מאמר שיטה

קרטוגרפיה מולקולרית דו-מודאלית: שילוב זיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון

DOI:

10.3791/68616

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה לזיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון בקטעי רקמה משובצים פרפין קבועים בפורמלין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לזהות חלבון ו-mRNA באותה בדיקה עוזרת לנו להבין כיצד התא מתכונן להגעה ואילו רמזים הוא מקבל בזמן שהוא נוסע ומקיים אינטראקציה בסביבה בה הוא נמצא. הדמיה גבוהה יותר מאפשרת כעת אפיון של mRNA (טרנסקריפטומיקה מרחבית) וחלבון (פרוטאומיקה מרחבית) בו זמנית. כדי למנוע יתירות, ניתן לנתח את האנליטים הללו בקטע רקמה יחיד. ישנן טכנולוגיות רבות המאפשרות חלבונים רבים ומעט mRNAs או להיפך, אך מכיוון שהאנליטים הפועלים המרכזיים הם חלבונים, כתב יד זה מתמקד בשילוב ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון (IMC) עם mRNA היברידיזציה באתרה (ISH) תוך שימוש בבדיקות מתכת. זה מאפשר לנו להבין אילו מסרים התא מוכן או שולח במהירות לעולם בזמן שהוא מתקשר במיקרו-סביבה שלו. הוא גם מתגבר על מגבלות הקשורות לזיהוי חלבונים מופרשים או סמנים מאתגרים שבדרך כלל קשה לכמת ולהמחיש באמצעות נוגדנים בלבד. פרוטוקול זה גם ממזער את הצורך בפיצויים או עיבוד לאחר הנראה בשיטות מבוססות פלואורסצנטיות גבוהות יותר, מכיוון שאין זליגה ספקטרלית פלואורסצנטית במערכת זיהוי מבוססת בדיקת מתכת, וגם אין שיקולי אוטופלואורסצנציה ספציפיים לרקמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן מציג גיוון מבני ותפקודי בחולים שונים. המיקרו-סביבה של הגידול (TME), המורכבת מתאים נורמליים וממאירים, היא הטרוגנית בקרב החולים. גרורות נובעות משאריות מהגידול הראשוני שבורחות לזרם הדם כאשכולות תאים ותאים בודדים, מה שמספק רמזים לגבי התקדמות המחלה ותגובה טיפולית 1,2. יש להבין את המורכבות של מיקרו-סביבות אלה1. למרות שגידולים כוללים סוגי תאים רבים, התקן הקליני מבוסס היסטולוגית על סמן יחיד, שמתחיל להשתנות 1,2. טכנולוגיות הדמיה מרובות העניקו כיוונים חדשים בפתולוגיה. פרוטאומיקה, גנומיקה, מטבולומיקה וליפידומיקה של סרטן אנושי אפשרייםכעת ברזולוציה של תא בודד 3,4,5,6 או קרוב אליה.

טכנולוגיות אלה יכולות לנתח את המיקומים התאיים ההטרוגניים ואת האינטראקציות בגידולים. שימוש במתודולוגיית ההדמיה הביולוגית המתאימה של תא בודד מאפשר יצירת פרופילים של סמנים ביולוגיים רבים של חלבונים הקשורים למחלה בביופסיות של מטופלים כדי ליידע את תכנון הטיפולים בסרטן. תובנות ממפות תאיות מרחביות יוכלו להנחות את הבחירה בטיפול משולב שיכול לחסל ביעילות סרטן עם הפחתת סטיות ממטרות, עמידות והישנות1. מדובר ביכולת לאחד את הטכנולוגיות הרבות והמגוונות הללו שבדרך כלל אינן פועלות בהרמוניה על אותו קטע של רקמה7. פרוטוקול זה, המתואר חזותית באיור 1, מציע את ההזדמנות לבחון מרחבית הן פרוטאומיקה והן תת-קבוצה ממוקדת של mRNAs באותו קטע רקמה ובאותו תא בו זמנית בפלקסיות גבוהה יותר ממה שאפשרי עם חלבון פלואורסצנטי בו זמנית + RNA-ISH8. זה יכול לשמש גם כגשר לניתוח מקביל 3,4,6, במטרה לפרק את ניתוח הנתונים. בעוד שקיים זיהוי כפול, ניתן גם לבחון תאים שהחלו במהירות בייצור mRNA, אך עבורם החלבון המופרש נותר בלתי ניתן לגילוי בשל הרגישות המוגבלת והיעדר הגברת האותות הטבועה בשיטות נוגדנים ראשוניות המסומנות ישירות, מה שהופך את איתור המולקולות המופרשות למאתגר במיוחד. הפרוטוקול הבא מותאם מזיהוי פלואורסצנטי/כרומוגני של 12 plex כדי להיות ישים לזיהוי מבוסס מתכת באמצעות בדיקות ששונו מופחתות תיול לזיהוי בו זמנית ב-IMC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) שנאספו מחולות שלא טופלו בעבר ועברו ניתוח ציטורדוקטיבי ראשוני לקרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה. כל הנתונים הקליניים התקבלו מהמאגר של המחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית ורפואת רבייה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טקסס. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים, והמחקרים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוכרות.

1. אמצעי זהירות והכנות

  1. השתמש תמיד במים נטולי נוקלאז (NFW) כדי להכין את כל הריאגנטים הדרושים.
  2. בצע את כל השלבים באמצעות מיכלי פלסטיק וללא שימוש בזכוכית כדי להפחית את קשירת המתכת לזיהום זכוכית ומתכת.
  3. שמור על אזור העבודה נקי מאוד ורסס משטחים ופיפטות עם תמיסת טיהור RNase, ואחריה 70% אתנול שהוכן עם NFW.
  4. להצמיד בדיקות זיהוי mRNA מצומדות (T1-T12) למתכות מתאימות באמצעות מקשר מלמיד כפי שתואר על ידי שולץ ואחרים7, המפורט בהרחבה ב-protocol.io בטבלת החומרים.
    הערה: יש לבחור מטרות חלבון כדי לציין את מיקום התא בתוך הרקמה (סמנים מבניים), לזהות אילו תאים קיימים (סמנים פנוטיפיים) ומה התאים עושים (סמנים פונקציונליים). מכיוון שחלק מהסמנים הפונקציונליים באים לידי ביטוי באופן חולף, הכללת מטרות mRNA מאפשרת זיהוי של תאים המייצרים מטרות אלה.

2. הכנת דגימה ועיבוד מקדים

  1. אופים חלקי טישו למשך הלילה בתנור יבש בחום של 60 מעלות צלזיוס.
  2. בצע דה-פרפיניזציה: שלושה סבבים של קסילן למשך 5 דקות בכל סיבוב, ו-10 סבבים של החזרת נוזלים (100% אתנול (EtOH) x2, 95% EtOH x2, 70% EtOH x2, 50% EtOH x2, 30% EtOH x2), למשך 3 דקות בכל סיבוב. יש לשטוף עם תמיסת מלח אחת (TBS) למשך 2 דקות, פעם אחת. בהתאם למספר הדגימות המעובדות בו זמנית, השתמש בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל (2 שקופיות מקסימום) או 350 מ"ל קלטות צביעה IHC (24 שקופיות מקסימום).
    הערה: שלב הסרת שעווה זה, למרות שהוא מומלץ, הוא אופציונלי ותלוי בסוג הרקמה.
  3. מרחו תמיסה של 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות על ידי דגירה של שקופיות הרקמה בצינור של 50 מ"ל עם מספיק תמיסת PFA כדי לכסות את קטע הרקמה.
  4. אחזור אנטיגן המושרה בחום (HEIR) באמצעות מיקרוגל: באמצעות מיקרוגל מנוטר טמפרטורה, מלאו מגש אחד במאגר אחזור אנטיגן pH 6 HEIR (350 מ"ל) ואת המגשים הנותרים ב-NFW. הנח חלקי רקמה במדף צביעה לשקופיות מיקרוסקופ והוסף אותם למגש עם מאגר אחזור אנטיגן.
    הערה: בעת ביצוע אחזור אנטיגן, ודא שמאגר אחזור האנטיגן נמצא בטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  5. בצע אחזור אנטיגן ב-107 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן תן לרקמות להתקרר ב-RT למשך 20 דקות במכסה מנוע כימי.
  6. במהלך אחזור האנטיגן, שטפו נייר לחות במים, הניחו אותו במגש צביעת שקופיות בקרת לחות והכניסו את המגש לתנור הכלאה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
  7. שטפו את השקופיות ב-TBS נטול RNase למשך 3 דקות, ולאחר מכן יבשו את השקופיות למשך 3 דקות.

3. טיפול בפרוטאז

  1. צייר מחסום הידרופובי סביב כל קטע רקמה בעזרת עט מחסום הידרופובי. הניחו למחסום להתייבש לחלוטין למשך כ-2 דקות.
  2. טען את המגלשות היבשות לתוך מחזיק ההחלקה של מגש הלחות על ידי פתיחת הנדנדה clamp.
  3. הוסף מספיק טיפות פרוטאז כדי לכסות לחלוטין את חלק הרקמות. הסר את מגש בקרת הלחות שחומם מראש (60 מעלות צלזיוס, שלב 2.6) מתנור ההיברידיזציה והכנס את מחזיק ההחלקה למגש בקרת הלחות. אטום מחדש את מגש בקרת הלחות והחזיר אותו לתנור ההכלאה. דגירה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. במהלך הדגירה הזו, הכינו חומרי בדיקת RNA-ISH.
    1. הכן 500 מ"ל של מאגר כביסה RNA-ISH 1x על ידי דילול מלאי 50x עם NFW. אחסן ב-RT עד חודש.
      הערה: אם מתרחשים משקעים במאגר הכביסה 50x, השהה מחדש על ידי חימום המאגר ל-40 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות לפני הכנת מאגר הכביסה 1x.
  5. הכן 1 ליטר של DTBS-T (0.5% Tween) ב-NFW על ידי הוספת 5 מ"ל של טווין ל-1 ליטר של DPBS-T.
  6. הכן בדיקות מטרה מזווגות RNA-ISH ZZ:
    1. מחממים מלאי בדיקת mRNA ומדלל RNA-ISH ב-40 מעלות צלזיוס בתנור יבש למשך 10 דקות. מערבל את הגשושיות וסובב אותן במיני צנטריפוגה על ספסל.
    2. הכן תערובת 1x (עד 12 בדיקות, טבלה 1) על ידי דילול בדיקות מלאי פי 50 בדילול RNA-ISH, וודא שיש מספיק נפח סופי כדי לכסות את כל קטע הרקמה.
    3. מערבולת היטב והשאיר את הבדיקות המעורבות ואת מדלל ה-RNA-ISH ב-RT עד לשימוש.
  7. הסר את מגש בקרת הלחות מתנור ההכלאה והסר את מחזיק השקופיות. מחזירים את המגש לתנור.
  8. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שוטפים את השקופיות ב-NFW בתסיסה קלה למשך 5 דקות.
  9. חזור על שלב הכביסה עם NFW טרי למשך 5 דקות.

4. הכלאה של בדיקות מטרה

  1. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות. הסר את מגש בקרת הלחות מהתנור והנח את מחזיק השקופיות לתוך המגש.
  2. הוסף מספיק מתערובת הבדיקה המתאימה כדי לכסות לחלוטין כל קטע רקמה. סוגרים את המגש ומכניסים לתנור למשך שעתיים בחום של 40 מעלות צלזיוס.
  3. הנח מגיב RNA-ISH Amplifier 1 (עצי זנב ZZ לזנבות T1 עד T4) לשיווי משקל ב-RT 30 דקות לפני סיום הדגירה, לשימוש בשלב 5.2.
  4. לאחר סיום הדגירה, הסר את מגש בקרת הלחות מתנור ההכלאה והסר את מחזיק השקופיות. מחזירים את המגש לתנור.
  5. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1x עם תסיסה קלה למשך 2 דקות.
  6. חזור על שלב הכביסה עם מאגר כביסה טרי 1x למשך 2 דקות ב-RT.

5. הכלאה של מגבר RNA-ISH 1

  1. הסר עודפי נוזלים מהמגלשות והנח את השקופיות במחזיק השקופיות של מגש הלחות. הכנס את מחזיק ההחלקה למגש בקרת הלחות.
  2. מערבולת RNA-ISH Amplifier 1 והוסף אותו כדי לכסות לחלוטין כל חלק. סוגרים את המגש ומכניסים לתנור ההיברידיזציה למשך 30 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס. הנח מגיב RNA-ISH Amplifier 2 (עצי זנב ZZ לזנבות T5 עד T8) ב-RT, לשימוש בשלב 6.2.
  3. הסר את מגש בקרת הלחות מתנור ההכלאה והסר את מחזיק השקופיות. מחזירים את המגש לתנור.
  4. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1x עם תסיסה קלה למשך 2 דקות.
  5. חזור על שלב הכביסה עם מאגר כביסה טרי 1x למשך 2 דקות ב-RT.

6. היברידיזציה של מגבר RNA-ISH 2

  1. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות. הסר את מגש בקרת הלחות מהתנור והנח את מחזיק השקופיות לתוך המגש
  2. מערבולת RNA-ISH Ampliifier 2 והוסף אותו כדי לכסות כל חלק. סוגרים את המגש ומכניסים לתנור ההיברידיזציה למשך 30 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס.
  3. הנח מגיב RNA-ISH Amplifier 3 (עצי זנב ZZ לזנבות T9 עד T 12) ב-RT, לשימוש בשלב 7.2. הסר את מחזיק השקופיות מהמגש. מחזירים את המגש לתנור.
  4. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1x עם תסיסה קלה למשך 2 דקות.
  5. חזור על שלב הכביסה עם מאגר כביסה טרי 1x למשך 2 דקות ב-RT.

7. הכלאה של מגבר RNA-ISH 3

  1. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות. הסר את מגש בקרת הלחות מהתנור והנח את מחזיק השקופיות לתוך המגש
  2. מערבולת RNA-ISH Amplifier 3 והוסף אותו כדי לכסות לחלוטין כל חלק. סוגרים את המגש ומכניסים לתנור ההיברידיזציה למשך 30 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס.
  3. במהלך הדגירה, הכינו את תערובת האוליגו המתכתית לשלב 8. כל אוליגו משמש בריכוז של 1:15 (ממלאי 10uM, תוך הקפדה על נפח סופי מספיק כדי לכסות את כל קטע הרקמה). מערבולת היטב ומשאירים את אוליגוס המתכת המעורבת ב- RT עד לשימוש. הוצא את מגש בקרת הלחות מהתנור ולאחר מכן הסר את מחזיק השקופיות מהמגש. לאחר מכן, מחזירים את המגש לתנור
  4. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1x עם תסיסה קלה למשך 2 דקות.
  5. חזור על שלב הכביסה עם מאגר כביסה טרי 1x למשך 2 דקות ב-RT.

8. הכלאה של אוליגוס מתכת

  1. הסר עודפי נוזלים מהשקופיות. הסר את מגש בקרת הלחות מהתנור והנח את מחזיק השקופיות לתוך המגש. הוסף אוליגוס מתכת מעורבים שהוכנו בשלב 7.3 (מערבולת לפני השימוש).
  2. סוגרים את המגש ומכניסים לתנור ההיברידיזציה למשך 45 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס.
  3. הסר את מגש בקרת הלחות מתנור ההכלאה והסר את מחזיק השקופיות. מחזירים את המגש לתנור.
  4. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר כביסה 1x עם תסיסה קלה למשך 2 דקות.
  5. חזור על שלב הכביסה עם מאגר כביסה טרי 1x למשך 2 דקות ב-RT.

9. נוגדנים מצומדים ממתכת

  1. כדי לחסום אתרים לא ספציפיים, יש למרוח מספיק נפח של מאגר חוסם כדי לכסות את כל קטע הרקמה ולדגור למשך 30 דקות ב-RT.
  2. במהלך הדגירה, הכינו את תערובת הנוגדנים לשימוש בשלב 10.1 על ידי דילול הנוגדנים (טבלה 1) במאגר מדלל נוגדנים.

10. דגירה עם נוגדנים מצומדים ממתכת

  1. לאחר חסימת הדגירה של המאגר, השליכו את המאגר החוסם משקופיות הרקמה והוציאו מספיק נפח של תערובת ה-Ab (משלב 9.2) כדי לכסות את כל קטע הרקמה.
  2. הנח את המגלשה בתא לחות ודגר למשך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

11. צביעת DNA

  1. הכן תמיסת Ir-Intercalator טרייה.
    1. מתמיסת מלאי של 500 מיקרומטר, הכינו פתרון עבודה של 1:2000 ב-TBS נטול RNase. ניתן להצטט פתרון עבודה ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (אין להקפיא-להפשיר).
  2. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר TBS-T עם תסיסה קלה למשך 5 דקות.
  3. חזור על הכביסה ב-TBS-T.
  4. שקופיות כתמים עם תמיסת עבודה Ir (משלב 11.1.1) למשך 5 דקות ב-RT.
  5. הנח את השקופיות לתוך מחזיק שקופיות שקוף שטוף מראש עם NFW. שטפו את השקופיות במאגר TBS-T עם תסיסה קלה למשך 5 דקות.
  6. חזור על הכביסה ב-TBS-T.
  7. שוטפים פעמיים בקצפות, 5 דקות (מערבבים לאט).
  8. טבלו את השקופית במהירות ב-ddH2O כדי למנוע התגבשות של המלחים הקיימים ב-TBS על הרקמה.
  9. יבש את השקופית מתחת למכסה מנוע כימי (10 דקות) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לרכישת התמונה.

12. רכישת תמונות

  1. טען את השקופית לתוך תא האבלציה של IMC.
  2. צלם תמונת פנורמה כדי לזהות את אזור העניין (ROI).
  3. מפה את ההחזר על ההשקעה בתוכנת רכישת התמונות.
  4. החל את תבנית הרכישה.
  5. התאם את עוצמת הלייזר (אנרגיית אבלציה) על סמך סוג המדגם. ברירת המחדל מוגדרת ל-0 dB.
    הערה: מומלץ לבדוק את אנרגיית האבלציה עם מספר אזורי רקמה קטנים (30 מיקרומטר x 30 מיקרומטר), ולהגדיל את ההספק ב-1 dB בכל פעם. בחר את אנרגיית האבלציה הנמוכה ביותר שמנקה את הדגימה מבלי להישרף לתוך השקופית. בדרך כלל, זה מביא לעוצמת לייזר של 3-4 dB. לעיתים, אם הרקמה עבה יותר מהמומלץ, עוצמת הלייזר תגדל ל-5 dB.
  6. התחל אבלציה בלייזר. המערכת מכוונת את הלייזר אל ה-ROI ומבטלת את החלבונים המתויגים במתכת, ויוצרת פלומות אירוסול המועברות ללפיד הפלזמה המצומד אינדוקטיבי (ICP), שם הפלומה מתאדה, אטומה ומיוננת בפלזמה.
  7. מדוד את הכמות של כל איזוטופ שנמדד על ידי הגלאי ומומר לנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לזהות חלבון ו-mRNA באותה בדיקה עוזרת לנו להבין כיצד התא מתכונן להגעה, אך גם אילו תורים הוא מקבל בזמן שהוא נוסע ומתקשר עם סביבתו. כפי שניתן לראות בנתונים המייצגים, זיהוי mRNA וחלבונים הם מרכיבים קריטיים במחקר ביולוגיה מרחבית, שכן גבולות הזיהוי התחתונים יכולים להיות מאתגרים למדי בהתבסס על אופן התקדמות שלבי התיוג, הגלאי ו/או ההדמיה. רק הכללת פרוטאזות יכולה לסבך סמנים קריטיים בפרוטוקולים משולבים, כך שהיתירות מבהירה כמו גם מאמתת.

פרוטוקול זה מציג בדיקה המורכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מולטיפלקס מולטי-אומיקס הוא התפתחות קריטית בנתונים שנאספו, המכוונת לאינטראקציות בין תא לתא ותא לשכונה המשפיעות על התקדמות המחלה והטיפול בה. ניתוח נתונים אלה באותה דגימה ולכן באותו תא הוא קריטי, מכיוון שמטרות חלבון רבות מתבטאות באופן חולף, או שונות ברמת ה-mRNA וביטוי החלבון, ובכך מביא זיהוי mRNA ממוקד בשילוב עם חלבון מאפשר התאמה של מטרות קשות לזיהוי או ביטוי דיפרנציאלי21. ההתקדמות האחרונה בשילוב טכנולוגיות RNA-ISH עם IMC הובילה לשילוב של מולטי-אומיקס על אותה שקופית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ארד ק. בורקס הוא יועץ ל-Standard BioTools.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה בוצע בשיתוף פעולה עם מתקן הליבה לזרימה ציטומטריה והדמיה תאית, הנתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק התמיכה במרכז הסרטן של M. D. Anderson P30 CA016672. מחקר זה נתמך בחלקו גם על ידי פרס פיתוח מענק התמיכה של מרכז הסרטן של MD Anderson, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. מאמצי JKB נתמכו בחלקו על ידי CA016672 P30 ומומחה המחקר של ה-NCI 1 R50 CA243707-01A1. מאמץ SFB נתמך בחלקו על ידי הברית לחקר סרטן השחלות (OCRA 811621 ו-891490), קרן טינה ברוזמן לחקר סרטן השחלות, תוכנית המחקר ההתפתחותי של סרטן השחלות MDACC, NIH 1R01CA261952-01A1. מאמצי SFB, JKB ו-BG נתמכו בחלקם על ידי מענק 1U01CA294459-01. המחברים מבקשים להודות לסמואל מוק, שחתך וסיפק את הדגימות שבהן נעשה שימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2קונוגציה של אוליגונוקלאוטידים-פולימר לצייטומטריית מסה בהדמיה V.2 
10 TBS ללא RNAseתרמו פישר סיינטיפיק J62780. K7לשטיפות לסירוגין בין שלבים
מערכת היברידיזציה ACD HybEZ IIACD Biotechne321711תנור לשקופיות טישו אפייה
מדלל נוגדניםדאקוS0809 בופר מדלל נוגדנים
נוגדן: B7-H3בתילA700-025CF, A700-026CFשיבוט: BLR025F, BLR026F
נוגדן: B7-H4תרמו פישר סיינטיפיק 14-5949-82שיבוט: H74
נוגדן: BRD4(6F11)בתילA700-005CFשיבוט: BL-151-6F11
נוגדן: CCR6R& DMAB195-100שיבוט: 53103
נוגדן: CD11bאבקאם AB209970שיבוט: EPR1344
נוגדן: CD25אבקאם AB215378שיבוט: EPR6452
נוגדן: CD278/ICOSCST 89601BFשיבוט: D1K2T
נוגדן: CD31אבקאם AB207090שיבוט: EPR3094
נוגדן: CD33אבקאם AB238784שיבוט: SP266
נוגדן: CD3e CST85061BFשיבוט: D7A6E
נוגדן: CD4אבקאםab181724שיבוט: EPR6855
נוגדן: CD44תרמו פישר סיינטיפיק MA1-10225שיבוט: IM7
נוגדן: CD45תרמו פישר סיינטיפיק 14-9457-82העתק: CD45-2B11
נוגדן: CD8aCST 85336BFשיבוט: D8A8Y
נוגדן: CXCL13R& DAF801שיבוט: פוליקלונלי
נוגדן: CXCR5R& DMAB190-100שיבוט: CXCR5
נוגדן: גמא-H2AXבתילA700-053CFשיבוט: BLR053F
נוגדן: גרנזים Bסנטה קרוזSC-8022 Xשיבוט: 2C5
נוגדן: KAP1בתילA700-014CFשיבוט: BL-248-2G6
נוגדן: Ki67בתילA700-021CFשיבוט: BLR021E
נוגדן: LCK CST2984BFשיבוט: D88
נוגדן: MFAP5לא זמיןלא זמיןPMID: 31332047 / שיבוט: 130A  (הערה: מעוצב בהתאמה אישית) 
נוגדן: SMACST56856BFשיבוט: 1A4
נוגדן: VEGFSTB-Fluidigm3163028Dשיבוט: G153-494
נוגדן: VISTACST64953BFשיבוט: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKבופר שחזור אנטיגנים
אלכוהול אתיל 100% (200 proof)פארמקו111000200לצורך דה-פרפיניזציה
EZ & ndash; רטריבר IRBioGeneXMW016-IRמערכת שאיבת אנטיגנים לחתכי רקמת FFPE
מערכת היברידיזציה HybEZ IIACD Biotechne321710המערכת כוללת: תנור HybEZ (PN 321710/321720), מגש בקרת לחות (PN 310012), ונייר לחות HybEZ (2 דפי PN 310025), מגש כביסה EZ-Batch (PN 321717), מחזיק מחסנית EZ-Batch (PN 321716)
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen VectorLabsH-4000עט מחסום הידרופובי
פתרון אינטרקלטור אינפרא אדוםתרמו פישר סיינטיפיק NC1038184משמש לזיהוי תאים גרעיניים
קרטין 18/8CST 4546BFשיבוט: C51
אוליגוס מתכתמגווןמגווןתג מתכת נע בין T1 ל-T12 בהתאם למה שנדרש
מים ללא נוקלאז (NFW)קורנינג 46-000-CM לנקות ולהכין את כל הציוד, ולהשתמש בו כמדלל בעת הצורך
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 משמש לחדירת ממברנות תאים של דגימות
מחזיק סלייד RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017תוכנן לעיבוד ידני של עד 20 שקופיות ביעילות
ערכת RNAscope HiPlex12 Reagents v2 ACD Biotechne324409חומרים ל-RNAScope
RNAscope HiPlex Probe - גשושי מטרהACD Biotechneמגווןטווח בין T1 ל-T12 תלוי במה שנדרש
תמיסת ניקוי זיהום RNaseZap RNaseתרמו פישר סיינטיפיקAM9782תמיסה לניקוי זיהום פני השטח שמחסלת RNאז'ים
מחזיק סלסל עם מיקרוסקופ עם מתקן צביעה, פלסטיק עמיד לכימיקלים 24 מקומותמדעי אופטימלי3028לצביעת מספר שקופיות
גיל 20תרמו פישר סיינטיפיק AAJ20605APלשטיפות לסירוגין בין שלבים
בלוק חלבון אולטרוויז'ןתרמו פישר סיינטיפיק TA125PBQמאגר חסימה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Situ HybridizationT CD8

מאמרים קשורים