מאמר שיטה

שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

DOI:

10.3791/68676

⸱

19 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ריאות כולל מידול המיקרו-סביבה של הגידול כאשר מחלה אזורית מתקדמת למחלה גרורתית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה להקמת מודל סינגני אורתוטופי של סרטן ריאות המאפשר מעקב in vivo אחר המחלה לאורך זמן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) ממשיך להיות הגורם מספר אחת למוות הקשור לסרטן בקרב נשים וגברים ברחבי העולם. יש לאסוף מידע נוסף כדי להבין את האינטראקציות בין תאי סרטן, מערכת החיסון, המיקרו-סביבה בתוך כל גידול והרקמה המארחת כדי לפתח שיטות טיפול יעילות יותר. מדווח כאן על שיטה פשוטה וחוזרת על עצמה להשראת סרטן בתוך ריאות העכבר, המאפשרת מעקב אחר צמיחת הגידול משלב מוקדם לשלב מאוחר של המחלה. ההליך הכירורגי כולל חתך שטחי קטן בעור והזרקת תאים סרטניים דרך השרירים הבין-צלעיים לריאות. מערכות הדמיה in vivo (IVIS) בשילוב עם תאים שהונדסו לבטא לוציפראז מספקות דרך נוחה להעריך את צמיחת הגידול והתקדמות המחלה במהלך המחקר. טכניקה זו ניתנת להעברה בקלות על פני מודלים שונים של סרטן ריאות וניתן להשתמש בה כדי לבחון את ההיתכנות והיעילות של טיפולים חדשים במודל פרה-קליני של סרטן ריאות המחקה את המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול. זה מרחיב את הרלוונטיות של מחקרי יעילות ובטיחות/רעילות המשתמשים בטיפולים סטנדרטיים, כולל כריתה כירורגית, הקרנות ואימונותרפיה בשילוב עם טיפולים ניסיוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הריאות ממשיך להיות אחד מסוגי הסרטן המאובחנים ביותר והגורם מספר אחת למוות הקשור לסרטן בקרב גברים ונשים ברחבי העולם 1,2,3. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה כמעט 90% מכלל מקרי סרטן הריאה בארצות הברית, ולמרות שנוף הטיפול השתפר מאוד בשנים האחרונות, ממשיך להיות עניין רב בפיתוח טיפולים חדשים המשפרים אתהתוצאות. בעוד שהיו התקדמות רבה בפיתוח טיפולים ממוקדים למוטציות מניעות ספציפיות ואימונותרפיה עבור תת-סוגים של NSCLC מגיבים, שיעור ההישרדות הכולל לחמש שנים ממשיך להיות נמוך, ועומד על כ-20% עבור כל שלבי סרטן הריאות 2,5,6,7. יתר על כן, למרות שהאימונותרפיה עשתה צעדים עצומים בשיפור ההישרדות במחלה מתקדמת, שיפורים אלה רק העבירו את המחט מהישרדות כוללת של חמש שנים של 6.8% ל-10.7% והגדילו את זמן ההישרדות מ-7 חודשים ל-8 חודשים8. עדיין יש צורך גדול להבין את מנגנוני הפעולה של המחלה ולפתח טיפולים חדשים המשתלבים בסינרגיה עם הטיפולים הסטנדרטיים הנוכחיים. הבנת המנגנונים הפועלים בהתקדמות הטבעית של NSCLC והתגובה לטיפולים חדשים דורשת מודלים פרה-קליניים הניתנים לשחזור מהימן, קלים לגרימה ועוטפים את המיקרו-סביבה של הגידול שבתוכה מתפתח הסרטן.

במהלך העשורים האחרונים פותחו הליכים רבים ושונים להערכת מודלים אורתוטופיים של סרטן ריאות במכרסמים. ההליכים נעים בין פולשניים מאוד, הדורשים רמה גבוהה של מומחיות, כגון השתלה תוך ריאתית או הליכי השתלה הפותחים את חלל החזה 9,10,11,12,13; פולשני בינוני כמו פרוצדורות תוך-קנה ואורוטרקל 14,15,16,17; להליכים זעיר פולשניים, כגון זריקות מלעוריות, וריד זנב או אינדוקציה תוך-אפית 18,19,20,21. כל ההליכים מציעים סיכונים ויתרונות שונים - עם טכניקות פולשניות יותר המאפשרות דיוק רב יותר אך שיעורי שחיקה גבוהים יותר, וטכניקות פחות פולשניות המעניקות הישרדות טובה יותר אך שונות רבה יותר של אתרי השתלת הגידול. מבין הפרוטוקולים השונים הללו, חלקם בוחרים לא לעקוב אחר צמיחת הגידול in vivo ורק להשלים הערכות של גידולים ex vivo 9,11,12,16. מבין הפרוטוקולים שכן עוקבים אחר צמיחת הגידול לאורך זמן, פרוטוקולים מוקדמים יותר מסתמכים יותר על מערכות כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT)14,19, טומוגרפיה של פליטת מיקום (PET)18 והדמיית תהודה מגנטית (MRI)17, בעוד שפרוטוקולים מאוחרים יותר, לאחר שמערכות הדמיה ביולומינסנציה (BLI) ותאים מהונדסים גנטית הפכו לזמינים יותר, בוחרים לעקוב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן עם BLI 20. 21.

מטרת פיתוח פרוטוקול זה הייתה לקחת את הלקחים מההליכים האחרים הללו וליצור שיטה פשוטה אך אמינה להשראת גידול ריאה בודד כדי לחקור את התקדמות NSCLC החל ממחלה מוקדמת, שבה הגידול מוגבל לריאה. המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר את השיטות ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני אמין וזעיר פולשני של סרטן ריאות שניתן לנטר באמצעות הדמיה in vivo ויכול לאפשר לחוקרים לחקור סרטן ריאות באיבר ממנו נובעת המחלה. שיטה זו יעילה ליצירת מודלים של עכברים אורתוטופיים xenograft באמצעות קווי תאים של סרטן ריאות אנושי ומודלים של עכברים אורתוטופיים סינגניים באמצעות קווי תאי סרטן ריאות בעכברים עם מערכת חיסון שלמה, מה שמעניק צדדיות לשיטה לחקור הן את סוגי הסרטן האנושיים והן את יחסי הגומלין המורכבים של מערכת החיסון ו-NSCLC.

התמקדנו באופטימיזציה של פרוטוקול זה במודל עכברי NSCLC בעלי יכולת חיסונית, Lewis Lung Carcinoma (LLC), מכיוון שמודל זה מאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את תגובת מערכת החיסון עם ובלי טיפולים עדכניים כגון כימותרפיה, הקרנות, אימונותרפיה וטיפולים ממוקדים אחרים 22,23,24,25. הפרוטוקול מייצר מודל המייצג מחלה בשלב מוקדם בעת החיסון (גידול בפרנכימת הריאה) וגרורות לקראת סוף המחקרים מכיוון שהגידול לרוב יגדל מעבר לפרנכימת הריאות ויזרע רקמות אחרות.

היבט חשוב בחקר מודלים אורתוטופיים הוא היכולת לעקוב אחר צמיחת הגידול שוב ושוב, עם לחץ מינימלי על החיה, ובמהירות, כך שניתן יהיה להעריך כל חיה במחקר בנקודת זמן אחת. בעוד שטכניקות הדמיה כמו MRI או CT מאפשרות רזולוציה משופרת של הגידול, שיטות הדמיה אלו יקרות, גוזלות זמן ומתקשות לעקוב אחר צמיחה מוקדמת של גידול במודלים של בעלי חיים קטנים כגון עכברים 26,27,28,29,30,31. לכן, בחרנו לנטר את צמיחת הגידול באמצעות ביולומינסנציה באמצעות תאים סרטניים שהונדסו עם לוציפראז. בפרוטוקול זה, הזרקנו 25,000-50,000 תאי LLC שהונדסו עם לוציפראז גחלילית (LLC-luc) וזיהינו גידולים כבר למחרת על ידי BLI. תגובת לוציפרין-לוציפראז היא כלי שימושי למעקב אחר צמיחת הגידול in vivo באמצעות מכשירי הדמיה ספקטרליים. בשל הרגישות של מערכות הדמיה אלה למעקב אחר פוטונים של אור, ניתן לעקוב אחר תאים סרטניים המבטאים לוציפראז in vivo מוקדם, לעתים קרובות לפני שניתן לזהות גידולים במודל עכבר על ידי MRI או CT, ולעתים קרובות 26,32,33,34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים נבדקים ומאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת איווה (IACUC). עכברי C57BL6/N (בגילאי 4-6 שבועות) נרכשים ומתאקלמים לפחות שבוע אחד לפני הניתוחים. כל בעלי החיים נמצאים במחזור אור/חושך של 12 שעות. בעלי חיים מאוחסנים 4 בכל כלוב ויש להם גישה מלאה למזון ומים עד למועד ההרדמה.

1. בחירה וגידול תאים להזרקה

  1. בצע בדיקת לוציפראז כדי לבחור שורת תאים כמתוארב-35.
    1. לגדל תאי LLC-luc במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), L-גלוטמין ופניצילין/סטרפטומיצין באינקובטור של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם לחות גבוהה. בצע את הבדיקה כאשר התאים מתכנסים 50%-100%.
    2. לפני ביצוע הבדיקה, שטפו תאים עם 1x PBS.
    3. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר/באר ליזה (25 מ"מ טריס/פוספט, 4 מ"מ EGTA, 1% טריטון X-100, 10% גליצרול) בצלחת של 6 בארות. מגרדים תאים מהבאר ומעבירים לצינור מיקרו-צנטריפוגה. סובב תאים בטמפרטורה של 16,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. אשר שנוצר כדור תא קומפקטי בתחתית הצינור ואסוף את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
    4. העבירו מחצית מתמצית התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ושמרו לכימות חלבון. מוסיפים 2 מ"מ דיתיותרייטול למחצית הנותרת ומערבבים היטב.
    5. שלב 8 מיקרוליטר של תמצית תאים המכילה 2 מ"מ דיתיותרייטול עם 42 מיקרוליטר של מאגר בדיקה (25 מ"מ טריס/פוספט, 20 מ"מ MgSO4, 4 מ"מ EGTA, 2 מ"מ ATP, 1 מ"מ דיתיותרייטול). הוסף 50 מיקרוליטר של 0.5-1 מ"מ לוציפרין.
    6. למדוד את שיא הזוהר המדווח כיחידות אור יחסיות (RLU) ולהעריך את תכולת החלבון בשיטת כימות חלבון מועדפת כדי לדווח על זוהר כ-RLU למ"ג חלבון (RLU/mg).
  2. בחר קו תאים עם זוהר בין 8,000-15,000 RLU/mg.
    הערה: הימנע מבחירה של ביטוי לוציפראז גבוה יותר (>15,000 RLU/mg) מכיוון שהדבר עלול להרוות את מכשיר ה-BLI.

2. הכנת תאים

  1. יש לגדל תאי LLC-luc ב-DMEM בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין ופניצילין/סטרפטומיצין באינקובטור של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם לחות גבוהה למשך שבוע לפחות לפני השימוש.
    הערה: עקוב אחר הצמיחה כדי להגביל את המפגש ל-70%-80% ופצל באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA לפי הצורך כדי להגיע לכמות הרצויה לזריקות כפי שתואר קודםלכן 36.

3. הכנה טרום ניתוחית

  1. לעכברים עם פרווה, יש להתגלח יום אחד לפני הניתוח.
  2. הנח את העכבר בתא אינדוקציה להרדמה באמצעות איזופלורן. הגדר את קצב זרימת החמצן ל-2.0 ליטר לדקה ואת הוופורייזר ב-2% איזופלורן; התאם זאת על סמך גודל העכבר המושרה.
  3. עקוב אחר נשימת העכברים והשתמש ברפלקס נסיגת דוושה כדי לאשר הרדמה מתאימה.
  4. הנח את העכבר בקונוס אף במצב נוטה על מכשיר חימום מאושר IACUC. בדוק כדי לוודא שהעכבר מורדם כראוי באמצעות רפלקס נסיגת הדוושה לפני שתמשיך.
  5. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים.
  6. כאשר העכבר מורדם כראוי, השתמש בקוצץ חשמלי כדי להסיר אזור מלבני גדול (2 ס"מ x 3 ס"מ) בחלק הגבי השמאלי של העכבר. לגלח את עמוד השדרה מדיאלית, את השולחן לרוחב עד שלא נראית פרווה, את הצלע האחרונה (13) נחותה, ואת הקצה העליון של עצם השכמה לכיוון הראש.
  7. הנח את העכבר בכלוב ריק במכשיר חימום מאושר IACUC והתבונן בנשימת העכבר עד שהעכבר ער וערני. בשלב זה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו עד לניתוח.

4. הכנת תרחיף תאים להזרקה

  1. ביום קצירת התאים (שלב 2.2), יש להוסיף חומר טרי עם 50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין 3-4 שעות לפני האיסוף כדי להסיר תאים מתים ומנותקים.
  2. שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם 1x PBS. הוסיפו טריפסין-EDTA ודגרו במשך 1-2 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. פזרו את התאים והוסיפו מדיה לנטרול הטריפסין. אוספים תאים בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  4. סובב בחום של 1,200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. אשר שנוצר כדור תא קומפקטי בתחתית הצינור, שאב את הסופרנטנט ושטוף את הגלולה עם 1x PBS. חזור על שלב זה 3 פעמים.
  5. השעו מחדש את כדור התא ב-1x PBS בכ-1-2 מיליון תאים/מ"ל לספירה. סנן דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לפני הספירה.
  6. שלב 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 10 מיקרוליטר של טריפן כחול וספור באמצעות המוציטומטר. הפוך מתלה תאים פי 2 וספור את שניהם כדי לאמת את ספירת התאים. חשב את ספירת התאים הכוללת ואת הכדאיות.
  7. סובב תאים ב-1,200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר להשעיה מחדש בנפח ההזרקה הסופי. שאפו את ה-PBS.
  8. השהה מחדש את התאים במטריג'ל של 0.5 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS למספר התאים הרצוי לכל זריקה בנפח של 50 מיקרוליטר. שמור את תרחיף התאים הסופי על קרח לאורך כל ההליך כדי למנוע התמצקות.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בתאי LLC-luc. הזרקה של 25,000-50,000 תאים בנפח של 50 מיקרוליטר לכל עכבר.

5. הכנה כירורגית

  1. בצע את ההליך בחדר ניתוח מאושר על ידי IACUC להליכים אספטיים. נקו את שולחן הניתוחים עם חומר חיטוי מאושר וטרינרי.
  2. הנח כרית חימום מחוטאת באישור IACUC באזור הניתוח. הניחו וילון כירורגי סטרילי מעל כרית החימום.

6. הרדמה כירורגית

  1. הנח את העכבר בתא אינדוקציה להרדמה באמצעות איזופלורן. הגדר את קצב זרימת החמצן ל-2.0 ליטר לדקה ואת הוופורייזר ל-2% איזופלורן.
    הערה: ניתן לכוונן את ריכוז האיזופלורן בהתאם לגודל העכבר.
  2. עקוב אחר נשימת העכבר והשתמש ברפלקס נסיגת דוושה כדי לאשר הרדמה מתאימה.
  3. הנח את העכבר בקונוס אף במצב שכיבה לרוחב ימין על וילון הניתוח הסטרילי. בדוק כדי לוודא שהעכבר מורדם כראוי באמצעות רפלקס נסיגת הדוושה לפני שתמשיך.
  4. יש לתת משכך כאבים לפני הניתוח, מלוקסיקם (2 מ"ג/ק"ג משקל) תת עורי ומשחת עיניים לשתי העיניים.

7. הזרקת ריאות אורתוטופית

  1. נקה את אזור הניתוח פי 3 על ידי החלפה בין 70% אתנול לבטדין באמצעות גזה סטרילית. הניחו על העכבר וילון כירורגי מעוקר עם פתח בגודל 3 ס"מ על 4 ס"מ. הניחו מכשירים מעוקרים עם חיטוי על וילון הניתוח.
  2. קבע היכן לבצע את החתך על ידי איתור קצה הגולגולת של עצם השכמה וקצה הזנב של כלוב הצלעות החזי באמצעות מלקחיים. ודא שהעור מתוח באמצעות האגודל והאצבע המורה של המנתח ובצע חתך שטחי של 5 מ"מ רק דרך העור ישירות מתחת לעצם השכמה עם להב בגודל 10.
    הערה: על המנתח ללבוש כפפות סטריליות.
  3. השתמש במספריים ישרים בגודל 115 מ"מ כדי לנתח את השומן התת עורי מהצלעות והשרירים הבין-צלעיים. אל תחתוך את השרירים הבין-צלעיים.
    הערה: היזהר לא לפגוע בעורק בית החזה ובענף העמוק של עורק צוואר הרחם הרוחבי, הנמצאים בסמוך לעצם השכמה. דימום קל עלול להתרחש עקב חיתוך נימים בתוך העור ושומן תת עורי. עצרו את הדימום על ידי הפעלת לחץ קל עם אפליקטור מעוקר עם קצה כותנה.
  4. השתמש במלקחיים של Micro-Adson כדי להחזיק את החתך פתוח. החל מהצלע האמיתית השביעית, השתמש במלקחיים בינוניים מעוקלים כדי לספור כלפי מעלה כדי לזהות צלעות ארבע וחמש. שימו לב לאזור זה להזרקה.
  5. מערבבים את מתלה התאים על ידי היפוך עדין פי 3-4. מיד לפני ההזרקה, השתמש במזרק אינסולין סטרילי 300 מיקרוליטר 31 גרם 8 מ"מ כדי לשאוב 50 מיקרוליטר מתרחיף התא ולוודא שאין בועות.
  6. הוסף למחט רצועת סרט מתכת מעוקר בעובי 4 מ"מ, סומק למזרק, כדי לשמש כפקק. זה מבטיח שהמחט נכנסת רק 4 מ"מ לעומק הריאה.
  7. הזרקו את תרחיף התאים של 50 מיקרוליטר ישירות מתחת לצלע הרביעית בחלל הבין-צלעי שבין צלע ארבע לחמש בזווית של 90 מעלות בניצב לריאה. לאחר הזרקת תרחיף התאים, החזק את המחט במקומה למשך 2-3 שניות כדי לאפשר למטריג'ל להתקשות ולמנוע מהתאים לצאת מאתר ההזרקה.
  8. הסר לאט את המחט באותה זווית והשליך למיכל חד.
  9. תפרו את העור באמצעות 2-3 תפרים, סגרו בקשרים מרובעים, והוסיפו דבק כירורגי וטרינרי כדי להבטיח שהפצע סגור מספיק.

8. הליכים לאחר ניתוח

  1. הנח את העכבר בכלוב ריק במכשיר חימום מאושר על ידי IACUC. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה מההרדמה, מה שאמור לקחת 1-2 דקות.
  2. ברגע שהעכבר ערני וזז, הנח אותו בכלוב עם מצעים טריים. התבונן בעכבר לעתים קרובות במהלך 24 השעות הראשונות לאיתור סימני כאב או זיהום.
  3. לתת משכך כאבים NSAID, מלוקסיקם (2 מ"ג/ק"ג משקל), באמצעות הזרקה תת עורית למשך יומיים לאחר הניתוח.

9. ניטור צמיחת גידול על ידי in vivo BLI

  1. עקוב אחר צמיחת הגידול בריאה באמצעות BLI כבר ביום שלאחר הניתוח ובתדירות של פעם ביום.
  2. בצע הדמיה in vivo באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS).
    1. הכינו לוציפרין במינון של 15 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS ללא מגנזיום או סידן. עבור עכבר של 20 גרם, זה שווה ערך להזרקת 200 מיקרוליטר מתמיסת לוציפרין של 15 מ"ג/מ"ל.
      הערה: הגן על תמיסת לוציפרין מוכנה מפני אור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום כאשר אינו בשימוש מכיוון שהוא רגיש לאור.
    2. פתח תוכנה והגדר פרמטרים להדמיה ביולוגית. הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי. הגדר את גורם ה-Binning ל-4.
    3. להזריק לעכברים תוך צפקית 150 מ"ג לוציפרין לק"ג משקל.
    4. בעת הדמיה של מודל חדש של תאים סרטניים בפעם הראשונה, בצע עקומה קינטית כדי לזהות את זמן ספיגת הלוציפרין האופטימלי, המצוין על ידי מתי הזוהר מגיע לשיא לפני שהוא מתחיל להתייצב.
      1. הזריקו לעכברים לוציפרין. יש להמתין 3 דקות לספיגת לוציפרין.
      2. עכברי תמונה כל 5-10 דקות למשך 60 דקות.
        הערה: זמן הספיגה האופטימלי עבור קווי תאים שונים נע בדרך כלל בין 5-15 דקות.
    5. עבור כל מפגשי ההדמיה הבאים, השתמש בזמן ספיגת הלוציפרין האופטימלי. להרדים את העכברים כהכנה להדמיה במהלך תקופה זו. הנח את העכברים בתא אינדוקציה באיזופלורן 2% עם קצב זרימה של 2.0 ליטר לדקה.
    6. לאחר השלמת הקליטה, צלם שתי תמונות על-ידי בחירה באפשרות Acquire.
      1. ראשית דמיין את העכבר שוכב במצב שכיבה לרוחב הימני. זה מאפשר למצלמה ללכוד את אתר ההזרקה, שנמצא בחלק הצדדי השמאלי של העכבר. השתמש בתצוגה זו כדי לכמת את צמיחת הגידול. תמונות שצולמו במיקום זה יסומנו מכאן והלאה כמבט לרוחב משמאל.
      2. מיד לאחר השלמת התמונה הראשונה, צלם תמונה שנייה של העכבר במצב שכיבה. זה מאפשר למצלמה ללכוד את הפוטונים הנפלטים מהגידול בחלל החזה מנקודת המבט הגחונית. השתמש בתצוגה זו (המסומנת כאן כתצוגת הגחון) כדי להעריך את מיקום הסרטן בתוך חלל החזה.
  3. כדי לנתח את התמונות, שנה את היחידות מ-Counts ל-Radiance.
  4. פתח את חיך הכלי. עבור אל התאמת תמונה, בחר ידני. בחר מינימום ומקסימום עבור סרגל הצבעים המתאים ביותר לתמונות שצולמו.
  5. פתח את כלי החזר ההשקעה. בחר את התפריט הנפתח של העיגול כדי להוסיף מעגל אזור עניין (ROI) לתמונה. הזז את העיגול מעל החתך למבט לרוחב שמאל ומעל מרכז החזה למבט הגחוני.
  6. בחר מדידת החזר על ההשקעה.

10. הערכת קריטריוני הכללה ואי הכללה

  1. ראשית, אשר את נוכחותה של זוהר הגידול בריאה על ידי התבוננות בתמונת המבט הצדדית השמאלית.
  2. לאחר מכן, אשר את נוכחותה של זוהר הגידול בחלל החזה השמאלי בתמונת הגחון. לאחר מכן, ודא שיש רק אתר אחד של זוהר מתמונת הגחון.
  3. אם שני הקריטריונים הללו (שלבים 10.1, 10.2) מתקיימים, הערך את קריטריוני ההחרגה על ידי הבטחת הזוהר אינו חוצה את קו האמצע בחלל החזה בתמונת הגחון. אם לא ניתן לזהות זוהר בתמונה השמאלית לאחר שתי תמונות IVIS רצופות במהלך 4 ימים לאחר הניתוח, אל תכלול עכבר זה במחקרים נוספים, מכיוון שתאי הסרטן ככל הנראה לא לקחו.

11. הערכת גידולים בתום הלימודים

  1. כאשר השטף הכולל של זוהר הגידול מגיע ל-1 ×10 8 פוטונים לשנייה (p/s) ומעלה, קצור את העכברים להערכות נקודת קצה.
  2. אסוף את הגידול לניתוח אנטומי גס או היסטולוגיה על ידי ביצוע השלבים הבאים להרדמה וזלוף של הריאה כמתואר קודם לכן37.
    1. הנח את העכבר בתא אינדוקציה להרדמה באמצעות איזופלורן. הגדר את קצב זרימת החמצן ל-2.0 ליטר לדקה ואת הוופורייזר ל-2% איזופלורן. עקוב אחר נשימת העכבר והשתמש ברפלקס נסיגת דוושה כדי לאשר הרדמה מתאימה.
      הערה: ניתן לכוונן את ריכוז האיזופלורן בהתאם לגודל העכבר.
    2. הנח את העכבר בקונוס אף במצב שכיבה. בדוק כדי לוודא שהעכבר מורדם כראוי באמצעות רפלקס נסיגת הדוושה לפני שתמשיך.
    3. פתח את חלל החזה של העכבר כדי לדמיין את הריאות והלב מאחורי הסרעפת.
    4. בצע חתך אנכי ארוך נחות לאורך קו האמצע של העכבר. הזיזו את המעיים כדי לדמיין את עורק הכליה השמאלי.
    5. חותכים את הסרעפת כדי לדמיין את הלב.
    6. חותכים את עורק הכליה השמאלי.
    7. יש להזריק כ-5-10 מ"ל של 1x PBS דרך החדר הימני של הלב בקצב של כ-5 מ"ל/דקה.
    8. בצע חתך לאורך הצוואר. נקה כל שומן תת עורי הממוקם מעל קנה הנשימה. היזהר לא לחתוך את קנה הנשימה.
    9. חודרים את קנה הנשימה במקביל עם מחט כדי להזריק 10% פורמלין ישירות לקנה הנשימה כדי לנפח ולתקן את הריאות.
    10. רכשו את הריאות מחלל החזה על ידי חיתוך קנה הנשימה מעל קודקוד הריאה, וחתכו את הצדר והרצועות המחברות את הריאה לחלל החזה.
    11. מניחים 10% פורמלין לתיקון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, עכברי C57BL6/N הוזרקו לפי הפרוטוקול שהוצג (איור 1). נעשה שימוש בתאי LLC שהונדסו גנטית כדי לבטא לוציפראז (LLC-luc). בנוסף, לעכבר דמה הוזרק מטריג'ל ללא תאים סרטניים. ניתן להתחיל את ה-BLI ב-IVIS כבר יום אחד לאחר הניתוח. מחקר LLC-luc זה עבר אופטימיזציה על BLI כדי להעריך סרטן ריאות בשלב מוקדם. למערכת BLI המשמשת במאמר זה יש קרינה ניתנת לגילוי מינימלית (MDR) של 10 פוטונים∙s-1∙cm-2∙sr-1 ורזולוציית פיקסלים מינימלית של תמונה של 50 מיקרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליך אופטימלי, זעיר פולשני, המאפשר זמני החלמה מהירים וניטור כמעט מיידי של הגידול, השונה משיטות אינטנסיביות יותר מבחינה כירורגית שתוארו קודם לכן 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. ו-C.S.C. הם המייסדים של Geminii, Inc. תנאי הסדר זה נבדקו ואושרו על ידי משרד ניגוד העניינים במחקר של אוניברסיטת איווה. לכל המחברים האחרים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לחברי מעבדות קרטר ושפילד, סוזן וולש, בריאן אלן וקראנטי מאפוסקר על דיונים חשובים. ברצוננו להודות גם לסמנתה אקלי, וטרינרית קלינית בכירה במשרד למשאבי בעלי חיים, על ההדרכה והעצות שלה. ברצוננו להכיר בשימוש במערכת ההדמיה IVIS Lumina S5 במתקן הליבה להדמיה של בעלי חיים קטנים, משאב ליבה הנתמך על ידי המחלקה לרדיולוגיה באוניברסיטת איווה. איורים גרפיים מדמויות שנוצרו באמצעות Biorender (https://biorender.com). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), התוכנית לביולוגיה של קרינה רדיקלית חופשית NCI T32CA078586 (S.C.H.), IVIS Lumina S5 Imaging System שנרכשה ב-1S10OD026835.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTA (פעם אחת)גיבקו25200-056
10% פורמלין נייטרלי עם בופרVWR16004-112
מנות 100 מ"מ x 20 מ"מ שטופלו בתרבות רקמהדוט סיינטיפיק בע"מ.667621
190 הוכחה לאתנול טהורדיקון לאבס2801
מזרק אינסולין 3/10 מ"ל עם מחט BD Ultra-Fine 31 גרם x 5/16 אינץ'.בקטון דיקינסון328438
3M ווטבונד3M1469SB
ATPסיגמאA5394
תמיסת בטדין 10% פובידון-יוד חיטויArvio Health L.P.67618-150-04
עכברי C57BL6/Nמעבדות צ'ארלס ריבר
מסננת תא 40 מ"מ ניילון בז352340
מכונת הרדמה קומפקטיתהרדמה של Vetamac 
משטח חימום אינפרא-אדום רחוק עם בקרKent Scientific Corporation  
ידית להב ניתוחית קונבנציונלית, מידה 3בראד-פארקר371030
מלקחיים מעוקלים בינוניים לשימושים כללייםפישרברנד16-100-110
דיתיותרייטולResearch Products InternationalD11000
D-לוציפרין (מלח נתרן)קיימן כימיקל14682
דראפ, כירורגי 18" x 26" לא מכוסה, סטריליתסגור783410
דולבקו' Modified Eagle Medium (1x)גיבקו11965-092
דולבקו' s מלח עם בופר זרחן (PBS) פעם אחתגיבקו14190-144
EGTAסיגמאE3389
סרום בקר עובריגיבקוA5670402
מקור אור FL150 למיקרוסקופ סיבים אופטייםמייג'י 
תמיסת גנטמיצין סולפטIBI ScientificIB02030
גליצרולResearch Products InternationalG22025
איזופלוראןפרימל פארמה בע"מ66794-013-25
IVIS לומינה S5פרקיןאלמר  
תוכנת תמונה חיהפרקיןאלמר  
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642השתמשו בקו התאים הסרטני שיתאים ביותר לצרכי המחקר 
מגנזיום סולפטפישר סיינטיפיקM63
מטריצת ממברנת בסיס מטריג'לקורנינג354234
מחזיק מחט מאיו-היגר, 6 אינץ', לסתות משוננותמילטקס8-44TC
מלקחיים מיקרו-אדסוןכלי המדע המדויק10018-12
גוזם כפות N5 Dog Paw עם להבים כפוליםOneisall 
לא סטריליים, ספוגי גזה 12 פלייםNDCP157112
חומר סיכה לעיניים Optixcareאוונטיקס5914304
פניצילין סטרפטומיציןגיבקו15140-122
תפר משי ביד קבועה 6-0 1 x 18"אתיקון K802H
חומצה זרחנית 85%פישר סיינטיפיקA242
להב סכין מידה 10, נירוסטה, סטריליCincinnati Surgical110
צינור עם מכסה בורג קוני 50 מ"לסארסטדט62.547.100
מספריים לרקמה 4.5" סטייט פרימיוםאונסונגSCT115
טריטון X-100סיגמאT6878
בסיס טריזמהסיגמאT1503
Trypan Blue Stain (0.4%)גיבקו15250-061
סרט אלומיניום שימושי עם סרט אלומיניוםIPGALF150L
אפליקטורים עם קצה כותנה מעץNDC76200

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים