Method Article

זיהוי רציף של ביומולקולות בדגימות קבועות פורמלין, משובצות פרפין עם הדמיית ספקטרומטריית מסה

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיית ספקטרומטריית מסה לזיהוי מטבוליט עוקב, גליקן מקושר ל-N ופפטיד טריפטי בדגימות רקמה קבועות בפורמלין, משובצות פרפין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות הן סביבות תאיות מורכבות, המורכבות ממגוון עצום של סוגי תאים וביו-מולקולות המקיימות אינטראקציה זו עם זו כדי לבצע את תפקידי האיבר. באופן מסורתי, טכניקות לניתוח ביומולקולות כגון מטבוליטים, גליקנים וחלבונים כללו הומוגניזציה של רקמות, והרסו את כל המידע המרחבי. שיטות מסורתיות אלה עיכבו את ההבנה המלאה של אינטראקציות מולקולריות מורכבות תוך-תאיות וחוץ-תאיות. הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI), לעומת זאת, לא רק משמרת את המידע המרחבי של ביומולקולות ברקמה אלא גם מאפשרת לזהות מספר סוגים של אנליטים מאותו קטע רקמה באמצעות ניתוח רציף ברזולוציה כמעט של תא בודד. זה מאפשר לנו לגזור תמונה מלאה יותר של אינטראקציות מולקולריות בין סוגים שונים של ביומולקולות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השלבים לביצוע הדמיית ספקטרומטריית מסה של מטבוליטים, גליקנים מקושרים ל-N ופפטידים טריפטיים ברצף מאותו קטע רקמה ברזולוציה של 20 מיקרומטר. התחשבות מצפונית בסדר הדמיית מחלקות האנליטים, יחד עם טיפול זהיר בקטעים כדי להבטיח שלמות, מאפשרת לאסוף מספר תמונות באיכות גבוהה מאותו קטע. לאחר מכן ניתן לשלב נתונים אלה עם נתוני אומיקס מרחביים אחרים (טרנסקריפטומיקה, אימונוהיסטוכימיה וכו') שנאספו מקטעים סדרתיים, שבהם ניתן לנתח את אותו תא בקטעים סמוכים אלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת זיהוי והדמיה של מאות עד אלפי ביומולקולות מקטעי רקמה דקים, ללא צורך בידע אפריורי של המולקולות המדויקות הקיימות ברקמה, מה שהופך אותה לכלי מצוין לגילוי סמנים ביולוגיים1. בעוד שמספר סוגים של MSI משמשים מעבדות שונות, כולל יינון ספיגה אלקטרו-ספריי (DESI)2,3, יינון לייזר בסיוע מטריצת אינפרא אדום (IR-MALDESI)4, וספקטרומטריית מסה של יונים משנית (SIMS)5, ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס (MALDI) נותרה הנפוצה והרב-תכליתית ביותר. ניתן לזהות את רוב סוגי הביו-מולקולות על ידי MSI על ידי התאמת הכנת הדגימה, כולל שטיפה/טיפול מקדים של הרקמה, עיכול אנזימטי והמטריצה/ממס בשימוש 6,7. MALDI MSI שימש לאיתור מטבוליטים, שומנים, גליקנים, חלבונים ופפטידים פרוטאוליטיים.

מחקרי MSI שימשו במגוון מחקרים קליניים ופרה-קליניים כדי להבין טוב יותר את מנגנוני המחלה 8,9, לשפר את דירוג הסרטן ואת קביעת השלב10,11, לחזות את תוצאת הטיפול12, לשפר את האבחנה13 ולקבוע שולי גידול מולקולריים14, בין היתר. רוב המחקרים הללו התמקדו באיתור של סוג אחד בלבד של אנליטים. עם זאת, לעתים קרובות מעניין לנתח יותר ממחלקה אחת של ביומולקולות מאותה דגימה. באופן מסורתי, זה בוצע עם חתכים סדרתיים של רקמות. אך לאחרונה, הוצגו דוגמאות לניתוח רציף של מחלקות אנליטיות מרובות מאותו קטע רקמה. לדוגמה, Yagnik ואחרים הדגימו הדמיית שומנים של רקמה קפואה ואחריה MALDI Immunohistochemistry מאותו סעיף לסיווג סוג תא15. קליפט ועמיתיו הראו יישום רציף של PNGaseF, קולגנאז וטריפסין על מקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין (FFPE) להדמיה של גליקנים מקושרים ל-N, חלבוני מטריצה חוץ-תאיים וחלבונים כלליים, בהתאמה16. אסקובר ואחרים הדגימו את הניתוח הרציף של גליקנים המקושרים ל-N, O-GlcNAc ופפטידים טריפטיים מאותו קטע של רקמה קפואה17. ניסויים מסוג זה מושגים באמצעות תכנון ניסיוני קפדני כדי לנתח תחילה את האנליטים שהכי קל לאבד, ואחריהם את אלה היציבים יותר ברקמה. במקרים רבים, השטיפות המשמשות להסרת מחלקות לא רצויות של מולקולות עוזרות לשפר מחלקות אחרות של מולקולות6, תכונה שניתן לנצל, כאשר כל שטיפה שמסירה את המטריצה שיושמה בעבר עוזרת גם לשפר את האות של המחלקה הבאה של אנליטים שיש לצלם.

לאחרונה, פרסמנו זרימת עבודה לניתוח רציף של מטבוליטים, גליקנים מקושרים ל-N ופפטידים טריפטיים מאותו קטע של רקמת סרטן השחלות FFPE18. כאן, אנו מציגים את זרימת העבודה המפורטת לניתוח שלושת הסוגים הללו של ביומולקולות מאותו קטע רקמה; סקירה כללית של הפרוטוקול מפורטת באיור 1. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון המתאר בפירוט את זרימת העבודה הזו להדמיה רציפה מרקמת FFPE. בקצרה, קטעי רקמה עוברים שעווה עם קסילן לפני ציפוי במטריצת 1,5-דיאמינונפתלין (10 מ"ג/מ"ל ב-50% אצטוניטריל) להדמיית מטבוליט במצב יונים שלילי. לאחר מכן מסירים את המטריצה, החלקים מיובשים מחדש ומאוחזרים על ידי אנטיגן, לפני שהם מרוססים ב-PNGase F (0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמוניום ביקרבונט) כדי לשחרר גליקנים מקושרים ל-N באתרם. לאחר הדגירה, החלקים מצופים במטריצת α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית (CHCA) (10 מ"ג/מ"ל ב-70% אצטוניטריל, 0.1% חומצה טריפלואורואצטית) ומצולמים במצב יונים חיוביים. לאחר מכן מסירים את המטריצה שוב, החזרת נוזלים ושליפת אנטיגן חוזרים על עצמם, והחלקים מרוססים בטריפסין (0.075 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמוניום ביקרבונט) ומודגרים לפני שהם מצופים שוב במטריצת CHCA (10 מ"ג/מ"ל ב-70% אצטוניטריל, 0.1% חומצה טריפלואורואצטית) ומצולמים במצב יונים חיוביים. יש להכין את כל הפתרונות טריים, מיד לפני השימוש, ואם בכלל אפשרי, יש לבצע את הניסויים במשך 3 ימים רצופים. אם נתקלים בעיכובים, יש לאחסן חלקים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס תחת ייבוש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) שנאספו מחולות שלא טופלו בעבר ועברו ניתוח ציטורדוקטיבי ראשוני לקרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה. כל הנתונים הקליניים התקבלו ממאגר סרטן השחלות של המחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית ורפואת רבייה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טקסס. הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים התקבלה על ידי צוות דלפק הקבלה, והמחקרים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוכרות.

1. הכנת דגימת הדמיית מטבוליט

הערה: פרוטוקול זה מניח שחלקים של רקמה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין (עובי 4 מיקרומטר) כבר הורכבו על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, מכיוון שדגימות קליניות חייבות בדרך כלל להיות מחולקות בתוך ליבת פתולוגיה קלינית על ידי היסטוטכנאים. מכיוון שהעבודה המוצגת כאן מבוצעת על מכשיר ה-TOF המוזכר, מדידת ה-TOF האורתוגונלית מקלה על הצורך בשקופיות מוליכות המשמשות באופן מסורתי בניסויי MSI. השימוש בשקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות תורם יותר גם לתהליכי עבודה סטנדרטיים במעבדות לפתולוגיה קלינית, כמו גם מאפשר שימוש ברקמות ארכיון שכבר נמצאות בשקופיות.

  1. צור סימני נאמנות בארבע פינות השקופית באמצעות סופר יהלומים.
  2. Deparaffinize חלקים על ידי טבילה בקסילן בדרגה היסטולוגית למשך 3 דקות.
    הערה: קסילן מזיק ויש להשתמש בו בקולט אדים כימי.
  3. טבלו חלקים בקסילן טרי למשך 3 דקות.
  4. הניחו לשקופית להתייבש בטמפרטורת החדר.
  5. הנח את השקופית לתוך יעד מתאם שקופיות.
  6. קבל תמונה אופטית של השקופית באמצעות סורק שטוח ברזולוציה של 4,800 dpi.
  7. הכינו מטריצת MALDI על ידי המסה של 15 מ"ג של 1,5-דיאמינונפתלין (DAN) ב-1.5 מ"ל של 50% ACN. סוניקאט עד להמסה מלאה, ~5 דקות. סנן את תמיסת המטריצה לפני הטעינה ללולאת הדגימה.
    הערה: DAN חשוד כמסרטן ויש להשתמש בו עם ציוד מגן אישי מתאים. יש לבצע ריסוס מטריקס במכסה אדים כימי.
  8. רססו את המגלשה בתמיסת DAN באמצעות מרסס ריאגנט רובוטי עם הפרמטרים הבאים: מהירות מסלול - 1,200 מ"מ לשנייה; מרווח מסילה - 3 מ"מ; טמפרטורת זרבובית - 60 מעלות צלזיוס; גובה זרבובית - 40 מ"מ; קצב זרימה - 100 מיקרוליטר לדקה; מסירות - 4; לחץ N 2 - 10 psi; דוגמא - CC
  9. מרחו 0.5 מיקרוליטר של זרחן אדום תלוי במתנול על מיקום ידוע בשקופית.

2. איסוף נתוני הדמיית מטבוליט

  1. הנח את השקופיות המוכנות לתוך מתאם שקופיות II וטען לתוך ספקטרומטר מסה של timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. טען את השיטה המתאימה לאיסוף נתונים במצב יונים שליליים ב-timsControl עם tims OFF. אם המכשיר עדיין לא היה במצב יונים שליליים, אפשר לפחות 25 דקות לאחר החלפת הקוטביות לשיווי משקל לפני כיול ואיסוף נתונים עם פרמטרי המכשיר הבאים עבור מטבוליטים: טווח m/z - 50 - 600; טווח סריקת לייזר - 16.0 מיקרומטר הן ב-X והן ב-Y; גודל השדה המתקבל - 20.0 מיקרומטר גם ב- X וגם ב- Y; צילומי לייזר - 150; שטף לייזר - ~30%; משפך 1 RF - 150.0 Vpp; משפך 2 RF - 200.0 Vpp; RF רב-קוטבי - 200.0 Vpp; אנרגיית התנגשות - 10.0 eV; התנגשות RF - 500.0 Vpp; זמן העברה - 55.0 מיקרון; אחסון PrePulse - 5.0 מיקרומטר (איור משלים S1).
  3. בצע פרופיל יעד (לחץ על כפתור צור כעת) והתאמת מיקוד (לחץ על כפתור התאם כעת) בכרטיסייה ספק לדוגמה. כוונן את מיקום הלייזר ב-X ו-Y, במידת הצורך בלשונית הלייזר כדי להבטיח שהלייזר מיושר בדיוק עם הכוונת.
  4. אסוף ספקטרום של זרחן אדום על ידי סיכום לפחות חמישה סטים של זריקות לייזר מהנקודה בשקופית.
  5. בצע כיול על-ידי לחיצה על לחצן כיול בכרטיסיה כיול. הסר את כל הפסגות בעוצמה נמוכה מאוד או שגיאת עמודים לדקה גבוהה.
    הערה: אפילו צבירי זרחן (P2 ו-P4) נותנים בדרך כלל אות חלש מאוד. ציון הכיול צריך להיות 100% לפני לחיצה על קבל. אם לא, נקה את הספקטרום המסכם ורכוש אחד חדש.
  6. הפעל את תוכנת flexImaging . ממשק המשתמש הגרפי לרכישת תמונות יתחיל אוטומטית.
  7. בחר הגדר הפעלת הדמיה חדשה בחלון בחר הפעלת הדמיה .
  8. בחר זרימת עבודה קלאסית בחלון בחר זרימת עבודה .
  9. בחלון אחסון נתונים , ספק שם הפעלת הדמיה וספריית תוצאות עבור הנתונים.
    הערה: אין להשתמש ברווחים בשמות קבצים.
  10. בחלון Acquisition Settings, בחר Acquisition Regions Measurement Defined והקלד 20 בתיבה Raster Width. לחץ על עיון כדי לבחור את פעולת השירות timsControl שנוצרה בעבר.
  11. בחלון 'תמונה לדוגמה ', לחצו על 'עיון ' לבחירת התמונה האופטית שהתקבלה באמצעות הסורק השטוח.
  12. בחלון ״למד דוגמה״, בצע/י יישור של שלוש נקודות בין התמונה האופטית לשקף; לאחר מכן, העבר את מנשא הדגימה ל-fiducial החרוט הראשון על השקופית ויישר את הכוונת ב-timsControl עם תכונה מובהקת בתחריט. התקרב לתמונה (מומלץ 100% זום), הגדר את התמונה לדוגמה להגדרת נקודות לימוד ולחץ על אותו מיקום בתמונה האופטית. חזור על תהליך זה פי 2 יותר ובסך הכל שלוש נקודות לימוד. לחץ על הבא כדי להשלים את ההוראה.
  13. לחץ על אישור כדי לצאת מאשף הפעלת ההדמיה החדשה.
  14. בדוק את דיוק ההוראה על ידי לחיצה על כפתור מנשא דגימת מיקום בתוכנה. התקרב ולחץ על תכונה מובהקת של נקודת הנאמנות הרביעית (שאינה בשימוש) בתמונה; ספק הדגימה יעבור למיקום זה בתוך timsControl. ודא שהכוונת מיישרת קו עם התכונה שנבחרה. אם הם לא מסתדרים, נקה את ההוראה ב-flexImaging וחזור על תהליך ההוראה כדי לשפר את הדיוק.
  15. בתוכנה, בחר בכלי Add Polygon Measurement Region ומתאר את הרקמות שיש לצלם. כל לחיצה על העכבר תיצור נקודת עיגון. לחץ על לחצן backspace במקלדת כדי להסיר נקודות, אחת אחת. לאחר ציור האזור, לחץ פעמיים על העכבר כדי לסגור את המצולע.
  16. בדוק את האות על ידי ירי הלייזר בכמה מקומות בתוך הרקמה. לחץ על מיקום בתמונה באמצעות כפתור מנשא דגימת מיקום , כמו בשלב 2.14, לבדיקת ההוראה. הספקטרום יישלט על ידי שיאי מטריצה סביב m/z 157 ו-313; התקרב לאזור M/Z מתחת ל-154 ו-250-300 כדי להראות שיאים רבים של מטבוליט מולקולות קטנות וחומצות שומן, בהתאמה. התאם את שטף הלייזר לפי הצורך לקבלת אות אופטימלי.
  17. שמור את פעולת השירות timsControl.
  18. התחל את רכישת ההדמיה על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה אוטומטית בתוכנה
    הערה: הדמיה במצב יונים שליליים עם מטריצת DAN מביאה לזיהוי של מטבוליטים רבים ממחזור TCA, חומצות אמינו וחומצות שומן, בין היתר.

3. הכנת דגימה להדמיית גליקן מקושר N

  1. לאחר הוצאת הדגימה מספקטרומטר המסה, הסר את מטריצת ה-DAN על ידי טבילת השקופית ב-100% אתנול (200 הוכחה) למשך דקה אחת.
  2. לחות את השקופית בצנצנות קופלין: אתנול טרי 100% למשך דקה; 95% אתנול למשך דקה; 70% אתנול למשך דקה; מים למשך 3 דקות; מים מתוקים למשך 3 דקות.
  3. הניחו לשקופית להתייבש למשך ~15 דקות.
  4. בצע אחזור אנטיגן על ידי טבילת המגלשה במאגר טריס של 100 מ"מ (נעשה על ידי המסת 6.06 גרם של בסיס טריס ב-500 מ"ל מים והתאמת pH לפי הצורך), pH 9, בצנצנת קופלין עם מכסה המונח באופן רופף מלמעלה המונח לתוך תא השרייה עם 500 מ"ל מים בתא. מחממים ל-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. הוציאו את צנצנת קופלין מתא ההשריה והניחו אותה על הספסל להתקרר למשך 20 דקות.
  6. החלף את המגלשה למים במשך חמישה שינויים. עבור שלושת הראשונים, שפכו מחצית מהתמיסה והחליפו אותה במים. עבור השניים האחרונים, שפכו את כל התמיסה והחליפו אותה במים.
  7. הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין.
  8. צור תא לחות לדגירה של המגלשה לאחר יישום PNGaseF. חותכים עיגול של מגבון סופג לכיסוי תחתית צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. גלגלו שני מגבוני מעבדה כדי ליצור כריות משני צדי צלחת הפטרי (איור 2). מוסיפים 8 מ"ל מים כדי להרוות את המגבונים הללו ומניחים את המכסה על צלחת הפטרי ומכניסים לתנור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לחימום מראש.
    הערה: החלק הפנימי של המנה צריך להיראות מהביל.
  9. הכן PNGaseF על ידי בנייה מחדש של 100 מיקרוגרם של אנזים ליופיליזציה ב-200 מיקרוליטר של 100 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.8 ומערבולת לערבוב. מעבירים את התמיסה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומדללים ל -1 מ"ל במים.
  10. רססו את השקופית עם PNGaseF באמצעות מרסס המגיב הרובוטי עם הפרמטרים הבאים. השתמש במשאבת המזרק ליישומי נפח נמוך/קצב זרימה נמוך: מהירות מסלול - 1200 מ"מ לשנייה; מרווח מסילה - 3 מ"מ; טמפרטורת זרבובית - 45 מעלות צלזיוס; גובה זרבובית - 40 מ"מ; קצב זרימה - 25 מיקרוליטר לדקה; מסירות - 15; לחץ N 2 - 10 psi; דוגמא - CC
  11. מניחים את השקופית בצלחת הפטרי שחוממת מראש, כשצד הרקמה כלפי מעלה, עם קצה אחד על כל אחת מכריות מגבון המעבדה. החלף את השקופית ואטום את צלחת הפטרי בסרט איטום דבק. מכניסים לתנור 37 מעלות ומניחים כרית חימום זוחלים מכוונת ל-40 מעלות צלזיוס על גבי צלחת הפטרי.
    הערה: זה שומר על המכסה החלק החם ביותר של המנה ומונע היווצרות עיבוי על המכסה ונפילה על הרקמה, מה שיגרום לחפצים בתמונות.
  12. דגרו על המגלשה למשך שעתיים כדי לאפשר לעיכול להמשיך.
  13. הסר את השקופית מצלחת הפטרי והניח לייבוש למשך ~5 דקות.
  14. הכינו את מטריצת MALDI על ידי המסת 15 מ"ג של חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית (CHCA) ב-1.5 מ"ל של 70% ACN, 0.1% TFA, 10 מ"מ אמוניום פוספט.
    הערה: TFA הוא קאוסטי ויש להשתמש בו במכסה מנוע עם ציוד מגן אישי מתאים.
  15. סוניקאט עד להמסה מלאה, ~5 דקות.
  16. סנן את תמיסת המטריצה לפני הטעינה ללולאת הדגימה.
  17. רססו את המגלשה עם CHCA באמצעות מרסס המגיב הרובוטי עם הפרמטרים הבאים: מהירות מסלול - 1,200 מ"מ לשנייה; מרווח מסילה - 3 מ"מ; טמפרטורת זרבובית - 75 מעלות צלזיוס; גובה זרבובית - 40 מ"מ; קצב זרימה - 120 מיקרוליטר לדקה; מסירות - 3; לחץ N 2 - 10 psi; דפוס - HH
  18. מרחו 0.5 מיקרוליטר של זרחן אדום תלוי במתנול על מיקום ידוע בשקופית.

4. איסוף נתוני הדמיית גליקן מקושר N

  1. הנח את השקופיות המוכנות לתוך יעד מתאם ההחלקה וטען לתוך ספקטרומטר המסה MALDI QTOF.
  2. טען את השיטה המתאימה לאיסוף נתונים במצב יונים חיובי ב-timsControl. אם המכשיר עדיין לא היה במצב יונים חיובי, אפשר לפחות 25 דקות לאחר החלפת הקוטביות לשיווי משקל לפני כיול ואיסוף נתונים עם פרמטרי המכשיר הבאים עבור גליקנים: טווח m/z - 700-3500; טווח סריקת לייזר - 16.0 מיקרומטר הן ב-X והן ב-Y; גודל השדה המתקבל - 20.0 מיקרומטר גם ב- X וגם ב- Y; צילומי לייזר - 200; שטף לייזר - ~25%; משפך 1 RF - 450.0 Vpp; משפך 2 RF - 500.0 Vpp; RF רב-קוטבי - 500.0 Vpp; אנרגיית התנגשות - 10.0 eV; התנגשות RF - 2,700.0 Vpp; זמן העברה - 140.0 מיקרון; אחסון PrePulse - 14.0 מיקרומטר (איור משלים S2).
  3. בצע פרופיל יעד (לחץ על כפתור צור כעת) והתאמת מיקוד (לחץ על כפתור כוונן כעת) בכרטיסייה מנשא דגימה. כוונן את מיקום הלייזר ב-X ו-Y, במידת הצורך, בלשונית הלייזר כדי להבטיח שהלייזר מיושר עם הכוונת.
  4. אסוף ספקטרום של זרחן אדום על ידי סיכום לפחות חמישה סטים של זריקות לייזר מהנקודה בשקופית.
  5. בצע כיול על-ידי לחיצה על לחצן כיול בכרטיסיה כיול. הסר את כל הפסגות בעוצמה נמוכה מאוד או שגיאת עמודים לדקה גבוהה.
    הערה: ציון הכיול צריך להיות 100% לפני לחיצה על קבל. אם לא, נקה את הספקטרום המסכם ורכוש אחד חדש.
  6. פתח את קובץ ה- .mis ששימש בעבר להדמיית מטבוליט בתוכנה.
  7. שמור את הקובץ בשם חדש המציין שמדובר בנתוני גליקן.
  8. תחת עריכה | מאפייני ריצת הדמיה, שנה את שיטת הרכישה לשיטת הגליקן הרצויה.
  9. ניקוי ההוראה הקודמת באמצעות עריכה | נקודות לימוד ברורות.
    הערה: השקופית לא תהיה באותו מיקום בדיוק לאחר הסרתה וטעינתה מחדש במתאם השקופיות.
  10. ביצוע הוראה חדשה באמצעות עריכה | הגדר נקודות לימוד; הגדר 3 נקודות כפי שנעשה באשף ההדמיה המקורי (שלב 2.12).
  11. בדוק את דיוק ההוראה על ידי לחיצה על כפתור מנשא דגימת מיקום בתוכנה. התקרב ולחץ על תכונה מובהקת של נקודת הנאמנות הרביעית (שאינה בשימוש) בתמונה. ספק הדגימה יעבור למצב זה בתוך timsControl; ודא שהכוונת מסתדרת עם התכונה שנבחרה.
    הערה: אם הכוונת אינה מסתדרת, נקה את ההוראה וחזור על תהליך ההוראה כדי לשפר את הדיוק.
  12. שמור את הקובץ.
  13. בדוק את האות על ידי ירי הלייזר בכמה מקומות בתוך הרקמה. לחץ על מיקום בתמונה באמצעות כפתור מנשא דגימת מיקום כמו בשלב 4.11 כדי לבדוק את ההוראה. אשר כי לספקטרום יש פסגות גליקן בשפע עם פסגות דומיננטיות בדרך כלל ב-m/z 1,663 ו-1,809. התאם את שטף הלייזר לפי הצורך לקבלת אות אופטימלי.
  14. שמור את פעולת השירות timsControl.
  15. התחל את רכישת ההדמיה על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה אוטומטית .

5. הכנת דגימות להדמיית פפטיד טריפטי

  1. הסר את מטריצת CHCA על ידי טבילת השקופית ב-100% אתנול (200 הוכחה) למשך ~1 דקה
  2. לחות את השקופית בצנצנות קופלין באופן הבא: אתנול טרי 100% למשך דקה; 95% אתנול למשך דקה; 70% אתנול למשך דקה; מים למשך 3 דקות; מים מתוקים למשך 3 דקות.
  3. הניחו לשקופית להתייבש למשך ~15 דקות.
  4. בצע אחזור אנטיגן על ידי טבילת המגלשה במאגר טריס של 100 מ"מ, pH 9, בצנצנת קופלין עם מכסה המונח באופן רופף למעלה המונח לתוך תא הסרת השרייה עם 500 מ"ל מים בתא. מחממים ל-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: אחזור אנטיגן שני זה הכרחי כדי לפרק את החלבונים לגישה יעילה יותר של הטריפסין לאתרי מחשוף.
  5. הוציאו את צנצנת קופלין מתא ההשריה והניחו אותה על הספסל להתקרר למשך 20 דקות.
  6. החלף את המגלשה למים במשך חמישה שינויים. עבור שלושת הראשונים, שפכו מחצית מהתמיסה והחליפו אותה במים. עבור השניים האחרונים, שפכו את כל התמיסה והחליפו אותה במים.
  7. הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין.
  8. הכן טריפסין על ידי בנייה מחדש של 100 מיקרוגרם של אנזים ליופילי ב-200 מיקרוליטר של חומצה אצטית של 100 מ"מ ופיפט למעלה ולמטה לערבוב. יש לצרף לגדלים מתאימים לניסוי (בדרך כלל 40 מיקרוליטר) ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
  9. הכן מנה של 40 מיקרוליטר של טריפסין על ידי הוספת 350 מיקרוליטר של 100 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.8 ו-39 מיקרוליטר של ACN. מערבבים היטב.
    הערה: אצטוניטריל (10% ACN) מגביר את פעילות הטריפסין בהשוואה לתמיסה מימית ומפחית את מתח הפנים של התמיסה לריסוס19.
  10. רססו את השקופית בטריפסין באמצעות מרסס ריאגנט רובוטי עם הפרמטרים הבאים. השתמש במשאבת המזרק ליישומי נפח נמוך/קצב זרימה נמוך: מהירות מסלול - 750 מ"מ לשנייה; מרווח מסילה - 3 מ"מ; טמפרטורת זרבובית - 30 מעלות צלזיוס; גובה זרבובית - 40 מ"מ; קצב זרימה - 10 מיקרוליטר לדקה; מסירות - 12; לחץ N 2 - 10 psi; דפוס - HH
  11. הניחו ריבוע מגבון סופג בתחתית צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ; וודאו שהפינות פשוט נוגעות בקצה המנה, והפיצו 1 מ"ל מים על המגבון.
  12. הנח את השקופית על גבי המגבון, כשצד הרקמה כלפי מעלה, הנח את המכסה על צלחת הפטרי ואטום את צלחת הפטרי בניילון איטום דביק.
  13. דגרו על המגלשה למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעיכול להמשיך.
  14. הסר את השקופית מצלחת הפטרי והניח לה להתייבש במשך ~5 דקות.
  15. הכינו מטריצת MALDI על ידי המסת 15 מ"ג של חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית (CHCA) ב-1.5 מ"ל של 70% ACN, 0.1% TFA, 10 מ"מ אמוניום פוספט.
  16. סוניקאט עד להמסה מלאה, ~5 דקות.
  17. סנן את תמיסת המטריצה לפני הטעינה ללולאת הדגימה.
  18. רססו את המגלשה עם CHCA באמצעות מרסס ריאגנט רובוטי עם הפרמטרים הבאים: מהירות מסלול - 1200 מ"מ לשנייה; מרווח מסילה - 3 מ"מ; טמפרטורת זרבובית - 75 מעלות צלזיוס; גובה זרבובית - 40 מ"מ; קצב זרימה - 120 מיקרוליטר לדקה; מסירות - 4; לחץ N 2 - 10 psi; דפוס - HH
  19. מרחו 0.5 מיקרוליטר של זרחן אדום תלוי במתנול על מיקום ידוע בשקופית.

6. איסוף נתוני הדמיית פפטיד טריפטי

  1. הנח את השקופיות המוכנות לתוך מתאם שקופיות וטען לתוך ספקטרומטר מסה timsTOF MALDI QTOF.
  2. טען את השיטה המתאימה לאיסוף נתונים במצב יונים חיובי ב-timsControl. אם המכשיר עדיין לא היה במצב יונים חיובי, אפשר לפחות 25 דקות לאחר החלפת הקוטביות לשיווי משקל לפני כיול ואיסוף נתונים באמצעות פרמטרי המכשיר הבאים עבור פפטידים: טווח m/z - 600-4500; טווח סריקת לייזר - 16.0 מיקרומטר הן ב-X והן ב-Y; גודל השדה המתקבל - 20.0 מיקרומטר גם ב- X וגם ב- Y; צילומי לייזר - 200; שטף לייזר - ~25%; משפך 1 RF - 450.0 Vpp; משפך 2 RF - 500.0 Vpp; RF רב-קוטבי - 600.0 Vpp; אנרגיית התנגשות - 10.0 eV; התנגשות RF - 3400.0 Vpp; זמן העברה - 180.0 מיקרון; אחסון PrePulse - 18.0 מיקרומטר (איור משלים S3).
  3. בצע פרופיל יעד (לחץ על כפתור צור כעת) והתאמת מיקוד (לחץ על כפתור התאם כעת) בכרטיסייה ספק לדוגמה. התאם את מיקום הלייזר ב-X ו-Y, במידת הצורך, בלשונית הלייזר כדי להבטיח שהלייזר מיושר עם הכוונת.
  4. אסוף ספקטרום של זרחן אדום על ידי סיכום לפחות חמישה סטים של זריקות לייזר מהנקודה בשקופית.
  5. בצע כיול על-ידי לחיצה על לחצן כיול בכרטיסיה כיול. הסר את כל הפסגות בעוצמה נמוכה מאוד או שגיאת עמודים לדקה גבוהה. ודא שציון הכיול הוא 100% לפני לחיצה על קבל. אם לא, נקה את הספקטרום המסכם ורכוש אחד חדש.
  6. פתח את קובץ ה- .mis ששימש בעבר להדמיית גליקן.
  7. שמור את הקובץ בשם חדש המציין שמדובר בנתוני פפטיד.
  8. תחת עריכה | מאפייני ריצת הדמיה, שנה את שיטת הרכישה לשיטת הפפטיד הרצויה.
  9. ניקוי ההוראה הקודמת באמצעות עריכה | נקודות לימוד ברורות.
    הערה: השקופית לא תהיה באותו מיקום בדיוק לאחר הסרתה וטעינתה מחדש במתאם השקופיות.
  10. ביצוע הוראה חדשה באמצעות עריכה | הגדר נקודות לימוד; הגדר שלוש נקודות כפי שנעשה באשף ההדמיה המקורי (שלב 2.12).
  11. בדוק את דיוק ההוראה על ידי לחיצה על כפתור מנשא דגימת מיקום . התקרב ולחץ על תכונה מובהקת של נקודת הנאמנות הרביעית (שאינה בשימוש) בתמונה. ספק הדגימה יעבור למצב זה בתוך timsControl; ודא שהכוונת מסתדרת עם התכונה שנבחרה.
    הערה: אם הכוונת אינה מסתדרת, נקה את ההוראה וחזור על תהליך ההוראה כדי לשפר את הדיוק.
  12. שמור את הקובץ.
  13. בדוק את האות על ידי ירי הלייזר בכמה מקומות בתוך הרקמה. לחץ על מיקום בתמונה באמצעות כפתור מיקום דגימת מנשא כמו בשלב 6.11 לבדיקת ההוראה. אשר כי לספקטרום יש פסגות פפטידים בשפע עם פסגות דומיננטיות בדרך כלל ב-m/z 944, 1,105 ו-1,198. התאם את שטף הלייזר לפי הצורך לקבלת אות אופטימלי.
  14. שמור את פעולת השירות timsControl.
  15. התחל את רכישת ההדמיה על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה אוטומטית .

7. צביעה היסטולוגית

הערה: קיימות מספר שיטות להמטוקסילין ואאוזין. מוצגת כאן שיטת Carazzi שונה המשמשת לעתים קרובות במעבדה זו.

  1. הסר את מטריצת CHCA על ידי טבילת השקופית ב-100% אתנול למשך דקה אחת.
  2. מכתים את השקופית באופן הבא: 95% אתנול למשך 30 שניות; 70% אתנול למשך 30 שניות; מים למשך 30 שניות; המטוקסילין למשך 2 דקות; מים למשך 30 שניות; 70% אתנול למשך 30 שניות; 95% אתנול למשך 30 שניות; אאוזין למשך דקה; 95% אתנול למשך 30 שניות; 100% אתנול למשך 30 שניות; קסילן למשך 2.5 דקות; כיסוי עם מדיום הרכבה.
  3. הניחו לשקופית להתייבש למשך > שעה והסירו בועות על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי.
  4. דיגיטציה באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי.

8. הדמיית נתונים

הערה: יש ניתוח מקיף שניתן לבצע עם SCiLS Lab שהוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. כאן, נתאר רק יצירת קבצים בסיסית, הדמיית נתונים וחיפוש פסגות מול מסדי נתונים לזיהוי משוער.

  1. הפעל את SCiLS Lab 2025b ובחר חדש.
  2. בחר את הנתוניםfile (ים) לטעינה לתוכנה.
    הערה: עם SCiLS Lab Pro, ניתן לטעון יחד קובצי נתונים מרובים שנאספו עם אותם פרמטרים לצורך נורמליזציה זה לזה ולהציג אותם בו-זמנית.
  3. סדרו את הדוגמאות בפריסה המועדפת. העבר את הדוגמאות בלחיצה שמאלית וגרירה. סובב את הדוגמאות על ידי לחיצה ימנית וגרירה. בחר הבא.
  4. בחלון הגדרות ציר מסה , בצע את ההתאמות הנדרשות. ערכי ברירת המחדל פועלים בדרך כלל היטב עבור נתוני timsTOF. לחץ על הבא.
  5. בחלון איתור תכונות , הגדר ערכים מתאימים לליקוט שיא אוטומטי במהלך הייבוא. לחץ על הבא.
    הערה: זה לא עובד טוב עבור נתוני מטבוליט מרקמת FFPE ויש לדלג עליו.
  6. הגדרות הייבוא יוצגו באופן חזותי בחלון סיכום ייבוא . לחץ על ייבוא.
  7. ספק שם קובץ ומיקום לשמירת קובץ SCiLS.
    הערה: בהתאם לגודל הקובץ, הייבוא עשוי להימשך מספר דקות עד מספר שעות.
  8. לאחר השלמתו, חלון סיכום יהיה גלוי. לחץ על Open Imported Dataset כדי לקיים אינטראקציה עם קובץ SCiLS.
  9. בפינה השמאלית העליונה של התוכנה, לחץ על התפריט הנפתח לצד נורמליזציה ובחר שורש ממוצע ריבוע.
    הערה: זוהי השיטה המתאימה ביותר לנתוני timsTOF בהתחשב בדלילות הנתונים המרכזיים המיובאים ותספק את ההדמיה הטובה ביותר.
  10. תחת קובץ | מאפייני קובץ, הגדר את רוחב מרווח הזמן לערך מתאים, בדרך כלל 10 - 15 עמודים לדקה עבור נתוני timsTOF. ודא שהערך מתאים על-ידי הערכה אם הוא משתרע על רוחב שיא בספקטרום הממוצע.
  11. התקרב לספקטרום הממוצע בתחתית התוכנה, על ידי לחיצה וגרירה או גלגול גלגל העכבר קדימה.
  12. בחר פסגה להמחשה על-ידי מיקום הכוונת בקודקוד ולחיצה שמאלית על גלגל העכבר.
  13. הוסף יונים מעניינים לרשימת תמונות היונים הפעילה על-ידי לחיצה על control + מקש רווח.
  14. שמור את רשימת התכונות שנאספה על ידי לחיצה על שמור כרשימת תכונות כפתור בתחתית חלון תמונות היונים בצד ימין של התוכנה.
  15. פתח רשימת תכונות שמורות על ידי לחיצה על קובץ | טבלת תכונות וחפש באמצעות MetaboScape מזהי מטבוליט או גליקן משוערים, אם MetaboScape מותקן ומוגדר באותה רשת. לחלופין, המר את קבצי SCiLS לקבצי .imzML לייבוא ל-METASPACE (https://metaspace2020.org/) לזיהוי משוער.
    הערה: תיאור מלא של היכולות של SCiLS Lab ניתן למצוא במדריך למשתמש תחת אפשרות תפריט העזרה .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלמת פרוטוקול זה אמורה לגרום לשלושה מערכי נתונים חזקים של MSI מאותו קטע של רקמה. בהדמיה של הספקטרום המלא של נתוני המטבוליטים, הספקטרום יהיה נשלט במידה רבה על ידי שיאי מטריצה ב-m/z 157 ו-315. זה נורמלי עבור רקמת FFPE. אותות מטבוליט וחומצות שומן רבים ייצפו על ידי התקרבות לטווחי m/z <155 ובין 250 ל-300. איור 3 מציג דוגמאות לספקטרום המלא ולטווחים המוגדלים המדגישים את ספקטרום המטבוליטים המורכב המתקבל מהרקמה. בדרך כלל, בין 700 ל-900 שיאי מטבוליט נצפים מקטעי רקמת FFPE במצב שלילי עם הכנת דגימה ז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף נתוני MSI עוקבים מקטע רקמה בודד דורש תשומת לב קפדנית לפרטים. ישנם כמה שלבים שהם חיוניים לחלוטין להשגת נתונים באיכות גבוהה. ראשית, יש לנקוט בזהירות אם מכינים יותר משקופית אחת בו זמנית. בעת הנחת המגלשות לתוך צנצנות קופלין או מעבר ביניהן, היזהר לא להניח שתי שקופיות באותו מיקום בצנצנת. זה יגרום לחשיפה לא מספקת לממס של משטח הרקמה, או ששקופית אחת יכולה לגרד את הרקמה מהשקופית השנייה. שנית, זה קריטי לאפשר למכשיר להתאזן למשך 25 דקות לפחות בעת שינוי קוטביות לניתוח. במהלך זמן זה, ערכי ה-m/z ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS ומתקן הדמיית ספקטרומטריית מסה של אוניברסיטת טקסס באוסטין נתמכים על ידי פרס המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (RP240559). מחקר זה מומן בחלקו על ידי הברית לחקר סרטן השחלות (OCRA 811621 ו-891490), קרן Sie וקרן התרומות של סטפני סי סטלטר. מחקר זה בוצע בשיתוף פעולה עם מתקן הליבה לציטומטריה והדמיה תאית, הנתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק התמיכה במרכז הסרטן של מ.ד. אנדרסון P30 CA016672 ומומחה המחקר של NCI של ג'ארד בורקס 1 R50 CA243707-01A1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-דיאמינונפתליןפישר סיינטיפיקD010125Gמטריצת MALDI להדמיית מטבוליט
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA955-4ממס בדרגת LC-MS המשמש להכנת מטריצה
&אלפא;-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמיתסיגמא-אולדריץ'70990-1G-Fמטריצת MALDI להדמיית גליקן ופפטיד
אמוניום ביקרבונטפישר סיינטיפיקA643-500חוצץ לאנזימים
אמוניום פוספטסיגמא-אולדריץ'ברקוד 467782-50 גרםתוסף להפחתת אשכולות מטריצה במהלך הדמיה
תא הסרת השרייה NxGenביוקר מדיקללא ישיםמשמש לאחזור אנטיגן של רקמות
אתנולפישר סיינטיפיק04-355-223ממס בדרגת LC-MS המשמש להכנת מטריצה וצביעה
מרסס ריאגנט רובוטי M5HTX הדמיהלא ישיםמשמש ליישום אנזימים ומטריצות על רקמות
מתנולפישר סיינטיפיקA456-4ממס בדרגת LC-MS להכנת תרחיף זרחן אדום
טריפסין בדרגת MSפישר סיינטיפיקPI90058אנזים לעיכול חלבונים
מתאם שקופיות MTP IIברוקר דלטוניקס8235380מתאם להכנסת שקופיות מיקרוסקופ לספקטרומטר מסה
סורק שקופיות דיגיטלי NanoZoomer SQHamamatsu Corpלא ישיםמשמש להפקת תמונות מיקרוסקופיה דיגיטלית של רקמות מוכתמות
סורק שטוח Perfection V600Epsonלא ישיםמשמש ליצירת תמונה אופטית של השקופית לאיסוף נתוני MSI
פטרי סילפישר סיינטיפיק50-212-518לאיטום צלחת פטרי במהלך עיכול אנזימטי
PNGaseFבולדוג ביוNZPP550LYאנזים לפיצול גליקנים מקושרים N מחלבונים
זרחן אדוםסיגמא-אולדריץ'04004-250זקליברנט MALDI למצב יונים חיובי ושלילי כאחד
מעבדת SCiLS (2025ב)ברוקר דלטוניקסלא ישיםתוכנה להדמיית נתונים של MSI
timsTOF fleX QTOF ספקטרומטר מסהברוקר דלטוניקסלא ישיםמשמש לאיסוף נתוני ספקטרומטריית מסה
חומצה טריפלואוראצטיתפישר סיינטיפיק85183תוסף מטריקס להפחתת pH להדמיית מצב יונים חיובי
בסיס טריספישר סיינטיפיקBP152-500מאגר לאחזור אנטיגן
מיםפישר סיינטיפיקW64ממס בדרגת LC-MS המשמש למטריצות, אנזימים וצביעה
וויפול X60פישר סיינטיפיק19-413-113מגבון סופג לדגירת אנזימים לחה
קסילןפישר סיינטיפיקX3P-1GALחומר ניקוי לצביעה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles