מאמר שיטה

קביעה מבנית ברזולוציה תת-ננומטרית של המגלוטינין מטומוגרפיה קריו-אלקטרונית של נגיפי שפעת

DOI:

10.3791/68636

⸱

7 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד נתונים של נגיפי שפעת שצולמו באמצעות טומוגרפיה קריו-אלקטרונית וממוצע תת-טומוגרפיה לאחר מכן של גליקופרוטאין המגלוטינין. פרוטוקול זה מכסה עיבוד נתונים שלב אחר שלב, החל מעיבוד מקדים של תמונה ועד לליטוש המודל הסופי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית היא כלי רב עוצמה להדמיית דגימות הטרוגניות, כאשר יישום עיקרי אחד הוא אפיון מבני של נגיפים פליאומורפיים. בשנים האחרונות, ממוצע תת-טומוגרפיה של גליקופרוטאינים נגיפיים התגלה כשיטה להמחשה ישירה של חלבונים חיוניים אלה על פני השטח של ויריונים שלמים. מטרה חשובה אחת היא גליקופרוטאין המגלוטינין (HA) של נגיף השפעת, המכסה בצפיפות את המעטפת הנגיפית ואחראי על קשירת קולטני שפעת ואיחוי הממברנה. בעוד שדווחו ממוצעים תת-טומוגרפיים של HA של שפעת, הרזולוציות שלהם הוגבלו בשל יחס האות לרעש הנמוך הטבוע ב-cryoET כמו גם המאמץ הידני הנדרש לניתוח ויריונים הטרוגניים של שפעת. מוצג כאן צינור ניתוח cryoET המשלב מספר חבילות תוכנה לניתוח נתונים טומוגרפיים של נגיפי שפעת ביעילות ובחוזקה. פרוטוקול זה מתאר את הקביעה המבנית של HA מנגיפי שפעת, דרך שלבים מתיקון תנועה ראשוני ועד לבניית המודל הסופי. בעקבות צינור זה, התקבל שחזור HA ברזולוציה של 6.0 Å משני מערכי נתונים של cryoET שנאספו מזן השפעת A/Puerto Rico/8/34 (PR8).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיה קריו-אלקטרונית (cryoET) יושמה במהלך העשורים האחרונים כדי ללכוד תמונות של קומפלקסים של חלבונים, וירוסים, תאים ואורגניזמים. שיטה של מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryoEM), cryoET היא שיטת ביולוגיה מבנית שבה דגימה ביולוגית מוקפאת, ולאחר מכן מצולמת דרך מגוון כיוונים באמצעות הטיה 1,2,3. תמונות שצולמו בכל כיוון מיושרות לאחר מכן באופן חישובי לציר ההטיה המשותף שלהן ומשוחזרות לטומוגרפיה כדי לספק תצוגה תלת מימדית4.

בעוד שקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו-cryoEM של חלקיק בודד דורשות מולקולות מטוהרות והומוגניות מבחינה מבנית, cryoET יכול לדמות מולקולה ישירות בהקשר המקורי שלה4. לכן, יתרון עיקרי אחד של cryoET הוא יכולתו לדמיין דגימות פליאומורפיות, כגון נגיפים קרומיים, כולל שפעת 5,6,7. הבטחה נוספת של cryoET היא היכולת שלו לצלם על פני קני מידה. בעוד שטומוגרפיה אינה נפתרת בדרך כלל מעבר ל-5-10 ננומטר8, השילוב של ממוצע תת-טומוגרמה, שבו עותקים של אותו חלקיק מזוהים, מיושרים וממוצעים, יכול לגרום לרזולוציה כמעט אטומית בכמה מולקולות ביולוגיות כגון ריבוזומים 9,10. עם זאת, רק סוגים מוגבלים של מולקולות יכולים להגיע לרזולוציה זו; ממוצעי תת-טומוגרמה אינם עולים בדרך כלל על רזולוציה של 10-15 Å. לעומת זאת, cryoEM של חלקיק בודד משיג באופן שגרתי רזולוציות של 3-4 Å לאחר מהפכת הרזולוציה11. ההתקדמות האחרונה הן בתפוקה גבוהה יותר של תוכנת רכישת נתונים cryoET והן בתוכנת ניתוח אפשרו קביעת מבנה ברזולוציה תת-ננומטרית של מולקולות ביולוגיות נוספות בהקשר המקורי שלהן 12,13,14,15,16,17,18.

שימוש נפוץ אחד עבור cryoET הוא לדמיין מורפולוגיה, ארגון ומבנה של וירוסים. למרות הרזולוציה הנמוכה יותר שמעניקה טכניקה זו בהשוואה ל-cryoEM של חלקיק בודד או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, cryoET בשילוב עם ממוצע תת-טומוגרפיה יכול לספק מידע על האופן שבו חלבונים נגיפיים מתנהגים בסביבתם המקורית ולספק פרטים חיוניים על ארגונם בהקשר של הוויריון. יעד נפוץ ל-cryoET של נגיפים הוא גליקופרוטאינים על פני השטח המשמשים בדרך כלל לחיבור ואיחוי של תאי מארח, מכיוון שהם לרוב האנטיגנים והמטרות העיקריים לטיפולים או חיסונים. עם ההתקדמות האחרונה בחבילות עיבוד cryoET, זה הפך לאפשרי יותר ויותר להשיג ממוצעים ברזולוציה תת-ננומטרית של גליקופרוטאינים אלה 19,20,21,22. דוגמה אחת כזו היא המגלוטינין (HA), החלבון העיקרי על פני השטח של נגיפים של שפעת. לא רק שחלבון זה מבצע גם קשירת קולטנים וגם היתוך ממברנה, אלא הוא גם מכסה את הוויריון בצורה צפופה להפליא, עם מאות עד אלפי HAs על ויריון5 יחיד. הפרוטוקול המוצג כאן (איור 1) משלב מספר חבילות נפוצות עם סקריפטים פנימיים כדי לתאר שלבים מעיבוד מקדים ועד חידוד מודל עבור ממוצע תת-טומוגרמה של HA של שפעת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ניתן לגשת למערכי נתונים לדוגמה המשמשים לפרוטוקול זה בכתובת EMPIAR-12864, הכוללת את שתי הקבוצות של סדרות הטיה המשמשות לפרוטוקול זה. סדרת ההטיה נאספת מרשתות צלילה ידנית של נגיף שפעת A מטוהר בגודל פיקסל פיזי של 2.09 Å לפיקסל כדי להבטיח שדה ראייה גדול מספיק כך שכל סדרת הטיה תכיל מספר ויריונים, וגם כדי לעבד שחזורים ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. עבור מערכי הנתונים של המשתמשים עצמם, מומלץ להתחיל את זרימת העבודה עם סרטי הטיה גולמיים. מערכי נתונים אלה עובדו והודגמו באמצעות תחנות עבודה בעלות ביצועים גבוהים. טבלת החומרים מפרטת את החומרה והתוכנה המשמשות לפרוטוקול זה. כל חבילות התוכנה המשמשות בפרוטוקול זה הן קוד פתוח וזמינות להורדה; קישורי התקנה והוראות מפורטים בטבלת החומרים. תחנת העבודה המומלצת לעיבוד מערכי נתונים של cryoET צריכה להיות מצוידת במעבד בעל 8 ליבות לפחות, כרטיס GPU ייעודי עם 6 GB של VRAM, 64 GB של זיכרון RAM ו-2 TB של אחסון מקומי.

1. עיבוד מקדים של סרטי הטיה ושחזור טומוגרמות קריו-אלקטרונים בעיוות 23 ו-IMOD 24

  1. במסוף, הפעל סביבת conda שבה מותקן Warp באמצעות הפקודה הבאה:
    conda activate warp_environment
  2. צור קובץ הגדרות סדרת מסגרות לעיבוד סדרות מסגרות. זהו קובץ תצורה המכיל מטא נתונים על המיקרוסקופ, מיקום הנתונים לעיבוד והיכן לאחסן קבצי פלט.
    WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
    הערה: נתונים אלה נאספו במצב סופר-רזולוציה.
  3. בצע הערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF) ותיקון תנועה.
    WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
    הערה: פרמטר m_grid צריך להתאים למספר תת-המסגרות בתוך סרט הטיה - מערכי הנתונים שלנו כללו 5 תת-פריימים לכל סרט הטיה.
  4. ייבא מטה-נתונים של סדרות הטיה כדי ש-WarpTools יוכל לזהות אילו סרטים שייכים לאיזו סדרות הטיה.
    WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
  5. לאחר אכלוס תיקיית ה-tomostar, צור קובץ הגדרות סדרת הטיה לעיבוד סדרות הטיה
    WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
  6. כתבו חבילות הטיה ובצעו יישור אוטומטי של סדרות הטיה מבוססות אמון באמצעות תוכנית האצווה של IMOD באמצעות ממשק המשתמש הגרפי Etomo24.
    1. הפעל את הפקודה הבאה בטרמינל:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      הערה: סדרות ההטיה יוצאו פי 4 מגודל הפיקסלים הפיזיים כדי להפחית את זמן היישור ומשאבי החישוב.
    2. בחר ערכת נתונים לדוגמה כדי להגדיר תחילה פרמטרי יישור לפני החלתם כתבנית עבור אצווה.
    3. ייבא פרמטרי יישור מ-IMOD אם אתה משתמש ב-batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      הערה: עבור מערך נתונים זה, השימוש בממשק המשתמש הגרפי של Etomo הניב תוצאות טובות יותר מאשר העטיפות בתוך WarpTools.
    4. לחלופין, בצע יישור אוטומטי של סדרות הטיה ללא נאמנות באמצעות עטיפת AreTomo25 בתוך WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      הערה: עטיפת AreTomo נבדקה עם AreTomo1.3.4.
  7. הפעל את הפקודה הבאה בטרמינל כדי להעריך פרמטרים של CTF עבור סדרות הטיה:
    WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
  8. בנו מחדש טומוגרפיה באמצעות WarpTools.
    1. הגדר משתנה סביבה:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      הערה: שלב זה מבטיח שהטומוגרמות יהיו תואמות לשלבים הבאים של עיבוד תמונה והדמיה בתוכנות אחרות המשמשות בפרוטוקול זה.
    2. כדי לשחזר טומוגרפיה, בצע בטרמינל: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
  9. חזור על שלבים 1.2 - 1.8.2 עבור כל מערכי הנתונים.

2. עיבוד מקדים של טומוגרפיה וקטיף חלקיקים

  1. במסוף, הפעל סביבת קונדה עם IsoNet26 מותקן.
    conda activate isonet_env
  2. התכונן לעיבוד טומוגרפיה על-ידי יצירת תיקיית משנה והעברת כל הטומוגרפיות לתיקיה זו.
    mkdir tomo_folder
    mv tomograms*.mrc tomo_folder/
  3. צור כוכב file בתיקיית הפרויקט.
    isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
  4. בעזרת עורך טקסט, פתחו את קובץ הכוכב שנוצר והזינו את ערך ביטול המיקוד המשוער של תמונות ההטיה של 0 מעלות בעמודה הרביעית (_rlnDefocus) לכל טומוגרפיה, שניתן לאתר בקובץ processed_items.json בתיקייה warp_tiltseries.
    הערה: ערך ביטול המיקוד צריך להיות באנגסטרומים עבור IsoNet. Warp כותב ערכי דה-פוקוס במיקרומטר, מה שדורש מקדם כפל של 10,000.
  5. הפעל את הפקודה CTF deconvolve בטרמינל.
    isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
  6. לאחר הפירוק, הפעל את EMAN2 GUI27 כדי להתחיל בעיבוד מקדים של טומוגרמות לאיסוף חלקיקים.
    conda activate eman_env
    e2projectmanager.py
  7. תחת טומוגרפיה, לחץ לחיצה ימנית על החץ לצד נתונים גולמיים ובחר ייבוא טומוגרמות מהתפריט הנפתח.
  8. לחץ לחיצה ימנית על החץ הסמוך ל-Segmentation ובחר Preprocess Tomograms.
    הערה: פרמטרי ברירת המחדל מתאימים ככל הנראה למערכי נתונים רבים. עבור טומוגרפיות אלה, הוחל מסנן מעביר נמוך ב-4 Å ותמונות ההטיה נורמלו. לאחר עיבוד מקדים, EMAN2 תיווצר אוטומטית ספריית מידע עם קבצי .json ריקים (עם שמות בסיס דומים לקבצים שעובדו מראש). יש להוסיף את ה-angpix לקבצי ה-json לפני איסוף החלקיקים.
  9. אימון רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) לזהות גליקופרוטאין HA.
    1. שנה את ספריית העבודה למיקום הטומוגרפיה שישמשו לאימון CNN ולליקוט חלקיקים:
      cd path/to/tomograms
    2. השתמש בטרמינל כדי לפתוח את חלון ההדרכה של CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
    3. ודא שארבעה חלונות פתוחים: אחד מכיל את המידע על פרמטרים וטומוגרפיות של CNN במדריך, ושלושת החלונות האחרים מכילים תמונות של הפניות טובות (חיובי), הפניות גרועות (שליליות) וחלקיקים שנבחרו על ידי CNN (חלקיקים).
    4. לחץ לחיצה ימנית על כפתור חדש בממשק המשתמש הגרפי של CNN כדי לאתחל CNN חדש. הגדר את קצב הלמידה המוגדר כברירת מחדל ל-0.0001 ואת גודל הקופסה ל-8.
    5. תחת העמודה FileName , לחץ לחיצה ימנית על טומוגרפיה מייצגת כדי לפתוח אותה בחלון חדש.
      הערה: רק טומוגרפיה אחת יכולה להיות פתוחה בכל פעם.
      1. כדי לנוע בציר z של טומוגרפיה, מקם את הסמן מעל הטומוגרפיה הפתוחה והקש על גלגל הגלילה של עכבר המחשב כדי לפתוח חלון חדש. המחוון שכותרתו N# ישנה את ציר ה-z.
    6. בטומוגרפיה הפתוחה, בחר 10-20 תכונות המתאימות ל-HA באמצעות לחצן העכבר השמאלי בחלונית החיובית.
      הערה: בחר הן את החלק העליון והן את הצד view של HA, המופיעים כצילינדרים או משולשים מעל הממברנה, כהפניות טובות לרשת חזקה יותר.
      1. תמונות של הפניות חיוביות יופיעו בחלון חיובי . להסרת הפניה, החזק את מקש Shift ולחץ לחיצה ימנית על תמונת הפניה.
    7. עבור לחלונית שלילית ובחר 10-20 הפניות המתאימות לתכונות כגון תיקוני ממברנה ריקים, צפיפות vRNP, סמנים נאמנים ופסולת.
      הערה: הפניות יופיעו בחלון שלילי .
    8. התחל את אימון CNN על ידי לחיצה ימנית על כפתור הרכבת בחלון הראשי.
      הערה: מספר האיטרציות (Niter) בחלון הראשי משנה את מספר האיטרציות של ההכשרה שעובר ה-CNN. ממליץ להגדיר את הפרמטר ל-50.
    9. לאחר שה-CNN הוכשר על ההפניות שנבחרו, לחץ לחיצה ימנית על Apply כדי להשתמש ב-CNN כדי לבחור חלקיקים בטומוגרמה הפתוחה.
      הערה: ניתן לראות תמונות של חלקיקים שנאספו בחלון חלקיקים. חלקיקים נבחרים יוצגו גם בטומוגרמה בעיגולים כחולים.
    10. המשך לבחור הפניות חיוביות ושליליות בהתבסס על הרשת שהוחלה, תוך שמירה מעת לעת על ההתקדמות באמצעות לחצן שמור .
    11. לאחר שיהיה משביע רצון, בחר החל הכל כדי שה-CNN יבחר חלקיקים בכל הטומוגרפיות בספרייה ויעריך את התוצאות במספר טומוגרפיות; בצע אימונים נוספים לפי הצורך.
  10. שמירת קואורדינטות בקובץ טקסט עבור כל טומוגרפיה.
    1. פתח את ממשק המשתמש הגרפי EMAN2 באמצעות הפקודה e2projectmanager.py .
    2. לחץ על החץ שליד ממוצע תת-טומוגרפיה ולחץ על אגרוף ידני.
    3. הזן את שם הטומוגרמה ולחץ על הפעל.
    4. שמור את הקואורדינטות בקובץ הטקסט על-ידי בחירה באפשרות קובץ > שמור תיבות > tomogram_ha.txt.
    5. נווט אל תיקיית המשנה של neuralnets ותיקיית המשנה של המידע כדי לגבות את nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf ו-boxes3dref.hdf.
  11. כדי להבטיח שהניתוח מבוצע רק על ויריונים שהורכבו במלואם כאשר ניכרת נוכחות של שכבת חלבון המטריצה (M1) וקומפלקס ריבונוקלאופרוטאין ויראלי (vRNP), אמן רשת עצבית קונבולוציונית שנייה לזיהוי חלבון M1.
    1. עקוב אחר אותו פרוטוקול כמתואר בשלב 2.9, שינוי גודל תיבת האימון מ-8 ל-14.

3. אוצר חלקיקים

  1. הורד מחברות מ-https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
  2. פתח את מחברת CNN_Particle_Cleaning.ipynb וטען את המודולים הנדרשים.
    הערה: הסקריפט משתמש ב- Open3D28 כחבילה להמחשת קואורדינטות חלקיקים כענני נקודות תלת-ממדיים.
  3. טען קבצי טקסט המתאימים לקואורדינטות HA ו-M1 והצג כענני נקודות תלת-ממדיים באמצעות חבילת Open3D.
  4. סנן חריגים של קואורדינטות HA באמצעות הסרת חריגים סטטיסטיים כפי שמיושמים ב- Open3D.
    הערה: הערכים ההתחלתיים המוצעים עבור HA הם nb_neighbors = 50 (מספר הקואורדינטות השכנות סביב קואורדינטה) ו- std_ratio = 0.5.
  5. חשב את המרחק בין ענני הנקודות HA ו-M1. כל קואורדינטות ה-HA במרחק של יותר מ-20 פיקסלים מענן הנקודות M1 יזוהו כחריגות. כל קואורדינטות החלקיקים שאינן מזוהות כחריגות יישמרו בקובץ .txt פלט.
    הערה: 20 פיקסלים תואמים למרחק משוער של 16 ננומטר עם גודל פיקסל של 8.35 Å/pixel. המרכז של טרימר HA לשכבת M1 הוא כ-15 ננומטר בטומוגרפיה שלנו.
  6. שרשר את כל החלקיקים ושמור כקבצי כוכבים באמצעות pts2starfile.ipynb.

4. מיצוע וסיווג תת-טומוגרמה איטרטיבי

  1. באמצעות WarpTools, חלץ חלקיקים במקדם binning של 4 ובצע סבבים ראשוניים של ממוצע תת-טומוגרפיהב-RELION4 29.
    WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
    הערה: גודל התיבה המוצע של 48 x 48 x 48 פיקסלים, המתאים לתיבה ~ 360 Å3שתהיה גדולה מספיק כדי להכיל מערך של 7-8 HA.
    1. המרת קובץ כוכב עיוות לקובץ תואם RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
    2. צור הפניה ראשונית באמצעות relion_refine_mpi על תת-קבוצה של חלקיקים.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
      mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
    3. השתמש relion_refine_mpi כדי לבצע חידוד אוטומטי תלת-ממדי בתת-טומוגרמות.
      1. פקודה לדוגמה: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
        הערה: הדגימה הגלובלית והמקומית הראשונית נקבעה ל-7.5 ו-1.8 מעלות, המקבילה לסדר healpix של 4 ו-healpix מקומי של 2. השיפורים הראשוניים ממנפים בעיקר את הצפיפות החזקה של הממברנה, חלבון M1 ומערך ה-HA. טווח היסט התרגום מותר להיות גדול יותר כדי להקיף את כל התזוזות שעלולות להתרחש בעת יישור המערך.
    4. חזור על המיקוד לאחר שהפעלת המיקוד הראשונה מתכנסת, שנה את התרגום ל-8 ואת השלב ל-2.
  2. מנף סיווג דו-ממדי כדי להשליך חלקיקי זבל באמצעות relion_refine.
    1. פקודה לדוגמה: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      הערה: נעשה שימוש בסיווג דו-ממדי במקום בסיווג תלת-ממדי מכיוון שהוא יעיל יותר מבחינה חישובית. ניתן להשתמש בסבטומוגרפיה ישירות כקלט לעבודת הסיווג הדו-ממדית ללא עיבוד תמונה נוסף.
    2. שלב מחלקות המכילות מערך HA ניתן לזיהוי המכיל HA גלילי, ממברנה וצפיפות M1 באמצעות relion_star_handler.
    3. ראשית, צור קבצי כוכבים המכילים שיעורים טובים.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
    4. לאחר מכן, השתמש בפקודה הבאה relion_star_handler כדי לשלב את קבצי הכוכבים הבודדים.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
  3. חלץ מחדש ב-bin2 וחלקיקים לא מאוחסנים לעידון מקומי איטרטיבי.
    1. לעידון bin2, חלץ חלקיקים באמצעות גודל קופסה קטן יותר של 80 ובצע חיפוש מקומי עם healpix ו-healpix מקומי מוגדרים ל-4 (דגימה זוויתית מקומית של 1.8 מעלות).
    2. בשלב זה, שלב ערכות חלקיקים ממערכי נתונים שונים באמצעות relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
    3. לאחר סבב העידון הראשון, צור מסכה גלילית באמצעות e2filtertool.py בתוך סביבת EMAN2 המקיפה את הממברנה המרכזית HA פלוס וצפיפות M1.
      הערה: פרמטרים המשמשים למסיכה הגלילית: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; כל שאר הפרמטרים אינם מסומנים.
    4. ערכו סבב נוסף של עידון עם המסכה.
    5. ערכו סבב נוסף של סיווג דו-ממדי כדי לחסל חריגים שאינם מתיישרים עם ה-HA המרכזי ופסולת נוספת.
    6. חזור על התהליך עם חלקיקים לא מאוחסנים בגודל קופסה של 120 וצור מסכה רכה המכסה את ה-HA המרכזי, יישר את ההתייחסות לסימטריית C3 והחל סימטריה בשלב עידון זה.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      הערה: הרזולוציה הסופית שהושגה באמצעות RELION הייתה 6.1 Å.
  4. חידוד סופי ב-MTools9
    1. צור אוכלוסיית עידון (לאחר הפעלת סביבת Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
    2. הוסף מקורות נתונים עבור כל ערכת נתונים.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. חזור על השלב הקודם עם מערכי נתונים נוספים.
    3. צור את מיני העידון.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
    4. עידון מרובה חלקיקים.
      1. ראשית לחדד את תנוחות החלקיקים עם הפקודה: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. לאחר מכן, חדדו הן את תנוחות החלקיקים והן את הסטייה הכדורית עם הפקודה: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
        הערה: הליטוש הופסק כאן מכיוון שאיטרציות נוספות לא שיפרו את הרזולוציה. עם זאת, שילובים שונים של פרמטרים שלא נבדקו באופן ממצה עשויים להמשיך לשפר את התוצאות.

5. חידוד מודל

  1. באמצעות ChimeraX30, טען את המפה הסופית ומודל אטומי של HA.
  2. מפה ושלב את כל המקטעים התואמים לתחום האקטו-דומיין של HA, והשתמש בכלי התאם למקטעים כדי לעגן במודל HA.
    1. שמור קואורדינטות שעברו שינוי של המודל.
  3. פתח את ממשק המשתמש הגרפי של Phenix31 והשתמש בכלי Real Space Refinement .
    1. כאשר תתבקש להוסיף קבצים, הוסף את מודל ה-HA שעבר שינוי ואת המפה, ומלא את הרזולוציה של השחזור הסופי.
    2. ערכו חמישה סבבים של מזעור גלובלי, התאמת רוטמר מקומי, חידוד תפוסה ושכלול ADP קבוצתי.
  4. דמיין את השחזור והמודל הסופי באמצעות ChimeraX.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול עיבוד זה (איור 1), זרימת העבודה שתוארה קודם לכן יושמה על שני מערכי נתונים של 25 טומוגרמות ביחד, שהתקבלו מזן נגיף שפעת H1N1 A (A/Puerto Rico/8/1934). פרמטרים לאיסוף נתונים מתוארים בטבלה 1. איור 2 ממחיש טומוגרפיה מייצגת ותצוגות מוגדלות של נגיפים של שפעת פליאומורפית. מורפולוגיות מגוונות נלכדות בטומוגרמה זו, שכן הוויריונים נעים בין כדורי לאליפסה/מוארכת בצורתם. בעוד שרוב חלקיקי השפעת מכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנה מבנית טובה יותר של חלבונים נגיפיים קריטיים יכולה להאיץ את גילוי הטיפולים החדשים נגד נגיפים אלה. בעשור האחרון, מהפכת הרזולוציה האיצה את קביעת מבנים נגיפיים ברזולוציה גבוהה באמצעות cryoEM של חלקיק בודד, אך שיטה זו מוגבלת לחלבונים מטוהרים או לנגיפים לא עטופים עם סימטריה איקוסהדרלית. לעומת זאת, cryoET מסוגל לדמיין ויריונים קרומיים מגוונים מבחינה מורפולוגית בתלת מימד, אך הוא בעל רזולוציה מוגבלת. הצינור המוצג כאן מתבסס על צינור Warp-RELION-M הנפוץ 9,32

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לדיונים מועילים עם מעבדת שיפר. ברצוננו להודות גם למתקן UMass Chan cryoEM Core על עזרתם ברכישת נתונים ועל מתן תמיכה וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01GM143773 ל-M.S. ו-R35GM151996 ל-C.A.S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4UC סן פרנסיסקוhttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52מכללת הרפואה ביילורhttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27אוניברסיטת קולורדו בבולדרhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
מרשמים לניתוח שפעתבית הספר לרפואה UMass Chanhttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3UCLAhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0ג'ננטקhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D מעבדות אינטלhttps://www.open3d.org/
PHENIX 1.21-5207מעבדת לורנס ברקלי הלאומיתphenix-online.org
RELION 4.0מעבדת הביולוגיה המולקולרית של MRChttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
אובונטו 20.04אובונטוhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1UC סן פרנסיסקוhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
וורפ 2.0.0ג'ננטקhttp://warpem.github.io/warp/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
  4. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  5. Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
  6. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  7. Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
  8. Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063(2022).
  9. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  10. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222(2024).
  13. Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
  14. Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
  15. Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
  16. Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
  17. Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).
  18. Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
  19. Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  20. Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  22. Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  25. Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  26. Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  27. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  28. Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
  29. Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724(2022).
  30. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  32. Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).
  33. Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
  34. Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
  35. Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
  36. Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

מאמרים קשורים