הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

744 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

7 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

תקציר

כאשר משתמשים בשיטות זיהוי הדמיה מסורתיות מבוססות בדיקה (ISH), קשה ללכוד מיקרו-RNAs (miRNAs) בשל גודלם, שנע בין 19 ל-25 נוקלאוטידים. עם זאת, מכיוון ש-miRNAs הם מווסתים אפיגנטיים מרכזיים התורמים לפיזיולוגיה תקינה ולמצבים פתולוגיים רבים, הבנת ההתנהגות המרחבית-זמנית של miRNAs חשובה כדי לחשוף את תפקודם ברמה התאית והתת-תאית. זה יוצר צורך ברור בטכניקות זיהוי והדמיה נאותות. לכן, יצרנו הגברה וזיהוי של MicroRNA באמצעות Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN (MARLIN), שפותח ומותאם באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה, ובדיקות חומצת גרעין נעולה (LNA) הממוקדות ל-miRNA. שיטה זו יכולה לכמת miRNA עם ביטוי חלבון מרובה, המאפשר כימות של miRNA תוך-תאי וחוץ-תאי בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) עם רגישות ושחזור גבוהים. השימוש המשולב בזיהוי miRNA ומבחני לכידת חלבון יכול גם לספק הבנה מקיפה של תפקודי התאים ומנגנוני הבקרה בתוך אותו TME.

מבוא

מיקרו-רנ"א
למרות שמיקרו-רנ"א (miRNA) הם קטנים להפליא, באורך של 19-25 נוקלאוטידים, מולקולות ה-RNA החד-גדיליות הללו הן מווסתות חזקות בביטוי גנים, ומווסתות RNA שליח (mRNA) לאחר שעתוק באמצעות אינטראקציות ספציפיות לרצף1. בעיקרו של דבר, miRNAs פועלים כמווסתים שליליים על ידי קשירה ל-mRNA מטרה, או מונעים את התרגום שלהם או מקדמים את פירוקם באמצעות מחשוף mRNA, בהתאם למידת המשלימות, מה שמוביל בסופו של דבר לירידה בתפוקת החלבון מהגן הממוקד. בעוד ש-miRNAs הם בעצם RNA לא מקודד, כ-40% מכלל ה-miRNAs עדיין נמצאים בתוך אינטרונים או אקסונים של גנים מקודדי חלבון2. המטרה התפקודית של miRNAs כוללת מספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים כגון התפשטות תאים, אנגיוגנזה, אפופטוזיס וכו'. יש לציין כי חוסר הוויסות של miRNAs היה מעורב בגידול, שכן ביטוי חריג של miRNAs ספציפיים וויסות גנים בתיווך miRNA נקשר לטרנספורמציה אונקוגנית במספר סוגי סרטן3.

מאז גילויים, miRNAs נחקרו בהרחבה במחלות שונות בשל הביטוי הספציפי לרקמה ותפקודי הוויסות שלהם, כאשר חוסר הוויסות שלהם קשור למחלות רבות, כולל הפרעות ניווניות, הפרעות אוטואימוניות וסוגי סרטן שונים 4,5,6. ניתן לתאם את דפוסי הביטוי של miRNAs עם סוג הסרטן, שלב ומשתנים קליניים, מה שהופך את פרופיל ה-miRNA לכלי רב ערך לאבחון סרטן ופרוגנוזה 4,5,6,7. הגילוי של miRNAs חדשים הואץ גם על ידי התקדמות בטכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה, מה ששיפר את ההבנה של מעורבות miRNA בתהליכים ביולוגיים מגוונים8. חשיבותם של miRNAs הודגשה על ידי פרס נובל לרפואה לשנת 2024 שהוענק לויקטור אמברוס וגארי רובקון על גילוי הפונקציה של miRNA בוויסות פוסט-שעתוק9.

כסמנים ביולוגיים חשובים לאבחון מחלות ופרוגנוזה, נחקר הפוטנציאל הטיפולי של miRNAs, מה שהוביל לפיתוח תרופות ממוקדות miRNA. הפוטנציאל הטיפולי של miRNAs בטיפול בסרטן טמון ביכולתם לווסת באופן מתואם מודולים של גנים, מה שעשוי לשחזר תפקודים תאיים תקינים10. בעבר, טיפולים אנטי-סרטניים מבוססי miRNA פותחו כמונותרפיה או בשילוב עם טיפולים ממוקדים קיימים כדי לשפר את תגובות הטיפול ולהגדיל את שיעורי הריפוי11. הספקטרום הדינמי של miRNAs מיצב אותם כמשאבים חיוניים לאסטרטגיות חדשניות לטיפול בסרטן. בהקשר של עמידות טיפולית, התמקדות ב-miRNAs הראתה הבטחה בהפחתת הישנות ועמידות לטיפולים מסורתיים בסרטן, מה שעשוי לשפר את הישרדות המטופלים על ידי התמקדות בתאי סרטן12. על ידי חקירת התפקידים של miRNAs בוויסות הפעילות של סוגי תאים שונים במיקרו-סביבת הגידול (TME), ניתן לגלות טיפולים ייחודיים ורלוונטיים לסרטן מבחינה קלינית.

בדיקות זמינות לאיתור miRNAs
נכון לעכשיו, השיטה הנפוצה ביותר למדידת miRNA מסתמכת על RNA שחולץ עבור PCR כמותי בזמן אמת (q-RT-PCR) או ריצוף הדור הבא (NGS), תוך איבוד הקשר מרחבי. ישנן חברות שיספקו מבחני מיקרו-RNA של TaqMan, המשתמשים בפריימרים ספציפיים ללולאת גזע לסינתזה של cDNA, וכימיה מבוססת צבע ירוק SYBR עם סינתזת cDNA אוניברסלית. בדיקות אלו יכולות להציע רגישות וספציפיות גבוהות וניתן להריץ אותן במגוון מכשירי q-RT-PCR. למרבה הצער, מבחני TaqMan אינם יכולים לספק כימות מוחלט, מה שעלול להוביל לבעיות כגון תוצאות חיוביות כוזבות ושונות בתוצאות13. כמו כן, למרות הרגישות הגבוהה שלהם, היישום של בדיקות אלו בסוגי דגימות שונים יכול להיות מוגבל על ידי הצורך בהכנת דגימה נרחבת והפרעות פוטנציאליות מרכיבים אחרים בדגימה.

ריצוף הדור הבא (NGS): miRNA-seq פופולרי יותר ויותר לניתוח ביטוי דיפרנציאלי על פני כל ה-miRNome של נוזלים ביולוגיים. היתרון של טכנולוגיות NGS כמו miRNA-seq הוא שהן מאפשרות ניתוחים מקבילים מסיביים של ביטוי הגנום של miRNAs, מה שמאפשר כימות של miRNAs בודדים, זיהוי וריאציות רצף וגילוי miRNAs חדשים14. חיסרון משמעותי בשיטות מבוססות ריצוף, כגון ערכת הכנת דגימות RNA קטנות של IlluminaTruSeq, הוא השראת הטיות כמותיות, המשפיעות על הדיוק של ניתוחי ביטוי דיפרנציאלי, בעיקר בשל ההומולוגיה ואורכי הקריאה הקטנים יותר של miRNAs14. לא רק זה, אלא שנוכחותם של isomiRs (וריאנטים השונים ברצף או באורך מרצף ה-miRNA הקנוני) וחפצים טכניים יכולים לסבך את פירוש הנתונים, מה שעלול להוביל לגילויים שגויים ולגורמים מבלבלים במבחני סמנים ביולוגיים14. כמו כן, כלים שונים לניתוח נתוני miRNA-seq, כגון sRNAbench ו-miRDeep2, יכולים להניב תוצאות משתנות, המשפיעות על העקביות והאמינות של גילוי miRNA חדש15,16. אפילו משהו כמו טכנולוגיית מיקרו-מערך יכול להיות לא מספיק ברוב המקרים. למרות שהיא יכולה לספק פלטפורמה רבת עוצמה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי רמות miRNA או ביטוי גנים, מה שהופך אותה למתאימה למחקרים ברחבי הגנום, הטכנולוגיה עדיין מוגבלת על ידי מספר ה-miRNAs שזוהו בעבר ואינה יכולה לאמת ישירות אינטראקציות miRNA-מטרה, מה שמגביל את התועלת שלהן במחקרים פונקציונליים17.

הגורם החשוב ביותר שניתן להדגיש כאן כאשר משווים בין כל האפשרויות הזמינות הללו הוא היעדר הקשר מרחבי. הם אינם מספקים שום הקשר ביחס למורפולוגיה של הרקמה או להתפלגות המרחבית-זמנית בתוך התאים. הדמיית ההתנהגות המרחבית-זמנית של miRNAs נחוצה כדי לחשוף את תפקודם ברמה התאית והתת-תאית. נכון לעכשיו, מבחני miRNAscope in situ Hybridization (ISH) נגישים, בדרך כלל תוך שימוש בשיטות זיהוי כרומוגניות. בעוד שבדיקות אלו מאפשרות הדמיה של miRNA ברזולוציה של תא בודד, התוצאות חסרות איכות, מה שמקשה על ההבחנה בין ביטוי ה-miRNA לרקע הדגימה. בדרך כלל, רבים מהם מייצרים בדיקות באיכות נמוכה, שאינן אמינות ובדרך כלל דורשות כימות ידני.

לכן, פיתחנו הגברה וזיהוי של MicroRNA באמצעות חומצת גרעין נעולה במקום hybridizatioN (MARLIN) באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית מרובה (על ידי צביעת חלבון אופל) ובדיקות חומצת גרעין נעולה (LNA) הממוקדות ל-miRNA, בתוך רקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין (FFPE). השגנו זאת על ידי הטמעת מערכת הגברת אותות טירמיד (TSA) המופעלת על ידי נוגדן מצומד נגד דיגוקסיגנין (DIG) חזרת פרוקסידאז (HRP). ה-HRP פועל כזרז ל-TSA, בעוד שה-Anti-DIG מתחבר לבדיקה LNA. בדיקה זו שימושית במיוחד בהבנת האופי החיוני של miRs בשינוי פוסט-טרנסקריפטומי עם חלבונים, ואולי RNA אחרים בו זמנית. יתר על כן, בשל היעדר בדיקה זמינה מסחרית שיכולה לכמת הן את ביטוי ה-miRNA והן את ביטוי החלבון, MARLIN מספקת דרך יעילה להבין את היחסים באתרם של miRs וחלבונים בתוך דגימות FFPE.

התוצאות הראשוניות מכימות miR-181c-3p באמצעות MARLIN הדגימו את ההיתכנות של ניתוח מקביל של miRNAs וחלבונים בהקשר המרחבי המקורי של רקמת FFPE בשחלות אנושיות. מעבר לדוגמא זו, בהתבסס על מרכיבי MARLIN, ניתן תיאורטית להרחיב לעד ארבעה חלבונים תוך שימוש בפלואורופורים פלואורסצנטיים מסחריים כמו Alexa Fluor, או צבעי מולקולות קטנות אחרות18.

בנוסף, מכיוון שמתודולוגיה זו משתמשת בווריאציות על שיטות היסטולוגיה סטנדרטיות, היא צריכה להיות תואמת לרקמות FFPE אחרות של יונקים, בהינתן בדיקת בדיקה ובחירת נוגדנים מתאימה. מתודולוגיה זו משמרת ארכיטקטורה מרחבית ומאפשרת כימות של miRNA ותת-תאי וקולוקליזציה של חלבונים. גישה זו מטפלת בפער קריטי בביולוגיה מרחבית על ידי מיפוי דפוסי ביטוי משותף של miRNAs-חלבון והתפלגות מרחבית, שניתן להקשר ישירות בתוך ארכיטקטורות רקמות מקומיות. כאן אנו מציגים ל-MARLIN סקירה גרפית מפורטת באיור 1. בעוד שהפרוטוקול המוצג מותאם ל-miR-181c-3p, ניתן לחקור miRs אחרים, בהינתן תכנון בדיקה מתאים. פרמטרים קריטיים לשיטה זו כוללים: הערכת איכות הרקמה ואופטימיזציה של ריכוזי הבדיקה. מומלץ להעריך את תקינות ה-RNA של בלוק הרקמה באמצעות מדד DV200 על ידי שימוש בשני חתכים של 10 מיקרומטר וחילוץ ה-RNA באמצעות פרוטוקול המשמר את כל גדלי שברי ה-RNA. דגימות עם ציון DV200 גדול מ-50 ומעלה, וריכוזי פרוטוקול, צריכות להיבדק באופן שיטתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה משתמש ברקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין (FFPE) של מקטעי רקמת גידול שחלות אנושיות מחולות עם HGSC. דגימות אלו נאספו מחולות שלא טופלו בעבר ועברו ניתוח ציטורדוקטיבי ראשוני לסרטן השחלות. כל הדגימות והנתונים הקליניים התקבלו ממאגר סרטן השחלות של המחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית ורפואת רבייה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טקסס. הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים התקבלה על ידי צוות דלפק הקבלה, והמחקרים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוכרות.

1. הכנת רקמות

  1. אופים את כל דגימות ה-FFPE למשך הלילה ב-60 מעלות צלזיוס ומנקים כל ציוד וכלים במים נטולי RNAse. ודא שהחלקים בעובי של כ-5 מיקרומטר.
    הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לגידולי שחלות, אך ניתן להשתמש בו עם סוגי רקמות אחרים לאחר בדיקות נוספות.
  2. בצע דה-פרפיניזציה עם שלושה סבבים של קסילן למשך 5 דקות בכל סיבוב, ו-10 סבבים של החזרת נוזלים למשך 3 דקות בכל סיבוב (100% אתנול (EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x). יש לשטוף עם תמיסת מלח אחת (TBS) למשך 2 דקות, פעם אחת.
    הערה: שלב הסרת שעווה זה, למרות שהוא מומלץ, הוא אופציונלי ותלוי בסוג הרקמה.
  3. לאחר דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים, יש למרוח תמיסה של 3% מי חמצן (H2O2) למשך 10 דקות. שוטפים במשך 2 דקות עם 1x כף, 2x. לאחר מכן, יש למרוח תמיסה של 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות. שוטפים במשך 2 דקות עם 1x כף, 2x.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ויש לשקול אותו רק עבור רקמות שומן, או דגימות המועדות לניתוק.
  4. המשך לסבב הראשון של אחזור אנטיגן. פרוטוקול זה משתמש במערכת ה-IR EZ-Retriever. בהתאם להוראות המערכת, מיקרוגל את הדגימות כשהן שקועות במאגר EZ-AR1 טרי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מניחים להתקרר למשך 20 דקות.
  5. שוטפים במשך 2 דקות עם 1x כף. לאחר מכן למשך 2 דקות עם 1x TBS-T (1x TBS עם 0.1% Tween), 2x.

2. יישום חלבון

  1. צייר מחסום סביב כל קטע רקמה בעזרת עט מחסום הידרופובי.
  2. הוסף תמיסת חסימת נוגדנים 1x (מספיק כדי לכסות את כל שטח הרקמה) ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לחות (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת).
  3. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן הראשוני הראשון באותה תמיסת חסימה, למרוח מספיק כדי לכסות את כל שטח הרקמה ולהשאיר לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לחות.
    הערה: במהלך פיתוח פרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-Anti-CD8 בדילול של 1:75.
  4. יש לשטוף במשך 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x. לאחר מכן, הוסף את Anti-Ms + Rb HRP והשאיר את הדגימות לדגור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא לחות (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת).
  5. יש לשטוף במשך 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x. יש לדלל את הפלואורופור הראשון עם מדלל ההגברה בשעה 1:100 ולדגור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות.
    הערה: במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, נעשה שימוש בפלואורופור פליטה של 690 ננומטר. מנקודה זו, מומלץ להשתמש בתאורה מינימלית להמשך ההליך לאחר מריחת הסיבוב הראשון של פלואורופור.
  6. יש לשטוף במשך 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x. התחל את הסבב השני של צביעת נוגדנים עם הסבב השני של שליפת אנטיגן במיקרוגל, על ידי טבילה נוספת של הדגימות במאגר EZ-AR1 טרי ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן קירור למשך 20 דקות.
  7. שוטפים במשך 2 דקות עם 1x כף. לאחר מכן יש לשטוף במשך 2 דקות עם 1x TBS-T, 2x.
  8. יש למרוח שוב את תמיסת חסימת הנוגדנים 1x למשך 30 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת).
  9. יש לדלל את הנוגדן הראשוני השני באותה תמיסת חסימה, למרוח מספיק כדי לכסות את כל שטח הרקמה, ולהשאיר לדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לחות למשך 16 שעות לפחות.
    הערה: במהלך פיתוח פרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-Anti-EpCAM בדילול של 1:200.
  10. התחל למחרת בשטיפה של 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x. לאחר מכן הוסף את Anti-Ms + Rb HRP והשאיר את הדגימות לדגור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא לחות (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת).
  11. יש לשטוף במשך 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x. יש לדלל את הפלואורופור השני עם מדלל ההגברה בשעה 1:100 ולדגור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות.
    הערה: במהלך פיתוח פרוטוקול זה, נעשה שימוש בפלואורופור פליטה של 620 ננומטר.

3. יישום בדיקה

  1. יש לשטוף במשך 2 דקות ב-1x TBS-T, 3x.
  2. התחל את אחזור האנטיגן השלישי והאחרון עם EZ-AR1 Elegance במיקרוגל בטמפרטורה של 107 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מניחים להתקרר למשך 20 דקות. שוטפים במשך 3 דקות בכף אחת.
  3. מרחו RNAscope Protease Plus (מספיק כדי לכסות את כל אזור הרקמה) ושמרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השתמש בתנור. שוטפים במשך 5 דקות ב-1x כף, 2x.
  4. בצע הכנת בדיקה על ידי דנטורציה ב-90 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות של בדיקת ה-miRNA LNA. לאחר מכן יש לדלל מיד את הגשושית באמצעות מאגר miRNA-ISH. מערבולת וסובב את תמיסת הבדיקה.
    הערה: במהלך פיתוח פרוטוקול זה נעשה שימוש בבדיקת מטרה miR-181c-3p בדילול של 1:250.
  5. מרחו בדיקה (מספיק כדי לכסות את כל שטח הרקמה) והחזירו לתנור למשך שעה בחום של 60 מעלות צלזיוס. יש לשטוף במשך 5 דקות במאגר נתרן ציטראט (SSC) 5x מלוח.
  6. בצע חמש שטיפות מחמירות ב-SSC שחומם מראש ב-60 מעלות צלזיוס בסדר הבא ודילול למשך 5 דקות בכל סיבוב: סיבוב אחד של 5x SSC, שני סיבובים של 1x SSC ושני סיבובים של 0.2x SSC.
  7. יש לשטוף במשך 5 דקות ב-0.2x SSC בטמפרטורת החדר. דגירה עם חיץ חוסם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. השתמש בשילוב של 1x TBS ואבקת ריאגנט חוסמת 0.5%, הקפד לסובב ולסובב את תמיסת החסימה לפני היישום.
  8. יש למרוח מצומד HRP נגד דיגוקסיגנין (עכבר) (עבור דגימות אלה נעשה שימוש בדילול של 1:500) ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
  9. שטפו במשך 5 דקות ב-1x TBS-T, 3x החל דילול מומלץ של 1:50 של אות טירמיד Amplification בתוספת ציאנין 3 (TSA+Cy3) פלואורופור למשך 10 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת). הקפד לסובב ולסובב את תמיסת TSA+Cy3 לפני היישום.
  10. שוטפים במשך 5 דקות ב-1x TBS-T, 3x.

4. צביעה גרעינית והרכבה

  1. יש למרוח תמיסת עבודה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (מספיק כדי לכסות את כל שטח הרקמה) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח (לחות סביבתית ובלתי מבוקרת).
    הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בדילול של 1:1000, כאשר מלאי ה-DAPI העובד מדולל ב-TBS.)
  2. שוטפים במשך 5 דקות ב-1x TBS-T, 3x. בסיום, יש למרוח תלושי כיסוי באמצעות אמצעי הרכבה ולהשאיר את השקופיות לייבוש למשך 10 דקות. אחסן שקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך בין 24-72 שעות לפני ההדמיה ועד שלושה חודשים לאחר מכן.

5. הדמיה וניתוח

  1. להדמיה, השתמש במיקרוסקופ סריקת שקופיות (עדיף) בהגדלה של פי 40.
  2. בצע ניתוח כמותי לאחר מכן כדי לספור פונקטה תוך שימוש ב-DAPI וצביעה נגדית של חלבונים לפילוח תאים ופנוטיפ.
    הערה: במהלך פרוטוקול זה, השתמשנו בהדמיה עם Phenoimager HT. סריקות שקופיות מלאות צולמו בהגדלה של פי 40 תוך שימוש במסננים מתאימים לפלואורופורים הקיימים, ולאחר מכן יוצאו תמונות מרובות כקבצי OME-TIFF. לאחר מכן הועלו התמונות הסרוקות לתוכנת ניתוח התמונות של Visiopharm לניתוח כמותני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעת בדיקת פרוטוקול זה, חשוב שיהיו שני חלקים סדרתיים של אותו מדגם מייצג לצורך דיוק והשוואה. במקרה זה, נעשה שימוש בדגימת סרטן שחלות בדרגה גבוהה (HGSC) כדי להשוות את התוצאות. נעשה שימוש בשקופית בקרה (איור 2A-B) שתעבור רק את צביעת ה-miRNA ושקופית בדיקה שתעבור גם צביעת חלבון וגם צביעת miRNA (איור 2C-J).

גם ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שחשיבותם של miRNAs מוכרת ומובנת, תצפיות הן על התפתחות נורמלית והן על מצבי מחלה מעוכבות כיום על ידי הקושי לחקור miRNAs בשיטות סטנדרטיות. המחסור בשיטות באתרן הוביל לפיתוח MARLIN (בדיקת miRNA FISH). בהתחשב בהומולוגיה ובאורך הקצר של miRNAs, זה הופך לאתגר לדמיין את מיקומם והשפעתם על ויסות פוסט-טרנסקריפטומי. פיתוח פרוטוקול זה משתמש בבדיקות חומצות גרעין נעולות (LNA). LNAs הם בסיסי RNA מותאמים שבהם הריבוז ננעל בגשר מתילן, המחבר את אטום החמצן לאטום הפחמן. גשר נוסף זה מגביל את הגמיש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לאנשים הבאים, צ'י לאם או יונג ומנג'ונאת נימקאיאלו, שהיו חלק מוועדת התזה של בסנט בזמן שהבדיקה הייתה בפיתוח. כמו כן, סמואל מוק, שחתך וסיפק את הדגימות שבהן השתמשו. לבסוף, אנו מודים ליוהאן דורה ודן וינקובסקי, שסיפקו סיוע נרחב במהלך הניתוח והשימוש בתוכנת Visiopharm. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הברית לחקר סרטן השחלות (OCRA 811621 ו-891490), קרן Sie וקרן התרומות של סטפני סי סטלטר. מחקר זה בוצע בשיתוף פעולה עם מתקן הליבה לציטומטריה והדמיה תאית, הנתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק התמיכה במרכז הסרטן של מ.ד. אנדרסון P30 CA016672 ומומחה המחקר של NCI של ג'ארד בורקס 1 R50 CA243707-01A1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 פעמים סוליין עם מאגר TRIS (TBS) pH 7.6 תרמו פישר סיינטיפיק  J62662  K7לשטיפות לסירוגין בין שלבים
1x מדלל/חסימה של נוגדן אופל  אקויה ביוסיינסיסARD1001EAתמיסת חסימת חלבון
מדלל הגברת אוטומציה 1x Plusאקויה ביוסיינסס FP1609משמש לדילול פלואורופורים של אופל
20x Concentrate  בופר נתרן ציטראט מלח (SSC)סיגמא-אלדריץ'S6639-1Lעבור שטיפות miRNA לאחר היברידיזציה של פרוב
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) תרמו פישר סיינטיפיק/אינויטרוגןEN62248 / 62248לצביעה גרעינית
מערכת היברידיזציה ACD HybEZ IIACD Biotechne321711תנור המשמש לווסת טמפרטורה במהלך פרוטוקול miRNAscope
אנטי-CD8 (D8A8Y), ארנב mAbטכנולוגיות איתות סלולריות85336Sדוגמה לנוגדן ראשוני המשמש לאופטימיזציה של פרוטוקול זה
קונוגט HRP אנטי-דיגוקסיגנין (עכבר)רוויטי הלתי סיינס בע"מNEF832001EAמגיב משני המשמש לזיהוי miRNA
אנטי-EpCAM (E6V8Y), ארנב mAbטכנולוגיות איתות סלולריות93790דוגמה לנוגדן ראשוני המשמש לאופטימיזציה של פרוטוקול זה
אבקת חוסםאקויה ביוסיינסס FP1012פתרון חסימת miRNA
אלכוהול אתיל 100% (200 proof)פארמקו111000200לצורך דה-פרפיניזציה
בופר EZ-AR1BioGeneXHK521-XAKמשמש לשאיבת אנטיגנים של חתכי רקמת FFPE בשלב החלבון
EZ-AR1 בופר אלגנטיותBioGeneXHK546-XAKמשמש לשחזור אנטיגנים של חתכי רקמת FFPE בשלב פרוב miRNA
מערכת EZ-Retriever IRBioGeneXMW015-IRמיקרוגל המשמש לשאיבת אנטיגנים של חתכי רקמת FFPE
תמיסת מי חמצן 30% סיגמא-אלדריץ'  HX0640-5 להכנת רקמות. מסייע לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית ולהפיק מוצרים בעלי צבע גבוה
miR-181c-3p miRNA גלאיקיאגן339112דוגמה לגלאי miRNA המשמש לאופטימיזציה של פרוטוקול זה
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)קיאגן339450 משמש לדילול גלאי miRNA
אופל 620אקויה ביוסיינסס FP1495001KTפלואורופור לזיהוי נוגדן ראשוני
אופל 690 אקויה ביוסיינסס FP1497001KTפלואורופור לזיהוי נוגדן ראשוני
Opal Anti-Ms + Rb HRPאקויה ביוסיינסיסARH1001EAנוגדן משני המשמש כסוכן גילוי
פירס 16% פורמלדהיד (ללא מתנול), ללא מתנולתרמו פישר סיינטיפיק28908לייצר 3.7% PFA להכנת רקמות
אנטי-פייד יהלום פרולונגתרמו פישר סיינטיפיקP36970מדיית הרכבה
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331לחדירת חתכי רקמה  על ידי עיכול חלקי של חלבונים ו- חשיפת מולקולות miRNA מטרה
מים ללא RNAse קורנינג 46-000-CM לנקות ולהכין את כל הציוד, ולהשתמש בו כמדלל כשצריך   
גיל 20סיגמא-אלדריץ'P1379-25MLליצור את TBS-T
הגברת אות טירמיד בתוספת ציאנין 3אקויה ביוסיינסס NEL744001KTפלואורופור לזיהוי miRNA
גשושי U6 ו-Scramble miRNAקיאגן339459גשושי בקרה אופציונליים
דרגת היסטולוגיה של קסילניםתרמו פישר סיינטיפיקUN1307לצורך דה-פרפיניזציה

מקורות

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

microRNAMultiplex ImmunofluorescenceFFPEEpCAM
הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.