נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) מוביל לגידולים שפירים במעטפת העצבים ההיקפית (נוירופיברומות) הדורשים מיקרו-סביבה עצבית ספציפית לצמיחה. פותח מודל קסנוגרפט אורתוטופי אופטימלי, תוך שימוש בהזרקה תוך-עצבית של תאי שוואן אנושיים לעכברי NSG. מודל זה מסכם נוירופיברומות אנושיות ומספק פלטפורמה רבת ערך להערכת אסטרטגיות טיפוליות.
מאמר שיטה
קסנוגרפט עצב סיאטי אורתוטופי לנוירופיברומטוזיס מסוג 1 נוירופיברומות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) היא הפרעה גנטית הנגרמת על ידי וריאנטים פתוגניים בגן NF1 , מה שמוביל לאובדן תפקוד נוירופיברומין ולהתפתחות גידולים שפירים במעטפת העצבים ההיקפית הידועים בשם נוירופיברומות. בעוד שמודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) קידמו את הבנתנו את הפתופיזיולוגיה של NF1, לעתים קרובות הם לא מצליחים לשכפל את הגידול הספונטני והמורכבות המיקרו-סביבתית של נוירופיברומות שמקורן בחולה. אתגר מרכזי במידול נוירופיברומות שפירות הוא התלות שלהן במיקרו-סביבה העצבית, שגישות קסנוגרפט קונבנציונליות אינן מסכמות. כאן, פותח מודל קסנוגרפט אורתוטופי אופטימלי עבור נוירופיברומות הקשורות ל-NF1. באמצעות הזרקה תוך-עצבית של תאי שוואן אנושיים שמקורם בנוירופיברומה אימורטלית לעצב הסיאטי של עכברים חסרי חיסון NSG, מודל זה מסכם את המאפיינים העיקריים של הביולוגיה של נוירופיברומה אנושית, כולל צמיחה תלוית עצב ואינטראקציות מיקרו-סביבתיות של גידול. פרוטוקול זה מאפשר ניטור דינמי בזמן אמת של התקדמות הגידול באמצעות הדמיית ביולומינסנציה, ומספק שיטה כמותית וניתנת לשחזור להערכת צמיחת נוירופיברומה. בניגוד ל-GEMMs, מודל זה מאפשר התחלה מבוקרת של גידול והערכה מדויקת של אסטרטגיות טיפוליות פרה-קליניות. בנוסף, הוא משמש כגשר בין GEMMs למודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה, ומשפר את הרלוונטיות התרגומית של מחקר נוירופיברומה. על ידי הצעת סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר אינטראקציות גידול-עצב, מודל זה מספק פלטפורמה רבת ערך לחקר הביולוגיה של נוירופיברומה ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. שיפורים עתידיים, כולל שילוב של רכיבים חיסוניים או טכניקות הדמיה מתקדמות, עשויים לשפר עוד יותר את יישומו במחקר NF1.
מבוא
נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) היא הפרעה גנטית הנגרמת על ידי וריאנטים פתוגניים בגן NF1 , מה שמוביל לאובדן תפקוד של נוירופיברומין, מדכא גידול מרכזי המווסת את מסלול האיתות 1 של חלבון קינאז המופעל על ידיRAS-mitogen (MAPK). NF1 היא תסמונת נטייה לגידול2 עם ביטויים קליניים עיקריים הכוללים את מערכת העצבים, העור ומערכת השלד, המשפיעים בעיקר על רקמות שמקורן בפסגה עצבית. סימן היכר של NF1 הוא התפתחות של גידולים עצביים היקפיים שפירים הידועים בשם נוירופיברומות. גידולים אלה מורכבים בעיקר מתאי שוואן המכילים אינאקטיבציה דו-אללית של NF1 (NF1-/-)3, יחד עם אלמנטים סטרומליים אחרים כולל פיברובלסטים NF1+/- , תאים פרינויריאליים, תאים חיסוניים ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים4.
מודלים של בעלי חיים חיוניים להבנת פתופיזיולוגיה של נוירופיברומה ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עכברים הומוזיגוטיים למוטציה בנוקאאוט Nf1 (KO) (Nf1-/-) מתו ברחם; עכברי Nf1+/- הם בני קיימא, פוריים ונוטים לסרטן, כמו עמיתיהם האנושיים5. עם זאת, בעלי חיים אלה אינם מפתחים מאפיינים מובהקים של מחלת NF1 האנושית: עכברי Nf1+/- לא הפגינו הפרעות פיגמנטציה או נוירופיברומות. מגוון גדול של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) הוקמו בעשור האחרון כדי למדל באופן עצמאי חלק מהתסמינים, באמצעות גישות KO מותנות. חלק מה-GEMMs פותחו כדי לגרום להיווצרות נוירופיברומה על ידי השבתה מותנית של Nf1 במבשרי תאי שוואן 6,7,8.
בעוד ש-GEMMs אלה קידמו משמעותית את הבנתנו את NF19, המורכבות וההטרוגניות הפנוטיפית שלהם דורשים מודלים עכבריים חלופיים ומשלימים לבדיקות טיפוליות. קסנוגרפים אורתוטופיים מספקים אלטרנטיבה רבת ערך בכך שהם מאפשרים להשתיל תאים אנושיים ישירות בנישה האנטומית הטבעית שלהם, ובכך מציעים מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, רוב המחקרים המבוססים על קסנוגרפט התמקדו בגידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים (MPNSTs)10, ככל הנראה מכיוון שהנוירופיברומות אינן מושתלות באופן אקטופי, ובכך משאירות פער במידול גידולים שפירים.
מחקר זה מתאר מודל נוירופיברומה NF1 אורתוטופי חדשני, המבוסס על הזרקה תוך-עצבית של תאי שוואן אנושיים שמקורם בנוירופיברומה אימורטלית (קו תאים CVCL_UI78 hTERT NF1 ipNF04.4) לעצב הסיאטי של עכברים חסרי חיסון NOD SCID gamma (NSG). גישה זו מנצלת את מלוא היתרונות של המיקרו-סביבה העצבית הטבעית, ומאפשרת היווצרות גידול שפיר, תוך שהיא מאפשרת ניטור דינמי באמצעות הדמיה ביולומינסנציה (BLI).
פרוטוקול זה נועד: (1) להקים מודל נוירופיברומה אורתוטופית הניתן לשחזור עבור NF1, (2) לספק פלטפורמה פרה-קלינית חזקה לחקר אינטראקציות גידול-עצב ולהערכת טיפולים חדשים, ו-(3) לגשר על הפער בין GEMMs11,12 לבין xenografts שמקורם בחולה (PDX)13 על ידי הצעת מערכת ניסויית ביניים ומבוקרת. מודל זה מאפשר התפתחות מהירה וחסכונית של גידול - בדרך כלל תוך 5 ימים לאחר ההזרקה - ללא צורך ביצירת קווי עכבר טרנסגניים, ובכך משלב את הנגישות של קסנוגרפים עם הרלוונטיות האנטומית של מיקום אורתוטופי.
מודל עכבר זה של נוירופיברומה אורתוטופית (CDX) מציע מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. בניגוד ל-GEMMs, המסתמכים על נטיות גנטיות כדי להניע גידול, מודל זה מאפשר שליטה ישירה על התחלת הגידול והתקדמותו.
פרוטוקול ההשתלה האורתוטופית של גידולי מעטפת עצב היקפית ממאירים (MPNSTs)10 הותאם למודלים של נוירופיברומות שפירות. זה מייצג צעד משמעותי קדימה במחקר NF1 תרגומי, עם יישומים פוטנציאליים בזיהוי מטרות טיפוליות חדשות ובדיקת אסטרטגיות טיפול חדשניות.
פרוטוקול
כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של מכון קירי CEEA-IC #118 (אישור #50186 שניתן על ידי הרשות הלאומית) בהתאם להנחיות הבינלאומיות ונערכו על ידי צוות מיומן בהתאם להנחיות אתיות למחקר בבעלי חיים. עכברי גמא (NSG) NOD SCID (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) נבחרו למחקר זה בשל הכשל החיסוני החמור שלהם, המאפשר השתלה מוצלחת של תאים אנושיים. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.
1. מודל בעלי חיים והכנת קו תאים
- בצע הסרת שיער באתר הניתוח באמצעות סכין גילוח חשמלי יום לפני ההשתלה כדי לייעל את ההליך עבור קבוצות גדולות של עכברי NSG.
- כדי למנוע פגיעה דו-צדדית בגפיים האחוריות, יש להזריק רק עצב סיאטי אחד (צד שמאל) לכל עכבר בכל הניסויים. עקוב אחר עכברים לאיתור סימני מצוקה, ירידה במשקל וליקויים מוטוריים.
- לאחר ההליך, אפשר לעכברים להתאושש לחלוטין על כרית חימום בכלוב ללא מצעים כדי למנוע שאיפה מקרית של חומר מצעים. ברגע שהעכברים ניידים לחלוטין ואינם מראים סימני גרוגיות, הכניסו אותם מחדש למתקן החיות.
- לצורך xenografting, השתמש בקו התאים NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78), קו תאי שוואן אנושי אימורטליזציה של hTERT שמקורו בחולה NF114. תאים אלה הומרו ביציבות עם מבנה CMV-luciferase, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), המאפשר מעקב אורכי באמצעות BLI באמצעות מערכת בדיקת לוציפראז מסחרית.
- שמור על תאים ב-DMEM בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. הרחב את התאים למפגש של 80% כדי לשמור על תנאי גדילה מיטביים.
- ביום ההשתלה, טריפסיניזציה של תאים (≤4 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס); לספור ולהשעות אותם ב-5 ×-103 תאים ב-4 מיקרוליטר לעכבר.
2. הליך כירורגי ל-xenografting אורתוטופי
- הכנה טרום ניתוחית
- הכן את תחנת הניתוח לפני השראת הרדמה על ידי חיטוי יסודי של אזור העבודה. כסו את כל משטחי המגע של המיקרוסקופ הכירורגי ומערכת התאורה בסרט שקוף סטרילי, וודאו שכל המכשירים הכירורגיים עברו עיקור בעבר על ידי חיטוי.
- טיפול מקדים בעכברים עם משככי כאבים טרום ניתוחיים עם בופרנורפין תת עורי (0.1 מ"ג/ק"ג) 30 דקות לפני הניתוח כדי להבטיח שיכוך כאבים ראשוני נאות.
- השראת הרדמה ושמירה עליה באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (15 מ"ג/ק"ג), שהוכנו טריים במי מלח סטריליים ומותאמים בהתאם למשקל הגוף (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אשר את עומק ההרדמה על ידי רפלקס צביטה בבוהן לפני שתמשיך.
- שמור על טמפרטורת הגוף באמצעות כרית חימום לאורך כל ההליך, כולל הרדמה, השתלה והתאוששות.
- מרחו טיפות סיכה על העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית.
- הליך הזרקה
- הניחו את העכבר על צדו הימני, כשרגליו האחוריות מפושקות בעדינות. יש לכסות את אזור הניתוח בווילון סטרילי לפני תחילת החתך.
- הכינו שדה כירורגי סטרילי באמצעות פובידון-יוד.
- חתך ודיסקציה: בצע חתך עור קטן (~5 מ"מ) במקביל לעצם הירך בעזרת מספריים עדינים. הפרד בזהירות את השריר הבסיסי כדי לחשוף את העצב הסיאטי: השתמש במלקחיים עדינים ובמספריים מיקרו כדי להפריד בעדינות את שכבות השריר, תוך הקפדה לא לפגוע בכלי הדם. זהה את העצב הסיאטי כמבנה לבן דמוי חוט הממוקם מדיאלי לעצם הירך.
- אחסן את תרחיף התאים בצינור של 1.5 מ"ל והחליק בעדינות כדי להשעות מחדש את כל התאים המיושבים. טען 4 מיקרוליטר של מתלה התא למזרק המילטון 10 מיקרוליטר עם מחט 33 גרם (שנבחרה כדי למזער טראומה עצבית תוך שמירה על כדאיות תאים גבוהה).
- הכנס את המחט במקביל לציר העצב הסיאטי (למניעת ניקוב) לעומק של ~2 מ"מ. התחל לאט להזריק כדי ליצור לחץ ופער בין העצב למעטפת ההיקפית. מקדמים לאט את המחט עוד 4 עד 5 מ"מ. לאחר מכן הזרקו לאט את המתלה תוך הוצאת המחט מהעצב. הימנע מכל מתח או תנועה של העצב.
- בצע את ההליך מבלי למתוח את העצב הסיאטי כדי למנוע נזק, ואל תשתמש במלחציים. המתן 10-15 שניות לפני שתמשוך לאט את המחט כדי למזער ריפלוקס.
- לאחר ההזרקה, ודא שהעצב הסיאטי נראה מעט נפוח במקום ההזרקה, ללא דליפה או שינוי צבע. הזרקה מוצלחת מסומנת על ידי מראה עצבי יציב ללא אקסטרוואזציה.
- סגור את החתך הניתוחי באמצעות 3 עד 4 תפרים קטועים פשוטים עם חומר שאינו נספג (3-0, 30 מ"מ, 3/8 ג') כדי למנוע דלקת באתר הניתוח. אם הניתוח נמשך יותר מ-10 דקות, יש לתת 1 מ"ל של רינגר לקטט (s.c). יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג, תת עורי) בסוף היום.
- תייגו כל עכבר לזיהוי ייחודי באמצעות אגרוף אוזניים או תג מיד לאחר הניתוח ולפני ההתאוששות מההרדמה.
- אפשר לעכברים להתאושש בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולעקוב אחר סיבוכים לאחר הניתוח.
3. הדמיה ביולומינסנציה לחריטה וניטור צמיחת גידול
- כדי להעריך השתלה מוצלחת והתקדמות הגידול, בצע BLI במספר נקודות זמן. לניטור in vivo , השתמש במערכת הדמיה in vivo כדי ללכוד אור הנפלט מהתגובה האנזימטית בין לוציפראז הגחלילית, המתבטא על ידי תאי הגידול, לבין המצע שלו, D-Luciferin. גישה זו סיפקה שיטה מדויקת להדמיה וכימות של פעילות הגידול, והציעה תובנות חשובות לגבי הדינמיקה של הגידול לאורך זמן.
- כימות אותות ביולומינסנציה בנקודות זמן ספציפיות לאחר ההשתלה, כולל ימים 5, 12, 19, 26, 30 ו-33 לאחר ההשתלה (איור 1). בדרך כלל, דמיין חמישה עכברים בו זמנית כדי לייעל את התהליך ולשמור על עקביות בכל המדידות.
4. הגדרת הדמיה
- להרדים עכברים עם איזופלורן 2% במהלך רכישת התמונה ולהשתמש בכרית חימום המשולבת בהדמיית IVIS.
- מקמו עכברים באופן עקבי באותו כיוון ודמו אותם 10 דקות לאחר הזרקה תוך-צפקית של D-לוציפרין במינון של 10 מיקרוליטר/גרם ממשקל הגוף (ריכוז מלאי: 15 מ"ג/מ"ל ב-PBS, טרי ומסונן).
- רכוש תמונה במהלך דקה אחת, באמצעות תוכנת רכישת הנתונים, כדי להבטיח שאף פיקסל לא יהיה רווי במהלך התהליך.
- מדוד את עוצמת האות הביו-לומינסנט כספירת פוטונים יחסית. השתמש במערכת ההדמיה עם ההגדרות הבאות: זמן חשיפה: אוטומטי; Binning: בינוני; F/עצירה: 1.2; שדה ראייה: 12.5 ס"מ; תוכנה: תוכנת תמונה חיה v4.7.3.
- למדוד את פליטת האור מאזורי הגידול, המדווחים כספירת פוטונים יחסית לשנייה, באמצעות תוכנה קניינית. דמיין את עוצמת הביולומינסנציה באמצעות קנה מידה פסאודו-צבעוני המונח על תמונות בשחור-לבן שצולמו בו-זמנית.
5. קריטריונים להצלחת ההשתלה
- אל תכלול עכברים אם הם לא מציגים ביולומינסנציה ניתנת לזיהוי או אם האות פוחת עם הזמן.
- כלול רק עכברים עם עלייה מתקדמת בזוהר בין הימים 5 ל -12.
- המשך לניטור הגידול באמצעות הדמיה ביולומינסנציה כמתואר בסעיף תוצאות מייצגות.
תוצאות
באמצעות ההליך שתואר לעיל, מודל גידול עצב סיאטי אורתוטופי הוקם בהצלחה בעכברי NSG עם תאים שמקורם בנוירופיברומה אימורטלית (ipNF04.4). הדמיית ביולומינסנציה עם D-luciferin חשפה לוקליזציה ברורה של הגידול בעצב הסיאטי כבר ביום החמישי, עם עדות לצמיחה אקספוננציאלית לאורך זמן. ההשתלה הצליחה ב-90% (37/41) מהעכברים שהוזרקו. התקדמות הגידול נוטרה בימים 5, 12, 19, 26, 30 ו-33 (איור 1A), ולא נצפו אותות לא ספציפיים לאורך כל תקופת הניטור. עכברים הומתו ביום ה-33, בהתאם להנחיות המוסד, עם הסימן הראשון למצוקה או עומס גידול מוגזם. לאחר הדיסקציה, הגידול נראה מפותח היטב ומשולב בתוך העצב הסיאטי, ללא סימנים להיווצרות מורסה (איור 1B). יש לציין כי עכברים הפגינו אמבולציה תקינה מיד לאחר ההתאוששות מההרדמה.
איור 1: הדמיה ביולומינסנציה וניתוח מקרוסקופי של קסנוגרפלים אורתוטופיים של עצב סיאטי בעכברי NSG. (A) הדמיה ביולוגית אורכית (BLI) של שני עכברי NSG שהוזרקו תוך עצבית עם תאי ipNF04.4 לעצב הסיאטי השמאלי. התמונות צולמו בימים 5, 12, 19, 26, 30 ו-33 לאחר ההזרקה, הממחישות צמיחה מתקדמת של הגידול לאורך זמן בשני העכברים האלה. העלייה בעוצמת האות הביולוגי משקפת השתלה מוצלחת והתרחבות הגידול בתוך המיקרו-סביבה העצבית. (B) מבט מקרוסקופי של העצב הסיאטי ביום 33 לאחר ההשתלה, שמראה גידול מפותח ומשולב ללא סימנים להיווצרות מורסה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פוטומיקרוגרף של אתר השתל מעכבר זה המדגים צמיחת גידול ופלישה מוקדית. קטעי רקמה משובצים בפרפין מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין (H&E). מוצגות דוגמאות לגידולים אופייניים משלושה עכברים. פסי קנה מידה: 2000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: התפתחות משקל גוף מייצגת של עכברי NSG (n=15) במהלך ניסוי ה-xenograft. לא נצפתה ירידה משמעותית במשקל. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.
דיון
ההקמה המוצלחת של מודל קסנוגרפט שמקורו בקו תאי נוירופיברומה אורתוטופית (CDX) בעכברי NSG מייצגת התקדמות משמעותית במחקר NF1, תוך התייחסות למגבלות העיקריות של מודלים קיימים. הפרוטוקול מאשר כי ניתן להשתיל ביעילות תאי שוואן אנושיים הקשורים ל-NF1 (ipNF04.4)14,15,16 ביעילות לעצב הסיאטי של עכברים חסרי חיסון, מה שמוביל להתפתחות גידול הניתן לשחזור בתוך מיקרו-סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. קסנוגרפים אורתוטופיים של קווי תאי שוואן הוזכרו במחקרים המקוריים המבססים קווי תאי שוואן אנושיים14,15, ופרוטוקול מפורט מסופק כאן.
המפתח להצלחת פרוטוקול זה היה הכנה וניטור קפדני הן של מרכיבי התא והן של בעלי החיים המארחים. במהלך ההליך, ההרדמה נוהלה בקפידה, והבטיחה שהעכברים יישמרו במצב הרדמה מתאים ללא לחץ משמעותי. כדי למזער כל נזק פוטנציאלי, העצב הסיאטי לא נמתח עם מלחציים או מלקחיים, והקפידו מאוד להימנע מלחץ מכני על הרקמות. השימוש ב-BLI מבוסס לוציפראז איפשר ניטור אורך לא פולשני של צמיחת הגידול, וסיפק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור. אסטרטגיית הדמיה זו לא רק אישרה את כדאיות השתל אלא גם אפשרה זיהוי של סטיות מוקדמות בדינמיקת הגידול. היעדר ירידה משמעותית במשקל (איור משלים 1), תפקוד מוטורי לקוי או סימני מצוקה אחרים בעכברים מדגיש את התאימות של פרוטוקול זה לעקרונות האתיים של רווחת בעלי חיים ול-3Rs (החלפה, הפחתה, עידון).
בהשוואה ל-GEMMs, המסתמכים על השבתה מותנית של Nf1 6,7,9, גישה זו מציעה מספר יתרונות ברורים. GEMMs דורשים שינויים גנטיים ספציפיים, אך ייתכן שהם לא ישכפלו באופן מלא את האינטראקציות המורכבות בין גידול לסטרומה שנצפו בנוירופיברומות אנושיות 1,17. מודל זה מאפשר מחקר ישיר של תאי שוואן אנושיים בנישת העצבים הטבעית שלהם, תוך שימור גורמים חיצוניים תאיים4. בניגוד ל-GEMMs, שבהם גידולים מתפתחים באופן בלתי צפוי לאורך זמן, מודל ה-xenograft מאפשר שליטה מרחבית-זמנית מדויקת על היווצרות הגידול. מודל זה מספק פלטפורמה מהירה וניתנת לשחזור לבדיקת טיפולים מועמדים, כאשר BLI מאפשר ניטור בזמן אמת של התקדמות הגידול והתגובה לטיפול.
יתר על כן, ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים על MPNSTs, שבהם הוכח כי השתלה אורתוטופית משפרת את הנאמנות של מודלים של גידול5. עם זאת, נוירופיברומות שפירות מציבות אתגרים ייחודיים, מכיוון שצמיחתן תלויה מאוד באינטראקציות עצביות ספציפיות, ששיטות השתלה תת עוריות קונבנציונליות אינן מצליחות לסכם6. התוצאות מאשרות כי הזרקה תוך עצבית מספקת סביבה אופטימלית להתפתחות נוירופיברומה מתמשכת.
לפיכך, מודל in vivo זה יכול להיחשב כחלופה משלימה רלוונטית ל-GEMMs, לבדיקות טיפוליות פרה-קליניות. עם זאת, ישנן מגבלות למודל. תאי שוואן אנושיים שמקורם בנוירופיברומות עברו אימורטליזציה ומציגים פנוטיפ גידול שיכול להיחשב אגרסיבי יותר מזה של נוירופיברומה פרספקס, עם התפשטות תאים צפופה (איור 2). לא נצפו עדויות להתפשטות מרוחקת בבעלי חיים, ולא הודגמה טרנספורמציה ממאירה מוחלטת. יש צורך במחקרים נוספים כדי להראות אם הפנוטיפ של התא יכול להתאים לפנוטיפ "הביניים" המזכיר נוירופיברומה לא טיפוסית, כמו ניאופלזמות נוירופיברומטיות לא טיפוסיות עם פוטנציאל ביולוגי לא ידוע (ANNUBP)18. מגבלה קריטית נוספת של המודל נעוצה בתלותו בעכברים חסרי חיסון. היעדר מערכת חיסון נרכשת בעכברי NSG מגביל את חקר האינטראקציות בין מערכת החיסון לגידול, המוכרות יותר ויותר כתורמות מרכזיות לביולוגיה של נוירופיברומה 7,19,20,21. שיפורים עתידיים יכולים לשלב מודלים אנושיים של עכברים או אסטרטגיות חלופיות כדי ללכוד טוב יותר את ההיבטים החיסוניים של המחלה. בנוסף, ההסתמכות על ביטוי לוציפראז לניטור גידולים, למרות שהיא יעילה ביותר, עשויה להגביל את תחולת פרוטוקול זה על מערכות ניסיוניות חסרות גישה לציוד BLI. בעוד ש-BLI היא שיטה רגישה ולא פולשנית, היא אינה מספקת תובנות ישירות לגבי שינויים היסטופתולוגיים. ניתוחים משלימים, כגון MRI או היסטולוגיה מתקדמת, יכולים לשפר עוד יותר את האפיון של התקדמות נוירופיברומה.
מספר שלבים פרוצדורליים עשויים לדרוש אופטימיזציה כדי להבטיח השתלת גידול מוצלחת. כשל בהזרקה יכול לנבוע ממיקום לא נכון של המחט או דליפה מוגזמת של מתלה התאים. כדי להקל על כך, יש להכניס את המחט בזהירות במקביל לעצב הסיאטי ולמשוך אותה לאט לאחר ההזרקה. שונות באותות ביולומינסנציה עשויה לנבוע ממינון לוציפרין לא עקבי או חוסר יישור במהלך ההדמיה. מומלץ לתקן את תזמון הזרקת הפוסט-לוציפרין (10 דקות) ולשמור על הגדרות הדמיה זהות בכל בעלי החיים. אם השונות בצמיחת הגידול נשארת גבוהה, אשר את כדאיות התאים לפני ההזרקה ומזער את הלחץ של בעלי החיים במהלך הטיפול.
לסיכום, מחקר זה מבסס מודל קסנוגרפט אורתוטופי חדשני וניתן לשחזור, המציע פלטפורמה פרה-קלינית יעילה לחקר גידולים שפירים הקשורים ל-NF1. על ידי מינוף תאי שוואן אנושיים במיקרו-סביבת העצבים הטבעית שלהם, מודל זה מחקה מקרוב את הביולוגיה של נוירופיברומה אנושית תוך מתן אפשרות לניטור גידול בזמן אמת והתערבויות טיפוליות מבוקרות. מודל זה מייצג צעד חיוני בין GEMMs למודלים שמקורם בחולה (PDX), וסולל את הדרך לגישות רלוונטיות יותר מבחינה קלינית למחקר וטיפול בנוירופיברומה.
שיפורים עתידיים צריכים לשאוף לשלב רכיבים חיסוניים, כגון מודלים של עכברים אנושיים, כדי לחקור את תפקיד המיקרו-סביבה של הגידול6. הרחבת שיטות ההדמיה, כולל סריקות MRI או PET, יכולה להשלים את BLI עם תובנות מבניות ומטבוליות22. הארכת לוחות הזמנים של הניסוי תהיה חיונית לחקירת התפתחות נוירופיברומה ארוכת טווח וסיכוני טרנספורמציה ממאירים פוטנציאליים. על ידי גישור על הפער בין מודלים של GEMMs ו-PDX, פלטפורמה זו משפרת את המחקר התרגומי ב-NF1, ומציעה הזדמנויות חדשות לחדשנות טיפולית בגידולי מעטפת עצב היקפיים שפירים.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (Inca_18828). ברצוננו להודות לפלטפורמת HistIM (בניהולה של מרילין פאבייר) ופייר סוהייה, במכון קוצ'ין.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בופרנורפין | בופרקר | לטיפול בהקלה טרום-ניתוחית | |
| מחצלות חימום | אניפי | VI-653246 | לשמירה על נורמתרמיה במהלך ניתוח עכברים |
| hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) קו תאים | חומרים ביולוגיים יישומיים | T0194 | קו תאים שוואן אנושי חסר NF1 שהונצח |
| איזופלוראן | איזו-וט | בהרדמה בעכברים במהלך הדמיה ביולומינסנטית | |
| IVIS לומינה סדרה III | Revvity | להדמיית ביולומינסציה | |
| קטמין | קטמין 1000 וירבאק | להרדמה כירורגית בעכברים | |
| תוכנת תמונה חיה | Revvity | כלול ב-IVIS | לרכישת תמונה וכימות |
| מערכת הבדיקה של לוציפראז | פרומגה | E1500 | לזיהוי BLI |
| מלוקסיקאם | METACAM | תרופה נוגדת דלקת לא-סטרואידית (NSAID) | |
| תפר מונופילמנט שאינו נספג | אתילון | F2419H | לתפירת החתך |
| מחט למזרק | המילטון | מנהג | GA33/12, 7 מ"מ/pst4-12° |
| עכברי NOD SCID גמא (NSG) | נהר צ'ארלס | 614NSG | |
| פלנטי CMV פורו LUC (w168-1) | אדג'ין | 17477 | לביטוי של לוסיפראז גחלילית |
| Povidone iodé E Dermique 10% | ויאטריס | 330200775 | חומר חיטוי מקומי לחיטוי עור |
| להב סכין | FST | 10015-00 | לחתך בעור במהלך ניתוח |
| מיקרוסקופ סטריאו L125 | לייקה | לצורך הדמיית אתר הזרקת התאים בעצב הסיאטי | |
| מזרק 10 ומיקרו; l | המילטון | 1701RN | להזרקת תאים לעצב הסיאטי |
| שילאזין | רומפון 2% | להרדמה כירורגית בעכברים |
מקורות
- Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
- Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
- Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
- Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
- Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
- Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
- Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
- Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
- Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
- Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
- Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
- Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
- Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
- Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
- Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
- Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
- Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).
הדפסות חוזרות והרשאות
