מאמר שיטה

ניווט בנתונים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה באמצעות כלים חישוביים חינמיים

DOI:

10.3791/68707

⸱

19 באוגוסט 2025

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתונים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה זמינים במאגרי מידע פתוחים ונגישים באמצעות כלים חינמיים. בהתחשב במורכבות של חיפושים ותיאורים במאגרי נתונים, לביולוגים רבים אין את הידע להשתמש במערכי נתונים אלה. כאן, אנו מספקים מדריך לשימוש בכלים חינמיים לחיפושי נתונים פרוטאומיים בסיסיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתוני פרוטאומיקה מבוססי ספקטרומטריית מסה (MS), כולל רכישה תלויה בנתונים (DDA) ורכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA), נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. עם זאת, היישום של מערכי נתונים אלה במחקרי אימות עדיין מוגבל בשל היעדר הדגמות ברורות כיצד לחפש ולנתח ביעילות נתונים פרוטאומיים. כדי למלא את הפער הזה, בחרנו מערך נתונים אחד של DDA ו-DIA אחד שהופקדו במאגר הנתונים של PRoteomics IDEntifications (PRIDE) כדי להמחיש טוב יותר את זרימת העבודה של ניתוח נתונים פרוטאומיים ואת העיבוד שלאחר הזרם של תוצאות חיפוש חלבונים. למטרות הדגמה, השתמשנו בשני כלים חישוביים חינמיים: FragPipe (v22.0) עבור מערכי נתונים של DDA ו-DIA-NN (2.1.0) עבור מערכי נתונים של DIA. שלבים לאחר עיבוד, כגון יצירת עלילות הר געש ורשימות של חלבונים לא מווסתים, הודגמו באמצעות קוד R. מחקר זה מספק פרוטוקולים בסיסיים לחיפוש וניתוח נתונים פרוטאומיים, המשמש כמדריך חיוני למתחילים לטיפול יעיל במערכי נתונים פרוטאומיים. באמצעות עבודה זו, אנו שואפים להעצים חוקרים עם הידע הדרוש כדי למנף נתונים פרוטאומיים בחקירות הביולוגיות שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחום הפרוטאומיקה עבר מהפכה על ידי אימוץ נרחב של מאגרי נתונים בגישה פתוחה וכלי תוכנה חופשיים1, שהיו חיוניים בקידום יכולות המחקר וקידום תרבות של שיתוף נתונים. הקמת משאבים מרכזיים, כגון PRIDE2, ופיתוח פורמטים סטנדרטיים של נתונים על ידי יוזמת תקני הפרוטאומיקה (PSI) של ארגון הפרוטאום האנושי (HUPO)3 יצרו הזדמנות חסרת תקדים לשימוש חוזר ושילוב נתונים. עם זאת, ניתוח ופרשנות של נתונים פרוטאומיים עדיין מהווים מחסומים טכניים משמעותיים, במיוחד עבור ביולוגים ומדענים רופאים המעוניינים לבצע אימות אורתוגונלי של תוצאות הניסוי שלהם4. כתב יד זה מתמודד ישירות עם אתגר זה על ידי הצגת זרימת עבודה חישובית אגנוסטית לספקים כדי לספק מסגרת נגישה לחוקרים לשאול, לנתח ולשלב באופן עצמאי נתוני פרוטאומיקה ציבוריים עם הממצאים שלהם, ובכך להקל על אימות אורתוגונלי חזק ללא צורך בניסויים נוספים במעבדה רטובה. עבודה זו מתאימה במיוחד לחוקרים המבקשים לאמת אורתוגונלית את הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים ספציפיים שזוהו בניסויים שלהם וליצור השערות חדשות על ידי חקירת דפוסי הביטוי של החלבונים המעניינים שלהם במגוון רחב של מחקרים שפורסמו. על ידי מתן מדריך צעד אחר צעד, אנו שואפים להעצים מגוון רחב יותר של מדענים לרתום את מלוא הפוטנציאל של נתוני פרוטאומיקה ציבוריים, ובסופו של דבר לשפר את החוסן וההשפעה של המחקר שלהם.

בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS), סריקות MS1 ו-MS2 הן בסיסיות לרכישת נתונים. סריקות MS1, או סריקות סקר, מזהות ומודדות את יחסי המסה למטען (m/z) של כל היונים במדגם, ומספקות סקירה מקיפה של אוכלוסיית היונים5. סריקות MS2, הנקראות גם סריקות פיצול, כוללות בידוד ופיצול של יונים קודמים ספציפיים שנבחרו מסריקת MS1, ויוצרות ספקטרום יונים של מקטע לזיהוי פפטיד6.

רכישה תלויה בנתונים (DDA) בוחרת את היונים הנפוצים ביותר מסריקות MS1 עבור פיצול MS2, ומייצרת ספקטרום פשוט יותר המייעל את הניתוח. עם זאת, DDA יכול להוביל לדגימה סטוכסטית ולערכים חסרים בדגימות מורכבות, מה שמגביל את יכולת השחזור7. לעומת זאת, רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA) מפצלת באופן שיטתי את כל היונים בתוך חלונות m/z מוגדרים מראש, מה שמבטיח כיסוי מקיף וממזער ערכים חסרים. זה משפר את הדיוק הכמותי ואת יכולת השחזור8, אם כי DIA דורש כלים חישוביים מתקדמים כדי לפענח אתספקטרום MS2 9 המורכב ביותר שלו.

PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride)2הוא מאגר מוביל בתוך קונסורציום ProteomeXchange (https://www.proteomexchange.org)10, פלטפורמה גלובלית לשיתוף נתוני פרוטאומיקה. משתמשים יכולים לנווט ביעילות במשאב העצום הזה באמצעות חיפושי מילות מפתח כדי לאתר מערכי נתונים מעניינים.

DIA-NN11, חבילת תוכנה הממנפת רשתות עצביות עמוקות, היא כלי בתקן זהב לניתוח נתוני פרוטאומיקה של רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA). הוא מצטיין בדיוק הזיהוי והכימות, מה שהופך אותו ליעיל במיוחד לעיבוד מערכי נתונים מורכבים של DIA12. עבור זרימות עבודה של רכישה תלוית נתונים (DDA), MSFragger13, המשולב בצנרת FragPipe, מציע זיהוי פפטידים מהיר במיוחד. גישת אינדקס השברים החדשנית שלה מאפשרת התאמה ספקטרלית מהירה, ועולה על הכלים המסורתיים במהירות של יותר מפי 100.

מצוידים במאגרי מידע מקיפים אלה ובכלים מתקדמים, חוקרים יכולים בקלות לעשות שימוש חוזר בנתונים פרוטאומיים לאימות צולב ותגליות ביולוגיות חדשות. נגישות זו הניעה את הזיהוי של סמנים ביולוגיים רבים של חלבונים במחלות מגוונות14,15, שיפרה את חיזוי הפרוגנוזה16 ואפשרה סיווג תת-סוגים מולקולרי על סמך פרופילים פרוטאומיים17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ראה איור 1לסקירה כללית של זרימת העבודה וטבלת החומרים לתיאורים מפורטים של התוכנה שבה נעשה שימוש.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה כללית של תכנון המחקר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הגדרת קובץ ותוכנה לדוגמה

הערה: כל היישומים ניתנים בחינם לשימוש מחקרי פרטני וניתן להפעיל אותם במחשב אישי (Windows ו-Linux נתמכים).

  1. צור ספריה חדשה עבור פרוייקט.
  2. הורד JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw מ-PRIDE.
    הערה: ניתן להוריד את שתי קבוצות הקבצים מ-https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 ו-https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 בנפרד (איור 2).
  3. הורד והתקן את כלי התוכנה הנדרשים.
    1. הורד את הגרסה העדכנית ביותר של DIA-NN כקובץ .msi. DIA-NN זמין באופן חופשי כקובץ .msi עבור Windows או קובץ .zip עבור לינוקס מ-https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
    2. הורד את הגרסה העדכנית ביותר של MSFileReader כקובץ .exe. MSFileReader זמין באופן חופשי כקובץ .exe מ-https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, הנדרש לעיבוד נתוני Thermo Fisher DIA בפורמט גולמי.
    3. הורד את הגירסה העדכנית ביותר של .NET SDK כקובץ .exe. .NET SDK זמין באופן חופשי כקובץ .exe מ-https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, הנדרש ב-Windows כדי להפעיל את MSFileReader.
    4. הורד את הגרסה העדכנית ביותר של FragPipe כקובץ .zip. FragPipe זמין באופן חופשי כקובץ .zip מ-https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. קובץ ה-zip עם jre מומלץ מכיוון שהוא מכיל זמן ריצה של Java עבור Windows, הדרוש להפעלת FragPipe. MSFragger מוטמע ב-FragPipe.
  4. הורד את הגרסה העדכנית ביותר של קבצי סקריפט R ו-Rstudio ו-R מקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2. ניתן להוריד את R ו-RStudio באופן חופשי מ-https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe ו-https://posit.co/download/rstudio-desktop/.
  5. פתח את הקבצים הדחוסים ולחץ על . exe או .msi Files כדי להתקין את היישומים.

2. ניתוח נתוני DIA באמצעות DIA-NN

  1. הורד את קובץ ההפניה proteome fasta מ-UniProt. כדי להוריד את פרוטאום הייחוס של הומו ספיינס (מידע איזופורמי לא כלול) עבור אל https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (איור 3A).
  2. לחץ על הוסף FASTA כפתור כדי לטעון את קובץ ההתייחסות ל- DIA-NN.
  3. בחר את שתי האפשרויות תקציר FASTA ליצירת חיפוש/ספרייה ללא ספרייה וספקטרום מבוסס למידה עמוקה, RTs ו-lMs תחת חלק יצירת יונים מבשר. לחץ על כפתור ההפעלה כדי ליצור ספרייה ספקטרלית חזויה (איור 3B).
    1. לאחר יצירת קובץ הספרייה הספקטרלית החזוי, השתמש בו שוב עבור ניסויים אחרים באותן הגדרות רכישה ניסיוניות באמצעות לחיצה על כפתור ספקטרלי כדי להוסיף את הספרייה החזויה.
  4. בטל את הבחירה בשתי האפשרויות תחת החלק יצירת יונים מבשר ולחץ על כפתור הסוג שמתאים לפורמט הקובץ מתחת לחלק הקלט כדי לטעון את נתוני ה-DIA.
  5. הגדר את דיוק המסה ודיוק MS1 תחת אלגוריתם ל-0.0 עמודים לדקה.
  6. התאם את הגדרות טווח המסה של המבשר והשבר תחת חלק יצירת יונים מבשר בהתבסס על הגדרות הניסוי.
  7. שמור את הגדרות ברירת המחדל האחרות.
    1. הדור המקדים של DIA-NN משתמש בטריפסין/P (נקרע אחרי K/R אלא אם כן אחריו פרולין) עם מחשוף אחד שהוחמץ כדי להדגים עיכול חלקי; השביתו את כריתת N-term M עבור פפטידים לא קנוניים (למשל, אימונופפטידומיקה) או הגדילו את המחשופים שהוחמצו ל-2 עבור פפטידים ארוכים יותר.
    2. הפעל במפורש שינויים משתנים (מושבתים כברירת מחדל) עבור מחקרי שינוי לאחר תרגום (PTM) (למשל, Ox (M) לחמצון, K-GG עבור ubiquitination), והרחיב מסנני פפטידים (אורך: 7-30 aa; טעינה: 1-4+; מבשר m/z: 300-1800) בהתאם להגדרות הניסוי (למשל, אורך: 5-50 aa, מטען = 1-6) עבור PTMs גדולים או עיכול לא טריפטי.
    3. הגדרות האלגוריתם ממנפות כיול אוטומטי (דיוק מסה = 0.0 עמודים לדקה) עבור יישור מסה מדויק - עקיפה עם טולרנסים ידניים (למשל, 10 עמודים לדקה) עבור מכשירים ברזולוציה נמוכה - והתאמה בין ריצות (MBR) מעבירה מזהים בין ריצות (השבתה עבור דגימות הטרוגניות).
    4. ניקוד רשת עצבית מגביר את ביטחון הזיהוי (שמירה אלא אם איכות הנתונים ירודה), בעוד שספקטרומטריית מסה קוונטית ללא תווית (UMS) מאפשרת כימות ללא תוויות ברמת דיוק גבוהה; עבור לכימות MS2 עבור תגים איזובריים (למשל, TMT). השתמש בחיפוש ללא ספרייה רק עם נתוני DIA ברזולוציה גבוהה כדי לעקוף את דרישות הספרייה הספקטרלית.
  8. לחץ על כפתור ההפעלה . המתן לתוצאות עד שסיים יוצג בממשק הפעולה המציין שהריצה הסתיימה (איור 3C).

