Method Article

פרופיל מרחבי מקיף של טרנסקריפטומים אגנוסטיים למינים באמצעות סטריאו-רצף

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי מקיף של RNA מארח, ויראלי, פטרייתי ומיקרוביום מקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין באמצעות Stereo-seq, המאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של טרנסקריפטומים מגוונים תוך שמירה על ארכיטקטורת רקמות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההרכב המרחבי של תאים בתוך המארח, כמו גם החיידקים או העומסים הנגיפיים בתוך הרקמה, יכולים להשפיע על האינטראקציה בין סוגי תאים ואנליטים המניעים את התא בתהליכים ספציפיים לסוג התא. Stereo-seq עבור רקמות FFPE משתמש בתחול אקראי לברקודים מרחביים, השונה משיטות טרנסקריפטומיקה מרחביות סטנדרטיות, המשתמשות ב-A'tailing כדי ללכוד RNA שליח (mRNA) או מבוסס בדיקה כדי ללכוד תעתיקים ספציפיים למין. שיטות אלה אינן מאמצות את הידע העדכני יותר על ההשפעה והחשיבות של סוגים אחרים של RNA מ-RNA ארוך שאינו מקודד, RNA מיטוכונדריאלי, microRNA או מינים אחרים, RNA, כגון מיקרוביאלי, ויראלי ופטרייתי. מתואר כאן הליך שלב אחר שלב מחיתוך רקמות דרך הכנת ספרייה ליישום סטריאו-רצף מרחבי אגנוסטי עם זיהוי RNA באמצעות מתודולוגיית בדיקה אקראית יותר, התואמת לרקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). לשיטת Stereo-seq זו יש חרוז לכידה אקראי בגודל 0.22 מיקרומטר המופיע מחדש במערך כל 0.5 מיקרומטר, ומאפשר רזולוציה תת-תאית מטכנולוגיה מבוססת רצף. מכיוון ששיטה זו מזהה הן RNA מארח והן RNA שאינו מארח, הפרוטוקול דורש שיקולים ספציפיים כדי לאפשר קביעה של מה נמצא בתוך הרקמה לעומת מה שהופקד על הרקמה במהלך תהליך האיסוף, השימור, החיתוך והזיהוי (כלומר, מזהמים סביבתיים וטיפוליים). לבסוף, פרוטוקול זה מאפשר לקבל רזולוציה גבוהה (תא בודד) של מיני רב-רנ"א בהקשר מרחבי, ומספק תובנה לגבי האקטום התוך-ובין-אקטום של סוגי תאים ומינים פתולוגיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות מרחביות-אומיקה חוללו מהפכה בחקר ההטרוגניות התאית של הרקמה בכך שאפשרו כימות בו-זמני של מטרות מרובות, DNA (גנומיקה), RNA (טרנסקריפטומיקה), מטבוליטים (מטבולומיקה) או חלבון (פרוטאומיקה)1. הרזולוציה של מבחנים שונים אלה משתנה לעתים קרובות, ומספקת מגבלות שונות בעת מדידת אנליטים, או עם דלילות מוגברת בעת מדידת תא בודד 2,3 או הקשר מרחבי מקורי 4. לעומת זאת, שיטות בתפזורת כגון ריצוף RNA מספקות רק ביטוי גנים ממוצע על פני דגימות שלמות ומטשטשות הטרוגניות תאית2, או ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq)2,3, הדורש דיסוציאציה של רקמות לריצוף תא בודד, דורש לעתים קרובות סינון. לכן, שיטות אלו אינן כוללות תאים גדולים ואגרגטים, בעוד ששיטות ביואינפורמטיות מנסות להסיר שברים וכפילים, כולם גורמים להטיות 5,6,7. טרנסקריפטומיקה מרחבית שומרת על ארכיטקטורת רקמות ומספקת תובנות קריטיות לגבי ארגון ואינטראקציות תאיות. לרוב שיטות הריצוף המרחבי הלא ממוקדות אין רזולוציה של תא בודד, ולכן דורשות דה-קונבולוציה של אזורי לכידה מרחבית המכילים 10 עד 100 תאים 8,9,10. עם זאת, בעשור האחרון, טרנסקריפטומיקה מרחבית עלתה על הצרכים בשיטות אלה, שכן חלה התקדמות ברזולוציה, אזורי לכידה גדולים יותר ושילוב של גישות מולטי-אומיקס, בין אם באמצעות אסטרטגיה ניסיונית או טכניקות חדשות 1,11,12.

רצף אומיקס ברזולוציה מרחבית משופרת (Stereo-seq) מספק רזולוציה בקנה מידה ננומטרי (500 ננומטר) ואזור לכידה בקנה מידה של סנטימטר, עם לכידת טרנסקריפטומי שלם שאינו אגנוסטי למינים המאפשר לכידת RNA13 מקודד, לא מקודד ולא מארח. שיטה זו היא כיום הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית ויש לה אפשרויות לספק את שדות הראייה הגדולים ביותר. עם זאת, לשיטה זו יש כמה מגבלות בולטות, כולל דרישות זמן ועבודה של כ-15 שעות מעשיות, המשתרעות על פני 4 ימים להשלמת הספריות המוכנות לרצף. לשם השוואה, טכנולוגיות טרנסקריפטומיקה מרחבית אחרות המבוססות על ריצוף, כגון טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת בדיקה, טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת מערך לכידת polyA, Slide-seq וברקוד דטרמיניסטי ברקמה לריצוף אומיקס מרחבי (DBiT-seq) דורשות בדרך כלל 5 עד 8 שעות של זמן מעשי במשך 2 עד 3 ימים (טבלה 1). עבור חוקרים רבים, התקדמות זו עולה על האתגרים הטכניים והיא אידיאלית לבניית אטלסים מרחביים של טרנסקריפטומיקה מלאה לחקר התקדמות המחלה ברמה התאית והתת-תאית, במיוחד אם היא מרובדת עם טכנולוגיות אחרות1.

לפרוטוקול Stereo-seq יש אפשרויות מעבר לתעתיק mRNA מסורתי, המסתמך על בדיקות poly-T ללכידת תעתיקי mRNA פוליאדניליים. ניתן לשנות שיטות אלו על ידי הוספת פוליאדנילציה לרקמות טריות14 או בדיקות ספציפיות למין עבור קבוצות גנים מוגדרות מראש15 לניתוח ביטוי מרחבי. במקום זאת, Stereo-seq משתמש בבדיקות נוקלאוטידים אקראיות כדי לבחור RNA מגוונים ללא קשר למין, כולל RNA מיקרוביאלי, RNA פטרייתי, RNA ויראלי ו-RNA לא פוליאדניל כגון RNA משפר, RNA מעגלי ו-RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs)16. תיאורטית, ניתן ללכוד RNA קטנים יותר או אלמנטים מתקנים כגון RNA מפריעים קטנים (siRNAs), מיקרו-RNAs (miRNAs) וטרנספוזונים17. עם זאת, נכון לעכשיו הביואינפורמטיקה והמיפוי של RNA אלה נותרו מאתגרים ולעתים קרובות מסוננים החוצה במהלך היישור הראשוני, שבדרך כלל משתמש בחתך של 30 bp.

מתואר כאן פרוטוקול מפורט, עם השינויים שלנו עבור לכידת נוקלאוטידים אקראית של יצרן על שבבי ננו-כדורי DNA (DNB) כדי להבטיח הבנה וטיפול טובים יותר בפרוטוקול Stereo-seq המוצג באיור 1. פרוטוקול זה כולל אסטרטגיות לביולוגים מולקולריים לבדיקת רקמות FFPE חדשות ב-Stereo-seq עם לכידת נוקלאוטידים אקראית כדי לייצר תשואות עקביות וגבוהות יותר מדגימות ארכיון ורקמות שומן באיכות נמוכה יותר. הפרוטוקול המתואר מותאם לדגימות FFPE מרוב האיברים, ללא קשר למין המוצא. עם זאת, פרוטוקול זה אינו כולל את השינויים הנוכחיים הדרושים לטיפול ברקמות קשות כמו מח עצם, הדורשות הסרת אבנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא מסופקים נתונים קליניים במאמר שיטות זה עבור דגימת מטופלת קרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה. עם זאת, נתונים קליניים קשורים נאספו בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) במרכז הסרטן של אוניברסיטת טקסס, המחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית ורפואת רבייה, ממשתתפים שסיפקו הסכמה מדעת בכתב.

הערה: מומלץ ללבוש מסכה כירורגית וכפפות במהלך כל הפרוטוקול כדי למנוע זיהום RNase. לחוקרים עם שיער ארוך מומלץ למשוך אותו לאחור או אפילו ללבוש רשת שיער. השתמש תמיד במים סטריליים ללא נוקלאז (NFW) ובצינורות DNA/RNA נטולי נוקלאז ובעלי קשירה נמוכה כדי למקסם את התפוקה. רקמות שאינן יונקים, כגון רקמות צמחים, עשויות לדרוש אופטימיזציה של היצמדות, הכוללת פולי-L-ליזין (PLL) וזמני חדירות ממושכים עקב דפנות התא. בעוד שלכידה מולקולרית נותרה אפשרית תיאורטית, יש צורך באימות ניסיוני מכיוון שרקמות הצמח לא נבדקו בזרימת העבודה הנוכחית שלנו.

1. להעריך את איכות ה-RNA ואת ערך התפלגות שבר ה-RNA 200 ציונים

  1. העריכו את איכות הרנ"א באמצעות ערך התפלגות רנ"א 200 (DV200), המודד את אחוז הרנ"א הגדול מ-200 נ"ב.
  2. השתמש בשני מקטעים של 10 מיקרומטר מאותו גוש רקמות המיועד לעיבוד סטריאו-רצף.
    הערה: עיבוד מיידי הוא אופטימלי, אך ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, -20 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות או -80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
  3. חלץ RNA באמצעות פרוטוקול מיצוי RNA סלקטיבי שאינו בגודל כפי שתואר על ידי Patel et al.18 כדי לאפשר הערכה מדויקת של התפלגות גדלי שברי RNA.
  4. הערך את איכות ה-RNA באמצעות אחד מהדברים הבאים באמצעות מנתח שברים כדי לקבוע את ציון ה-DV200, או את אחוז השטח מתחת לעקומה המייצג שברי RNA ארוכים מ-200 bp. באופן אידיאלי, הרקמה צריכה להיות בעלת ציון DV200 (> 50%) וריכוז (> 10 ננוגרם/מיקרוליטר).

2. ניקיון סביבת העבודה

  1. נקו את כל המשטחים עם 30% אקונומיקה. הניחו למשטחים להתייבש לפחות 30 דקות כדי למנוע היווצרות כלורופורם משילוב של אקונומיקה ואתנול.
  2. נגב משטחים עם מגבוני טיהור DNA (DDW). רססו את כל המשטחים עם תמיסת טיהור RNase (RDS) ולאחר מכן 70% אתנול שהוכן עם NFW.
    הערה: לעולם אל תערבב אקונומיקה או כל אלכוהול אחר. שילוב זה ייצר כלורופורם, שהוא רעיל מאוד ועלול לגרום לאובדן הכרה, נזק לאיברים או מוות אפילו בחשיפות נמוכות.

3. הכנת שבב לכידת אוליגונוקלאוטידים אקראי סטריאו-רצף (N-chip)

  1. נקה את סביבת העבודה כמתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, כולל כל המערכות המשמשות בשלב זה.
  2. הסר את שבב ה-Stereo-seq N מאריזתו, הקלט את מזהה השבב ונקה את הקצוות של שבב ה-Stereo-seq N ומגלשת הזכוכית עם 100% אתנול מבלי לגעת בשבב. יש להניח לייבוש מלא באוויר.
  3. יישום שרף לאבטחת השבב לשקופית (אופציונלי למשתמשים המשתמשים בקסילנים).
    הערה: למרות שסוכני ניקוי שאינם קסילן מומלצים לרוב על ידי ספקים מסחריים, נצפה כי חומרי ניקוי שאינם קסילן יכולים להיות פחות יעילים בהתאם לתערובת הפרפין. לעתים קרובות הם אינם תואמים לפלסטיק מסוים, שרפים סינתטיים או רקמות משובצות בשעוות דבורים, ואינם מנקים ביעילות פרפינים צולבים או בעלי נקודת התכה גבוהה. אם אינך בטוח בהרכב הפרפין המשמש להטמעת הדגימה, מומלץ להשתמש בקסילנים לניקוי אופטימלי. יתר על כן, קסילנים מסוגלים טוב יותר לנקות רקמות שומן, כגון רקמת שד, שחלה, ביצית או מוח.
    1. לנער או לערבב היטב שרף כדי לוודא שהוא לבן בצורה הומוגנית. בעזרת מיקרופיפטה, יש למרוח בזהירות 10 מיקרוליטר של שרף קרמי הניתן לריפוי UV סביב קצה שבב ה-Stereo-seq N (איור 2A).
      הערה: שרף עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים ועלול להוביל לתגובות עור אלרגיות בחשיפה חוזרת. בעת פיפטינג או טיפול בשרף זה, יש ללבוש תמיד כפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. עבדו באזור מאוורר היטב וחבשו מסכה בעת שימוש בכמויות גדולות או בתמיסת חימום והימנעו ממגע ישיר עם העור או העיניים.
    2. השתמש בספוגית קצף אטומה, הסר עודפי שרף, והשאיר רק קו דק סביב קצה השבב. הנח את השקופית לתוך מכשיר ריפוי ה-UV, והקפד לא לגעת במשטח השבב.
    3. הנח את השבב המיושם בשרף על גבי מסכה אטומה על מקור האור UV של 405 ננומטר כדי להאיר את החלק האחורי של השקופית ולרפא למשך 5 דקות. זה מודגם באיור 2B.
      הערה: אין לחשוף יתר על המידה את שבב ה-Stereo-seq N לאור UV ואל תיגע בשרף על פני השבב, מכיוון שהוא עלול לגרום להשפעות מזיקות לננו-כדורים.
    4. לאחר הריפוי, השתמש בספוגיות קצף אטומות ספוגות בכל אחד מהדברים הבאים: 100% אתנול בדרגה מולקולרית; 70% אתנול; ולבסוף NFW כדי לנקות סביב הקצה שבו הונח שרף. אם כתמים לבנים יורדים, נקה שוב את הקצה. לעולם אל תיגע במשטח השבב (איור 2C).
    5. הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין. לאחר הבדיקה, אחסן את הצ'יפס למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם חומר ייבוש במידת הצורך. עם זאת, מומלץ להמשיך בהכנת השבבים וחתך מיד במידת האפשר.
      הערה: ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים, כולל משקפי מגן UV, בעת עבודה עם אור UV. טפל באתנול ושרף באזור מאוורר היטב, רצוי קולט אדים. השלך חומרי פסולת בהתאם להנחיות המוסדיות.
  4. הכנת שבב עם פולי-L-ליזין (אופציונלי לרקמות שומן או רקמות עם בעיות הידבקות.)
    1. נקה את סביבת העבודה כמתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, כולל כל המערכות המשמשות בשלב זה.
      הערה: אין לרסס כימיקלים ישירות לתוך מכונת ה-PCR. עבור כל השלבים שלפני ה-PCR, עבדו במכסה המנוע, במידת האפשר, כדי למנוע זיהום כולל הגברה קודמת של cDNA.
    2. טבלו את השבב שלוש פעמים ב-NFW טרי באמצעות צינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. יבש את השבב באמצעות אוויר דחוס, תוך שימוש במלוא הכוח של אוויר דחוס בזווית של כ-60° עד 80° הנע באלכסון (45°) על פני השבב ממרחק של כ-5 ס"מ מפני השטח של השבב (איור 2E). אם המשטח נראה מעונן, חזור על הכביסה עם NFW טרי וייבש שוב (משטח הענן בדרך כלל אומר שהקרמיקה לא נשטפה או נרפאה מספיק בשלבים הקודמים).
    4. מרחו 150 מיקרוליטר של תמיסת PLL כדי לכסות את כל משטח השבב. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס עד 25 מעלות צלזיוס). זה מודגם באיור 2D.
    5. הסר את תמיסת ה-PLL ושטוף את השבב פעמיים במים נטולי נוקלאז למשך 10-15 שניות.
    6. יבש את שולי השקופית בזהירות לאחר הכביסה השנייה (מבלי לגעת בשבב).
    7. יבש היטב את השבב באמצעות אוויר דחוס, תוך שימוש במלוא הכוח של אוויר דחוס בזווית של כ-60° עד 45° העובר באלכסון על פני השבב ממרחק של כ-5 ס"מ מפני השטח של השבב (איור 2E).
      הערה: השבב צריך להיות יבש לחלוטין תוך 30 שניות או פחות. אם זה ייקח יותר זמן מזה, ה-DNB יופרע, מה שיגרום לחפצים בלכידה.
    8. המשך להרכבה תוך שעה אחת ושמור על השבב יבש.
      הערה: אם משטח השבב נראה מעונן לאחר הייבוש, יש לשטוף עם NFW טרי ולחזור על תהליך הייבוש. אם יש חפצים על פני השבב לאחר הייבוש, הדבר עלול לגרום לבעיות לכידה באזורים אלה. הימנע משימוש ב-PLL כדי להיצמד אם הרקמה אינה דורשת זאת. נגיעה בשבב עלולה לגרום לשריטות ולאובדן אזורי לכידה לפני שחרור cDNA, או לכידה לא אחידה לאחר השחרור. שרף על פני השבב מוביל לאובדן מנומר של אזורי לכידה. הצבת השבב קרוב מדי לפיית האוויר הדחוס עלולה ליצור גבישים וריסוס של סימני DBN פגומים על פני השבב; עם זאת, זה נדיר ובדרך כלל קורה רק אם הזרבובית כמעט נוגעת בשבב ובקבוק האוויר הדחוס קר מדי. מומלץ לתרגל הליך זה מספר פעמים עם שבבי הערכה, מכיוון ששלב זה מאתגר מבחינה טכנית.

4. חיתוך והרכבה של רקמות

  1. ודא שסביבת העבודה נקייה כמתואר בשלבים 2.1 ו-2.2. ודא שנעשה שימוש בלהבים חדשים וב-NFW עבור כל אמבטיות המים והקרח במהלך חיתוך והרכבה של רקמות. אל תיגע ישירות בשבב, וכסה רק 80% מהשבב ברקמה.
    הערה: מומלץ להשתמש בעובי של 5 מיקרומטר לרקמה סטנדרטית או 4 מיקרומטר לרקמות עתירות שומן. השתמש בסרט של מקטעים טוריים כדי להתאים אופנים בין דוגמאות, אם רלוונטי.
  2. מגלשות יבשות ב-42 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות בתנור או במכונת PCR עם מכסה פתוח. לאחר מכן מעבירים שקופיות או משנים את הטמפרטורה בתנור או במכונת PCR ל-37 מעלות צלזיוס ואופים למשך הלילה במשך 12-48 שעות. מומלץ להשתמש בסביבות 18 שעות.
  3. נקודת עצירה אופציונלית: לאחר הייבוש, אטמו את המגלשות בשקיות אלומיניום עם חומר ייבוש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני שתמשיכו.
    הערה: זמני ייבוש ארוכים יותר עלולים להפחית את שלמות ה-RNA. ייבוש קצר מדי יגרום להידבקות רקמות תחתונות למגלשה. אפייה בטמפרטורה גבוהה יותר עלולה להפחית את שלמות ה-RNA. ניתן לשלוח שקופיות לעיבוד חיצוני (למשל, ניתוח מארח). עם זאת, משלוח אינו מומלץ לניתוח מיקרוביום עקב זיהום פוטנציאלי מוגבר במהלך ההובלה.

5. הפזר שקופיות

  1. ודא שסביבת העבודה נקייה כמתואר בשלבים 2.1 ו-2.2.
  2. הכן ריאגנטים לדפראפיניזציה ופרוטוקול סטריאו-סק.
    1. יש לציין את הריאגנטים הנדרשים: שני 30 מ"ל של קסילנים בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל, שני 30 מ"ל של 100% אתנול בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
    2. הכן את הריאגנטים המדוללים הבאים עם NFW: 96% אתנול לשבב (נדרשים 2 חרוטי או 1 מ"ל), 90% אתנול לשבב, 80% אתנול לשבב, 70% אתנול לשבב, 50% אתנול לשבב, 30% אתנול לשבב, 2.5 מ"ל של 5x מלח-נתרן ציטראט (SSC) מתמיסה של פי 20, 5 מ"ל של 0.01N HCl (מדלל 0.1N HCl עם NFW ל-pH 2). לדילול אתנול, הכינו תמיסה אחת של 30 מ"ל בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל או תמיסה של 500 מיקרוליטר בצינור של 1.5 מ"ל אם משתמשים באטמי סיליקון.
    3. הכן את הפתרונות הבאים ושמור אותם על קרח: i) 32.5 מ"ל של 0.1x SSC מתמיסה 5x (שמור 30 מ"ל תמיסה בצינור חרוטי והכניס את 2.5 מ"ל הנותרים לצינור 5 מ"ל לשימוש עתידי), ii) 400 מיקרוליטר של 0.1x SSC עם 5% RI, שמור על קרח.
    4. הכן את הריאגנטים המדוללים הבאים עם 0.1 N HCl.
      1. הכן תמיסת ריאגנט חדירות (PR) פי 10 על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 N HCl למגיב הליופיליזציה המסופק מסחרית.
        הערה: שמור על קרח רק למשך שעה, הקפד להשתמש במוצר לשימוש עתידי והקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      2. הכן 500 מיקרוליטר של תמיסת PR 1x (לדלל תמיסת PR פי 10 עם 0.01 N HCl, לשמור על קרח עד 6 שעות).
        הערה: חיוני שה-pH של 0.01 N HCl יהיה בטווח של 10% מ-pH 2.0, שכן אנזימים מבוססי פפסין מתפקדים בצורה מיטבית ב-pH 2.
  3. הפזר שקופיות על ידי השריית שקופיות בקסילנס (מומלץ) למשך 2 סיבובים ב-20 דקות כל אחד.
  4. מיד, יש להרטיב את הדגימה עם אתנול (100%, 96%, למשך 2 סיבובים, 5 דקות כל אחד, ואחריו 90%, 70%, 50% ו-30% למשך סיבוב אחד, 2 דקות). לבסוף, יש להתייבש עם NFW למשך דקה אחת. לדילול אתנול, השתמש ב-30 מ"ל תמיסה בצינור חרוטי של 50 מ"ל לכל שקופית אם מכינים דגימות למחקרי מיקרוביום, או השתמש ב-30 מ"ל לכל שתי שקופיות אם מכינים דגימות שאינן מיקרוביום. עבור כל הדילולים הבאים, הכינו 30 מ"ל תמיסה בצינור חרוטי של 50 מ"ל, או, אם משתמשים באטמי סיליקון, השתמשו ב-500 מיקרוליטר של תמיסהלכל שבב 1 ס"מ 2 כדי לכסות את שטח השבב במלואו.
    אופציונלי: מומלץ למקם תא סיליקון ממגלשת הסרה בת 3 חדרים סביב השבב כדי ליצור אטימה לאחר שלב 100% אתנול, כפי שמוצג באיור 2F-H. זה מאפשר שימוש בכמויות קטנות יותר של ריאגנטים ומפחית את הסיכון לפגיעה בשבב. לחלופין, ניתן להשתמש בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל כדי לטבול במלואו את שקופית הסטריאו-רצף לאורך כל ההליך.

6. (אופציונלי) הדמיה גרעינית וצביעת ssDNA

הערה: אפשר לראגנט הקישור FFPE להגיע לטמפרטורת החדר (~25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש ב-6.1. פתרונות צביעה אחרים אפשריים, אך צביעה גרעינית פלואורסצנטית נדרשת כיום לפילוח תאים בודדים ושילוב תאים של נתונים טרנסקריפטומיים.

  1. צביעה פלואורסצנטית באמצעות צבע DNA חד-גדילי (ssDNA)
    1. הכן 2 מיקרוליטר של תמיסת צביעה ssDNA במאגר SSC על ידי דילול מגיב ה-ssDNA של Qubit עם מאגר SSC פי 5 בדילול של 1:1 לכל 1 עד 2 שבבים.
      הערה: דילול ה-ssDNA יכול להשתנות על סמך המיקרוסקופ המשמש בעת הדמיה.  לכן יש לבדוק מיקרוסקופים חדשים עם סט דילול צבע ssDNA באמצעות שבב הערכה ורקמת בדיקה כדי לקבוע את הטווח הדינמי הטוב ביותר.
    2. צור תערובת מאסטר של תמיסת הצביעה (200 מיקרוליטר לשבב) באמצעות דילול של 1:20 של מעכב RNase (RI), דילול 1:200 של דילול ssDNA ו-5x SSC הנותר.
    3. הוסף תמיסת מכתים (150 מיקרוליטר לשבב) ודגר בחושך למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את תמיסת הצביעה מפינת השבב בעזרת פיפטה.
      הערה: אם אתה משתמש בתא הסיליקון הנשלף, הסר אותו לפני צביעת השבב בתערובת צבע ssDNA.
    4. שטפו את השבב פעמיים עם 0.1x SSC (150 מיקרוליטר לשבב בכל פעם) למשך 10-15 שניות. יבש את שולי השקופית בזהירות עם נייר עדשות לאחר הכביסה השנייה (מבלי לגעת בשבב).
    5. הוסף ~3-5 מיקרוליטר גליצרול (השתמש פחות במיקרוסקופ הפוך) כדי להרכיב את התלתן (היזהר מבועות).
      הערה: ודא שהנפח הנכון של גליצרול מוחל על אזור ההחלקה, בדרך כלל כ-4 מיקרוליטר עבור שבב 1 ס"מ2. שימוש רב מדי בגליצרול עלול לגרום להחלקת הכיסוי לזוז כאשר המגלשה מוחזקת אנכית. שימוש במעט מדי גליצרול מגביר את הסיכון לנזק לרקמות בעת הסרת הכיסוי ועלול להכניס בועות, מה שעלול להשפיע לרעה על תוצאות ההדמיה ופילוח התאים הבודדים.
    6. זרוק את הכיסוי מגובה של כ -1 ס"מ על השבב. אם אתה משתמש במיקרוסקופ מעורב, ודא שהכיסוי אינו מחליק כאשר הוא מוחזק אנכית. אם הוא אכן עולה מחדש מבלי להוסיף עוד גליצרול.
    7. צלם תמונות פלואורסצנטיות של רקמה מוכתמת ב-ssDNA עם מיקרוסקופ בעל שדה רחב עם חפיפה של 10% בין אריחי התמונה.
      הערה: מומלץ לבצע מפת מיקוד ידנית של 9-13 נקודות עם מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות מטרה פי 10. ניתן להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, אך הוא רגיש הרבה יותר לשינויים מוקדיים על פני הרקמה והשבב.
    8. תפר תוכנת עיבוד תמונה כגון ImageJ, תוך שימוש בחפיפה תיאורטית כדי ליצור את המיקום המשוער של כל אריח ולאחר מכן לבצע חפיפה חישובית תואמת פיקסלים כדי לכוונן את אריחי התמונה
    9. עבד תמונות בתוכנת StereoMap וודא ש-Image QC עובר לפני שתמשיך.
    10. טבלו את שקופית הסטריאו-seq ב-30 מ"ל של 0.1x SSC עד שהכיסוי יתנתק.

7. תהליך הצלבה

הערה: הימנע מלגעת או להטות את השבב במהלך שלב זה, ופיפטה בעדינות.

  1. ודא שמגיב הקישור FFPE נמצא בטמפרטורת החדר החמה (~25 מעלות צלזיוס) ובדוק כדי לוודא שאין חלקיקים שהופכים את התמיסה לעכורה. אם חלקיקים נראים לעין, מחממים ל-55 מעלות צלזיוס ומצננים ל-30 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. הפעל את התרמו-סייקלר עם ההגדרות הבאות: 30 מעלות צלזיוס לשיווי משקל (מכסה מחומם של 85 מעלות צלזיוס); 95 מעלות צלזיוס לדגירה של 30 דקות; זמן החזקה אינסופי של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הרכיבו את אטם הקלטת, ולאחר מכן הנחו את שקופית שבב הסטריאו-seq בקלטת.
  4. הוסף מגיב FFPE decrosslinking (400 מיקרוליטר לכל שבב) לבאר הקסטה המכילה את השבב. מרחו סרט איטום על הקסטה ואשרו שהיא אטומה היטב.
  5. התחל את הדגירה של 30 דקות ב-95 מעלות צלזיוס משלב 7.2. לאחר שחלפו 10 דקות, הניחו 10 מ"ל מתנול במיכל של 15 מ"ל (יהיה צורך בכ-1 מ"ל לכל שקופית) במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
  6. הסר בזהירות את השבב מהתרמאופקלר, העביר את הקסטה לספסל וקילף את סרט האיטום.
  7. הסר והשליך את מגיב הקישור FFPE באמצעות פיפטה. לאחר הסרת כל ריאגנטים לקישור צולב, נתק והשליך את הקסטה והאטם.
  8. איזון את שקופית הסטריאו-seq לטמפרטורת החדר ~ 23 מעלות צלזיוס. מתחת למכסה אדים סטרילי, יבש את קצה השקופית והחל תא סיליקון חדש (אם רלוונטי). מוסיפים 500 מיקרוליטר מתנול צונן מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס, ומוודאים שכל החלק שקוע לחלוטין למשך 20 דקות.
    הערה: לחלופין, ניתן לטבול את כל שקופית הסטריאו-seq בצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-30 מ"ל של מתנול צונן.
  9. יש לחמם מראש את תמיסת ה-1x PR על בלוק יבש של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני השימוש כ-5 דקות לפני סיום קיבוע המתנול (שלב 7.8).
  10. לאחר השלמת הקיבוע, העבר את השקופית למכסה אדים סטרילי. נגב את כל עודפי המתנול בשקופית והמתן לאידוי המתנול שנותר על השבב (~5 דקות). הרכיבו קלטת ואטם חדשים. לאחר שהמתנול התאדה במלואו, הנח את שקופית שבב הסטריאו-seq בקלטת.

8. חדירות ושעתוק הפוך

הערה: עבור שלבים 8.1-8.11, פיפטה לאט ואל תיגע בשבב. לחץ עודף יגרום לדיפוזיה או לסימנים ב- DNBs.

  1. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב חדירות לשבב. מרחו סרט איטום על קלטת השקופיות של Stereo-seq וודאו שהיא אטומה היטב.
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. הכן את מאגר הכביסה על ידי הוספת 380 מיקרוליטר של 0.1x SSC ו-20 מיקרוליטר של RI (מעכב RNA) עבור כל שקופית. הכינו 400 מיקרוליטר לכל שקופית ושמרו על קרח עד לשימוש.
  4. משוך החוצה את הריאגנטים לשעתוק הפוך של FFPE (FFPE RT), ואז סובב את כל הדברים הבאים, ושמור את תערובת האנזימים, האוליגו והדימרים על הקרח. מחממים את מאגר FFPE RT לטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס).
  5. 5 דקות לפני הדקה לפני סיום החדירה, הכינו 200 מיקרוליטר לכל שבב של תערובת FFPE RT. הוסף מאגר FFPE RT (158 מיקרוליטר), תערובת אנזימים FFPE RT (30 מיקרוליטר), FFPE RT אוליגו (10 מיקרוליטר) ודימר FFPE (2 מיקרוליטר). מערבבים את זה בעדינות ושומרים אותו על קרח.
  6. שמירה על השבב על התרמו-סייקלר שנו את טמפרטורת הדגירה לטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס). הסר את החותם והשליך בעדינות את תמיסת ה-1x PR.
  7. שוטפים את השבב בעדינות רבה עם 200 מיקרוליטר של 0.1x SSC (עם 5% RI) לכל 1 ס"מ2 שבב.
  8. הסר את הכביסה של 0.1x SSC (עם 5% RI) מפינת השבב.
  9. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת FFPE RT לפינת השבב.
  10. החל סרט איטום על קלטת השקופיות של Stereo-seq וודא שהיא אטומה היטב; אחרת, אידוי מפחית את התשואה.
  11. התחל את הפרוטוקול תגובה איזותרמית דגירה FFPE RT ב-42 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם של 45 מעלות צלזיוס למשך (5 עד 24 שעות).
    הערה: מומלץ לדגור במשך 12 עד 16 שעות ולהיות עקבי בכל הניסויים.

9. שחרור וטיהור cDNA

הערה: עבור שלבים 9.6-9.7, פיפטה לאט ואל תיגע בשבב. לחץ עודף יגרום לדיפוזיה או לסימנים ב- DNBs.

  1. הכן 400 מיקרוליטר של מאגר שחרור cDNA על ידי חימום מאגר שחרור cDNA ב-55 מעלות צלזיוס כדי להמיס כל משקעים שאולי נוצרו.
  2. איזון מאגר שחרור cDNA לטמפרטורת חדר חמה (25 מעלות צלזיוס). אין לשים קרח.
  3. סובב את מאגר שחרור ה-cDNA ואת אנזים שחרור ה-cDNA ב-100 x גרם בצנטריפוגה שולחנית לפני השימוש.
  4. הכן מאגר cDNA על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של אנזים שחרור ל-380 מיקרוליטר של מאגר שחרור cDNA.
  5. שמירה על השבב על התרמו-סייקלר שנו את טמפרטורת הדגירה לטמפרטורת החדר (~23 מעלות צלזיוס). הסר את החותם והסר בעדינות והשליך את תמיסת FFPE RT.
  6. שטפו את השבב פעם אחת, בעדינות מדהימה, עם 0.1x SSC לכל שבב (200 מיקרוליטר).
  7. הסר 0.1x SSC מפינת השבב, פיפטינג בזהירות רבה.
  8. הוסף 400 מיקרוליטר מתמיסת שחרור ה-cDNA המוכנה לכל שבב.
  9. אטום את קלטת השקופיות של Stereo-seqs על ידי הנחת סרט איטום (או כיסוי PCR) על הקסטה. ודא שהקסטה אטומה היטב כדי למנוע אידוי, דליפה או זיהום.
  10. דגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך ≥ 5 שעות (מינימום 5 שעות עד 24 שעות) עם מכסה מחומם ל-60 מעלות צלזיוס.
    הערה: מומלץ לדגור במשך 5 עד 7 שעות או להיות עקביים בניסויים עם שעתיים.

10. אוספים את תערובת שחרור ה-cDNA

  1. מחממים מראש NFW ל-37 מעלות צלזיוס (לפחות 500 מיקרוליטר לכל שבב של 1 ס"מ2).
  2. הסר את החותם והפיפטה במרץ בכל פינה ומרכז השבב מעל הרקמה, אך אל תגרד או תיגע ברקמה. אסוף את כל תערובת שחרור ה-cDNA מהשבב והעביר לצינור צנטריפוגה של 1.5 או 2.0 מ"ל. רשום מספרי זיהוי שבב (מזהה שבב) על כל צינור.
  3. הוסף 350 מיקרוליטר של NFW מחומם מראש ישירות על משטח השבב. ושוב פיפטה במרץ עם פיפטה קטנה יותר (P100 או P200), הטה את הקצה כדי להפעיל יותר כוח גזירה, אך אל תיגע ברקמה ואל תגרד את השבב.
  4. שלבו את הכביסה משלב 10.3 (350 מיקרוליטר) עם תערובת שחרור cDNA משלב 10.2 (400 מיקרוליטר). הקפד לשלב רק את הדגימות משבב יחיד.
  5. מניחים 100 מיקרוליטר NFW על השבב, אוטמים את שקופית שבב הסטריאו-seq בקלטת ושומרים אותה במקרר עד סוף הפרוטוקול.
    הערה: במקרים של תפוקה נמוכה, שקול לשחרר מחדש את ה-cDNA. ניתן להעריך את נוכחות ה-DNA על השבב באמצעות צבע ssDNA והדמיה מחדש עם או בלי כיסוי.

11. אסוף את ניקוי חרוזי ה- cDNA

  1. השעו מחדש את cDNA משלב 10.4 עם נפח שווה של חרוזי אימוביליזציה הפיכה בשלב מוצק (SPRI). מערבבים עד שהחרוזים מתפזרים באופן שווה בכל התמיסה כדי לבחור שברי DNA מעל ~100 bp.
  2. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה שבין 27 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס (מומלץ 30 מעלות צלזיוס).
    1. במהלך הדגירה. הכן 5 מ"ל של 80% אתנול טרי ב-NFW עבור כל 2 שבבים מעובדים.
  3. קח את הצינורות עם תערובת החרוזים המודגרת וסובב לזמן קצר ב -100 x גרם על צנטריפוגה על השולחן.
  4. הנח את הצינורות על מתלה הפרדה מגנטי ודגר לפחות 5 דקות (עד שהנוזל מתבהר).
  5. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים ושמור אותו בשפופרת נקייה עם תווית. סמן את שחרור ה-cDNA עם מזהה השבב והתאריך.
  6. הוסף 1.5 מ"ל של 80% אתנול לצינורות מבלי להפריע לחרוזים ודגר במשך 30 שניות לפני הסרת האתנול.
  7. חזור על שלב 11.6 פעם נוספת, הפעם הסר כמה שיותר אתנול באמצעות קצה פיפטה קטן מבלי להפריע לחרוזים.
  8. יבש באוויר את החרוזים בצינורות עד שהם כבר לא מחזירי אור. הזמן ישתנה, לכן בדוק באופן קבוע כדי למנוע ייבוש יתר (סדקים), מה שיגרום לתשואה נמוכה.
    הערה: מדוד את הלחות והטמפרטורה של החדר. בטמפרטורות גבוהות (27 מעלות צלזיוס) ולחות נמוכה (פחות מ-20%), החרוזים יתייבשו מהר מאוד (3 עד 5 דקות). בטמפרטורות נמוכות (23 מעלות צלזיוס), ולחות גבוהה (יותר מ-40%), החרוזים יתייבשו הרבה יותר לאט (7 עד 15 דקות).
  9. הסר את צינורות החרוזים ממתלה המגנטים, הוסף 22 מיקרוליטר NFW וערבב על ידי מערבולת.
  10. דגירה באמבטיה יבשה או במכונת PCR בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 15 דקות.
  11. צנטריפוגה קצרה והנח את הצינור בחזרה על מתלה ההפרדה המגנטי עד שהנוזל מתבהר (2 עד 5 דקות).
  12. העבירו 21 מיקרוליטר של סופרנטנט המכיל cDNA לתוך צינור ה-PCR המסומן בדגימה של 0.2 מ"ל מבלי להפריע לחרוזים.
  13. חזור על שלבים 11.9 עד 11.12 עבור כל צינור, ואסף בסך הכל 42 מיקרוליטר של cDNA. המשך ישירות עם ההגברה של cDNA (שלבים 12.1 עד 12.8).
    הערה: עיכוב בהתחלת ההגברה יביא לירידה בתפוקה, קריאות קצרות מוגברות והשפלה של תבנית DNA חד-גדילית.

12. הגברת cDNA

  1. הסר את תערובת ההגברה של cDNA ואת פריימרים FFPE cDNA מהמקפיא והניח אותם על קרח רטוב להפשרה.
  2. סובב את תערובת ההגברה של cDNA ואת פריימרים FFPE cDNA על צנטריפוגה שולחנית ב-~100 x גרם.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת הגברה cDNA ו-8 מיקרוליטר של פריימרים FFPE cDNA לכל צינור cDNA מ-42 מיקרוליטר מ (שלב 11.13) והנח בתרמו-סייקלר עם מתאם המכסה השטוח כדי למנוע עיוות צינור.
  4. הפעל את תוכנית התרמו-סייקלר להגברת ה-cDNA: דנטורציה ראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; רכיבה על אופניים: [98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות] × 15 מחזורים; הארכה סופית: 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; טמפרטורת החזקה: 12 מעלות צלזיוס (אם מעבדים מיד) / 4 מעלות צלזיוס (אם מוחזקים למשך הלילה).
  5. מדוד את ריכוז ה-DNA של 1 מיקרוליטר cDNA לפני ואחרי ניקוי החרוזים.
    הערה: יש לחשב את כמות מוצר ה-cDNA לפני הניקוי כך שתעלה על 1 מיקרוגרם עבור כל שבב של 1 ס"מ. הריכוז לאחר הניקוי צריך להיות לפחות 10 ננוגרם/מיקרוליטר. אובדן מדגם משמעותי בשלב זה נמצא בקורלציה עם ציוני DV200; עם זאת, DV200 אינו מנבא מושלם לתוצאות.
  6. חזור על ניקוי חרוזי cDNA משלבים 11 (ניקוי חרוזים) תוך שימוש במוצר ה-PCR משלב 12.4, עם שלושה שינויים: השתמש במדף מגנטי PCR קטן יותר, הוסף רק 200 מיקרוליטר של 80% אתנול בשלב 11.6, והשהה מחדש ב-22 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA (TE) (pH 8) בשלב 11.9.
  7. אחסן חרוזים בשפופרת עם 20 מיקרוליטר NFW, מסומנים בשמות לדוגמה, ברקוד, תאריך ומזהה שבב.
  8. מדוד את התפלגות שברי ה-cDNA באמצעות מנתח שברים. טווח גודל השבר צריך להיות בין 250-400 bp. אם השברים קטנים מדי, חזור על ניקוי החרוזים אך השתמש בטמפרטורת החדר (~25 מעלות צלזיוס) במקום 27 מעלות צלזיוס.
    נקודת עצירה אופציונלית: לאחר מדידת ה-cDNA, ניתן לאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס עד חודש ו-80 מעלות צלזיוס עד שנה. ניתן לאחסן חרוזים ב-NFW למשך שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אין להקפיא חרוזים.

13. הכנת הספרייה (יום 4)

  1. תגובת הגברה הכנת תערובת
    1. הסר את פתרון ההגברה PCR של הספרייה, ערכות ברקוד ספרייה, מוצר cDNA ו-NFW. הפשירו את ה-cDNA והריאגנטים על קרח ומים בטמפרטורת החדר וסובבו מטה ב-100 x גרם למשך 10 שניות.
  2. קבע את אסטרטגיית ברקוד הספרייה עבור כל 25 μL של תערובת פריימר ברקוד PCR.
    הערה: עבור רצף זה, כל הבסיסים חייבים להיות מיוצגים באופן שווה בכל מיקום בערכת ברקודים. לכן רוב הערכות המסחריות התואמות לכך מתוכננות עם טטרדות ברקוד מוגדרות מראש (קבוצות של ארבעה). ניתן ליישם את הטטרדות הללו על דגימות בודדות בעת פיצול על פני נתיב ריצוף, או שניתן לאגד אותם יחד לדגימה בודדת בעת ריצוף דגימה אחת לכל נתיב. שמירה על ברקודים מאוזנים היא הכרחית, מכיוון שברקודים לא מאוזנים יפחיתו את כמות הנתונים השמישים שנוצרים על ידי הרצף.
  3. קבע את נפח ה-cDNA עבור 20 ננוגרם (למשל, 10 ננוגרם/מיקרוליטר יצטרכו 2 מיקרוליטר). באמצעות זה ליצור תמיסת NFW (25 מיקרוליטר) של cDNA מדולל (לדלל ל~1 ננוגרם/מיקרוליטר).
  4. שלב תערובת הגברת ספרייה (50 μL) עם cDNA מדולל ב-NFW (25 μL) ותערובת פריימר ברקוד PCR (25 μL) לצינור PCR של 0.2 מ"ל.
  5. מערבבים את הבאר על ידי פיפטינג ומסובבים כלפי מטה ב -100 x גרם למשך 10 שניות.
  6. הכניסו את צינורות ה-PCR בנפח 0.2 מ"ל לתוך התרמו-סייקלר וודאו שיש לכם תוספת כדי למנוע ריסוק צינורות.
  7. הפעל את תוכנית התרמו-סייקלר להגברת ה-cDNA: דנטורציה ראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; רכיבה על אופניים: [98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות] × 8 מחזורים; הארכה סופית: 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; טמפרטורת החזקה: 12 מעלות צלזיוס (אם מעבדים מיד) / 4 מעלות צלזיוס אם מוחזקים למשך הלילה.
    הערה: ניתן להשתמש בכמויות משתנות של קלט cDNA כדי להכין את הספרייה. עם זאת, הכמות בשימוש תשפיע על מספר מחזורי ה-PCR הנדרשים להגברה. לדוגמה, הספק ממליץ על 20 ננוגרם של DNA קלט ושימוש ב-8 מחזורים. אפשר גם להשתמש ב-40 נ"ג עם 7 מחזורים או 80 נ"ג עם 6 מחזורים. לא מומלץ להשתמש בפחות מ-20 ננוגרם או יותר מ-80 ננוגרם של קלט cDNA.

14. ניקוי חרוזי הגברה בספרייה

  1. כמת את מוצר הספרייה הגולמית כפי שנעשה בשלב 12.5.
  2. חזור על ניקוי החרוזים משלב 11 (ניקוי חרוזים) תוך שימוש במוצר הספרייה הגולמית משלב 13.7 עם שלושה שינויים: השתמש בחרוז ביחס של 0.8:1 למוצר, השתמש במדף מגנטי PCR קטן יותר, השתמש רק ב-200 מיקרוליטר של 80% אתנול בהשוואה לשלב 11.7, והשעיה מחדש ב-22 מיקרוליטר של מאגר TE (pH 8) בשלב 11.9. הכינו כ -1 מ"ל אתנול טרי 80% טרי לכל שני 1 ס"מ2 צ'יפס.
  3. נקודת עצירה אופציונלית: לאחר מדידת הספרייה, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד חודש ו-80 מעלות צלזיוס עד שנה. ניתן לאחסן חרוזים ב- NFW למשך שבוע ב -4 מעלות צלזיוס. אין להקפיא את החרוזים.

15. מערכת DNBSEQ-T7RS לריצוף DNBs Stereo-Seq Random Oligonucleotide Primed

  1. באמצעות ערכת PE75 במערכת DNBSEQ-T7RS, הקצה את המחזורים כ-25 עבור קריאה 1 ו-62 עבור קריאה 2 (PE25+62), ואחריו אינדקס של 10 bp:
    1. הקריאה הראשונה (קריאה 1 מתוך 25 מחזורים) לוכדת את מזהה השבב המרחבי (CID) או מידע ספציפי למיקום מהברקודים מבוססי השבב.
    2. הקריאה השנייה (קריאה 2 מתוך 62 מחזורים) לוכדת את המזהה המולקולרי (MID), רצף אקראי של 6 bp, המחובר ישירות לתוספות הגן עם 3 מחזורים כהים נוספים המשמשים לתיקון שלבים וכיול היסט ברקוד. לאחר מכן נכנס גן של 30-59 bp מקריאה 2, המזוהה על ידי מיפוי לגנומים או טרנסקריפטומים ידועים.
      הערה: הוספות גנים ארוכות יותר אפשריות, אך ידרשו ערכות קצה זוגיות שונות, ושינוי בזרימת העבודה של המיפוי.
    3. מחזור האינדקס עבור דה-מולטיפלקס מכסה 10 bps בהתבסס על ברקודי הרצף שנאספו בשלב 13.2.
      הערה: זמן ריצוף אופייני של כ-10-12 שעות עבור תא זרימה של 75 PE. ריצוף נעשה לרוב בליבת ריצוף, או במתקן מסחרי, ולא בתהליך פנימי עבור רוב המעבדות, מכיוון שהוא דורש DNBSEQ-T7RS או מכשיר ריצוף דומה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנתונים שלהלן מדגימים את היכולת לבצע פילוח של תא בודד באמצעות צינור SAW ומיפוי ל-RNA שאינו פולי אדניל כגון tRNA (TRDMT1) מקטע FFPE. הנתונים הבלתי מוטים מ-Stereo-seq מאפשרים לבחון את החשיבות של לא רק mRNAs אלא גם tRNAs, rRNAs ו-RNA שאינם מארחים (אם רלוונטיים). באמצעות הפלט הישיר מצינור SAW16 והסטריאופיה להערכת איכות של פלט ה-Stereo-seq באיור 3A-G, יצרנו סקירות מרחביות סטנדרטיות, ביטוי ג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול Stereo-seq מפורט ביותר וכולל מספר שלבים קריטיים הדורשים דיוק, תזמון וסביבה נקייה כדי להבטיח הצלחה במיוחד עם פרופיל מיקרוביום או שאינו מארח שעשוי לדרוש אמצעי זהירות ספציפיים.

נדרש שימוש במים נטולי נוקלאז במהלך כל השלבים, ואסור לגעת בשבב הלכידה בשום דבר אחר מלבד הדגימה והריאגנטים. היזהר מאוד בעת השימוש במכלול הקלטות, והקדש זמן לשימוש בשבבי תרגול. שריטה באזור הרקמה תהרוס את הרזולוציה המרחבית של הרקמה, ושריטה בקווי המסילה עלולה ככל הנראה למנוע את הרזולוצי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי עבודה זו לא מומנה על ידי Complete Genomics. עם זאת, Complete Genomics תומכת בעלויות פרסום מאמר זה.  הם לא קיבלו עותק מתקדם או קלט על התוכן.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן בחלקו על ידי הברית לחקר סרטן השחלות (OCRA 811621 ו-891490), קרן Sie וקרן התרומות של סטפני סי סטלטר. מחקר זה בוצע בשיתוף פעולה עם מתקן הליבה לציטומטריה והדמיה תאית, המחלקה לרפואה וכירורגיה וטרינרית וליבת טכנולוגיית גנומיקה מתקדמת, הנתמכת בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענק התמיכה במרכז הסרטן P30 P30 CA016672 של מ.ד. אנדרסון ומומחה המחקר של NCI של ג'ארד בורקס 1 R50 CA243707-01A1.

ברצוננו גם להודות ל-Compete Genomics, במיוחד לברנדון ונדרבוש וטנזין יוסוף על ההכשרה הטכנית ופתרון הבעיות, כמו גם לג'יה "ג'קי" ז'או, יונגפו וונג וארין פטרילי. המחברים קיבלו סט של ריאגנטים FFPE OMNI וריצוף, כמו גם גישה לתוכנית הגישה המוקדמת T7, מ-Complete Genomics במחיר מוזל. בנוסף, חלק מהריאגנטים סופקו ללא תשלום לשימוש במחקר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל DNAse/RNAse רגיליםThermo Fisher Scientific / Invitrogen3456לערבב ריאגנטים (רצועות אחרות בסדר) 
100% אתנולסיגמא-אלדריץ'E7023דרגה מולקולרית
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים בנפח 15 מ"לThermo Fisher Scientific / Invitrogen339650משמש ל-aliquots 
20x Concentrate  בופר נתרן ציטראט מלח (SSC)סיגמא-אלדריץ'S6639-1Lשימש לייצור 5X SSC לצביעה ו-1X SSC לצעדים של שטיפה והסרת כיסוי.
מכשיר ביואנלייזר 2100אג'ילנטDiscountinuedמבנה: ביואנלייזר
תא 3 בארות, נשלףאיבידי80381תא סיליקון להפחתת נפחים במהלך ההידרציה מחדש וקיבוע מתנול.
מקור אור UV 405 ננומטרמגווןלא זמיןלצורך ייבוש שרף UV
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים בנפח 50 מ"לThermo Fisher Scientific / Invitrogen339652משמש לאליקוטים ולדה-פרפיניזציה  
70% אלכוהול איזופרופנול סטריליTexwipe TX3270לניקוי שטח  
ערכת DNA רגישות גבוהה של Agilentאג'ילנט5067-4626לצורך אפיון ביואנלייזר של cDNA וספריות
ערכת Agilent RNA 6000 פיקואג'ילנט5067-1513לצורך אפיון ביואנלייזר של RNA
נייר אלומיניוםמגווןלא זמיןכדי לכסות את השקופית בזמן צביעת ssDNA.
בקמן קולטר SPRIselectבקמן קולטר מדעי החיים  B23317/B23318/B23319חרוזי SPRI cDNA וניקוי ספרייה
אקונומיקהמגווןלא זמיןניקוי תחנת עבודה והסרת זיהום מיקרוביום
מטליות קצף אטומות של CONSTIXקונטק19161023לניקוי מדויק של שרף
קאברסליפסיגמא-אלדריץ'BR470045-2000EA
חבילות מתייבשותמגווןלא זמיןחבילות יבש ללא RNase וללא אבק.
מסכת פנים חד-פעמיתThermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001הגנה, זיהום RNAse ו-& סטריליות 
מגבוני מחיקת DNAסיגמא-אלדריץ'L9060-250EAדה-קונטמינציה על ידי ניקוי משטחים (מגבונים לחים)
צינורות DNA LoBind 1.5 מ"לאפנדורף 22431021משמש לאיסוף cDNA והגברות פוסט בספרייה.
צינורות DNA LoBind 2 מ"לאפנדורף 22431048משמש לאיסוף cDNA לפני הגברה.
DNBSEQ OneStep DNB Make Reagent Kitגנומיקה מלאה940-001891-00ריאגנטים להכנת DNA ננו-כדורי (DNB) והגברה
ערכת תגובת ניקוי DNBSEQ-T7RSגנומיקה מלאה940-001903-00מחסנית לכביסה לאחר סיום הרצף
ערכת ריאגנט עומס DNB DNBSEQ-T7RSגנומיקה מלאה940-001894-00מגיבים ולוחית לטעינת DNBs לתא הזרימה
תא זרימת ריצוף DNBSEQ-T7RSגנומיקה מלאה940-001902-00נתיב אחד/תא זרימה
ערכת תגובת ויזואליזציה סטריאו-SEQ של DNBSEQ-T7RSגנומיקה מלאה940-001893-00המחסנית והריג'נטים לרצף.
מערכת DNBSEQ-T7RSגנומיקה מלאהסט ויזואליזציה סטריאו-סקווי זה עושה שימוש בטכנולוגיית DNBSEQ. ריצת ריצוף מתחילה בהיברידיזציה של עוגן DNA, ולאחר מכן מחובר גלאי פלואורסצנטי לננובול ה-DNA (DNB) באמצעות כימיה של ריצוף עוגן קומבינטורי (cPAS). לבסוף, מערכת ההדמיה ברזולוציה גבוהה לוכדת את אות הפלורסצנטי. לאחר עיבוד דיגיטלי של האות האופטי, הסיקוונסר מייצר מידע ריצוף איכותי ומדויק.
אוויר דחוס מהאבקמטיןM-6318חשוב להשתמש במותג הזה או במותג עם דלק דומה  
להבי מיקרוטום מסוג Edge-RiteThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280Lהיסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
מקפיא עמיד לפיצוציםמגווןלא זמיןלקרר מתנול לפני ובמהלך שלב קיבוע המתנול.
מברשות היסטולוגיהמגווןלא זמיןהיסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אלדריץ'2104-50MLלדילול אנזים הפרמוליבליזציה ב-0.01 N HCl (pH 2). ריכוז המלאי הסטנדרטי לתמיסת HCl הוא 0.1 ניוטון.
מערכת הדמיהמגווןלא זמיןGC Stomics Imager, לסיה, Evo Revolution
תמיסת ניקוי זיהום Invitrogen RNaseZap RNaseThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780ניקוי תחנת עבודה והסרת זיהום RNAse
מגבים עדינים של Kimtech & nbsp;קימטק34155לייבוש ספסלים, ציוד, פיפטות וכו'.
מעיל המעבדהמגווןלא זמיןציוד הגנה אישי (PPE)
נייר העדשהThermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997עבודות שונות לייבוש שקופיות ללא שידור
מגבוני מחיקת DNA של Lookoutסיגמא-אלדריץ'L9060ניקוי תחנת עבודה והסרת זיהום PCR
מתקן הפרדה מג'נטי 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08להפרדת חרוזים בצינורות PCR
Magjet Rack בגודל 12x1.5 מ"לThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02להפרדת חרוזים בצינורות של 1.5 מ"ל
מיקרוטום סיבובי ידנילייקהRM2235היסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
מתונל ו-ge; 99.9%, מתאים לאימונופלואורסצנציה, HPLCסיגמא-אלדריץ'34860לקיבוע (צריך להיות בדרגת HPLC)
מלקחיים מיקרו-דיסקאטייםסיגמא-אלדריץ'F4142-1EAהיסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
מיקרופיפטהמגווןלא זמין
מים ללא נוקלאז בדרגה מולקולרית ללא טיפול ב-DPECמגווןלא זמיןדילול ושחרור חרוזים
כפפות ניטרילמגווןלא זמיןציוד מגן אישי
תנורמגווןלא זמיןלאפות צ'יפס
צינורות PCR 0.2 מ"ל עם קבלים מחובריםמגווןלא זמיןליישומי PCR
כיסויי PCR  מגווןלא זמיןהחלפה אם הדבק על הכיסוי המסופק חלש
הוד ו-PCR תחנת עבודהמיסטרMY-PCR24-010לשלבים טרום-PCR (RNA ל-cDNA)
מד pHמגווןלא זמיןמד pH לאישור pH של HCl.
תמיסת פולי-אל-ליזיןסיגמא-אלדריץ'A005-Cאופציונלי להגדלת ההידבקות של הרקמה לשבבים
פלואורומטר קיוביט 4Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226פגיעה; מדידת כמות DNA
ערכות בדיקת כימות קיוביט dsDNAThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851למדידת cDNA וכימות ספרייה
ערכת בדיקת ssDNA של קיוביטThermo Fisher Scientific / InvitrogenQ10212צביעת ssDNA (רק צבע בשימוש)
גוש קרח ללא RNAseמגווןלא זמיןהיסטולוגיה - משמשת בחתך דגימות להידרציה של בלוקים לפני החתך
תמיסת ניקוי זיהום RNaseZap RNaseThermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782תמיסה לניקוי זיהום פני השטח שמשמידה RNAים
ערכת RNeasy FFPEקיאגן73504 & 19093להפקת RNA והפקת RNA מדידת DV200  
Sculpt Ultra White שרףסיראיה טקלא זמיןשרף עמיד לטמפרטורות גבוהות ל-UV הניתן לריפוי
ערכת הכנת ספריית ברקוד ל-Stereo-seq 16STOmics / גנומיקה מלאה111KL160לבניית ספריית OMNI FFPE ב-Stereo-seq
ערכת אביזרים סטריאו-סq FFPESTOmics / גנומיקה מלאה310AK002חלקי אביזרי OMNI מרחביים של ערכת 211SN114
סלייד N-שבב סטריאו (1 ס"מ x 1 ס"מ)STOmics / גנומיקה מלאה210CN114שבב OMNI מרחבי חלק מערכת 211SN114
מתאם PCR ל-Stereo-seq  STOmics / גנומיקה מלאה301AUX001לשלבים של היברידיזציה של PCR מותאמים להתאים לשלושה, בדומה למתאם היברידיזציה מיקום PCRmax
ערכת N של טרנסקריפטומיקס סטריאו-סקSTOmics / גנומיקה מלאה211KN114חלק רג'נט מרחבי של OMNI מתוך ערכת 211SN114
להב גילוח תעשייתי כללי Surgical DesignThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236היסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
פתרון TE Buffer pH 8.0סיגמא-אלדריץ'8890להסרת cDNA וספריות
תרמיים סייקלריםBioRad / מגוון1861096 /12015392 / שונותמכונת PCR עם מכסה ידני או אפשרויות באר עמוקה (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler וכו')
ערכות בופר pH All-in-One של Thermo Scientific OrionThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
אמבט ציפה לרקמות - דיגיטלי XH-1003בכורהNC0779538היסטולוגיה - משמשת לחיתוך דגימות
משקפיים מגן UVמגווןלא זמיןלמען בטיחות בזמן ריפוי UV
קסילניםסיגמא-אלדריץ'247642לצורך דה-פרפיניזציה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles