מאמר שיטה

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

841 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68677

⸱

15 ביולי 2025

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

תקציר

קולטני אינסולין (IRs) באים לידי ביטוי באופן נרחב בכל הרקמות ובכל סוגי התאים. הוא קיים בשני איזופורמים נפרדים מבחינה תפקודית - IR-A ו- IR-B - הנבדלים ב-12 חומצות אמינו עקב שחבור אקסון 11 חלופי. איזופורמים אלה מציגים דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות ולתאים, כאשר שכיחותם היחסית משתנה לאורך ההתפתחות, ההזדקנות והמחלה. בשל הדמיון הגבוה ברצף שלהם, ההבחנה בין IR-A ל-IR-B בשיטות אימונולוגיות מסורתיות הייתה מאתגרת. כאן, אנו מתארים בדיקת הכלאה דופלקס חדשה באתרה (ISH) המאפשרת הדמיה של ביטוי IR-A ו-IR-B ברקמה. באמצעות גישה זו, אנו מדגימים לראשונה שבעוד ששני האיזופורמים באים לידי ביטוי במקלעת הכורואיד של העכבר, IR-A הוא הדומיננטי. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקירת ההתפלגות המרחבית של איזופורמים של קולטני אינסולין באתרם על פני רקמות שונות. בעוד ש-qPCR בזמן אמת יכול לזהות תעתיקי IR-A ו-IR-B בתרביות חד-תאיות במבחנה , הוא חסר את היכולת ללוקליזציה מרחבית בתוך רקמות מורכבות, מה שמדגיש את הצורך והתועלת של טכניקת Duplex ISH.

מבוא

קולטן האינסולין (IR) הוא קולטן אנזימטי טרנסממברני במעבר יחיד המתווך את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות של אינסולין. הוא מתפקד כחלבון דימרי, כאשר כל מונומר מורכב משתי שרשראות פפטיד המקושרות בקשר דיסולפיד: תת-היחידה α החוץ-תאית, המכילה את תחום קשירת הליגנד, ותת-היחידה β הטרנסממברנית, שהרצף התוך-תאי שלה בעל פעילות טירוזין קינאז מהותית1. באמצעות שחבור חלופי של אקסון 11, שעתוק של גן ה-IR מוליד שתי גרסאות IR mRNA. IR-A חסר אקסון 11, בעוד IR-B שומר עליו. כתוצאה מכך, IR-A ו-IR-B נבדלים זה מזה ברצף של 12 חומצות אמינו ליד מסוף C של תת-היחידה α, וכתוצאה מכך קשירה ברורה של גורמי גדילה מלבד אינסולין בוגר, ותכונות איתות משתנות במורד הזרם. בעוד ששתי הגרסאות מציגות זיקה דומה לאינסולין, ל-IR-A יש זיקה גבוהה יותר לגורם גדילה דמוי אינסולין-II (IGF-II) ופרואינסולין בהשוואה ל-IR-B. דפוסי הביטוי של IR-A ו-IR-B משתנים בהתאם לרקמה ולסוג התא, ומצב מחלה2.

הביטוי הדיפרנציאלי שלהם ברקמות ובמחלות מדגיש את תרומתם הייחודית לפיזיולוגיה ולפתולוגיה. מקלעת הכורואיד (CP), מבנה מיוחד המייצר נוזל מוחי שדרתי (CSF) ומהווה חלק ממחסום הדם-CSF, ממלא תפקיד קריטי בהובלת חומרים מזינים, פינוי פסולת והגנה עצבית, במיוחד במהלך דלקת. שני האיזופורמים של IR באים לידי ביטוי ב-CP, שם הם ככל הנראה מווסתים את נפח ה-CSF והרכבו. IR-A, באמצעות קשירת הזיקה הגבוהה שלו על ידי IGF-II, ככל הנראה מקדם התפשטות תאים ותיקון רקמות באפיתל CP. IR-B, לעומת זאת, מעורב בהובלת אינסולין על פני מחסום הדם-CSF, ותומך בזמינות אינסולין במוח עבור אסטרוציטים, נוירונים, גליה והומאוסטזיס גלוקוז 3,4.

רמות IR טרום סוכרתיות נקשרו לעלייה ב-CSF tau אצל אנשים אסימפטומטיים בסיכון גנטי למחלת אלצהיימר (AD)5, ושינויים ביחס IR-A/IR-B נקשרו לתנגודת לאינסולין, הזדקנות וגורמי פעילות פרוליפרטיביים מוגברים שעשויים לתרום לסרטן ופתולוגיות אחרות6. זיהוי דפוסי ביטוי ספציפיים לאיזופורמים של IR-A ו-IR-B מייצג צעד קריטי לקראת פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות להפרעות מורכבות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, הגישות הנוכחיות, כגון צביעה חיסונית ו-qPCR, מוגבלות: לא כל החלבונים יכולים להיות בעלי תווית חיסונית מהימנה בגלל מחסור בנוגדנים מאומתים, ובעוד ש-qPCR הוא ספציפי מאוד, הוא חסר רזולוציה מרחבית.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, השתמשנו ב-Duplex in situ hybridization (ISH), טכנולוגיה מתקדמת לזיהוי RNA המבוססת על פלטפורמת RNAscope BaseScope. בדיקה זו משתמשת בעיצוב בדיקה כפול Z ייחודי הדורש קשירה טנדם ל-RNA המטרה, מה שמאפשר ספציפיות ורגישות גבוהות, אפילו עבור תעתיקים בשפע נמוך. האות הפלואורסצנטי או הכרומוגני מוגבר באמצעות אירועי קשירת בדיקה מרובים, משפר את הזיהוי ומפחית את הרקע7. בניגוד ל-RNAscope סטנדרטי, בדיקה זו מותאמת לאיתור רצפי RNA קצרים (50-300 בסיסים), מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לזיהוי אירועי שחבור חלופיים, גרסאות חד-נוקלאוטידים ותעתיקים נדירים ברקמות מורכבות כמו המוח8.

בדיקה זו מדמיינת מטרות בו-זמנית כאותות כרומוגניים ירוקים (C1) ואדומים (C2) מובהקים תחת שדה בהיר. הוא מבטיח הצלחה בשימוש ברקמות קבועות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) או 10% פורמלין ניטרלי (NBF) וחתך ב-5 מיקרומטר-15 מיקרומטר (קפוא/FFPE), המכילות RNA בשפע נמוך עד גבוה. בשל רגישות לפירוק RNA, קיבוע יתר ושגיאות בדיקה, עלינו לייעל את הטיפול המקדים, תכנון הבדיקה והבקרות כדי למקסם את הספציפיות ולמזער את הרקע. כאן, יישמנו את מבחן ה-ISH הדופלקס הזה כדי לאפיין את דפוסי הביטוי של IR-A ו-IR-B ב-CP של העכברים, והצענו תובנות חדשות לגבי הביולוגיה המרחבית של איזופורמים IR ותפקידיהם האפשריים בבריאות המוח ובמחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המכון הלאומי להזדקנות (NIA), המוסמך באופן מלא על ידי האגודה האמריקאית להסמכה לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC). הפרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של תוכנית המחקר הפנימי של ה-NIA (IRP/NIA). העכברים שוכנו במתקן מבוקר טמפרטורה במחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה אד-ליביטום למים וצ'או סטנדרטי אלא אם צוין אחרת. עכברים זכרים C57BL/6J התקבלו ממעבדת ג'קסון ושימשו לניסויים בגיל 3-4 חודשים.

1. הכנת דגימה קפואה קבועה

  1. יש לערבב את העכבר עם 4% PFA טרי ב-1x PBS ולהניח את כל המוח ב-4% PFA טרי שהוכן למשך 17-24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: רקמה המונחת ב-4% PFA (10 מ"ל לכל מוח) למשך לא יותר מ-24 שעות.
  2. טבלו את הרקמה בסוכרוז של 10% (10 מ"ל) ב-1x PBS ב-4 מעלות צלזיוס עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל. לאחר מכן, העבירו את הרקמה ברצף ל-20% סוכרוז ולבסוף ל-30% סוכרוז, מה שמאפשר לה לשקוע בכל שלב.
    הערה: הזמן הדרוש לשקיעת הרקמה משתנה בהתאם לסוג הרקמה וגודלה. עבור רקמת מוח, זה לוקח בערך 18 שעות.
  3. הקפיאו את הרקמה באמצעי הטמעת OCT ואחסנו גושי טישו בכלי אטום בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  4. חתכו רקמות מוח קפואות קבועות בפורמלדהיד לפרוסות של 10 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: הרכיב את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית; סוגי שקופיות אחרים עלולים לגרום לאובדן רקמות. אם לא נעשה שימוש מיידי בשקופיות, אחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.

2. טיפול מקדים בחתך לפני בדיקת זיהוי דופלקס

  1. ביום הבדיקה, שטפו את השקופיות ב-1x PBS למשך 5 דקות, הזיזו בעדינות את מתלה השקופיות למעלה ולמטה כדי להסיר שאריות OCT.
  2. אופים את השקופיות בחום של 60 מעלות למשך 30 דקות.
  3. לאחר תיקון השקופיות ב-4% PFA מקורר מראש ב-1x PBS למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. העבר את השקופיות ברצף דרך סדרת EtOH: 50% EtOH למשך 5 דקות ב-RT, 70% EtOH למשך 5 דקות ב-RT, 100% EtOH למשך 5 דקות ב-RT, 100% EtOH שוב למשך 5 דקות ב-RT.
  5. מגלשות יבשות באוויר למשך 5 דקות ב-RT.
  6. יש למרוח 2-4 טיפות מי חמצן על כל חלק ולדגור למשך 10 דקות ב-RT. יש לשטוף פעם אחת במים מזוקקים.
  7. הכן 700 מ"ל של תמיסת אחזור מטרה 1x טרייה בכוס. מכסים בנייר כסף ומביאים לרתיחה עקבית (99-100 מעלות צלזיוס).
    הערה: אין להרתיח יותר מ-30 דקות לפני השימוש. בינתיים מחממים את התנור (ראו טבלת החומרים) ל-40 מעלות.
  8. טבלו בזהירות את מתלה השקופיות בתמיסת אחזור המטרה הרותחת ודגרו למשך 5 דקות. שמור על הטמפרטורה בין 98-102 מעלות צלזיוס ופקח מקרוב.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן הרתיחה (5-15 דקות) בהתאם לסוג הרקמה.
  9. העבירו מיד את מתלה השקופיות החם לכלי עם מים מזוקקים, הזיזו את המתלה למעלה ולמטה פי 3-5. חזור על הפעולה עם מים מזוקקים טריים.
  10. יש לשטוף את המגלשות ב-100% EtOH טרי, ולהזיז אותן למעלה ולמטה פי 3-5. מגלשות יבשות באוויר.
  11. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר סביב כל קטע רקמה פי 2-3. אפשר למחסום להתייבש לחלוטין ב-RT.
  12. הנח את השקופיות במגש שקופיות אצווה. הוסף פרוטאז (ראה טבלת החומרים) לכל סעיף, וודא שהרקמה מכוסה במלואה. דוגרים בתנור בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
    הערה: זמן הדגירה של פרוטאז עשוי לדרוש התאמה בהתאם לסוג הרקמה וגן המטרה.
  13. מוציאים את מגש ההחלקה מהתנור ומכניסים אותו למים מזוקקים. שטפו בעדינות את השקופיות על ידי הזזתן למעלה ולמטה למשך 2 דקות, וחזרו על שלב זה פעמיים עם מים מזוקקים טריים.

3. בדיקת זיהוי דופלקס

  1. בדיקות
    1. הכן שני חלקים נוספים לבדיקות בקרה חיוביות ושליליות.
    2. בחר בדיקות בקרה עם אותו מספר זוגות ZZ כמו בדיקת המטרה. עבור זוג ZZ אחד, השתמש בבקרה חיובית ובבקרה שלילית (ראה טבלת החומרים).
    3. לפני השימוש, אזנו בדיקות ב-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והביאו ריאגנטים AMP1-12 ל-RT.
  2. הכלאת בדיקה
    1. סובב בקצרה את הגשושית C2 וערבב ביחס של 1:50 עם הגשושית C1. מוסיפים מספיק בדיקה (100-200 מיקרוליטר) מערבבים כדי לכסות כל חלק במלואו ולדגור את השקופיות בתנור בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שטפו את השקופיות למשך 2 x 2 דקות ב-1x מאגר כביסה ב-RT.
    2. יישום דופלקס דופלקס בהיקף בסיס AMP1
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP1 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 30 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    3. יישום דופלקס AMP2 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP2 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 30 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    4. יישום AMP3 דופלקס בהיקף בסיס
      1. הסר את מאגר הכביסה העודף מהשקפים והוסף AMP3 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
        הערה: אין לחרוג מ-15 דקות דגירה.
    5. יישום דופלקס דופלקס בהיקף בסיס AMP4
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP4 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    6. יישום דופלקס AMP5 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP5 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 30 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    7. יישום דופלקס AMP6 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP6 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
        הערה: באשר ל-AMP3, אל תעלה על 15 דקות דגירה.
    8. יישום דופלקס AMP7 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP7 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
        1. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
          הערה: דגירה עם AMP7 בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות.
    9. יישום דופלקס AMP8 בהיקף בסיס
      1. הסר את מאגר הכביסה העודף מהשקפים והוסף AMP8 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
        הערה: דגירה עם דגירה AMP8 למשך 15 דקות ב-RT.
    10. זיהוי אות אדום (C2)
      1. סובב לזמן קצר את ה-Fast Red-B וערבב עם Fast Red-A ביחס של 1:60.
      2. מרחו על כל חלק (100-200 מיקרוליטר), כסו את המגש ודגרו במשך 10 דקות ב-RT בחושך.
      3. שטפו 2 פעמים במאגר כביסה 1x.
        הערה: השתמש בתמיסה אדומה מהירה מעורבת תוך 5 דקות. יש להגן מפני אור (אור שמש או UV).
    11. יישום דופלקס AMP9 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP9 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    12. יישום דופלקס היקף בסיס AMP10
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP10 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. מחזירים לתנור ומדגרים בחום של 40 מעלות למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
    13. יישום דופלקס AMP11 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP11 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. דגירה ב- RT למשך 30 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
        הערה: דגירה עם AMP11 ב-RT למשך 30 דקות.
    14. יישום דופלקס AMP12 בהיקף בסיס
      1. הסר עודפי מאגר כביסה מהשקפים והוסף AMP12 (100-200 מיקרוליטר) כדי לכסות לחלוטין כל חלק. דגירה ב- RT למשך 15 דקות.
      2. שטפו 2 x 2 דקות במאגר כביסה 1x.
        הערה: אין לחרוג מ-15 דקות דגירה.
    15. זיהוי אות ירוק (C1)
      1. סובב בקצרה את צינור Fast Green-B וערבב עם Fast Green-A ביחס של 1:50.
      2. מרחו את התמיסה הירוקה על כל חלק (100-200 מיקרוליטר), כסו את המגש ודגרו למשך 10 דקות ב-RT.
      3. יש לשטוף במשך 5 דקות ב-1x Wash Buffer ולשטוף קצרות במים מזוקקים.
        הערה: השתמש בתמיסה מעורבת של Fast Green תוך 5 דקות. יש להגן מפני אור. יחס B ל-A ירוק הוא 1:50. גם המצעים האדומים וגם הירוקים רגישים לאלכוהול. אין להשתמש בריאגנטים המכילים אלכוהול.

4. כתם נגד

  1. טבלו שקופיות בתמיסת צביעה של 50% המטוקסילין למשך דקה אחת ב-RT עד שהחלקים מופיעים סגולים.
  2. יש לשטוף במי ברז פי 3-5 על ידי תנועה למעלה ולמטה. חזור על הפעולה עם מי ברז טריים עד שהרקע מתבהר אך החלקים נשארים סגולים.
  3. טובלים מגלשות במי אמוניה 0.02% למעלה ולמטה פי 3 עד שהחלקים הופכים לכחולים.
  4. יש לשטוף שוב במי ברז פי 3-5.

5. הרכבה

  1. מחליק יבש לחלוטין בתנור יבש של 60 מעלות צלזיוס למשך ~15 דקות.
  2. טובלים שקופיות בקסילן טרי.
    הערה: מכיוון שאמצעי ההרכבה צמיג למדי, טבילה קצרה בקסילן לפני ההרכבה מקלה על פיזור חלק יותר של המדיום על פני קטע הרקמה ומפחיתה את היווצרות בועות האוויר מתחת לכיסוי.
  3. החל אמצעי הרכבה (ראה טבלת החומרים) על המגלשה והכיסוי, הימנע מבועות.
  4. מגלשות יבשות באוויר למשך 5 דקות לפחות.

6. להעריך את הדגימות

  1. דמיין את החלקים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי בהגדלה של פי 20 או פי 40. (איור 1).
    הערה: פקדים חיוביים צריכים להראות נקודות פיסוק בתאים. בקרות שליליות מקובלות אם אין יותר מנקודה אחת לכל 20 תאים בהגדלה של פי 20.

7. ניקוד (אופציונלי)

  1. השתמש בתוכנת ניתוח תמונות (למשל, Halo או QuPath) כדי לכמת את נקודות ה-RNA לתא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קולטן האינסולין (IR) הוא קולטן טירוזין קינאז טרנסממברני המורכב משתי תת-יחידות α חוץ-תאיות ושתי תת-יחידות β טרנסממברניות, היוצרות הטרוטרמר תפקודי. α-תת-היחידות מתווכות את קשירת האינסולין, בעוד של-β-תת-היחידות יש פעילות טירוזין קינאז מהותית היוזמת איתות במורד הזרם. שחבור חלופי של IR mRNA של אקסון 11 מייצר שני איזופורמים של IR, IR-A ו-IR-B. ככזה, IR-B כולל מקטע של 12 חומצות אמינו המקודד על ידי אקסון 11 בתוך אזור מסוף C של תת-היחידה α, בעוד ש-IR-A חסר קטע זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בתוך המוח, הביטוי של קולטני אינסולין (IR) הוא הטרוגני, עם צפיפות גבוהה שנצפתה באזורים כמו פקעת הריח, ההיפותלמוס, ההיפוקמפוס ומקלעת הכורואיד10. אפיון מקיף של דפוסי הביטוי השונים באזורי מוח וסוגי תאים ספציפיים יספק מידע חיוני, ויאפשר לנו לחקור ולהבין את התפקידים הספציפיים של אינסולין ואיתות IGF-II בפלסטיות סינפטית, למידה וזיכרון12. בנוסף, זה ייתן לנו תובנות טובות יותר לגבי התהליכים הפתולוגיים המעורבים בהפרעות נוירולוגיות מורכבות. חוסר ויסות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית/המכון הלאומי להזדקנות/המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מי אמוניוםמדע מיקרוסקופ אלקטרונים ברקוד 26754-4א
ערכת ריאגנטים לזיהוי Dulplex של BaseScopeביוגרפיה של ACD323810
בדיקת בקרה חיובית דופלקס דופלקס BaseScope- עכבר (מ"מ)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZביוגרפיה של ACD700121
בדיקת בקרה חיובית דופלקס דופלקס BaseScope-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZביוגרפיה של ACD700141
המטוקסילין I של גילסיגמא-אולדריץ'GHS132-1L
עיזים נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor Plus 488Invitrogenא32731
תנור, מגש, מתלה ומגש כביסה HybEZביוגרפיה של ACD321721, 310012, 321716, 321717
עט מחסום הידרופובי ImmEdgeמעבדת וקטורH-4000
בדיקות איזופורם AAND B של INSR: BA-Mm-Insr-TV1-E10E11, BA-Mm-Insr-TV2-E11E12-C2ביוגרפיה של ACD717411, 717421-C2
נוגדן לקולטן אינסוליןאיתות סלולרי 23413
RNAscope 10x Target Retrivalביוגרפיה של ACD322000
RNAscope מי חמצן, פרוטאז פלוסביוגרפיה של ACD322381
מי מלח-נתרן ציטראט (SSC) 20xפישר סיינטיפיקBP1325-1
שקופיות SuperFrost Plusפישר סיינטיפיק12-550-18
VectaMount מדיום הרכבה קבועמעבדת וקטורH-5000

מקורות

  1. Häring, H. U. The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance. Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).
  2. Benecke, H., Flier, J. S., Moller, D. E. Alternatively spliced variants of the insulin receptor protein: expression in normal and diabetic human tissues. J Clin Invest. 89 (6), 2066-2070 (1992).
  3. Vella, V., Malaguarnera, R., Nicolosi, M. L., Morrione, A., Belfiore, A. Insulin/IGF signalling and discoidin domain receptors: an emerging functional connection. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (11), 118522(2019).
  4. Galal, M. A., et al. Insulin receptor isoforms and insulin growth factor-like receptors: implications in cell signaling, carcinogenesis, and chemoresistance. Int J Mol Sci. 24 (19), 15006(2023).
  5. Starks, E. J., et al. Insulin resistance is associated with higher cerebrospinal fluid tau levels in asymptomatic APOEɛ4 carriers. J Alzheimers Dis. 46 (2), 525-533 (2015).
  6. Belfiore, A., et al. Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view. Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. https://acdbio.com/basescope-duplex-assay (2025).
  9. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074.e21 (2021).
  10. Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D., Raffa, R. B. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev. 24 (8), 855-872 (2000).
  11. Milstein, J. L., Ferris, H. A. The brain as an insulin-sensitive metabolic organ. Mol Metab. 52, 101234(2021).
  12. Moruzzi, N., et al. Tissue-specific expression of insulin receptor isoforms in obesity/type 2 diabetes mouse models. J Cell Mol Med. 25 (10), 4800-4813 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IR AIR BISHRNA

מאמרים קשורים