מאמר שיטה

יצירת תנודות חמצן מהירות בניתוח צמיחה מיקרוביאלית של תא בודד באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתית

DOI:

10.3791/68697

⸱

18 ביולי 2025

 , 
1IBG-1: Biotechnology, Institute of Bio- and Geosciences, Forschungszentrum Jülich GmbH, 2Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לייצור שבב מיקרופלואידי דו-שכבתי ולניתוח צמיחה מיקרוביאלית תחת תנודות חמצן מהירות. ביצועי המכשיר אומתו באמצעות חישת חמצן בתעלות נוזלים וגידול מיקרוביאלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח מיקרוביאלי של תא בודד באמצעות מיקרופלואידיקה בשילוב עם מיקרוסקופ זמן-lapse טומן בחובו הבטחה לחקירת התנהגות צמיחה מיקרוביאלית בסביבות מוגבלות עם רזולוציה מרחבית-זמנית, ומציע תובנות שלא ניתן להשיג מגידול קונבנציונלי ופלטפורמות אנליטיות. חמצן ממלא תפקיד מכריע בקביעת צמיחת חיידקים. עם זאת, בקרה זמנית בטווח השניות לא יושמה בניתוח מיקרוביאלי באמצעות מיקרופלואידיקה. לאחרונה פיתחנו שבב מיקרופלואידית PDMS דו-שכבתי המאפשר בקרת חמצן זמנית בטווח של עשרות שניות. השבב מורכב משכבה עליונה לגז ושכבה תחתונה לגידול וזלוף נוזלים. שתי השכבות מופרדות על ידי קרום PDMS ביניים דק, המאפשר חילופי גזים מהירים בין שתי השכבות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מסבירים את הליך ייצור השבב, אפיון וגידול מיקרוביאלי באמצעות השבב. כתוצאות מייצגות, אנו מדגימים את יכולת החלפת החמצן המהירה בעשרות שניות, גידול מיקרוביאלי וניתוח גידול שנפתר בזמן בתנאי חמצן קבועים ומתנודדים. פרוטוקול זה נועד לסייע לחוקרים המעוניינים ליישם בקרת חמצן זמנית במערך המיקרופלואידיקה שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חמצן קשור קשר הדוק לצמיחה ופיזיולוגיה של חיידקים בין גורמים סביבתיים שונים, במיוחד משפיע על תהליכים תאיים כגון תגובת עקה חמצונית, הומאוסטזיס ברזל וזיהומים פתוגניים 1,2,3. באופן קונבנציונלי, גידול מיקרוביאלי נערך בתנאי סביבה או עם שליטה מינימלית ברמות חמצן ספציפיות. בתרחישים מציאותיים, לעומת זאת, סביבות חמצן לרוב אינן קבועות במקרים רבים אלא משתנות עם הזמן. לדוגמה, חיידקים יכולים להיחשף לרמות חמצן משתנות תוך שניות עד דקות במערכות מימיות כשהם נעים בסביבה עקב תנועת נוזלים ותנועתיות מיקרוביאלית 4,5,6. באופן דומה, ביו-ריאקטורים תעשייתיים יוצרים גם סביבות חמצן לא הומוגניות עקב ערבוב לא מספק, מה שמשפיע על צמיחת החיידקים והתפוקה הסופית 7,8. חקר תגובות מיקרוביאליות לתנאים דינמיים כאלה חיוני להבנת תהליכים אקולוגיים ולשיפור יישומים ביוטכנולוגיים.

אנאירובים פקולטטיביים כגון Escherichia coli (E. coli) יכולים לעבור בין מסלולים אירוביים ואנאירוביים בהתאם לזמינות החמצן 9,10. למרות שמחקרים קודמים חקרו את יכולת ההסתגלות המטבולית הזו, רוב המחקרים מתמקדים במעברי חמצן בודדים באמצעות מערכות גידול קונבנציונליות, שאינן מצליחות לשחזר את השינויים המהירים שחיידקים מתמודדים איתם לעתים קרובות 9,11,12,13,14. כתוצאה מכך, קיימת הבנה מוגבלת של האופן שבו חיידקים מגיבים מבחינה פיזיולוגית לרמות חמצן המשתנות לעתים קרובות.

כאמור, מערכי מעבדה מסורתיים חסרים את הדיוק והמהירות הדרושים כדי לחקות תנודות חמצן מהירות ואינם תומכים בניטור רציף ברזולוציה גבוהה. כדי לטפל בכך, פיתחנו לאחרונה פלטפורמה מיקרופלואידית מיוחדת עם שבב פולידימתילסילוקסן דו-שכבתי (PDMS), המאפשר בקרת חמצן מהירה והדמיה חד-תאית15. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לייצור שבב מיקרופלואידית דו-שכבתי היוצר תנודות חמצן מהירות ומאפשר ניתוח צמיחה מיקרוביאלית של תא בודד בתנאי חמצן מבוקרים. השבב מורכב משתי שכבות – שכבה עליונה לזלוף גזים ושכבה תחתונה לזלוף נוזלים וגידול מיקרוביאלי. הממברנה הדקה הבינונית בין שתי השכבות מאפשרת חילופי גזים מהירים. כהדגמה, E. coli MG1655 טופח בשבב שפותח. נותח הגידול בתנאי חמצן קבועים ומתנודדים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת עובש

  1. מכינים תבנית לשכבה העליונה על ידי הדפסת תלת מימד. בנה את תבנית השכבה העליונה עם משטח חלק כדי להבטיח משטח חלק של השכבה העליונה PDMS המתקבלת. אנו ממליצים להשתמש בהדפסת תלת מימד סטריאוליתוגרפיה (SLA).
    1. תכנן את התבנית עם תוכנת CAD תלת מימדית (איור 1A). ודא שהעיצוב כולל תעלות גז החופפות לתעלות הנוזל התחתונות. בצע תהליך תכנון זה במקביל לתכנון השכבה התחתונה (שלב 1.2.1).
    2. הדפס את התבנית באמצעות הדפסת תלת מימד SLA. הסר את השרף הנותר מהתבנית המודפסת ושטוף אותו באמבט איזופרופיל אלכוהול (IPA) למשך 30 דקות (איור 1B).
    3. בצע לאחר ריפוי על ידי חשיפת התבנית לאור 405 ננומטר עם משך וטמפרטורה מתאימים בהתאם לסוג השרף והגיאומטריה.
    4. הניחו לתבנית להשרות ב-IPA באמבט אולטרסאונד למשך 15 דקות כדי להסיר שרף לא נרפא שנותר בתבנית, שאחרת עלול לעכב את ריפוי ה-PDMS.
  2. מכינים תבנית פרוסות סיליקון לשכבה התחתונה.
    1. תכנן את השבב המיקרו-נוזלי עם עורך פריסת CAD (איור 1C). ודא שהעיצוב כולל כניסות, תעלות נוזלים ויציאות.
    2. צור תבנית פרוסות סיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה דו-שכבתית, כמתואר במאמר הקודם (איור 1D)16.
      הערה: התעלות בשכבה התחתונה הן בגודל מיקרומטר ודורשות ייצור מדויק, ואילו התעלות בשכבה העליונה הן בגודל מ"מ. מכיוון שהדפסת תלת מימד SLA מציעה זמן ייצור קצר יותר ולכן אב טיפוס מהיר יותר, הדפסת SLA שימשה לייצור מבנים גדולים למדי עבור תבנית השכבה העליונה. השכבה התחתונה יוצרה על ידי פוטוליתוגרפיה כדי להבטיח ייצור מדויק. במקרה שהתעלות בשכבה העליונה נמצאות גם הן בטווח של מיקרומטר ודורשות דיוק, שקול לייצר תבנית גם באמצעות פוטוליתוגרפיה.

2. ייצור שבב מיקרופלואידי דו-שכבתי PDMS

  1. הכן את תמיסת הריפוי לפני ה-PDMS על ידי ערבוב יסודי של הבסיס וחומר הריפוי ביחס של 10:1. מסירים את התערובת בחומר ייבוש למשך שעה.
  2. נקו את תבנית השכבה העליונה עם IPA וייבשו באמצעות אוויר דחוס.
  3. יוצקים את ה-PDMS לתבנית השכבה העליונה, ואחריה אשפרה תרמית בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (שלב ריפויראשון , איור 1E). שלבהריפוי הראשון מאפשר קילוף, חיתוך וניקוב של PDMS בזמן שהוא אינו נרפא במלואו.
  4. בדוק את דביקות ה-PDMS ביד או בפינצטה לאחר 20 דקות של חימום. אם ה-PDMS עדיין דביק, התאם את זמן החימום.
  5. מקלפים את ה- PDMS מתבנית השכבה העליונה וחותכים אותה לחתיכות בודדות (כאן 20 מ"מ על 18 מ"מ). חורי ניקוב (קוטר = 0.75 מ"מ) עבור כניסות גז (איור 1F). נקו את המשטח התחתון של השכבה העליונה על ידי שטיפה עם IPA, ייבוש באוויר דחוס והצמדת סרט דבק.
  6. נקו את תבנית השכבה התחתונה עם IPA וייבשו אותה באמצעות אוויר דחוס. מקבעים את תבנית השכבה התחתונה על ציפוי מסתובב ויוצקים PDMS במרכז התבנית. יוצקים PDMS קרוב לפרוסה כדי להפחית בועות אוויר. אם נמצאו בועות אוויר לאחר שפיכת PDMS, העבר אותן לצד החיצוני באמצעות פינצטה או מחטים נקיות.
  7. סובב את ציפוי ה-PDMS על תבנית השכבה התחתונה ב-1000 סל"ד למשך 60 שניות, ולאחר מכן ריפוי תרמי ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (שלב ריפויראשון , איור 1G). בדוק את דביקות ה-PDMS ביד או עם פינצטה לאחר 10 דקות והתאם את זמן החימום במידת הצורך.
  8. הנח את חלקי ה-PDMS של השכבה העליונה על שכבת ה-PDMS התחתונה על התבנית ולחץ בחוזקה מלמעלה כדי להבטיח חיבור פני השטח של השכבות העליונות והתחתונות (איור 1H).
  9. רפא תרמית את ה-PDMS לחלוטין ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות (שלב ריפוי שני). שלב הריפויהשני מאפשר את ריפוי ה-PDMS הסופי, שבו השכבות העליונות והתחתונות מחוברות זו לזו באופן בלתי הפיך (איור 1H).
  10. חותכים בעדינות את השכבה התחתונה של ה-PDMS לחתיכות. קלפו בזהירות את כל שבב ה-PDMS מהתבנית (איור 1H).
    הערה: אם קשה לקלף את שבבי ה-PDMS מהתבנית, שקול טיפול פני שטח נוסף בתבנית השכבה התחתונה, כגון סילניזציה וציפוי משטח כימי, כדי להקל על הליך הקילוף. אם השכבות העליונות והתחתונות מתנתקות בזמן הקילוף, שקול לקצר את הזמן לשלב ריפויראשון .
  11. חורי ניקוב (קוטר = 0.5 מ"מ) עבור כניסות ויציאות נוזלים בשני הקצוות של תעלות הנוזל (איור 1H). נקו בזהירות את המשטח התחתון של השבב על ידי שטיפה עם IPA, ייבוש באוויר דחוס והצמדת סקוטש.
  12. חבר את השבב עם זכוכית כיסוי בעובי 0.175 מ"מ לאחר הפעלת המשטח על ידי חמצון פלזמה (25 שניות, איור 1H).
  13. לאחר הנחת השבב על מצע הזכוכית, יש לשטוף את השכבה העליונה באוויר בלחץ כדי להבטיח שהשכבה התחתונה של ממברנת ה-PDMS מחוברת כהלכה לזכוכית.
  14. מחממים את השבב המודבק ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות עד דקה אחת כדי להגביר את יציבות ההדבקה.
    הערה: שלב הריפוי PDMS הנ"ל וזמן הריפוי הנדרש יכולים להיות מושפעים מפרמטרים שונים, כגון עובי התבנית, ציוד ותנאי הסביבה. לכן, התאם את זמן הריפוי בהתאם למקרה שהפרוטוקול המוצע אינו מתאים ליישום.

3. מערך ניסוי

הערה: מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימה (CMOS), מצלמת מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM) (תחום תדרים) וחממת טמפרטורה משמשים כמערך הניסוי הסטנדרטי. מקור לייזר עירור מאופנן (445 ננומטר, 100 מגוואט) מחובר למצלמת FLIM. שלושה בקרי זרימת מסה (חנקן, חמצן ופחמן דו חמצני) משמשים לבקרת גז. משאבות מזרק משמשות לזילוף בינוני.

  1. הכן צינורות לזילוף גז (כניסה) ונוזל (כניסה ויציאה). הפעל את החממה כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה לפני הניסוי (כאן 37 מעלות צלזיוס).
  2. בחר עדשת אובייקט רצויה (כאן, 20x לחישת חמצן ו-100x לתצפית מיקרוביאלית) והוסף שמן טבילה במידת הצורך. תקן את השבב השכבה הכפולה על מחזיק שבבים עם דבקים.

4. בקרת חמצן וחישה על השבב

  1. הכן תמיסת צבע רגישה לחמצן בריכוז מתאים (כאן, 3 מ"מ טריס (2,2'-bipyridyl) דיכלורורוטניום (II) הקסהידרט, RTDP).
  2. כייל את מצלמת FLIM באמצעות שקופית ייחוס עם אורך חיים ידוע (כאן 3.75 ns). מדוד את עוצמת האות עם מצלמת FLIM והתאם את זמן החשיפה או צמצם המיקרוסקופ כדי להשיג עוצמת אות של 0.68 - 0.72 לכיול טוב יותר.
  3. תקן את מחזיק השבב על במת המיקרוסקופ. חבר צינורות מתאימים לכניסת ויציאת הנוזל. התחל להחדיר תמיסת צבע רגישה לחמצן בקצב זרימה קבוע באמצעות משאבת מזרק (כאן 100 nL/min).
  4. חבר את כניסת הגז ואת בקרי זרימת המסה עם צינורות מתאימים. התחל לשטוף גז עם ריכוז חמצן מבוקר (כאן 0% או 21% חמצן, קצב זרימת מסה כולל 600 מ"ל לדקה).
  5. מדוד את אורך חיי הפאזה בהיעדר חמצן (τ0) ובריכוז חמצן ידוע אחר (כאן ב-21%). חשב את קבוע המרווה (Kq) באמצעות משוואת שטרן-וולמר כדלקמן, המתארת את כיבוי הקרינה בנוכחות חמצן. לחלופין, ניתן להשתמש בעוצמת הקרינה (I); עם זאת, מדידה מבוססת עוצמה עשויה להיות מושפעת משינויים בעוצמת מקור האור, הלבנת תמונות וכן הלאה.
    figure-protocol-1
    הערה: מומלץ להמתין מספר דקות לאחר תחילת שטיפת הגז כדי להבטיח כיול מדויק, במיוחד כאשר מכוונים לרמות דלדול חמצן נמוכות עד 0%. לדיוק משופר, שקול להשלים את התהליך בשיטות נוספות לדלדול חמצן, כגון שימוש בנבלות חמצן או מערך תא אטום נוסף.
  6. מדוד את אורך חיי הפאזה וחשב את ריכוז החמצן המתאים באמצעות משוואת שטרן-וולמר. ליצירת תנאי חמצן מתנודדים, השתמש בכל מערכת בקרת מכשירים כדי להתאים אוטומטית את קצב זרימת הנפח עבור חנקן וחמצן.

5. הכנת תרבית חיידקים

  1. . התחל תרבית מוקדמת על ידי חיסון אורגניזם רצוי (כאן, E. coli MG1655, חרוז יחיד מוכן לשימוש מבקבוקון קריו לכל בקבוקון) במדיום רצוי (כאן, מדיום LB המורכב מ-10 גרם/ליטר פפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים ו-10 גרם/ליטר NaCl) ודגירה למשך הלילה (כאן, 37 מעלות צלזיוס ב-150 סל"ד).
  2. מדוד את הצפיפות האופטית המתקבלת באמצעות פוטומטר ב-600 ננומטר (OD600).
  3. התחל את התרבית הבאה במדיום LB על ידי חיסון הקדם-תרבית (כאן ODראשוני 600 = 0.3 או 0.0001). דגרו על התרבות עד שתגיע לשלב הצמיחה האקספוננציאלי.
    הערה: אם המדיום לגידול על השבב שונה מהמדיום הראשון, רצוי לבצע קדם-תרבית שנייה עם המדיום לגידול על השבב כדי לאפשר לאורגניזמים להכיר את המדיום החדש16.
  4. הכן תמיסת זריעה על ידי דילול התרבות לצפיפות אופטית מתאימה. העבירו את תמיסת הזריעה למזרק של 1 מ"ל לשלב הבא. עבור E. coli, הצפיפות האופטית (OD600) של תמיסת הזריעה הייתה בסביבות 0.5.

6. גידול מיקרוביאלי על השבב והדמיית זמן-lapse בתנאי חמצן מבוקרים

  1. תקן את מחזיק השבב על במת המיקרוסקופ. הניחו למחזיק השבב ולשבב ה-PDMS להתחמם בחממה (כאן 37 מעלות צלזיוס) למשך מספר שעות, מכיוון שהדבר יפחית את הסיכון לביטול המיקוד במהלך הדמיית זמן-lapse עקב תזוזה הקשורה לטמפרטורה.
  2. לפני תחילת הגידול, התחל בגז עם ריכוז החמצן הראשוני הרצוי על ידי התאמת אחוז הנפח של זרימת מסת החמצן והחנקן תוך שמירה על קצב הזרימה הכולל וקצב זרימת הפחמן הדו חמצני קבועים.
  3. חבר את כניסת הגז של השבב ואת בקרי זרימת המסה.
  4. זרע את האורגניזם לתוך השבב על ידי חיבור המזרק עם תמיסת הזריעה לשקע הנוזל ודחיפה ידנית של המזרק. בדוק דרך המיקרוסקופ אם תאים נלכדים בהצלחה בתאי הגידול.
  5. לאחר חיסון התאים, הסר את המזרק וחבר מזרק נוסף עם המדיום הטרי לכניסת הנוזל. דחוף ידנית את המזרק כדי לשטוף את כל התאים שנותרו בתעלת האספקה הבינונית.
  6. התחל להחדיר את המדיום בקצב זרימה קבוע (כאן 100 נ"ל/דקה) עם משאבת המזרק. הקפידו על קצב זרימה מספיק, שכן קצב לא מספיק עלול להוביל להתייבשות החדר. קצב הזרימה המספיק יכול להשתנות בהתאם למספר גורמים, כולל הגיאומטריה של תעלת הנוזל וקצב זרימת הגז בתעלת השכבה העליונה.
  7. התחילו ברכישת תמונות דולג זמן. לגידול בתנאי חמצן מתנודדים, התחל בקרה אוטומטית של בקרי זרימת מסה במקביל לתחילת רכישת התמונה. במקרה שיש עיכוב כלשהו בהתחלת בקרת הגז ורכישת התמונה, קח בחשבון את העיכוב לניתוח נתוני תמונה מאוחר יותר.

7. ניתוח נתוני תמונה

  1. שמור את התמונה עם קיטועי זמן כאוסף תמונות אחד לכל מיקום.
  2. עבד מראש את התמונה כדי לסובב, ליישר ולחתוך את המושבה המעובדת באמצעות תוכניות ניתוח תמונה. דוגמאות לעיבוד מראש . תמונות TIF זמינות כאן:15 https://doi.org/10.5281/zenodo.13982747
  3. פלח תאים וחלץ ערכים רלוונטיים, כגון מספר תא, אורך, שטח, עוצמת הקרינה וכן הלאה. נתח עוד התנהגויות צמיחה. סקריפטים לדוגמה של Python זמינים כאן: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור שבבים דו-שכבתי PDMS
השבב הדו-שכבתי המיוצר מתואר באיור 2A, עם תעלות גז צבעוניות (אדום) ותעלות נוזל (כחול) להדמיה. לשבב שלוש תעלות נוזל זהות ותעלות גז חופפות כדי לאפשר ניסויים מקבילים. בתעלת הנוזל יש אזור גידול עם סדרה של תאי גידול (איור 2A(i)). תאים נלכדים בתוך תאי הגידול ומאפשרים להם לגדול בפורמט חד-שכבתי, המאפשר הדמיית זמן-lapse ברזולוציה גבוהה עם קצב רכישת תמונה גבוה. חתך השבב מדגים שכבה עליונה בעובי 3 מ"מ ושכבות תחתונות בעובי 65 מיקרומטר, המאפשרת דיפוזיה מהירה של גז מתעלת הגז לתעלת הנוזל דרך ממברנת ה-PDMS הבינונית (איור 2A (ii-ii')).

בקרת חמצן על השבב
יכולת חילופי הגזים של השבב שפותח נבדקה באמצעות FLIM וצבע רגיש לחמצן15. כפי שמוצג באיור 2B, ריכוז החמצן בתעלת הנוזל הראה ירידה או עלייה מקבילה תוך עשרות שניות כאשר ריכוז החמצן הועבר בין 21% ל-0%. תוצאות מדידת החמצן הללו מדגימות כי ניתן לשכפל את תנודת החמצן המהירה בעשרות שניות בשבב המיקרופלואידית הדו-שכבתי שפותח.

גידול מיקרוביאלי בתנאי חמצן קבועים
השבב שימש לראשונה לאפיון גידול אנאירובי פקולטטיבי של E. coli בתנאים גזיים קבועים עם ריכוזי חמצן שונים. פחמן דו חמצני תמיד התווסף לגז האספקה מכיוון שראינו צמיחה מוגבלת של E. coli תחת דלדול פחמן דו חמצני בניסויים ראשוניים (נתונים לא מוצגים). איור 3A ואיור 3B מתארים תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של E. coli בתנאים אירוביים (21% אספקת חמצן) ואנאירוביים (0% אספקת חמצן), בהתאמה. לאחר 3 שעות של גידול, E. coli שגדל בתנאים אירוביים הביא למושבות גדולות יותר בהשוואה לתנאים אנאירוביים. ניתוח כמותי מראה גם שיעורי גידול שונים בגודל המושבה (מושבה) התלויים בזמינות החמצן, כפי שמוצג בעקומות הגדילה באיור 3C. שימו לב שמושבה מנורמלת לפי שטח התחלתי כדי לאפשר השוואה בין מושבות ותנאים שונים. ניתן לקבוע את קצב הגידול האקספוננציאלי μ מעקומת הצמיחה כדלקמן ולסכם באיור 3D.

figure-results-1

התוצאות מאמתות את יכולתו של המכשיר לשלוט בחמצן בריכוזים מכוונים ולנתח ביעילות את הצמיחה המיקרוביאלית המתאימה מתמונות זמן-lapse שנרכשו.

גידול מיקרוביאלי בתנאי חמצן מתנודדים
לבסוף, E. coli טופח בתנאי חמצן מתנודדים, תוך מעבר בין שלבים אירוביים ואנאירוביים של גזים עם מרווח החלפה T'. T' שונים בין 60 דקות לדקה אחת נבדקו כדי לבחון את היכולת לניתוח גדילה שנפתרה בזמן בקורלציה לתנאי חמצן מתנודדים. איור 4 מתאר צמיחה מכומתת של E. coli בתנאי חמצן מתנודדים עם T' = 60, 30, 10, 5, 2 ו-1 דקה. בנוסף לעקומת הצמיחה המבוססת עלמושבה, קצב הגידול המיידי μΔt נקבע גם לרכוש תובנות שנפתרו בזמן כדלקמן.

figure-results-2

שיעורי הגידול בתנאים אירוביים ואנאירוביים קבועים מוצגים גם עם קווים מקווקוים (μ21%, μ0%) באיור 4 כהפניות לגדילה. גידול ה-E. coli הציג דינמיקה מובהקת בתגובה לתנאים גזיים מתנודדים. לדוגמה, לאחר ששלב הגזים הועבר מתנאים אירוביים לאנאירוביים (T' = 60 דקות), הגידול הראה (i) שלב תגובה: ירידה פתאומית בקצב הגדילה, ואחריו (ii) שלב ההתאוששות: עלייה הדרגתית בקצב הגדילה, ו-(iii) שלב הייצוב: ייצוב גדילה סביב μ0%. דינמיקת הגדילה של E. coli נפתרה בהצלחה זמנית תחת T' שונים עד דקה אחת, כאשר E. coli הראה קצב גדילה מונוטוני למעלה ולמטה עקב זמן מוגבל להסתגלות הצמיחה לתנאים גזיים משתנים. יתר על כן, ניתן לנתח התנהגות גדילה לא רק ברמת המושבה אלא גם ברמת התא הבודד. איור 5 ממחיש את התפתחות אזור התא הבודד תחת תנודות חמצן במרווחי מיתוג שונים T'. ניתן להסיק צמיחה של תא בודד על ידי מעקב אחר חלקות שכנות, ללא ניתוח מעקב. התנהגות הגדילה ברמת התא הבודד דומה למה שנצפה ברמת המושבה באיור 4; עלייה מהירה יותר בשטח בשלב הגז האירובי ושינוי ברור במהירות הצמיחה באירוע מיתוג הגז. התוצאות כאן מדגימות את היכולת לגדל חיידקים בתנאים גזיים מתנודדים ולנתח צמיחה מיקרוביאלית בקורלציה עם זמינות החמצן באופן שנפתר בזמן.

figure-results-3
איור 1: הליך ייצור שבבים דו-שכבתי. ההליך מתחיל בעיצוב תבניות (A, C), (B, D) ייצור תבניות, (E-G) יציקת PDMS ו-(H) הרכבת שבבים. נתון זה שונהמ-15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 2: שבב דו-שכבתי מיוצר ויכולת בקרת החמצן שלו. (A) מוצגת התמונה המייצגת של השבב המיוצר הכוללת תעלות גז צבעוניות (אדום) ותעלות נוזל (כחול) עבור הדמיה. תמונת ה-SEM מוצגת ב-(i), המתארת סדרה של תאי גידול המחוברים לתעלות נוזל משני הצדדים (סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). חתך השבב מוצג ב-(ii-ii'), המתאר את השכבה העליונה בעובי 3 מ"מ ואת השכבה התחתונה בעובי 65 מיקרומטר. (B) ריכוז החמצן הנמדד בתעלת הנוזל אחרי המעבר בין תנאים אירוביים (21% חמצן) ואנאירוביים (0% חמצן). נתון זה שונהמ-15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 3: גידול E. coli בתנאי חמצן קבועים. (A) תאים מעובדים באופן אירובי (21% אספקת חמצן) למשך 3 שעות, ותמונות זמן-lapse נרכשות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. (B) תאים מעובדים באופן אנאירובי (0% אספקת חמצן), ותמונות זמן-lapse נרכשות במשך 3 שעות. (C) גדילת תאים בתנאי חמצן קבועים שונים משורטטת על סמך מושבה A. (ד) קצב הגידול האקספוננציאלי מחושב ומסוכם. כל פסי קנה המידה = 5 מיקרומטר. הנתונים מבוטאים כממוצע ± S.D. n = 35 מושבות (0%), 27 (0.1%), 21 (0.5%), 16 (1%), 13 (5%), 13 (10%), 29 (21%). נתון זה שונהמ-15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 4: גידול E. coli בתנאי חמצן מתנודדים. נבדק גדילת תאים בתנאי חמצן מתנודדים שונים (T', מרווח מעבר בין תנאים אירוביים לאנאירוביים). צמיחת תאים המבוססת על מושבה משורטטת לאורך זמן (למעלה), ו-μΔt משורטט לאורך זמן כדי לאפשר פרשנות נתונים שנפתרה בזמן (למטה). הנתונים מבוטאים כממוצע ± S.D. n = 5 מושבות (60 דקות), 3 (30 דקות), 4 (10 דקות), 4 (5 דקות), 4 (2 דקות), 5 (1 דקה). נתון זה שונהמ-15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 5: שטח תא בודד (תא בודד ) של E. coli המעובד בתנאי חמצן מתנודדים. הנתונים הם ממושבה מייצגת מכל מרווח מיתוג T'. נתון זה שונהמ-15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול לייצור והפעלה של מערכת מיקרופלואידית דו-שכבתית סופק כדי לצפות בצמיחה מיקרוביאלית בתנאי חמצן מתנודדים במהירות עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. בשילוב עם הדמיית זמן-lapse, פלטפורמה זו מאפשרת גידול על שבב וניטור בזמן אמת של מיקרואורגניזמים בתנאי חמצן מבוקרים, ומאפשרת ניתוח של צמיחת חיידקים בקורלציה לזמינות החמצן.

בפרוטוקול זה, השכבות העליונות והתחתונות מוכנות בנפרד ולאחר מכן מורכבות לשבב יחיד. תפיסה מודולרית זו מאפשרת עיצובי שבבים שונים פשוט על ידי החלפת התצורות הדו-שכבתיות. שיטות ייצור שונות שימשו לתבניות השכבה העליונה והתחתונה - הדפסת תלת מימד SLA לחלק העליון ופוטוליתוגרפיה לחלק התחתון - בהתבסס על דרישות הגודל והדיוק שלהן. גישה זו משפרת את היעילות הכוללת של תהליך הייצור. הרכבת שתי השכבות מתבצעת באמצעות תהליך ריפוי PDMS דו-שלבי. חיוני לייעל את זמן החימום לשלב הריפוי הראשון בהתאם לתכנון, שכן עובי העובש ותנאי החימום המקומיים יכולים להשפיע על תוצאות הריפוי של PDMS.

אנו ממנפים את האופי של PDMS להיות חדיר מאוד לאוויר כדי להשיג החלפת חמצן מהירה. מצד שני, הדיוק של בקרת החמצן עשוי להיות מושפע גם מהדיפוזיה הפסיבית של חמצן באמצעות PDMS, במיוחד ברמות חמצן נמוכות יותר. כדי לפצות על מגבלה זו, ניתן להוסיף שיפורים נוספים לפרוטוקול. לדוגמה, לשיטת הכיול של חיישן החמצן יש הזדמנויות לשיפור. בפרוטוקול המודגם, החיישן מכויל בשתי נקודות ייחוס, 0% ו-21% רמות חמצן, באמצעות שבב דו-שכבתי PDMS. כתוצאה מכך, הדיוק של חישת חמצן מסתמך על היכולת ליצור תנאים מדויקים מדוללי חמצן לכיול. כפי שהוזכר בפרוטוקול, מומלץ להמתין מספר דקות לאחר תחילת שטיפת הגז כדי להבטיח כיול מדויק, במיוחד כאשר מכוונים לרמות דלדול חמצן נמוכות עד 0%. עם זאת, משימה זו מאתגרת עקב דליפות פוטנציאליות או אגירת אוויר בשבב ה-PDMS החדיר לאוויר. ניתן לשפר עוד יותר את דיוק הכיול על ידי שימוש בכימיקלים לניקוי חמצן או סגירת השבב בתא אטום היטב ונטול גז17,18. תוספים אלה יכולים לאפשר ניתוח חזק ומדויק יותר של התנהגות מיקרוביאלית בתנאים אנאירוביים ודלי חמצן לחלוטין.

המכשיר המודגם יהיה מעניין בתחומי מחקר שונים. לדוגמה, זה יהיה שימושי לשכפול תנאי חמצן בביו-ריאקטורים תעשייתיים, שבהם ההנחה היא שזמינות החמצן אינה הומוגנית מבחינה מרחבית-זמנית 7,8,19,20. השימוש בשבב הדו-שכבתי מאפשר לחוקרים לאפיין ולהבין התנהגות מיקרוביאלית בסביבות חמצן המשתנות במהירות, מה שלא היה אפשרי במערכי גידול קונבנציונליים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KK נתמך על ידי תוכנית התמיכה בחילופי סטודנטים של ארגון שירותי הסטודנטים היפני (JASSO) (G2130401003N) וה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - SFB1535 - מזהה פרויקט 458090666.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קליווין 5תוכנת WieWeb, הולנדלא ישיםעורך פריסה
מצלמת CMOSNikon, יפןDS-QI2
כיסוי זכוכיתSchott AG, גרמניהD263 ביו39.5 מ"מ x 34.5 מ"מ x 0.175 מ"מ
מנקה פלזמה פמטוDiener Electronics, גרמניה-מליטה פלזמה של שבב
טופס 3BFormlabs, ארצות הברית-מדפסת תלת מימד
חומר עזר לכל החייםסטארנה סיינטיפיק, בריטניהUMM-SFG
בקר זרימת מסהVö gtlin Instruments GmbH, שוויץGSC-A9SA-BB22חנקן, חמצן
בקר זרימת מסהVö gtlin Instruments GmbH, שוויץGSC-A9SA-BB21פחמן דו חמצני
דגם שרף v3Formlabs, ארצות הבריתRS-F2-DMBE-03שרף הדפסת תלת מימד
NaClCarl Roth, גרמניה3957.1רכיב בינוני LB
ניקון Eclipse Ti-E 2Nikon, יפן-מיקרוסקופ הפוך
מצלמת pco.flimPCO AG, גרמניה-
pco.flim לייזרOmicron-Laserprodukte GmbH, גרמניה-
פפטוןCarl Roth, גרמניה8986.1רכיב בינוני LB
Plan Apo λNikon, יפן-פי 100 שמן, פי 20
פולידימתילסילוקסן (PDMS)חברת דאו כימיקלים, ארה"בערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184
כלי ניקוב, Φ 0.50 מ"ממכשירי דיוק עולמיים, ארה"ב504528
כלי ניקוב, Φ 0.75 מ"ממכשירי דיוק עולמיים, ארה"ב504529
בקבוקון קריו של חנות ROTICarl Roth, גרמניה-
סולידוורקס 2016 x64 מהדורתדאסו מערכות, צרפתלא ישיםCAD תלת מימד
ציפוי ספין מצעAPT Automation, גרמניהספין150iציפוי ספינינג PDMS
משאבת מזרקCETONI, גרמניהneMESYS
חממת טמפרטורהOkolab, איטליה-ציוד מיקרוסקופ
tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate, (RTDP)Acros Organics, בלגיה208750010
אבוביםSaint-Gobain, צרפתטיגון F-4040-Aצינורות כניסת גז
אבוביםSaint-Gobain, צרפתטיגון AAD04103צינורות נוזלים
תמצית שמריםCarl Roth, גרמניה2363.3רכיב בינוני LB

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species. Int Microbiol. 3 (1), 3-8 (2000).
  2. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 413-451 (2007).
  3. André, A. C., Debande, L., Marteyn, B. S. The selective advantage of facultative anaerobes relies on their unique ability to cope with changing oxygen levels during infection. Cell Microbiol. 23 (8), e13338(2021).
  4. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  5. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  6. Taylor, J. R., Stocker, R. Trade-offs of chemotactic foraging in turbulent water. Science. 338 (6107), 675-679 (2012).
  7. Enfors, S. O., et al. Physiological responses to mixing in large scale bioreactors. J Biotechnol. 85 (2), 175-185 (2001).
  8. Takors, R. Scale-up of microbial processes: Impacts, tools and open questions. J Biotechnol. 160 (1), 3-9 (2012).
  9. Partridge, J. D., Scott, C., Tang, Y., Poole, R. K., Green, J. Escherichia coli transcriptome dynamics during the transition from anaerobic to aerobic conditions. J Biol Chem. 281 (38), 27806-27815 (2006).
  10. Ren, T., et al. Oxygen sensing regulation mechanism of Thauera bacteria in simultaneous nitrogen and phosphorus removal process. J Cleaner Prod. 434, 140332(2024).
  11. Murashko, O. N., Lin-Chao, S. Escherichia coli responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. Proc Natl Acad Sci. 114 (38), E8025-E8034 (2017).
  12. Yasid, N. A., Rolfe, M. D., Green, J., Williamson, M. P. Homeostasis of metabolites in Escherichia coli on transition from anaerobic to aerobic conditions and the transient secretion of pyruvate. Royal Soc Open Sci. 3 (8), 160187(2016).
  13. von Wulffen, J., RecogNice-Team,, Sawodny, O., Feuer, R. Transition of an Anaerobic Escherichia coli Culture to Aerobiosis: Balancing mRNA and Protein Levels in a Demand-Directed Dynamic Flux Balance Analysis. PloS one. 11 (7), e0158711(2016).
  14. Pedraz, L., Blanco-Cabra, N., Torrents, E. Gradual adaptation of facultative anaerobic pathogens to microaerobic and anaerobic conditions. FASEB J. 34 (2), 2912-2928 (2020).
  15. Kasahara, K., et al. Unveiling microbial single-cell growth dynamics under rapid periodic oxygen oscillations. Lab on a Chip. 25, 2234-2246 (2025).
  16. Gruenberger, A., et al. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560(2013).
  17. Wu, H. M., et al. Widefield frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FD-FLIM) for accurate measurement of oxygen gradients within microfluidic devices. Analyst. 144 (11), 3494-3504 (2019).
  18. Kasahara, K., et al. Enabling oxygen-controlled microfluidic cultures for spatiotemporal microbial single-cell analysis. Front Microbiol. 14, 1198170(2023).
  19. Bisgaard, J., et al. Characterization of mixing performance in bioreactors using flow-following sensor devices. Chem Eng Res Des. 174, 471-485 (2021).
  20. Nauha, E. K., Kálal, Z., Ali, J. M., Alopaeus, V. Compartmental modeling of large stirred tank bioreactors with high gas volume fractions. Chem Eng J. 334, 2319-2334 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time LapsePDMS

מאמרים קשורים