3. ניתוח נתוני DDA באמצעות FragPipe

  1. לחץ על סמל Fragpipe בתיקייה ~\FragPipe\fragpipe\bin לאחר ההתקנה. ניתן לראות את כל ההגדרות התלויות בכרטיסייה תצורה. בדוק אם שלושת המודולים (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN ו-Python) קיימים במחשב שלך. אם לא, הורד אותם על ידי לחיצה על הורד/עדכן או הורד (איור 4A).
  2. מעבר לכרטיסיה הבאה, זרימת עבודה. בחר ברירת מחדל עבור זרימת העבודה ולחץ על טען זרימת עבודה. לחץ על הוסף קבצים כדי להוסיף נתיבי קבצים. הקצו שם ניסוי ומספר ביו-שכפול תחת הקצאת קבצים או פשוט השאירו אותו (איור 4B).
  3. כעת, לחץ על מסד נתונים ופנה לכרטיסייה זו. טען קובץ fasta או הורד כל קבצי fasta בהתאם למין הדגימות. בזמן ההורדה, בחר באפשרויות רצפים שנבדקו בלבד, הוסף פיתויים והוסף מזהמים נפוצים עבור ריצה פשוטה (איור 4C).
  4. לאחר מכן לחץ על MSFragger כדי לשנות את הכרטיסייה. בחר את תצורת ברירת המחדל של חיפוש סגור ולחץ על טען.
    הערה: החיפוש הסגור הוא בעצם חיפוש אחר השינויים שהגדרת בעוד שהחיפוש הפתוח יחקור את כל השינויים האפשריים מהנתונים, מה שגוזל יותר זמן וזיכרון.
  5. עבור התאמת שיא, שמור על הגדרות ברירת המחדל פרט לכך שמומלץ לבחור ללא עבור כיול ומיטוב, מכיוון שהיא תחסוך זמן.
  6. לעיכול חלבון, התאם את הפרמטרים בהתאם לתנאי הניסוי. שמור על הגדרות ברירת המחדל הבאות (איור 5A).
    הערה: סובלנות המסה של המבשר והשבר (± 20 ppm) מגדירה את שגיאת המסה המקסימלית המותרת להתאמת ספקטרום ניסיוני לפפטידים תיאורטיים, עם ערכים הדוקים יותר המומלצים עבור מכשירים ברזולוציה גבוהה. כללי האנזים (טריפסין קפדני) מציינים את ספציפיות המחשוף (אחרי K/R, אלא אם כן אחריו P), כאשר מחשופים שהוחמצו (2) מאפשרים פפטידים מעוכלים חלקית. מסנני אורך פפטיד (5-50 שאריות) ומסה (500-5000 Da) אינם כוללים מועמדים לא סבירים. שינויים משתנים (למשל, +15.9949 Da על מתיונין לחמצון, +79.96633 Da על S/T/Y לזרחון) מאפשרים זיהוי של שינויים כימיים, בעוד ששילובים מקסימליים (5) מגבילים שינויים בו-זמנית לכל פפטיד כדי לנהל את מרחב החיפוש. מקסימום מודים משתנים לכל אתר (למשל, 3 על M) שולט בתדירות השינוי. מסד נתונים מפוצל משפר את היעילות עבור פרוטאומים גדולים, ושגיאת איזוטופים (0/1/2) אחראית לשיאים איזוטופיים שהוקצו באופן שגוי. הגדרות אלה מאזנות ביחד רגישות, ספציפיות ועומס חישובי בזיהוי פפטידים.
  7. שנה לכרטיסיה אימות. בטל את הבחירה ב-Predict RT ו-Predict spectra, המיועד לנתוני DIA (איור 5B).
  8. לחץ על הכרטיסייה Quant (MS1). בחר הפעל MS1 quant ולחץ על טען ברירות מחדל כמות. בחר IonQuant ושמור על הגדרות ברירת המחדל (איור 6A). השבת את MBR עבור זמני שמירה לא יציבים או השבת את נורמליזציה של עוצמה אם נוצרות הטיות קנה מידה גלובלי; אפשר שמור אינדקס בדיסק כדי לחסוך ב-RAM עם ערכות נתונים גדולות.
    הערה: ברירת המחדל של Quant (MS1) היא לייעל את הכימות ללא תווית באמצעות MaxLPQ (כימות חלבון מבוסס MaxLFQ, אלגוריתם המרחיב את שיטת MaxLFQ לקבוצות חלבונים), הדורש ≥1 יון ייחודי לחלבון (הגדל ל-≥2 לחומרה גבוהה יותר במחיר הכיסוי). התאמה בין ריצות (MBR) מעבירה זיהויים בין ריצות באמצעות עמידות זמן שמירה (RT) (ברירת מחדל של 0.4 דקות; הידוק ל-0.2 דקות עבור כרומטוגרפיה יציבה או שחרור עבור שונות שיפוע) ועמידות ניידות יונים (IM) (ברירת מחדל 0.05 1/k0 [ניידות מופחתת הפוכה]; התאמה בהתבסס על דיוק של הודעות מיידיות), מסוננת לפי ≤1% FDR (שיעור גילוי שגוי; ברירת מחדל של יון MBR FDR=0.01; נמוכה ל-0.005 עבור קפדנות). הסקת חלבון משתמשת ב-uniquer+rascor (הקצאת פפטיד סכין גילוח לקיבוץ חלבונים). גילוי מאפיינים משתמש בסובלנות מסה של 10 ppm (הגדלה ל-20 ppm עבור MS ברזולוציה נמוכה או ירידה ל-5 ppm עבור רזולוציה גבוהה).
  9. כעת, לחץ על הכרטיסייה הפעלה . בחר ספריית פלט. לחץ על RUN כדי להתחיל לנתח את הנתונים (איור 6B).
    הערה: עבור נתוני פרוטאומיקה ללא תוויות שאינם מתמקדים בשינויים או משתמשים בכימות מבוסס תווית, לא נעשה שימוש בכרטיסיות PTMs, Glyco ו-Quant (איזוברי).

4. ניתוח DIA-NN/FragPipe במורד הזרם

הערה: קודים מפורטים המשמשים במחקר זה נכללים כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2. ניתן למצוא את גרסאות החבילה המשומשות במחקר זה בקובץ משלים 3.

  1. פתח את RStudio וקרא את נתוני ביטוי החלבון שנוצרו על ידי DIA-NN או FragPipe. נתוני מטריצת קבוצת חלבונים המסתיימים ב-.pg_matrix.tsv מ-DIA-NN ונתוני חלבון משולבים המסתיימים ב-.tsv מ-FragPipe משמשים בדרך כלל לניתוח.
  2. הסר את הערכים החסרים מבלי למלא NA וסנן את קבוצות החלבון שזוהו וכימתו עם פחות משני פפטידים ייחודיים.
    הערה: נתוני ה-DIA במחקר זה נוצרו על ידי קבוצות חלבון מסוננות, בעוד שנתוני ה-DDA היו מקבוצות חלבון לא מסוננות.
  3. נרמל את עוצמות החלבון באמצעות קנה מידה חציוני או נורמליזציה קוונטילית על פני דגימות. נתוני DIA במחקר זה נורמלו על ידי נורמליזציה חציונית ואילו נתוני DDA על ידי נורמליזציה קוונטילית כדי להדגים טוב יותר את שתי השיטות.
    הערה: נורמליזציה חציונית חזקה כנגד חריגים ומתאימה לתרחישים שבהם רוב החלבונים נשארים ללא שינוי על פני הדגימות, מה שהופך את שפע החלבון החציוני לנקודת ייחוס יציבה. עם זאת, הוא עלול להיכשל בתרחישים עם חלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי גבוה18. נורמליזציה קוונטילית מבטיחה התפלגות אחידה של שפע החלבון על פני דגימות, מה שמועיל כאשר משווים דגימות עם התפלגויות שונות. הוכח שהוא מפחית את הכוח הסטטיסטי ועלול לנרמל נתונים יתר על המידה, מה שעלול להסוות הבדלים ביולוגיים אמיתיים18. בפרוטאומיקה, נורמליזציה חציונית נמצאת בשימוש נרחב במחקרים ללא תוויות כדי להסיר הטיות שיטתיות הקשורות לביצועי מכשירי טרשת נפוצה. נורמליזציה קוונטילית מועדפת עבור מערכי נתונים בקנה מידה גדול, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וניתוח אשכולות19,20.
  4. חשב שינויים בקיפול log2 (למשל, סרום PDAC לעומת רגיל) וערכי p של מבחן t. חישוב ערכי p מתוקנים בשיטת בנימיני-הוכברג. הגדר ספי מובהקות (למשל, |log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0.05).
    הערה: ערכי ה-p החותכים המשמשים בנתוני מחקר זה מייצגים ערכים גולמיים, שכן שימוש בערכי p מותאמים (p_adj) יבטל את כל החלבונים הניתנים לזיהוי בכוח הסטטיסטי של מערכי נתונים מוגבלים אלה.
  5. בדוק את קיומם של ערכי NA חסרים ואל תכלול אותם. צור עלילת הר געש כדי להמחיש פגיעות משמעותיות.
  6. בחר חלבונים לא מווסתים באופן משמעותי. החל נורמליזציה של ציון Z על ערכי ביטוי חלבון. שרטט מפת חום מקובצת עם ביאורים של קבוצות לדוגמה.
  7. מפה חלבונים למזהי Entrez באמצעות org. Hs.eg.db. לבצע העשרת GO (תהליך ביולוגי) וניתוח מסלול KEGG.
    הערה: קטגוריות תהליך ביולוגי (BP) נבחרות בדרך כלל בניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) מכיוון שהן מתארות את התהליכים הגדולים יותר או התוכניות הביולוגיות המושגות על ידי פעילויות מולקולריות מרובות20. מונחים אלה מתמקדים בתפקודים תאיים שמשתבשים במחלות כמו סרטן, כולל תהליכים חיוניים כמו ויסות מחזור התא, תהליכים מטבוליים וכו'. בנוסף ל-BP, ניתוח GO כולל גם קטגוריות תפקוד מולקולרי (MF) ורכיב סלולרי (CC). מונחי MF מתארים את הפעילויות הביוכימיות של תוצרי גנים, כגון הובלת יונים או יכולות קשירת DNA. מונחי CC מגדירים את המיקומים התאיים שבהם תוצרי גנים מבצעים את תפקידיהם, כגון הגרעין, הממברנה המיטוכונדריאלית או השלד הציטולוגי.
  8. שאילתה STRINGdb עבור אינטראקציות (ניקוד מהימנות ≥ 400). צור רשת אינטראקטיבית באמצעות visNetwork.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש טוב יותר את החיפוש אחר מערכי נתונים פרוטאומיים, בחרנו שני סוגים של מערכי נתונים לניתוח זה. במטרה להדגים חלבונים לא מווסתים בהקשרים קליניים, חיפשנו ב-PRIDE באמצעות מילות מפתח כגון קליניקה. באופן ספציפי, בחרנו מערך נתונים המתאים לניתוח DIA מהקונסורציום לניתוח גידולים פרוטאומיים קליניים (CPTAC)21, ואחר המתאים לניתוח DDA מפרויקט הפרוטאום האנושי הסיני (CNHPP)22. בחירות אלה אפשרו הערכה והדגמה מקיפה של יכולות התוכנה בניתוח נתונים פרוטאומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג ממחיש ניתוח נתונים פרוטאומיים על ידי שילוב כלים חינמיים כמו DIA-NN ו-FragPipe. ההצלחה תלויה בשלבים קריטיים כגון בחירת יונים קודמת מדויקת והגדרות דיוק מסה עבור יצירת ספרייה ספקטרלית ב-DIA-NN (שלב 2.3)27, שהם תלויי מכשיר וחיוניים לזיהוי פפטיד מלא. באופן דומה, הקמה קפדנית של מסד נתונים ב-FragPipe (שלב 3.4), כולל יצירת פיתויים וסינון מזהמים, חיונית לשליטה ב-FDR.

שינויים ופתרון בעיות כרוכים לעתים קרובות באימות תלות בתוכנה (ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פ.ז. הוא המייסד של Molemuse Biotech Studio.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה נתמך על ידי Molemuse Biotech Studio.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
.NET SDK גרסה 9.0.203מיקרוסופטhttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN גרסה 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 תרמו פישרhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
ר 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedrioli, P. G. A., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  2. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database at 20 years: 2025 update. Nucl Acids Res. 53 (D1), D543-D553 (2025).
  3. Deutsch, E. W., et al. Proteomics Standards Initiative at Twenty Years: Current Activities and Future Work. J Proteome Res. 22 (2), 287-301 (2023).
  4. Schubert, O. T., Röst, H. L., Collins, B. C., Rosenberger, G., Aebersold, R. Quantitative proteomics: challenges and opportunities in basic and applied research. Nat Protoc. 12 (7), 1289-1294 (2017).
  5. Wang, X., Shen, S., Rasam, S. S., Qu, J. MS1 ion current-based quantitative proteomics: A promising solution for reliable analysis of large biological cohorts. Mass Spectro Rev. 38 (6), 461-482 (2019).
  6. Vaudel, M. MS2-Based Quantitation. Proteome Inform. , 155-177 (2016).
  7. Meyer, J. G. Qualitative and Quantitative Shotgun Proteomics Data Analysis from Data-Dependent Acquisition Mass Spectrometry. Shotgun Proteomics. 2259, 297-308 (2021).
  8. Fröhlich, K., et al. Data-Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry-Based Proteomics. Mol Cell Proteomics. 23 (8), 100800(2024).
  9. Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry-Based Proteomics and Software Tools: A Glimpse in 2020. Proteomics. 20 (17-18), 1900276(2020).
  10. Deutsch, E. W., et al. The ProteomeXchange consortium at 10 years: 2023 update. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1539-D1548 (2023).
  11. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. DIA-NN:neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Meth. 17 (1), 41-44 (2020).
  12. Zhang, F., et al. A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 22 (9), 100623(2023).
  13. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nat Meth. 14 (5), 513-520 (2017).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci. 113 (8), E968-E977 (2016).
  16. Cao, L., et al. Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell. 184 (19), 5031-5052.e26 (2021).
  17. Dong, L., et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Cell. 40 (1), 70-87.e15 (2022).
  18. Dubois, E., Galindo, A. N., Dayon, L., Cominetti, O. Comparison of normalization methods in clinical research applications of mass spectrometry-based proteomics. 2020 IEEE Conf Computat Intelligence Bioinfo Computat Biol. , 1-10 (2020).
  19. Dressler, F. F., Brägelmann, J., Reischl, M., Perner, S. Normics: Proteomic Normalization by Variance and Data-Inherent Correlation Structure. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100269(2022).
  20. Dimmer, E. C., et al. The Gene Ontology - Providing a Functional Role in Proteomic Studies. Proteomics. 8 (23-24), pmic.200800002(2008).
  21. Lih, T. M., et al. Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma-Associated Proteins in Serum. Mol Cell Proteomics. 23 (1), 100687(2024).
  22. Chinese Human Proteome Project (CNHPP) Consortium. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 567 (7747), 257-261 (2019).
  23. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Matsuura, Y., Ishiguro-Watanabe, M. KEGG: biological systems database as a model of the real world. Nucl Acids Res. 53 (D1), D672-D677 (2025).
  24. Campello, E., Ilich, A., Simioni, P., Key, N. S. The relationship between pancreatic cancer and hypercoagulability: a comprehensive review on epidemiological and biological issues. Br J Cancer. 121 (5), 359-371 (2019).
  25. Fang, L., Xu, Q., Qian, J., Zhou, J. Y. Aberrant Factors of Fibrinolysis and Coagulation in Pancreatic Cancer. OncoTargets Ther. 14, 53-65 (2021).
  26. Vlodavsky, I., Elkin, M., Ilan, N. Impact of heparanase and the tumor microenvironment on cancer metastasis and angiogenesis: basic aspects and clinical applications . Rambam Maimonides Med J. 2 (1), (2011).
  27. Fröhlich, K., et al. Benchmarking of analysis strategies for data-independent acquisition proteomics using a large-scale dataset comprising inter-patient heterogeneity. Nat Comm. 13 (1), 2622(2022).
  28. Polasky, D. A., et al. MSFragger-Labile: A Flexible Method to Improve Labile PTM Analysis in Proteomics. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100538(2023).
  29. Gerault, M. A., Camoin, L., Granjeaud, S. DIAgui: a Shiny application to process the output from DIA-NN. Bioinfo Adv. 4 (1), (2024).
  30. Hsiao, Y., et al. Analysis and Visualization of Quantitative Proteomics Data Using FragPipe-Analyst. J Proteome Res. 23 (10), 4303-4315 (2024).
  31. Yu, F., Deng, Y., Nesvizhskii, A. I. MSFragger-DDA+ enhances peptide identification sensitivity with full isolation window search. Nat Comm. 16 (1), 3329(2025).
  32. Li, K., Teo, G. C., Yang, K. L., Yu, F., Nesvizhskii, A. I. diaTracer enables spectrum-centric analysis of diaPASEF proteomics data. Nat Comm. 16 (1), 95(2025).
  33. Qiao, R., Li, H., Bian, H., Xin, L., Shan, B. De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery. Biorvix. 10, (2025).
  34. Meissner, F., Geddes-McAlister, J., Mann, M., Bantscheff, M. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Disc. 21 (9), 637-654 (2022).
  35. Zheng, Y., et al. Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials. Nat Biotechnol. 42 (7), 1133-1149 (2024).
  36. Bubis, J. A., et al. Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity. Nat Meth. 22 (3), 510-519 (2025).
  37. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).
  38. Schneider, M., et al. A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis. Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).
  39. Jalili, V., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update. Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

KEGG

מאמרים קשורים