתרן כלורי (NaCl) ו-88.2 גרם נתרן ציטראט (Na3C6H5O7) ב-800 מ"ל של מים נטולי יונים ללא נוקלאז.
    2. מדוד pH וטיטראט ל-pH 7.0 טיפתית עם 1 M חומצה הידרוכלורית (HCl).
    3. חיטוי לעיקור.
      הערה: ניתן לרכוש SSC סטרילי 20x גם מחברות שונות. לאחר הפתיחה, יש לאחסן בטמפרטורת החדר ל-4 מעלות צלזיוס.
    4. הכן מאגר SSC 4x על ידי שילוב של 1 מ"ל של מלאי SSC 20x עם 4 מ"ל מים נטולי יונים ללא נוקלאז

6. RNA-ISH רציף + אימונופלואורסצנציה רציפה

הערה: כל השלבים המתוארים כאן מותאמים מפרוטוקול היצרן עבור seqRNA-ISH+seqIF המתואר בטבלת החומרים, ככזה רוב הריאגנטים מזוהים כריאגנטים תואמי מערכת, מסחריים. ריאגנטים אלו מזוהים ו/או מסופקים על ידי היצרן ומתוכננים להיות תואמים למערכת. שינויים אפשריים ומתוארים בדיון, אך עשויים לדרוש בדיקות נוספות ושטיפת נוזלים כדי למנוע הצטברות. התוכנה תחשב את הנפח הכולל של ריאגנטים הדרושים לאחר תכנון והזנת הפאנל והפרוטוקול. עם זאת, מוצגים שינויים מומלצים. הנפח הכולל תמיד ישתנה בהתאם למספר המחזורים והיעדים שבהם נעשה שימוש בכל פרוטוקול. עם זאת, דילול הנוגדנים וה-RNA-ISH לא יחושבו על ידי המערכת אלא אם כל שילוב בודד יוזן כפריט ייחודי במסד הנתונים. עבור פרוטוקול זה, נדרשים 400 uL של קוקטייל נוגדנים לכל שקופית דגימה.

  1. הכנת המערכת
    1. לפני seqRNA-ISH+seqIF, יש לשטוף היטב את כל המיקרופלואידיקה במים נטולי נוקלאז.
    2. יש לרסס מחוץ למערכת בתמיסת טיהור RNAse, ואחריה 70% אתנול.
  2. הכן ריאגנטים כלליים
    1. מאגר כביסה: 50 מ"ל של מאגר תואם מערכת 20x, מסחרי, רב מכתים + 950 מ"ל מים נטולי יונים ללא נוקלאז
    2. מים: 100 מ"ל מים נטולי יונים ללא נוקלאז.
    3. אתנול: 100 מ"ל של 70% אתנול.
    4. מאגר הדמיה: 16 מ"ל של תמיסת הדמיה מסחרית תואמת מערכת פי 10 + 140 מ"ל מים נטולי יונים ללא נוקלאז + 4 מ"ל של מלאי הדמיה מסחרי תואם מערכת.
    5. מאגר סילוק: 152 של תואם מערכת, מסחרי, פתרון Elution 1 + 8 של תואם מערכת, מסחרי, פתרון Elution 2
    6. מאגר מרווה: 130 מ"ל של מים נטולי יונים ללא נוקלאז + 14 מ"ל של פתרון מרווה תואם מערכת, מסחרי 1 + 16 מ"ל של פתרון מרווה תואם מערכת, מסחרי 2.
  3. הכן ריאגנטים מכתימים לפרוטוקול RNA-ISH
    הערה: ניתן להשלים שלב זה בלילה שלפני ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. בעוד שהמלצות היצרן קובעות כי ניתן להשתמש בבדיקות משותפות עד שנה, לא מומלץ לאגד בדיקות יותר משבוע לפני הזמן בשל חששות לזיהום. עבור בדיקות, עדיף להקיש או לפיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב ולצנטריפוגה בעדינות כדי להסתובב לפני השימוש.
    1. תמיסת חדירות תואמת מערכת עומס, מסחרית, ללא פרוטאינאז ב-500 מיקרוליטר לשקופית בצינור מיקרו-צנטריפוגה תואם מערכת.
    2. מגברי RNA-ISH של בריכה המבוססים על מחזור (טבלה 1) בסך הכל 500 מיקרוליטר לכל שקופית לכל אחד מהבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה תואם מערכת: i) עצי זנב ZZ לזנבות T1 עד T4, ii) עצי זנב ZZ לזנבות T5 עד T8, iii) עצי זנב ZZ לזנבות T9 עד T 12.
    3. ספציפי לעץ זנב הבריכה, התאמת מגבר, פלואורופורים בסך הכל 500 מיקרוליטר לכל שקופית לכל אחד מהבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה תואם מערכת: i) פלואורופור לעץ T1 עד T4, ii) פלואורופור לעץ T5 עד T8, iii) פלואורופור ל-T9 עד T 12.
      הערה: שלב זה רגיש לאור
    4. הכן 1 מ"ל של דילול של 1:200 של DAPI מסחרי (ריכוז מלאי של 1 מ"ג/מ"ל) במאגר רב-צביעה מסחרי העשוי ממים נטולי נוקלאז לכל שקופית
      הערה: ההליך בוצע על פי היצרן, הכולל DAPI כחלק מהריאגנטים הסטנדרטיים. אם משתמשים בתכשירים מותאמים אישית של DAPI המדוללים ב-N,N-Dimethylformamide (DMF), הדילולים עשויים להשתנות, ויהיה צורך לבצע בדיקות טיטרציה. עם זאת, מומלץ להשתמש בריכוז בסביבות 1:1000-1:2000 של ריכוז מלאי של 1 מ"ג/מ"ל. בדרך כלל, זה בריכוז גבוה מהרגיל מאשר פרוטוקולי צביעה ידניים, מכיוון שהוא חייב להימשך מספר סבבים של הדמיה והפשטה. ניסוחים טריים של DAPI ב-DMF נוטים להיות בהירים יותר מתכשירי DAPI הזמינים מסחרית. ריאגנטים עם פורממיד, כגון DAPI, יוקצו מתחת למכסה אדים כימי. פורממיד עלול לגרום לרעילות רבייה ולנזק לאיברים והוא חשוד כמסרטן. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים (למשל, כפפות וחלוק מעבדה).
    5. הכן מאגר הדמיה של RNA-ISH מיד לפני השימוש עם 12.125 מים נטולי יונים ללא נוקלאז, 1.5 מ"ל של מלאי מאגר הדמיה 10x B ו-275 מיקרוליטר של 40x Imaging Buffer Stock A (מופשר או טרי)
    6. הכן עד 10 זוגות נוגדנים ראשוניים (נוגדני החלבון העיקריים מתוארים בטבלה 2) עבור seqIF על פי דילולים שנבדקו בטיטרציה במאגר רב-צביעה מסחרי בסך הכל 400 מיקרוליטר לשקופית בצינור מיקרוצנטריפוגה תואם מערכת. ודא שכל מחזור של seqIF מכיל רק נוגדן ראשוני אחד לכל מין מארח.
    7. הכן פלואורופורים משניים (טבלה 3) בתוספת DAPI בהתאם לשילובי נוגדנים ראשוניים בשלב 6.3.7 עבור seqIF על פי דילולים שנבדקו בטיטרציה. לדלל במאגר רב-מכתים בסך הכל 400 מיקרוליטר למחזור בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם נפח מת של 1 מ"ל לפחות. ריכוזים לדוגמה עבור נוגדנים משניים של Alexa Fluor ו-DAPI הם כדלקמן: דילול של 1:200 עבור Alexa Fluor 555, דילול של 1:400 עבור Alexa Fluor 647, דילול של 1:1800 עבור DAPI (מ-1 מ"ג/מ"ל DAPI ב-DMF)
      הערה: שלב זה רגיש לאור. התוספת של DAPI למשניים אינה בהתאם לפרוטוקול היצרן, מכיוון שהיא יכולה לסייע בשמירה על ביטוי DAPI לאורך מספר מחזורים של seqIF, מה שמסייע ביישור תמונות לאחר ההפעלה. רוב תוכנות עיבוד התמונה, כמו זו הכלולה במערכת זו, משתמשות באות DAPI כדי לאשר יישור של הדמיה מחזורית לקולוקליזציה פלואורסצנטית.
  4. אתחול מערכת
    1. טען כל אחד מהריאגנטים משלב 6.3 בסדר שצוין על ידי המערכת. שים לב שבדרך כלל ההזמנה תהיה כאמור לעיל, אך ודא תמיד שהריאגנטים תואמים למקום שבו הם נטענים
    2. טען את השקופית שאוחזרה מהאנטיגן לתוך המחזיק וודא שחלון הדמיית השקופיות מיושר במרכז חלל ההדמיה לפני הנחת שבב המיקרופלואידיקה התואם למערכת למעלה ונעל אותו במקומו.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בשבבי מיקרופלואידיקה לבדיקות טיטרציה של seqIF אם מנקים ומאוחסנים כראוי עד פעם נוספת אחת, כל עוד האטמים נשארים שלמים. לא ניתן לעשות שימוש חוזר בשבבי מיקרופלואידיקה אם מפעילים פאנל RNA עקב זיהום פוטנציאלי.
    3. הכן תמיסת חיתוך על ידי ערבוב של 1.35 מ"ל של 4x SSC ו-150 מ"ל של תמיסת חיתוך מסחרית 10x.
      הערה: תמיסת ה-10x מתחמצנת במהירות ומאוחסנת באמפולת זכוכית שיש לשבור רק מיד לפני השימוש בריצת ניסוי seqRNA-ISH+seqIF.

7. הפעלת מערכת

  1. הפעל את המערכת בהתאם להוראות היצרן, זמני ריצה משוערים לשתי שקופיות ב-12-plex seqRNA-ISH עם seqIF חלבון 20-plex הם 48 שעות עבור חלון הדמיה של 12.5 ס"מ על 12.5 ס"מ.
  2. לאחר השלמת ריצת seqRNA-ISH+seqIF, ניתן להסיר את השקופית ולאחסן אותה ב-1x PBS או להשתמש בה מיד ל-seqIF נוסף (עבור עד 40 חלבונים).
    הערה: חשוב לנקות ולשטוף את המיקרופלואידיקה של המערכת באמצעות מים נטולי נוקלאז לפני ואחרי כל ריצה כדי להפחית את פוטנציאל הזיהום.

8. אופציונלי: תמונה וניתוח סטטיסטי

  1. המשך בניתוח תמונות וסטטיסטיקה באמצעות כלי ניתוח תמונה או ניתוח פתולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדוגמה לשיטה זו, הרצנו את seqRNA-ISH (טבלה 1) + SeqIF (טבלה 2 וטבלה 3) על שתי שקופיות מקרצינומה של שחלות סרוזיות אנושיות בדרגה גבוהה.

איור 2 ממחיש את שכבת העל של seqRNA-ISH+seqIF על דגימה של רקמת גידול בשחלות. סמני חלבון מבניים כגון קולגן 1 משמשים לזיהוי אזורי גידול, בעוד שסמנים פנוטיפיים ותפקודיים כמו CD33, CD8 ו-Granzyme B (GZMB) עוזרים להבחין בין תאים חיסוניים ספציפיים החיוניים להבנת המיקרו-סביבה החיסונית של הג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלב הקריטי ביותר בהכנה וטיפול בדגימות הוא הורדת זיהום RNAse. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש במסכות למניעת זיהום מהנשימה ועל ידי ניגוב משטחי עבודה עם תמיסת טיהור RNase ו-70% אתנול העשוי ממים נטולי נוקלאז. עבור שקופיות FFPE, עדיף לחתוך שקופיות מרובות וסמוכות מגושי FFPE עבור seqRNA-ISH+seqIF ולאחסן אותן ב-4 מעלות צלזיוס עם חומר ייבוש. לבקרת איכות, בנוסף לבדיקת DV200 של גושי רקמות, מומלץ להריץ את שקופית הבקרה החיובית של RNA (UBC, PPIB, POLR2A) ושקופיות בקרה שליליות (DapB) על קטע רקמה סמוך. אחס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן בחלקו על ידי הברית לחקר סרטן השחלות (OCRA 811621 ו-891490), קרן Sie וקרן התרומות של סטפני סי סטלטר. מחקר זה בוצע בשיתוף פעולה עם מתקן הליבה לציטומטריה והדמיה תאית, הנתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק התמיכה במרכז הסרטן של מ.ד. אנדרסון P30 CA016672 ומומחה המחקר של NCI של ג'ארד בורקס 1 R50 CA243707-01A1.

ברצוננו להודות גם לאמילי מרטרסטק מלונאפור על הסיוע הטכני וההכשרה.

המחברים קיבלו סט של בדיקות ממוקדות ובקרה של RNAScope כחלק מתוכנית גישה מוקדמת מ-Bio-Techne במחיר מוזל, וחלק מהריאגנטים סופקו ללא תשלום לשימוש במחקר זה. ליצרן לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)תרמו פישר סיינטיפיק / InvitrogenEN62248 / 62248לצביעה גרעינית (המוצר ששימש במהלך מחקר זה, 62247 הופסק)
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים 50 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק339652משמש ל-aliquots & פתרונות משניים מעורבים
70% אלכוהול איזופרופנול סטריליטקסוויפTX3270לטיהור פני השטח
נוגדניםמגווןמגווןמשמש ליעדים עיקריים, משתנה בהתאם לערוץ בו נעשה שימוש
APOE - מנחה: עכבר, שיבוט: 960318מו"פ DMAB41443-100(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
aSMA - מארח: עכבר, שיבוט: 1A4CST69319SF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
מיקרוטום חיתוך אוטומטילייקה14051956472חתך רקמה
CD10 - מארח: ארנב, שיבוט: E5P7SCST65534S(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD11c - מארח: ארנב, שיבוט: D3V1ECSTברקוד 93233SF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD163 - מארח: ארנב, שיבוט: D6U1JCSTתצוגה 93498S(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD163 - מארח: ארנב, שיבוט: ja51-30InvitrogenMA5-32684(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD20 - מארח: עכבר, שיבוט: L26בתילA500-017ACF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD31 - מארח: עכבר, שיבוט: 3F8E2חלבון טקברקוד 66065-2-IG(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD33 - מארח: ארנב, שיבוט: BLR061GבתילA700-061CF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD4 - מנחה: ארנב, שיבוט: EPR6855אבקםאילן אלכסנדר(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD45 - מארח: ארנב, שיבוט: BL-178-12C7בתילA700-012(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD45RO - מארח: עכבר, שיבוט: UCHL1בתילA500-020ACF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD56 - מארח: ארנב, שיבוט: BLR152Jבתיל99746(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD66b - מארח: ארנב, שיבוט: BLR111HInvitrogenMA5-44413(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD68 - מארח: עכבר, שיבוט: KP-1ביולג'נד916104(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD8 - מארח: עכבר, שיבוט: C8/144Bביולג'נד372902(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
CD86 - מארח: ארנב, שיבוט: E2G8PCSTברקוד 76755SF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
Col 1A1 - מארח: עכבר, שיבוט: E3E1XCST66948 ש'(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
צינורות DNA LoBind 2 מ"לאפנדורף22431048משמש לפתרונות בדיקת RNA מעורבים
Drierite 21005 המציין חומר ייבושקול-פאלמר21005Desiccant for Desiccator
להבי מיקרוטום Edge-Riteתרמו פישר סיינטיפיק / Invitrogen4280 ליטרהיסטולוגיה - משמשת בעת חיתוך דוגמאות
אלכוהול אתילי 100% (200 הוכחה)פארמקו111000200לדפראפיניזציה
EZ-AR2 Elegance Bufferביוג'ניקסHK547-XAKמשמש לאחזור אנטיגן של קטעי רקמת FFPE
FOXP3 - מארח: ארנב, שיבוט: פוליקלונליבתילA700-034CF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
עיזים נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 555תרמו פישר סיינטיפיק / Invitrogenא-21425(הערה: ספציפית למחקר זה) F(ab')2-עזים נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor™ 555
עיזים נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 647תרמו פישר סיינטיפיק / InvitrogenA-48289/A-21237(הערה: ספציפית למחקר זה) F(ab')2-עזים נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor™ פלוס 647
עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 555תרמו פישר סיינטיפיק / Invitrogenא-21430(הערה: ספציפית למחקר זה) F(ab')2-עזים נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor™ 555
עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 647תרמו פישר סיינטיפיק / Invitrogenא-21246(הערה: ספציפית למחקר זה) F(ab')2-עזים נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor™ 647
GZMB - מארח: ארנב, שיבוט: פוליקלונליחלבון טק13588-1-AP(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
HS-POLR2A-T1ACD ביוטכנולוגיהברקוד 310457-T1בדיקה אנושית עם ביטוי נמוך
HS-PPIB-T5ACD ביוטכנולוגיהברקוד 313907-T5בקרת בדיקה אנושית באמצע הביטוי
HS-UBC-T9ACD ביוטכנולוגיהברקוד 310047-T9שליטה אנושית גבוהה בביטוי
תמיסת מי חמצן 30%סיגמא-אולדריץ'HX0640-5להכנת רקמות. מסייע בחסימת פעילות פרוקסידאז אנדוגנית ולהניב מוצרים צבעוניים במיוחד. להכנת תמיסת מי חמצן 3%
Ker8/18 - מארח: עכבר, שיבוט: פוליקלונליחלבון טקברקוד 66187-1-PBS(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
LRP5 - מארח: ארנב, שיבוט: HPA030505סיגמאHPA030505-100UL(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
Lunaphore 20x Multistaining Bufferביו-טכנולוגיהBU06משמש כמדלל ולשטיפות עבור COMET
שבב שביט Lunaphoreביו-טכנולוגיהMK03שבב MCIROFLUIDICS עבור מכשיר COMET
שביט לונפורביו-טכנולוגיהCM10-Sמסדר אוטומטי Seq-IF
ערכת חיץ Lunaphore Elutionביו-טכנולוגיהBU07-Lפתרון 1 & פתרון 2 לשלבי הפליטה של ה-COMET
ערכת מאגר הדמיה של Lunaphoreביו-טכנולוגיהב09מומס & ממס המשמש להדמיה במהלך ריצת COMET
חוצצי מרווה של Lunaphoreביו-טכנולוגיהBU08-Lפתרון 1 & פתרון 2 לשלבי המרווה של ה- COMET
מיקרופיפטהמגווןלא ישיםלהכנת ריאגנטים
Periostin - מארח: עכבר, שיבוט: 1A11A3חלבון טק66491-1-PBS(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
פירס 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנולתרמו פישר סיינטיפיק28908להכנת 3.7% PFA להכנת רקמות
320102 בדיקה (ערוץ T2)ACD ביוטכנולוגיה300040שליטה שלילית DapB ב-T2
320102 בדיקה (ערוץ T3)ACD ביוטכנולוגיה300040שליטה שלילית DapB ב-T3
320102 בדיקה (ערוץ T4)ACD ביוטכנולוגיה300040שליטה שלילית DapB ב-T4
פתרון מלאי חיתוך RNAscope HiPlexביו-טכנולוגיהמכפיל רווח 324399מגיב לדבקות במהלך בדיקת RNAScope
ערכת RNAscope HiPlex Pro עבור COMET 12-plex, ערכת 20 שקופיותביו-טכנולוגיה322075ריאגנטים & מאגרים עבור RNAScope
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-APOE-T2ACD ביוטכנולוגיהברקוד 433093-T2(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-APOE-T2
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-ARG1-T4ACD ביוטכנולוגיהברקוד 401581-T4(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-ARG1-T4
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-CD274-T1ACD ביוטכנולוגיה600863-T1(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-CD274-T1
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-CD40-T6ACD ביוטכנולוגיהברקוד 445973-T6(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-CD40-T6
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-CXCL1-01-T12ACD ביוטכנולוגיהברקוד 1256473-T12(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-CXCL1-01-T12
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-GZMB-T7ACD ביוטכנולוגיהברקוד 468453-T7(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-GZMB-T7
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-IFNG-T3ACD ביוטכנולוגיהברקוד 310503-T3(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-IFNG-T3
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-IL23A-T8ACD ביוטכנולוגיהברקוד 562853-T8(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-IL23A-T8
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-IL6-T9ACD ביוטכנולוגיהברקוד 400883-T9(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-IL6-T9
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-TNFa-T11ACD ביוטכנולוגיהברקוד 310423-T11(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-TNFa-T11
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-VEGFa-T5ACD ביוטכנולוגיהברקוד 423163-T5(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-VEGFa-T5
בדיקת RNAscope HiPlex- HS-VISTA-T10ACD ביוטכנולוגיהברקוד 491513-T10(הערה: ספציפית למחקר זה) גישה מוקדמת RNAscope™ בדיקה HiPlex CS- HS-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS בדיקה בקרה שליליתACD ביוטכנולוגיה324347לוח בקרה שלילי מלא של 12 plex המומלץ על ידי היצרן. DapB ב-T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS בדיקה בקרה חיובית-HsACD ביוטכנולוגיה324317לוח בקרה חיובי מלא של 12 plex Human המומלץ על ידי היצרן. Hs -RTU לגן משק הבית הבא בערוצים T1 עד T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
מים ללא RNAseקורנינג46-000-ס"מלניקוי והכנת כל הציוד, ולשימוש כמדלל בעת הצורך
פתרון טיהור RNaseZap RNaseתרמו פישר סיינטיפיקAM9782תמיסת טיהור פני השטח המשמידה RNases
ערכת RNeasy FFPEקיגן73504 & 19093למיצוי RNA & מדידת DV200
דואר שקופיותסימניטא סיינטיפיקM9504MAלאחסון שקופיות במאגר נוזלי.
עיצוב כירורגי סכין גילוח תעשייתי לשימוש כלליתרמו פישר סיינטיפיק / Invitrogen13-812-236היסטולוגיה - משמשת בעת חיתוך דוגמאות
TOX 1/2 - מארח: ארנב, שיבוט: E613QCST62886SF(הערה: ספציפית למחקר זה) חלבון ראשוני נוגדן
כיתה היסטולוגית של קסילןתרמו פישר סיינטיפיקUN1307לדפראפיניזציה

מקורות

  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים