Subnanometer-resolution Structural Determination of Hemagglutinin from Cryo-electron Tomography of Influenza Viruses

Qiuyu J. Huang; Clint N. McDaniel; Alijah A. Griffith; Celia A. Schiffer; Mohan Somasundaran

doi:10.3791/68636

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת

DOI: 10.3791/68636

November 7, 2025

Qiuyu J. Huang¹, Clint N. McDaniel¹, Alijah A. Griffith¹, Celia A. Schiffer¹, Mohan Somasundaran¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology,University of Massachusetts Chan Medical School

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד נתונים של נגיפי שפעת שצולמו באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית וממוצע תת-טומוגרפיה לאחר מכן של גליקופרוטאין המגלוטינין. פרוטוקול זה מכסה עיבוד נתונים שלב אחר שלב, החל מעיבוד מקדים של תמונה ועד לליטוש המודל הסופי.

Abstract

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית היא כלי רב עוצמה להדמיית דגימות הטרוגניות, כאשר יישום עיקרי אחד הוא אפיון מבני של נגיפים פליאומורפיים. בשנים האחרונות, ממוצע תת-טומוגרפיה של גליקופרוטאינים נגיפיים התגלה כשיטה להמחשה ישירה של חלבונים חיוניים אלה על פני השטח של ויריונים שלמים. מטרה חשובה אחת היא גליקופרוטאין המגלוטינין (HA) של נגיף השפעת, המכסה בצפיפות את המעטפת הנגיפית ואחראי על קשירת קולטני שפעת ואיחוי הממברנה. בעוד שדווחו ממוצעים תת-טומוגרפיים של HA של שפעת, הרזולוציות שלהם הוגבלו בשל יחס האות לרעש הנמוך הטבוע ב-cryoET כמו גם המאמץ הידני הנדרש לניתוח ויריונים הטרוגניים של שפעת. מוצג כאן צינור ניתוח cryoET המשלב מספר חבילות תוכנה לניתוח נתונים טומוגרפיים של נגיפי שפעת ביעילות ובחוזקה. פרוטוקול זה מתאר את הקביעה המבנית של HA מנגיפי שפעת, דרך שלבים מתיקון תנועה ראשוני ועד לבניית המודל הסופי. בעקבות צינור זה, התקבל שחזור HA ברזולוציה של 6.0 Å משני מערכי נתונים של cryoET שנאספו מזן השפעת A/Puerto Rico/8/34 (PR8).

Introduction

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryoET) יושמה במהלך העשורים האחרונים כדי ללכוד תמונות של קומפלקסים של חלבונים, וירוסים, תאים ואורגניזמים. שיטה של מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryoEM), cryoET היא שיטת ביולוגיה מבנית שבה דגימה ביולוגית מוקפאת, ולאחר מכן מצולמת דרך מגוון כיוונים באמצעות הטיה ^1,2,3. תמונות שצולמו בכל כיוון מיושרות לאחר מכן באופן חישובי לציר ההטיה המשותף שלהן ומשוחזרות לטומוגרפיה כדי לספק תצוגה תלת מימדית⁴.

בעוד שקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו-cryoEM של חלקיק בודד דורשות מולקולות מטוהרות והומוגניות מבחינה מבנית, cryoET יכול לדמות מולקולה ישירות בהקשר המקורי שלה⁴. לכן, יתרון עיקרי אחד של cryoET הוא יכולתו לדמיין דגימות פליאומורפיות, כגון נגיפים קרומיים, כולל שפעת ^5,6,7. הבטחה נוספת של cryoET היא היכולת שלו לצלם על פני קני מידה. בעוד שטומוגרפיה אינה נפתרת בדרך כלל מעבר ל-5-10 ננומטר⁸, השילוב של ממוצע תת-טומוגרמה, שבו עותקים של אותו חלקיק מזוהים, מיושרים וממוצעים, יכול לגרום לרזולוציה כמעט אטומית בכמה מולקולות ביולוגיות כגון ריבוזומים ^9,10. עם זאת, רק סוגים מוגבלים של מולקולות יכולים להגיע לרזולוציה זו; ממוצעי תת-טומוגרמה אינם עולים בדרך כלל על רזולוציה של 10-15 Å. לעומת זאת, cryoEM של חלקיק בודד משיג באופן שגרתי רזולוציות של 3-4 Å לאחר מהפכת הרזולוציה¹¹. ההתקדמות האחרונה הן בתפוקה גבוהה יותר של תוכנת רכישת נתונים cryoET והן בתוכנת ניתוח אפשרו קביעת מבנה ברזולוציה תת-ננומטרית של מולקולות ביולוגיות נוספות בהקשר המקורי שלהן 12,13,14,15,16,17,18.

שימוש נפוץ אחד עבור cryoET הוא לדמיין מורפולוגיה, ארגון ומבנה של וירוסים. למרות הרזולוציה הנמוכה יותר שמעניקה טכניקה זו בהשוואה ל-cryoEM של חלקיק בודד או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, cryoET בשילוב עם ממוצע תת-טומוגרפיה יכול לספק מידע על האופן שבו חלבונים נגיפיים מתנהגים בסביבתם המקורית ולספק פרטים חיוניים על ארגונם בהקשר של הוויריון. יעד נפוץ ל-cryoET של נגיפים הוא גליקופרוטאינים על פני השטח המשמשים בדרך כלל לחיבור ואיחוי של תאי מארח, מכיוון שהם לרוב האנטיגנים והמטרות העיקריים לטיפולים או חיסונים. עם ההתקדמות האחרונה בחבילות עיבוד cryoET, זה הפך לאפשרי יותר ויותר להשיג ממוצעים ברזולוציה תת-ננומטרית של גליקופרוטאינים אלה 19,20,21,22. דוגמה אחת כזו היא המגלוטינין (HA), החלבון העיקרי על פני השטח של נגיפים של שפעת. לא רק שחלבון זה מבצע גם קשירת קולטנים וגם היתוך ממברנה, אלא הוא גם מכסה את הוויריון בצורה צפופה להפליא, עם מאות עד אלפי HAs על ויריון⁵ יחיד. הפרוטוקול המוצג כאן (איור 1) משלב מספר חבילות נפוצות עם סקריפטים פנימיים כדי לתאר שלבים מעיבוד מקדים ועד חידוד מודל עבור ממוצע תת-טומוגרמה של HA של שפעת.

Protocol

הערה: ניתן לגשת למערכי נתונים לדוגמה המשמשים לפרוטוקול זה בכתובת EMPIAR-12864, הכוללת את שתי הקבוצות של סדרות הטיה המשמשות לפרוטוקול זה. סדרת ההטיה נאספת מרשתות צלילה ידנית של נגיף שפעת A מטוהר בגודל פיקסל פיזי של 2.09 Å לפיקסל כדי להבטיח שדה ראייה גדול מספיק כך שכל סדרת הטיה תכיל מספר ויריונים, וגם כדי לעבד שחזורים ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. עבור מערכי הנתונים של המשתמשים עצמם, מומלץ להתחיל את זרימת העבודה עם סרטי הטיה גולמיים. מערכי נתונים אלה עובדו והודגמו באמצעות תחנות עבודה בעלות ביצועים גבוהים. טבלת החומרים מפרטת את החומרה והתוכנה המשמשות לפרוטוקול זה. כל חבילות התוכנה המשמשות בפרוטוקול זה הן קוד פתוח וזמינות להורדה; קישורי התקנה והוראות מפורטים בטבלת החומרים. תחנת העבודה המומלצת לעיבוד מערכי נתונים של cryoET צריכה להיות מצוידת במעבד בעל 8 ליבות לפחות, כרטיס GPU ייעודי עם 6 GB של VRAM, 64 GB של זיכרון RAM ו-2 TB של אחסון מקומי.

1. עיבוד מקדים של סרטי הטיה ושחזור טומוגרמות קריו-אלקטרונים בעיוות ²³ ו-IMOD ²⁴

במסוף, הפעל סביבת conda שבה מותקן Warp באמצעות הפקודה הבאה:
conda activate warp_environment
צור קובץ הגדרות סדרת מסגרות לעיבוד סדרות מסגרות. זהו קובץ תצורה המכיל מטא נתונים על המיקרוסקופ, מיקום הנתונים לעיבוד והיכן לאחסן קבצי פלט.
WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
הערה: נתונים אלה נאספו במצב סופר-רזולוציה.
בצע הערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF) ותיקון תנועה.
WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
הערה: פרמטר m_grid צריך להתאים למספר תת-המסגרות בתוך סרט הטיה - מערכי הנתונים שלנו כללו 5 תת-פריימים לכל סרט הטיה.
ייבא מטה-נתונים של סדרות הטיה כדי ש-WarpTools יוכל לזהות אילו סרטים שייכים לאיזו סדרות הטיה.
WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
לאחר אכלוס תיקיית ה-tomostar, צור קובץ הגדרות סדרת הטיה לעיבוד סדרות הטיה
WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
כתבו חבילות הטיה ובצעו יישור אוטומטי של סדרות הטיה מבוססות אמון באמצעות תוכנית האצווה של IMOD באמצעות ממשק המשתמש הגרפי Etomo²⁴.
1. הפעל את הפקודה הבאה בטרמינל:
  Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
  הערה: סדרות ההטיה יוצאו פי 4 מגודל הפיקסלים הפיזיים כדי להפחית את זמן היישור ומשאבי החישוב.
2. בחר ערכת נתונים לדוגמה כדי להגדיר תחילה פרמטרי יישור לפני החלתם כתבנית עבור אצווה.
3. ייבא פרמטרי יישור מ-IMOD אם אתה משתמש ב-batchruntomo.
  WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
  הערה: עבור מערך נתונים זה, השימוש בממשק המשתמש הגרפי של Etomo הניב תוצאות טובות יותר מאשר העטיפות בתוך WarpTools.
4. לחלופין, בצע יישור אוטומטי של סדרות הטיה ללא נאמנות באמצעות עטיפת AreTomo²⁵ בתוך WarpTools.
  WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
  הערה: עטיפת AreTomo נבדקה עם AreTomo1.3.4.
הפעל את הפקודה הבאה בטרמינל כדי להעריך פרמטרים של CTF עבור סדרות הטיה:
WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
בנו מחדש טומוגרפיה באמצעות WarpTools.
1. הגדר משתנה סביבה:
  export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
  הערה: שלב זה מבטיח שהטומוגרמות יהיו תואמות לשלבים הבאים של עיבוד תמונה והדמיה בתוכנות אחרות המשמשות בפרוטוקול זה.
2. כדי לשחזר טומוגרפיה, בצע בטרמינל: WarpTools ts_reconstruct --settings warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
חזור על שלבים 1.2 - 1.8.2 עבור כל מערכי הנתונים.

2. עיבוד מקדים של טומוגרפיה וקטיף חלקיקים

במסוף, הפעל סביבת קונדה עם IsoNet²⁶ מותקן.
conda activate isonet_env
התכונן לעיבוד טומוגרפיה על-ידי יצירת תיקיית משנה והעברת כל הטומוגרפיות לתיקיה זו.
mkdir tomo_folder mv tomograms*.mrc tomo_folder/
צור כוכב file בתיקיית הפרויקט.
isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
בעזרת עורך טקסט, פתחו את קובץ הכוכב שנוצר והזינו את ערך ביטול המיקוד המשוער של תמונות ההטיה של 0 מעלות בעמודה הרביעית (_rlnDefocus) לכל טומוגרפיה, שניתן לאתר בקובץ processed_items.json בתיקייה warp_tiltseries.
הערה: ערך ביטול המיקוד צריך להיות באנגסטרומים עבור IsoNet. Warp כותב ערכי דה-פוקוס במיקרומטר, מה שדורש מקדם כפל של 10,000.
הפעל את הפקודה CTF deconvolve בטרמינל.
isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
לאחר הפירוק, הפעל את EMAN2 GUI²⁷ כדי להתחיל בעיבוד מקדים של טומוגרמות לאיסוף חלקיקים.
conda activate eman_env e2projectmanager.py
תחת טומוגרפיה, לחץ לחיצה ימנית על החץ לצד נתונים גולמיים ובחר ייבוא טומוגרמות מהתפריט הנפתח.
לחץ לחיצה ימנית על החץ הסמוך ל-Segmentation ובחר Preprocess Tomograms.
הערה: פרמטרי ברירת המחדל מתאימים ככל הנראה למערכי נתונים רבים. עבור טומוגרפיות אלה, הוחל מסנן מעביר נמוך ב-4 Å ותמונות ההטיה נורמלו. לאחר עיבוד מקדים, EMAN2 תיווצר אוטומטית ספריית מידע עם קבצי .json ריקים (עם שמות בסיס דומים לקבצים שעובדו מראש). יש להוסיף את ה-angpix לקבצי ה-json לפני איסוף החלקיקים.
אימון רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) לזהות גליקופרוטאין HA.
1. שנה את ספריית העבודה למיקום הטומוגרפיה שישמשו לאימון CNN ולליקוט חלקיקים:
  cd path/to/tomograms
2. השתמש בטרמינל כדי לפתוח את חלון ההדרכה של CNN.
  e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
3. ודא שארבעה חלונות פתוחים: אחד מכיל את המידע על פרמטרים וטומוגרפיות של CNN במדריך, ושלושת החלונות האחרים מכילים תמונות של הפניות טובות (חיובי), הפניות גרועות (שליליות) וחלקיקים שנבחרו על ידי CNN (חלקיקים).
4. לחץ לחיצה ימנית על כפתור חדש בממשק המשתמש הגרפי של CNN כדי לאתחל CNN חדש. הגדר את קצב הלמידה המוגדר כברירת מחדל ל-0.0001 ואת גודל הקופסה ל-8.
5. תחת העמודה FileName , לחץ לחיצה ימנית על טומוגרפיה מייצגת כדי לפתוח אותה בחלון חדש.
  הערה: רק טומוגרפיה אחת יכולה להיות פתוחה בכל פעם.
  1. כדי לנוע בציר z של טומוגרפיה, מקם את הסמן מעל הטומוגרפיה הפתוחה והקש על גלגל הגלילה של עכבר המחשב כדי לפתוח חלון חדש. המחוון שכותרתו N# ישנה את ציר ה-z.
6. בטומוגרפיה הפתוחה, בחר 10-20 תכונות המתאימות ל-HA באמצעות לחצן העכבר השמאלי בחלונית החיובית.
  הערה: בחר הן את החלק העליון והן את הצד view של HA, המופיעים כצילינדרים או משולשים מעל הממברנה, כהפניות טובות לרשת חזקה יותר.
  1. תמונות של הפניות חיוביות יופיעו בחלון חיובי . להסרת הפניה, החזק את מקש Shift ולחץ לחיצה ימנית על תמונת הפניה.
7. עבור לחלונית שלילית ובחר 10-20 הפניות המתאימות לתכונות כגון תיקוני ממברנה ריקים, צפיפות vRNP, סמנים נאמנים ופסולת.
  הערה: הפניות יופיעו בחלון שלילי .
8. התחל את אימון CNN על ידי לחיצה ימנית על כפתור הרכבת בחלון הראשי.
  הערה: מספר האיטרציות (Niter) בחלון הראשי משנה את מספר האיטרציות של ההכשרה שעובר ה-CNN. ממליץ להגדיר את הפרמטר ל-50.
9. לאחר שה-CNN הוכשר על ההפניות שנבחרו, לחץ לחיצה ימנית על Apply כדי להשתמש ב-CNN כדי לבחור חלקיקים בטומוגרמה הפתוחה.
  הערה: ניתן לראות תמונות של חלקיקים שנאספו בחלון חלקיקים. חלקיקים נבחרים יוצגו גם בטומוגרמה בעיגולים כחולים.
10. המשך לבחור הפניות חיוביות ושליליות בהתבסס על הרשת שהוחלה, תוך שמירה מעת לעת על ההתקדמות באמצעות לחצן שמור .
11. לאחר שיהיה משביע רצון, בחר החל הכל כדי שה-CNN יבחר חלקיקים בכל הטומוגרפיות בספרייה ויעריך את התוצאות במספר טומוגרפיות; בצע אימונים נוספים לפי הצורך.
שמירת קואורדינטות בקובץ טקסט עבור כל טומוגרפיה.
1. פתח את ממשק המשתמש הגרפי EMAN2 באמצעות הפקודה e2projectmanager.py .
2. לחץ על החץ שליד ממוצע תת-טומוגרפיה ולחץ על אגרוף ידני.
3. הזן את שם הטומוגרמה ולחץ על הפעל.
4. שמור את הקואורדינטות בקובץ הטקסט על-ידי בחירה באפשרות קובץ > שמור תיבות > tomogram_ha.txt.
5. נווט אל תיקיית המשנה של neuralnets ותיקיית המשנה של המידע כדי לגבות את nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf ו-boxes3dref.hdf.
כדי להבטיח שהניתוח מבוצע רק על ויריונים שהורכבו במלואם כאשר ניכרת נוכחות של שכבת חלבון המטריצה (M1) וקומפלקס ריבונוקלאופרוטאין ויראלי (vRNP), אמן רשת עצבית קונבולוציונית שנייה לזיהוי חלבון M1.
1. עקוב אחר אותו פרוטוקול כמתואר בשלב 2.9, שינוי גודל תיבת האימון מ-8 ל-14.

3. אוצר חלקיקים

הורד מחברות מ-https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
פתח את מחברת CNN_Particle_Cleaning.ipynb וטען את המודולים הנדרשים.
הערה: הסקריפט משתמש ב- Open3D²⁸ כחבילה להמחשת קואורדינטות חלקיקים כענני נקודות תלת-ממדיים.
טען קבצי טקסט המתאימים לקואורדינטות HA ו-M1 והצג כענני נקודות תלת-ממדיים באמצעות חבילת Open3D.
סנן חריגים של קואורדינטות HA באמצעות הסרת חריגים סטטיסטיים כפי שמיושמים ב- Open3D.
הערה: הערכים ההתחלתיים המוצעים עבור HA הם nb_neighbors = 50 (מספר הקואורדינטות השכנות סביב קואורדינטה) ו- std_ratio = 0.5.
חשב את המרחק בין ענני הנקודות HA ו-M1. כל קואורדינטות ה-HA במרחק של יותר מ-20 פיקסלים מענן הנקודות M1 יזוהו כחריגות. כל קואורדינטות החלקיקים שאינן מזוהות כחריגות יישמרו בקובץ .txt פלט.
הערה: 20 פיקסלים תואמים למרחק משוער של 16 ננומטר עם גודל פיקסל של 8.35 Å/pixel. המרכז של טרימר HA לשכבת M1 הוא כ-15 ננומטר בטומוגרפיה שלנו.
שרשר את כל החלקיקים ושמור כקבצי כוכבים באמצעות pts2starfile.ipynb.

4. מיצוע וסיווג תת-טומוגרמה איטרטיבי

באמצעות WarpTools, חלץ חלקיקים במקדם binning של 4 ובצע סבבים ראשוניים של ממוצע תת-טומוגרפיה^{ב-RELION4 29}.
WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
הערה: גודל התיבה המוצע של 48 x 48 x 48 פיקסלים, המתאים לתיבה ~ 360 Å³שתהיה גדולה מספיק כדי להכיל מערך של 7-8 HA.
1. המרת קובץ כוכב עיוות לקובץ תואם RELION 4
  relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
2. צור הפניה ראשונית באמצעות relion_refine_mpi על תת-קבוצה של חלקיקים.
  head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
3. השתמש relion_refine_mpi כדי לבצע חידוד אוטומטי תלת-ממדי בתת-טומוגרמות.
  1. פקודה לדוגמה: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
    הערה: הדגימה הגלובלית והמקומית הראשונית נקבעה ל-7.5 ו-1.8 מעלות, המקבילה לסדר healpix של 4 ו-healpix מקומי של 2. השיפורים הראשוניים ממנפים בעיקר את הצפיפות החזקה של הממברנה, חלבון M1 ומערך ה-HA. טווח היסט התרגום מותר להיות גדול יותר כדי להקיף את כל התזוזות שעלולות להתרחש בעת יישור המערך.
4. חזור על המיקוד לאחר שהפעלת המיקוד הראשונה מתכנסת, שנה את התרגום ל-8 ואת השלב ל-2.
מנף סיווג דו-ממדי כדי להשליך חלקיקי זבל באמצעות relion_refine.
1. פקודה לדוגמה: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
  הערה: נעשה שימוש בסיווג דו-ממדי במקום בסיווג תלת-ממדי מכיוון שהוא יעיל יותר מבחינה חישובית. ניתן להשתמש בסבטומוגרפיה ישירות כקלט לעבודת הסיווג הדו-ממדית ללא עיבוד תמונה נוסף.
2. שלב מחלקות המכילות מערך HA ניתן לזיהוי המכיל HA גלילי, ממברנה וצפיפות M1 באמצעות relion_star_handler.
3. ראשית, צור קבצי כוכבים המכילים שיעורים טובים.
  relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
4. לאחר מכן, השתמש בפקודה הבאה relion_star_handler כדי לשלב את קבצי הכוכבים הבודדים.
  relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
חלץ מחדש ב-bin2 וחלקיקים לא מאוחסנים לעידון מקומי איטרטיבי.
1. לעידון bin2, חלץ חלקיקים באמצעות גודל קופסה קטן יותר של 80 ובצע חיפוש מקומי עם healpix ו-healpix מקומי מוגדרים ל-4 (דגימה זוויתית מקומית של 1.8 מעלות).
2. בשלב זה, שלב ערכות חלקיקים ממערכי נתונים שונים באמצעות relion_star_handler.
  relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
3. לאחר סבב העידון הראשון, צור מסכה גלילית באמצעות e2filtertool.py בתוך סביבת EMAN2 המקיפה את הממברנה המרכזית HA פלוס וצפיפות M1.
  הערה: פרמטרים המשמשים למסיכה הגלילית: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; כל שאר הפרמטרים אינם מסומנים.
4. ערכו סבב נוסף של עידון עם המסכה.
5. ערכו סבב נוסף של סיווג דו-ממדי כדי לחסל חריגים שאינם מתיישרים עם ה-HA המרכזי ופסולת נוספת.
6. חזור על התהליך עם חלקיקים לא מאוחסנים בגודל קופסה של 120 וצור מסכה רכה המכסה את ה-HA המרכזי, יישר את ההתייחסות לסימטריית C3 והחל סימטריה בשלב עידון זה.
  relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
  הערה: הרזולוציה הסופית שהושגה באמצעות RELION הייתה 6.1 Å.
חידוד סופי ב-MTools⁹
1. צור אוכלוסיית עידון (לאחר הפעלת סביבת Warp conda).
  MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
2. הוסף מקורות נתונים עבור כל ערכת נתונים.
  MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
  1. חזור על השלב הקודם עם מערכי נתונים נוספים.
3. צור את מיני העידון.
  MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
4. עידון מרובה חלקיקים.
  1. ראשית לחדד את תנוחות החלקיקים עם הפקודה: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
  2. לאחר מכן, חדדו הן את תנוחות החלקיקים והן את הסטייה הכדורית עם הפקודה: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
    הערה: הליטוש הופסק כאן מכיוון שאיטרציות נוספות לא שיפרו את הרזולוציה. עם זאת, שילובים שונים של פרמטרים שלא נבדקו באופן ממצה עשויים להמשיך לשפר את התוצאות.

5. חידוד מודל

באמצעות ChimeraX³⁰, טען את המפה הסופית ומודל אטומי של HA.
מפה ושלב את כל המקטעים התואמים לתחום האקטו-דומיין של HA, והשתמש בכלי התאם למקטעים כדי לעגן במודל HA.
1. שמור קואורדינטות שעברו שינוי של המודל.
פתח את ממשק המשתמש הגרפי של Phenix³¹ והשתמש בכלי Real Space Refinement .
1. כאשר תתבקש להוסיף קבצים, הוסף את מודל ה-HA שעבר שינוי ואת המפה, ומלא את הרזולוציה של השחזור הסופי.
2. ערכו חמישה סבבים של מזעור גלובלי, התאמת רוטמר מקומי, חידוד תפוסה ושכלול ADP קבוצתי.
דמיין את השחזור והמודל הסופי באמצעות ChimeraX.

Representative Results

כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול עיבוד זה (איור 1), זרימת העבודה שתוארה קודם לכן יושמה על שני מערכי נתונים של 25 טומוגרמות ביחד, שהתקבלו מזן נגיף שפעת H1N1 A (A/Puerto Rico/8/1934). פרמטרים לאיסוף נתונים מתוארים בטבלה 1. איור 2 ממחיש טומוגרפיה מייצגת ותצוגות מוגדלות של נגיפים של שפעת פליאומורפית. מורפולוגיות מגוונות נלכדות בטומוגרמה זו, שכן הוויריונים נעים בין כדורי לאליפסה/מוארכת בצורתם. בעוד שרוב חלקיקי השפעת מכילים מכלולי M1 ו-vRNP מאורגנים היטב, נראה כי חלק מהנגיפים אינם מאורגנים יותר וחסרים רכיבים מבניים חיוניים.

ממערך נתונים זה, קבוצה ראשונית של 40,995 תת-טומוגרמות שימשה לשחזור bin4 (8.35 Å/pix) לאחר איסוף ואוצרות חלקיקים. שני מערכי הנתונים עובדו בתחילה באופן עצמאי בשנת RELION4 עם סימטריה C1 ומסכה כדורית רחבה שהקיפה את מערך ה-HA הכולל. שלושה מחזורי חידוד בוצעו עבור תת-טומוגרמות אלה, ואחריהם סיווג דו-ממדי. לאחר הסיווג, הושלכו תת-טומוגרפיות וחלקיקי זבל שנפתרו בצורה גרועה; שאר הסבטומוגרמות חולצו ב-bin2 (4.17 Å/pix) ושני מערכי הנתונים שולבו. תת-טומוגרפיות Bin2 יושרו תחילה יחד בסבב של ממוצע תת-טומוגרמה, ולאחר מכן הוחלה מסכה גלילית סביב ה-HA המרכזי ליישור המיקוד. בשלב זה, ניתן לדמיין בבירור סימטריה טרימרית עבור שחזור ה-HA. סבבי חידוד נוספים בוצעו ב-bin2 וב-2.8 Å/pix. סבב אחרון של סיווג דו-ממדי נערך עם מסכה קטנה המכסה רק את טרימר ה-HA המרכזי עם תת-טומוגרפיות מיושרות. המחלקה העיקרית, המורכבת מ~94% מהתת-טומוגרמות הנותרות, חולצה לחלקיקים לא מאוחסנים והייתה נתונה לעידון תלת מימדי עם סימטריית C3 מיושמת. לבסוף, תת-טומוגרמות אלה יוצאו ל-M, שם בוצעו תנוחות חלקיקים ומחזורי עידון סטייה כדורית (איור משלים 1).

ממוצע הסבטומוגרמה הסופי (איור 3A), המורכב מ-15,970 חלקיקי HA, הגיע לרזולוציה גלובלית של 6.0 Å ולטווח רזולוציה מקומי של 5-7 Å (איור 4). דגם של PR8 HA שוכלל בצורה גמישה לצפיפות; ב-FSC=0.5 ו-FSC=0.143, הרזולוציה ממפה למודל הייתה 8.1 Å ו-6.6 Å, בהתאמה. הארכיטקטורה של שחזור HA דמתה מאוד למפות קודמות של cryoEM ו-cryoET. ברזולוציה הזו אפשר להבחין בין סלילי אלפא ויריעות בטא (איור 3B); יתר על כן, ניתן להתחיל לזהות גליקנים בארבעה אתרי גליקוזילציה בראש ובגבעול ה-HA (איור 3C).

התוצאות שלנו מראות את ההתאמה של cryoET בשחזור של HA מנגיפי שפעת מקומיים. באמצעות הפרוטוקול, נצפתה צפיפות ברורה של הגליקופרוטאין הגלילי בניצב לקרום הנגיפי, והרזולוציה השתפרה בכל שלב. עבור הנתונים האישיים, מוצע שממוצע הסבטומוגרמה יתחיל מערימת חלקיקים מאוחסנת, ויש לעקוב מקרוב אחר התוצאות בכל מחזור זיכוך. אם צפיפות הגליקופרוטאין אינה ניכרת בשלבים הראשונים, מומלץ למפות את מיקומי הסבטומוגרמה בחזרה לטומוגרפיה כדי לוודא מיקום מדויק. אחרת, ניתן לשנות פרמטרי יישור או ליישם שלבי סיווג נוספים כדי להשיג תוצאות מיטביות.

איור 1: צנרת כוללת לממוצע תת-טומוגרפיה של HA מ-cryoET של נגיף השפעת. הפאנל העליון מייצג זרימת עבודה מסכמת עבור שני מערכי הנתונים המשמשים להדגמת הפרוטוקול. ההרכב השני מתאים לסעיף 1 לפרוטוקול, ההרכב השלישי מתאים לסעיפים 2-3, וההרכב הרביעי מתאים לסעיפים 4-5. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טומוגרפיה מייצגת של נגיף השפעת PR8. (A) חתך דרך טומוגרפיה משוחזרת. סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר. (ב-ד) זום בתצוגה של (B) כדורי, (C) גלילי, (D) ויריון PR8 חסר M1. כל מוטות קנה המידה ב-B-D מתאימים ל-50 ננומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ממוצע תת-טומוגרמה של PR8 HA. (A) מבט מלמעלה ומהצד של שחזור HA בשתי רמות מתאר המצויד בגמישות במבנה CryoEM של חלקיק יחיד PR8 HA. (B) תצוגות חתוכות דרך שחזור HA. חצים צבעוניים תואמים לתיבות צבעוניות. (C) שחזור HA מוצג בקווי מתאר תחתונים כדי לחשוף את צפיפות הגליקן. מוצגות גם תצוגות תקריב של גליקנים בייצוג מקל במפת cryoET. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אומדן רזולוציה של ממוצע תת-טומוגרמה של HA. (A) אומדן רזולוציה מקומית של ממוצע תת-טומוגרמה HA ממופה על השחזור. סרגל הצבעים מתאר 5-7 Å בפלטת הצבעים הכחולה-לבנה-אדומה. (B) עקומות FSC של חצאי מפות ושל רזולוציה ממפה למודל. העקומה הכחולה היא של השחזור ללא מסכה, והאדום הוא של המסכה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

	מערך נתונים 1	מערך נתונים 2
גודל פיקסל	2.09	2.09
טווח הטיה	0 עד ±54°	0 עד ±66°
שלב הטיה	3°	3°
שנת איסוף	2024	2021
טווח טשטוש	4-8 מיקרומטר	4-8 מיקרומטר
מינון כולל	120 e-/Å2	120 e-/Å2
# מסגרות משנה	6	5
# סדרת הטיה בשימוש	15	11
# חלקיקים	3278	12692

טבלה 1: פרמטרים לאיסוף נתונים עבור מערכי נתונים cryoET של נגיף השפעת PR8.

איור משלים 1: זרימת עבודה של מיצוע תת-טומוגרמה עבור HA. יישור, מיצוע וסיווג איטרטיביים מתבצעים עבור תת-טומוגרפיה של HA באמצעות ביטול הדרגתי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

למחברים אין מה לחשוף.

Disclosures

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לדיונים מועילים עם מעבדת שיפר. ברצוננו להודות גם למתקן UMass Chan cryoEM Core על עזרתם ברכישת נתונים ועל מתן תמיכה וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01GM143773 ל-M.S. ו-R35GM151996 ל-C.A.S.

Materials

AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WX	AMD	https://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4	UC סן פרנסיסקו	https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52	מכללת הרפואה ביילור	https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27	אוניברסיטת קולורדו בבולדר	https://bio3d.colorado.edu/imod/
מרשמים לניתוח שפעת	בית הספר לרפואה UMass Chan	https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3	UCLA	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0	ג'ננטק	https://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000	NVIDIA	https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D	מעבדות אינטל	https://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207	מעבדת לורנס ברקלי הלאומית	phenix-online.org
RELION 4.0	מעבדת הביולוגיה המולקולרית של MRC	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
אובונטו 20.04	אובונטו	https://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1	UC סן פרנסיסקו	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
וורפ 2.0.0	ג'ננטק	http://warpem.github.io/warp/

References

Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465 (2022).
Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063 (2022).
Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222 (2024).
Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212 (2025).
Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068 (2022).
Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482 (2022).
Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724 (2022).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319 (2021).
Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318 (2021).
Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת