Method Article

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גידול במחזור (CTC) משמשים כסמן ביולוגי מבטיח למעקב אחר גרורות סרטניות, התקדמות והישנות המחלה. טכניקות ביופסיה נוזלית המתמקדות בזיהוי CTC הוכיחו פוטנציאל ניכר בשל אופיין הלא פולשני ויכולתן לספק ניטור בזמן אמת של דינמיקת הגידול. עם זאת, ניתוחי CTC קונבנציונליים בתפזורת אינם מצליחים ללכוד את ההטרוגניות הפנימית בקרב אוכלוסיות CTC, ומטשטשים תובנות חיוניות לגבי הביולוגיה של הגידול. ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות CTC, ומציע הזדמנויות חדשות לאונקולוגיה מדויקת ומחקרים מכניסטיים של התקדמות הגידול. למרות היתרונות הללו, המתודולוגיות הקיימות לריצוף CTC יחיד נוטות לסבול מחוסר יעילות, כולל שיעורי התאוששות נמוכים, זרימות עבודה עתירות עבודה וסיכוני זיהום הקשורים לשלבי טיפול ידניים מרובים. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, אנו מציגים פרוטוקול מיקרופלואידית משולב המאחד העשרת CTC, טיהור וריצוף תא בודד לזרימת עבודה מאוחדת. השיטה משתמשת בלכידה מגנטית מבוקרת דינמית בתוך שבב מובנה אדרה, שבו ערבוב מערבולת וקשירת חרוזים אימונומגנטיים מצטברים מאפשרים בידוד CTC חזק ובתפוקה גבוהה עם נזק מינימלי לתאים. טיהור לאחר מכן באמצעות שבב מיקרופלואידי מצופה נוגדן לויקוציטים מסיר ביעילות את התאים שאינם מטרה, ומשפר עוד יותר את טוהר ה-CTC באמצעות ברירה שלילית. לבסוף, שבב ריצוף תא יחיד בעל דיוק גבוה, שתוכנן על בסיס עקרונות התנגדות זרימה דיפרנציאלית, מאפשר לכידה יעילה של תא בודד והתאמה עם מיקרו-חרוזים עם ברקוד ייחודי. פלטפורמה חדשה זו מתגברת על המגבלות של שיטות מבוססות הפצה של פואסון, ומשפרת את ניצול ה-CTC תוך מזעור צריכת המיקרו-חרוזים ועלויות הריצוף. הפרוטוקול המשולב שלנו משפר משמעותית את יעילות לכידת ה-CTC, הטוהר ותפוקת הריצוף של תא בודד, מה שהופך אותו למתאים היטב ליישומים קליניים ולמחקר סרטן בקנה מידה גדול. על ידי מתן אפשרות לניתוח מדויק וניתן להרחבה יותר של הטרוגניות CTC, לשיטה זו יש פוטנציאל לחדד אבחון מוקדם של סרטן, ניטור טיפול ומחקרים מכניסטיים של גרורות, ובסופו של דבר לקדם את תחום האונקולוגיה המדויקת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות גידול הן תהליך מורכב ורב-שלבי המתחיל בהפצה ולאחר מכן עובר תרדמה וקולוניזציה על ידי תאי הגידול בתוך הגידול הראשוני. תאים אלה פולשים בהדרגה דרך קרום הבסיס לרקמות עמוקות יותר, ולאחר מכן נכנסים לכלי דם או לימפה. ברגע שהם במחזור הדם, תאים אלה הופכים לתאי גידול במחזור הדם (CTCs), שיכולים לנסוע לאיברים מרוחקים1. הופעתם של CTCs היא שלב קריטי במפל הגרורתי, מכיוון שהם משמשים כזרעים לגרורות מרוחקות1. בשנים האחרונות, טכנולוגיית ביופסיה נוזלית מבוססת CTC זכתה לתשומת לב רבה בשל יתרונותיה, כולל האופי הלא פולשני והנוח של ההליך, כמו גם היכולת לניטור דינמי בזמן אמת. טכנולוגיה זו מאפשרת הערכה מדויקת, בזמן אמת ומקיפה של הביולוגיה של הגידול, ומציעה יתרונות ייחודיים בניטור יעילות הטיפול, חיזוי הישנות והנחיית הטיפול 2,3,4. יתר על כן, מחקרים הראו כי CTCs קיימים בדם היקפי גם בשלבי עומס גידול נמוך, כגון סרטן מוקדם, גרורות מוקדמות או הישנות 5,6. כתוצאה מכך, ביופסיית נוזל CTC מתגברת על המגבלות של ביופסיות רקמות מסורתיות, המוגבלות לגידולים מוצקים הניתנים לזיהויבהדמיה 7. הוא מספק פרספקטיבה חדשה ותמיכה טכנולוגית לאבחון מוקדם של סרטן, הישנות וניטור גרורות, הדרכה טיפולית, כמו גם הבהרת מנגנוני התחלת הגידול, התקדמותו וגרורותיו. לדוגמה, מספר ה-CTC בדם היקפי הוכח כמנבא עצמאי הן של הישרדות ללא התקדמות והן של הישרדות כוללת בחולי סרטן, כאשר ספירת CTC גבוהה יותר מצביעה על פרוגנוזה גרועה יותר8. שינויים דינמיים במספרי ה-CTC קשורים קשר הדוק גם להתקדמות המחלה ולעומס הגידול לאחר הטיפול 9,10.

מחקרים אחרונים הדגישו טכנולוגיות מבוססות מיקרופלואידיקה ככלים טרנספורמטיביים לבידוד CTCs. ניתן לסווג את הטכנולוגיות הללו באופן כללי לגישות מבוססות פיזיקה וביולוגיות, שכל אחת מהן מציעה יתרונות מובהקים תוך התמודדות עם אתגרים ספציפיים. שיטות מבוססות פיזיקה מסתמכות על הבדלים בגודל וביכולת העיוות כדי להפריד CTCs, מה שמאפשר מיון ללא תוויות עם תפוקה גבוהה. עם זאת, אסטרטגיית הפרדה לא ספציפית זו עלולה לפגוע הן ביעילות הלכידה והן בטוהר בשל ההטרוגניות המובנית של CTCs. לדוגמה, לו ועמיתיו דיווחו על שבב מיקרופלואידי, ששילב תכנון של הפרדת מיקוד והפחתת מהירות עם מערכי מלכודות, שביצעו ביצועים טובים יותר מרוב הטכניקות הקונבנציונליות המבוססות על פיזיקה במונחים של העשרה וטיהור CTC11. עם זאת, השבב השיג רק דלדול של 3-4 לוג של תאי דם לבנים (WBCs), מה שנותר לא מספיק ליישומים קליניים. מצד שני, אסטרטגיות בידוד CTC מבוססות חיסון מציעות בדרך כלל קצב התאוששות וטוהר גבוהים יותר של תאי מטרה. עם זאת, אינטראקציית הקישור בין מולקולות לכידה ל-CTCs מגבילה לעתים קרובות את התפוקה של גישות כאלה12,13. בהתאם לכך, שיטת בידוד המאזנת הן יעילות העשרה גבוהה והן תפוקה חיונית לעיבוד יעיל של דגימות קליניות עם אוכלוסיות CTC נדירות.

יתר על כן, ההטרוגניות המשמעותית בין CTCs מהווה אתגר משמעותי לניתוחים במורד הזרם 10,14,15, שכן ניתוחי CTC קונבנציונליים בתפזורת מטשטשים לעתים קרובות הבחנות תאיות בודדות. ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) מאפשר אפיון מקיף ברמה המולקולרית של הטרוגניות ביטוי גנים CTC, ומספק תובנות לגבי הסיווג, המצב והתפקוד של CTCs. טכנולוגיה זו מציעה גישות חדשניות לאונקולוגיה מדויקת ומקלה על מחקר על התחלת גידול, התקדמות ומנגנוני גרורות16. לדוגמה, פאן ועמיתיו בנו אטלס טרנסקריפטומי של CTC יחיד מאתרי כלי דם שונים בחולי קרצינומה של הכבד, חשף הטרוגניות מרחבית בקרב CTCs וזיהה מתווכים מרכזיים של התחמקות חיסונית17. במקביל, מיאמוטו ועמיתיו זיהו מוטציות בגן קולטני אנדרוגן ווריאנטים של חיבור ב-CTCs של חולי סרטן הערמונית, ובכך הבהירו את המנגנונים העומדים בבסיס העמידות לתרופות18.

עם זאת, הפיתוח של ריצוף טרנסקריפטומי CTC יחיד מתקדם לאט. המתודולוגיות הקיימות סובלות מליקויים באוטומציה ובאינטגרציה, וכתוצאה מכך יעילות התאוששות CTC נמוכה, נהלים מורכבים ושיעורי הצלחה ניסויים נמוכים19. לדוגמה, הפרוטוקולים הנוכחיים דורשים תהליך רציף הכולל העשרת CTC, טיהור, בידוד תא בודד והגברה של חומצות גרעין. שלבים אלה מבוצעים בצינורות צנטריפוגה נפרדים, מה שמחייב שלבי פיפטינג והעברה מרובים. ההליכים עתירי העבודה לא רק מפחיתים את היעילות אלא גם מגבירים את הסיכון לאובדן CTC וזיהום20. גישות קונבנציונליות, כגון קטיף תאים מבוסס נימים, מגבילות עוד יותר את התפוקה והיעילות האנליטית במהלך בידוד תא בודד21. יתר על כן, שיטות מסורתיות מוגבלות גם על ידי התפלגות פואסון, שהיא תופעה סטטיסטית המתארת את האנקפסולציה האקראית של תאים. התוצאה היא שיעור גבוה של טיפות ריקות או תאים מרובים לכל טיפה, ובכך מגביל את יעילות הלכידה. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, חוקרים פיתחו שבבים מיקרופלואידיים משולבים לניתוח טרנסקריפטומי CTC של תא יחיד. פלטפורמות אלו מאחדות שלבים מרובים לזרימת עבודה של שבב יחיד, מפחיתות את סיכוני הזיהום ומשפרות את היעילות האנליטית. לדוגמה, Euisik Yoon et al. פיתחו את שיטת Hydro-Seq, המשתמשת בבחירת גודל מבוססת דינמיקת נוזלים כדי לבודד CTCs למיקרו-תאים ולזווג ביעילות CTCs בודדים עם מיקרו-חרוזים מקודדים ייחודיים22. גישה זו מאפשרת ניתוח תא בודד מקביל בתפוקה גבוהה של מספר CTCs.עם זאת, שיטה זו מסתמכת על הפרדת CTC מבוססת גודל, אשר מביאה לרוב לטוהר CTC נמוך ותפוקה מוגבלת (10 מיקרוליטר לדקה), מה שהופך אותה לבלתי מתאימה לעיבוד דגימות קליניות בנפח גדול. לכן, יש צורך דחוף בפיתוח מערכת ניתוח CTC חד-תאית משולבת, בעלת תפוקה גבוהה, נפח נמוך ועמידה בפני זיהום.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ותפוקה גבוהה עבור העשרת CTC וריצוף תא יחיד, הכולל שלושה מרכיבים עיקריים: מיון CTC, טיהור ושבב ריצוף תא יחיד (איור 1). השבב המיקרופלואידי למיון CTC מתוכנן על בסיס העיקרון של כוחות לכידה מגנטיים מווסתים דינמית (איור 2A). זה מאפשר העשרת CTC בתפוקה גבוהה באמצעות ערבוב מערבולת בתוך מבנה האדרה, כמו גם לכידה מצטברת על ידי חרוזים אימונומגנטיים. השחרור הלא הרסני של CTCs מושג לאחר מכן באמצעות אפנון מדויק של השדה המגנטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשבב טיהור, שבו משתמשים במיקרו-תעלות מצופות נוגדני לויקוציטים לברירה שלילית, ומניבים CTCs מטוהרים מאוד (איור 2B). לבסוף, נעשה שימוש בפלטפורמת מניפולציה של תא יחיד עם נצילות גבוהה המבוססת על התנגדות זרימה דיפרנציאלית, המתגברת בהצלחה על מגבלות הפצת פואסון ומאפשרת זיווג ולכידת מיקרוספירה יעילה של תא יחיד/מקודד (איור 3A). זה משפר משמעותית את השימוש ב-CTC תוך הפחתת צריכת המיקרו-חרוזים ועלויות הריצוף.

figure-introduction-1
איור 1: סכמטי של טכנולוגיית מיון CTC וריצוף תא יחיד מבוססת מיקרופלואידיקה. תהליך עבודה זה ממחיש את התהליך שבו תאי גידול מתנתקים מנגעי הגידול, נכנסים לזרם הדם ויוצרים CTCs. דגימות דם היקפיות או לויקופק המכילות CTCs מעובדות ברצף באמצעות שבבי הלכידה, הטיהור וה-scRNA-seq של CTC, ובסופו של דבר מאפשרים ריצוף טרנסקריפטומי וניתוח ביואינפורמטי של ה-CTC. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיטה 1: בידוד CTC מבוסס מיקרופלואידיקה

  1. ייצור שבב אדרה (שבב HB)
    1. הכנת עובש מאסטר
      1. מכינים פרוסת סיליקון נקייה ואופים אותה בחום של 135 מעלות למשך הלילה כדי להסיר לחות. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, טפל בפרוסה באמצעות מנקה פלזמה חמצן ב-150 וואט למשך דקה אחת להפעלת המשטח.
      2. דפוס השכבה הראשונה של השבב ליצירת מערך עמודי תמיכה (28 עמודות × 7 שורות, ממוספרות מ-#1 עד #28 לאורך כיוון הזרימה) באמצעות SU-8 photoresist. הגדר את ציפוי הסיבוב לפעול ברצף ב-500 סל"ד למשך 10 שניות, 2350 סל"ד למשך 55 שניות ו-500 סל"ד למשך 10 שניות. ודא שגובה שכבה זו הוא 50 מיקרומטר.
      3. אופים את השכבה הראשונה רכה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לאידוי הממס. מצננים לטמפרטורת החדר.
      4. חשוף את השכבה הראשונה באמצעות מסיכת פוטו עם עיצוב עמוד התמיכה המתאים. הגדר את מינון החשיפה ל-130 mJ/cm2.
      5. בצע אפייה לאחר החשיפה ב-65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות.
      6. לאחר הקירור, הוצא מפתח SU-8 על משטח הפרוסה כדי להסיר פוטו-רזיסט לא מקושר ולקבל את השכבה התחתונה. הניחו לו לשלולית במשך 30 שניות, ולאחר מכן שטפו במים נטולי יונים.
      7. יש לצפות את שכבת ה-SU-8 השנייה על גבי השכבה הראשונה באמצעות אותם פרמטרי ספין כמו בשלב 1.1.1.2. דפוס השכבה השנייה ליצירת מבני אדרה בזווית של 45 מעלות לדופן התעלה, עם רוחב חריץ של 100 מיקרומטר, גובה של 200 מיקרומטר ושישה רכסים למחזור. ודא שגובה שכבה זו הוא גם 50 מיקרומטר.
        הערה: תרשים סכמטי הממחיש את כל הממדים הרלוונטיים של תכונות המיקרו-מבנה (כולל מערך עמודי התמיכה וחריצי אדרה) סופק באיור משלים 1.
      8. אופים את השכבה הראשונה רכה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לאידוי הממס. מצננים לטמפרטורת החדר.
      9. חשוף את השכבה השנייה באמצעות מסיכת פוטו בעיצוב אדרה. הגדר את מינון החשיפה ל-130 mJ/cm2.
      10. בצע אפייה לאחר החשיפה ב-65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות.
      11. לאחר הקירור, השתמש במפתח SU-8 כדי להסיר אזורים לא מקושרים ולחשוף את המיקרו-מבנה הדו-שכבתי השלם.
    2. הכנת העתק PDMS
      1. נסח את תערובת ה-PDMS על ידי שילוב הפרה-פולימר והקרוסלינקר ביחס משקל של 10:1. הכינו 10-15 מ"ל מהתערובת לשבב יחיד.
      2. יוצקים את התערובת לתבנית הראשית ומסירים אוויר כלוא על ידי הסרת גזים. רפאו את ה-PDMS על ידי הכנסת התבנית לתנור בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. הסר את העתק ה-PDMS הנרפא מהתבנית. צור כניסה אחת ויציאה אחת באמצעות מנקב PDMS בקוטר 1 מ"מ.
    3. מכלול שבב HB
      1. הגדר את שואב פלזמת החמצן להספק של 150 וואט למשך 3 דקות. הפעל את המשטחים על ידי טיפול הן בהעתק ה-PDMS והן בשכבת ה-PDMS המודבקת מראש על שקופית זכוכית נקייה.
        הערה: בשל השפע של קשרי Si-O בשרשראות פולימר PDMS, הפעלת פלזמה מאפשרת קשר קוולנטי בין PDMS למצעים כגון זכוכית, סיליקון, ובכך מקלה על איטום השבבים.
      2. יישר את מבני ה-PDMS המטופלים וחבר אותם יחד בחוזקה. ודא שמערך עמודי התמיכה ותכונות האדרה משולבים לחלוטין עם מצע הזכוכית כדי לסיים את שבב HB.
  2. הכנת חרוזים אימונומגנטיים (IMBs)
    1. דגרו 25 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שעברו שינוי סטרפטווידין (SA-MBs) שטופים ותלויים מחדש (SA-MBs) (1 מיקרומטר) (≈4 × 108 חרוזים למ"ל) עם 1 מיקרוגרם של נוגדן EpCAM (מולקולת הידבקות תא אפיתל) ביוטיניליזציה בטמפרטורת החדר עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 40 דקות להכנת ה-IMBs.
    2. לאחר הפרדה מגנטית על מתלה מגנטי, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החרוזים ב-25 מיקרוליטר של מאגר בידוד (1% BSA, 2 מ"מ EDTA, D-PBS).
  3. פעולת שבב בידוד
    1. פיפטה 20 מיקרוליטר של מתלה החרוזים המגנטיים תוך 1-2 שניות, מה שמבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר.
    2. הנח מיד את השבב אנכית על מגנט ואפשר לחרוזים להתיישב במשך 5 דקות ללא הפרעה.
    3. אסוף את דגימת הדם (דם היקפי או דגימות לויקופק ניסיוניות) ושאב מיד 4 מ"ל למזרק, תוך הקפדה על הסרת בועות אוויר. אטום את הכניסה והיציאה של השבב בנוזל כדי למנוע בועות אוויר. הכנס את צינורות הכניסה והיציאה של הדגימה לתוך השבב.
      הערה: ודא כי קיימים אמצעי הגנה אישיים בסיסיים בעת טיפול בדגימות ביולוגיות.
    4. הזרקו את הדגימה באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 1.5 מ"ל לשעה.
    5. לאחר טעינת הדגימה, הזרקו 60 מיקרוליטר של D-PBS לשבב HB בקצב זרימה של 0.2 מ"ל לשעה כדי לשטוף את התאים הלא קשורים.
    6. הסר את המגנט והזריק ידנית 1.5 מ"ל BSA (5% w/v ב-D-PBS) כדי לשטוף את השבב ולשחרר את תאי הגידול שנלכדו משבב HB.

2. שיטה 2: טיהור CTC מבוסס מיקרופלואידיקה

  1. שינוי שבב HB
    1. הכן תמיסת טרימתוקסילן (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPTS) באתנול עם שבר נפח (v/v) של 10%. הכניסו מיד 20 מיקרוליטר של תמיסת MPTS לשבב HB ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    2. יש לשטוף פעם אחת עם אתנול נטול מים ולייבש בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. הכן תמיסת N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS) באתנול בריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל. מצננים את השבב ל-37 מעלות צלזיוס, מכניסים את תמיסת ה-GMBS ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: בעת שימוש ב-MPTS ו-GMBS, יש ללבוש תמיד כפפות, חלוק מעבדה ומסכה. ריאגנטים אלו הם בעלי תכונות רעילות ומגרות ריריות ויש לטפל בהם בזהירות באזור מאוורר היטב.
    4. יש לשטוף פעמיים עם ddH2O, ולאחר מכן שתי שטיפות עם D-PBS.
    5. מוסיפים מיד 15 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטווידין (SA), מדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. יש לשטוף פעמיים עם D-PBS.
    7. הכן את מאגר הנוגדנים CD45: 0.2% (w/v) BSA ו-20 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן CD45 ביוטיניל, מדולל לנפח עם D-PBS.
    8. הזרקו 20 מיקרוליטר של מאגר הנוגדנים CD45 לתוך שבב HB לבחירה שלילית של תאי דם לבנים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS.
    9. הוסף תמיסת חסימה המכילה 3% (w/v) BSA ו-0.05% (w/v) Tween-20, דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. יש לשטוף עם D-PBS לפני טעינת הדגימה.
  2. טעינה לדוגמא
    1. שאפו את הדגימה באמצעות מזרק, וודא בועות אוויר מוסרות. אטום את הכניסה והיציאה של השבב בנוזל כדי למנוע בועות אוויר. הכנס את צינורות הכניסה והיציאה של הדגימה לתוך השבב.
    2. הזרקו את הדגימה באמצעות משאבת מזרק והגדירו את קצב הזרימה ל-0.6 מ"ל לשעה.
    3. אסוף את תאי הגידול המטוהרים מהשקע לספירה וריצוף תאים בודדים.

3. שיטה 3: טכנולוגיית ברקוד וריצוף של תא יחיד מבוססת Microwell

  1. הכנת ריאגנטים וחומרים
    1. טיפול מקדים בשבבים
      1. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת D-PBS 1x ו-0.5% F-68 לכניסת השבב.
      2. בצע סוניקציה של אמבט מים תוך כדי החזקת השבב. כאשר בועות נראות על פני כל האזור המיקרופורוסי, המשך בסוניקציה למשך 30 שניות כדי להסיר בועות מהבארות הכפולות.
    2. הכנת חרוזים ברקודים
      1. מערבבים היטב את תמיסת המלאי של חרוזים מגנטיים ברקודים ומעבירים 200 מיקרוליטר לתוך צינור צנטריפוגה. יש למרוח הפרדה מגנטית עד שהתמיסה תתבהר, ולהשליך את הסופרנטנט.
      2. שטפו את החרוזים הברקודים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של TE-TW (10 מ"מ Tris-HCl pH = 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.01% Tween-20).
      3. שטפו והשעו מחדש את החרוזים הברקודים ב-200 מיקרוליטר של 20x TE (10 מ"מ Tris-HCl pH = 7.5, 1 מ"מ EDTA) ותמיסת DTT של 50 מ"מ, ואז הניחו על קרח.
    3. הכנת מתלה חד תאי
      1. העבירו את תאי הגידול המטוהרים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 400 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 1x D-PBS.
      2. בצע ספירת תאים והכן את המתלה החד-תאי בהתאם. נפח טעינת הדגימה צריך להיות 200 מיקרוליטר, עם סך של 80,000 תאים (400 תאים/מיקרוליטר).
    4. הכן את מאגר הליזיס של התאים, הכולל 1x נתרן ציטראט מלוח (SSC), 0.5 M LiCl, 0.6% טריטון X-100, 10 מ"מ EDTA, 5 מ"מ DTT ומעכב U/μL RNase 1.
  2. פעולת שבב מיקרופלואידית
    1. לכידת תאים
      1. הזרקו 200 מיקרוליטר מתרחיף תאי הגידול לתוך השבב (60000 בארות כפולות), ולאחר מכן נערו ב-10 סל"ד על שייקר מסיר צבע למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב בבארות הלכידה על ידי כוח הכבידה.
      2. פיפטה בעדינות את מתלה התא בשבב למעלה ולמטה פעמיים. לאחר מכן, הנח את השבב על שייקר מסיר צבע ב-10 סל"ד למשך 5 דקות כדי להשעות מחדש את התאים שלא נלכדו ולאפשר להם להתיישב שוב.
      3. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת D-PBS 1x ו-0.5% F-68 דרך הכניסה ושאב את התמיסה מהשקע. חזור על הפעולה פעמיים בסך הכל שלוש שטיפות של השבב.
    2. לכידת חרוזים מקודדים
      1. השעו מחדש את מתלה החרוזים הברקוד, ואז הזריקו מיד 200 מיקרוליטר מהמתלה לשבב דרך הכניסה. יש לנער ב-10 סל"ד למשך 20 שניות.
      2. פיפטה בעדינות את מתלה החרוזים פעמיים, ואז נער ב-10 סל"ד למשך 20 שניות. חזור על שלב זה פעם אחת.
      3. משוך את מתלה החרוזים הברקוד מהשקע, הוסף 200 מיקרוליטר של 20x TE (pH = 7.5) ותמיסת DTT של 50 מ"מ, ולאחר מכן משוך את הנוזל מהשקע. חזור על שלב זה פעמיים, בסך הכל שלוש כביסות.
    3. ליזיס תאים ולכידת mRNA
      1. הוסף לאט לאט 200 מיקרוליטר של מאגר הליזיס של התאים לשבב דרך הכניסה. מיד לאחר מכן, הוסיפו לאט 200 מיקרוליטר שמן מינרלי כדי לאטום את הבארות הכפולות.
        הערה: איטום חייב להתרחש באופן מיידי כדי למנוע זיהום.
      2. הסר את התמיסה הזורמת משקע השבבים למאגר הפסולת. הנח את השבב בצורה אופקית ותן לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. שחזור חרוזים מקודדים
      1. לאחר הליזה, הוסף לאט 200 מיקרוליטר של 6x SSC דרך הכניסה, הסר את נוזל הפסולת ושאב את התמיסה הנותרת משקע השבב.
      2. הוסף לאט לאט 200 מיקרוליטר של 6x SSC כדי למלא את השבב. החזק מגנט קרוב לפני השטח של השבב והעבר אותו לאט מהכניסה לשקע כדי לאסוף חרוזים ברקודים מבארות הלכידה. לאחר מכן, שאפו במהירות את התמיסה כמו גם חרוזים מקודדים מהשבב לתוך צינור צנטריפוגה טעון מראש ב-6x SSC.
      3. שטפו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של 6x SSC, ולאחר מכן פעם אחת עם מאגר RT 1x (ראה טבלת חומרים).
  3. שעתוק הפוך (RT), טיפול באקסונוקלאז I ו-PCR
    1. RT
      1. השעו מחדש את החרוזים הברקודים ב-100 מיקרוליטר של תערובת תגובת שעתוק הפוכה, המכילה 1× מאגר RT, 1 מ"מ GTP, 1 מ"מ dNTP, 5% PEG 8000, 2.5 מיקרומטר מתג תבנית אוליגו (ראה טבלת חומרים), 1 מעכב U/μL RNase ו-10 U/μL טרנסקריפטאז הפוך. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 120 דקות.
    2. טיפול באקסונוקלאז
      1. לאחר שעתוק הפוך, שטפו את החרוזים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-SDS (10 מ"מ Tris-HCl pH = 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.5% SDS), פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-TW, ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCl (pH = 8.0).
      2. השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של תערובת אקסונוקלאז, המכילה 1x Exonuclease I Buffer ו-1 U/μL Exonuclease I, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    3. סינתזה של גדיל שני
      1. שטפו את החרוזים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-SDS. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH ודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב ב-30 סל"ד כדי לנטרל את המוצר ההיברידי mRNA-cDNA. לאחר מכן שטפו את החרוזים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-TW ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCl (pH = 8.0).
      2. השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר מתערובת התגובה, המכילה 1x מאגר RT, 1 מ"מ dNTP, 5% PEG 8000, פריימר סינתזה של גדיל שני של 0.5 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים), ו-0.125 U/μL של שבר קלנוב. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    4. הגברת cDNA
      1. שטפו את החרוזים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-SDS, פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x TE-TW, ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ Tris-HCl (pH = 8.0).
      2. השעו מחדש את החרוזים ב-150 מיקרוליטר של תערובת PCR כולל 1x תערובת תגובת PCR ו-0.8 מיקרומטר של אוליגו ISPCR (ראה טבלת חומרים). הגדר את תוכנית ה-PCR באופן הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ארבעה מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; שמונה מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. טהר את מוצר ה-PCR פעמיים עם חרוזים מגנטיים של 0.6x Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) לטיהור DNA על פי הוראות היצרן ושטוף ב-20.5 מיקרוליטר של H2O. מדוד את ריכוז מוצר ה-PCR המטוהר באמצעות בדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנטי.
      4. בצע הגברה שנייה של מוצר ה-PCR המטוהר באמצעות תערובת PCR המכילה תערובת תגובת PCR 1x ו-0.8 מיקרומטר של אוליגו ISPCR (ראה טבלת חומרים). הגדר את תוכנית ה-PCR באופן הבא: 98 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; חמישה מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      5. טהר את מוצר ה-PCR פעמיים עם חרוזים מגנטיים של 0.6x SPRI לטיהור DNA לפי הוראות היצרן ושטוף ב-20.5 מיקרוליטר של H2O. מדוד את ריכוז מוצר ה-PCR המטוהר באמצעות בדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנטיות23.
    5. בניית ספריית cDNA
      1. בנה את הספרייה עם ערכת הכנת ספריית DNA סטנדרטית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
      2. הגבר את הספרייה על ידי PCR באמצעות זוג פריימר N70X / P5 (ראה טבלה משלימה). הגדר את תוכנית ה-PCR באופן הבא: 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; שנים עשר מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. טהר את הספרייה עם חרוזים מגנטיים של 0.6x SPRI לטיהור DNA על פי הוראות היצרן ושטוף ב-20 מיקרוליטר של H2O. מדוד את ריכוז מוצר ה-PCR המטוהר באמצעות בדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנטיות.
        הערה: בדרך כלל, ריכוז סופי של ספריית DNA של ≥ 2 ננוגרם/מיקרוליטר וכמות כוללת של ≥ 50 ננוגרם נחשב מקובל24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להעריך את ההרכבה והשחרור של ממשק לכידת ה-CTC על ידי מיקרוסקופיה. התפלגות אחידה של החרוזים המגנטיים (MBs) בתחתית שבב HB תחת שדה מגנטי מצביעה על הרכבה מוצלחת, בעוד ש-MBs שיוריים מינימליים או ללא שיוריים מאשרים שחרור מוצלח (איור 2C). שלב זה הוא קריטי לקביעת התפוקה והטוהר של CTCs שנלכדו. כדי לאמת את יעילות הלכידה של שבב הבידוד של CTC, ביצענו ניסוי ספייק-אין. מספר קטן של תאי גידול עם ביטוי EpCAM גבוה (PC3 או LNCaP) הוכנסו ל-PBS המכיל אוכלוסייה גדולה של תאי ג'ורקט, המציגים ביטוי EpCAM נמוך, המדמה נוכחות של תאי דם בשפע במחזור הדם. שבב בידוד ה-CTC לכד ביעילות תאי גידול מדגימות של 1 מ"ל ו-10 מ"ל, והפגין את יכולת מיון ה-CTC היעילה והתפוקה הגבוהה שלו (איור 2D). כדי להעריך את הספציפיות של לכידה מבוססת IMB, השתמשנו בשבב בקרה ששונה עם SA-MBs חסרי צימוד נוגדנים EpCAM. היעדר לכידת תאי גידול משמעותית אישר את הספציפיות של בידוד CTC בתיווך IMB (איור 2D).

בנוסף ליעילות הלכידה, טוהר הוא פרמטר קריטי נוסף להערכת פלטפורמות בידוד CTC. השווינו את טוהר תאי הגידול שבודדו באמצעות שבב הלכידה או שבב הטיהור בלבד, כמו גם את הטוהר שהושג באמצעות ברירה חיובית ושלילית ברצף (איור 2E). שני השבבים שיפרו משמעותית את טוהר תאי הגידול בהשוואה לקבוצת הביקורת, והוכיחו את יעילותם בבידוד CTCs. חשוב מכך, השימוש המשולב בברירה חיובית ושלילית שיפר עוד יותר את הטוהר והתפוקה של תאי הגידול בהשוואה לשימוש בשיטה אחת.

כדי להעריך עוד יותר את הביצועים של שבבי הלכידה והמיון של CTC במסגרות קליניות, אספנו דגימות דם היקפי (PB) משישה תורמים בריאים וערכנו ניסויי זינוק. בהתחשב בשכיחות הנמוכה ביותר של CTCs בדגימות קליניות, כ-500-1000 תאי LNCaP הוכנסו לכל 10 מ"ל של דגימת PB. ספירת ה-WBC בכל דגימות ה-PB שנאספו הייתה בטווח הנורמלי (4-10 ×-106 תאים/מ"ל). התוצאות הראו כי מערכת המיון CTC שמרה על יעילות לכידה וטוהר גבוהים של תאי הגידול, גם בעת עיבוד דגימות קליניות (איור 2F-G, ואיור משלים 2).

figure-results-1
איור 2: פלטפורמת לכידה וטיהור CTC מובנית-אדרה. (A) זרימת עבודה של שבב בידוד CTC. ראשית, שדה מגנטי יציב ו-IMBs מצומדים לנוגדני EpCAM מרכיבים את ממשק הלכידה. לאחר מכן, ערבוב מערבולת בתוך שבב HB משפר את יעילות העברת המסה בין CTCs ו-IMB, ומקל על לכידה מצטברת. לבסוף, שחרור עדין של CTCs מושג על ידי הסרת השדה המגנטי. (B) זרימת עבודה של שבב הטיהור של CTC. שבב ה-HB שונה עם נוגדנים לברירה שלילית, וערבוב מערבולת מקל עוד יותר על אינטראקציות לויקוציטים-נוגדנים, ובסופו של דבר מניב CTCs מטוהרים מאוד. (D) עלילות עמודות משוות את יעילות לכידת ה-CTC של פלטפורמת הבידוד על פני נפחי דגימה שונים, תוך שימוש ב-SA-MBs לא פונקציונליים כבקרה. קווי שגיאה, ממוצע ± SD, n = 3. (E) תרשימי עמודות משווים את הטוהר של CTCs המתקבלים באמצעות שבב HB יחיד בלבד לעומת אלה שעוברים לכידה וטיהור רציפים. קבוצת הביקורת מייצגת טוהר CTC לא מטופל. קווי שגיאה, ממוצע ± SD, n=3. (F) זיהוי תאים בשבב הבידוד של CTC. תאי LNCaP נצבעו ב-Hoechst ו-Calcein AM, בעוד שתאי הדם נצבעו ב-Hoechst בלבד. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (G) טוהר תאי הגידול ויעילות לכידה בניסויי זינוק באמצעות 1 מ"ל או 10 מ"ל של דם היקפי. קווי שגיאה, ממוצע ± SD, n = 3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תאי הגידול המבודדים היו נתונים לאחר מכן לריצוף תאים בודדים בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול שלנו משלב מערכת ברקוד חד-תאית המורכבת מ-60,000 מיקרו-בארות מקוננות (איור 3A-B). המיקרו-בארות התחתונות בצורת ריבוע משמשות ללכידת תאים בודדים, בעוד שהמיקרו-בארות העליונות מיועדות להעמסת חרוזים. כל מיקרובאר תחתונה מודדת 25 מיקרומטר באורך, רוחב וגובה, המתאימים לרוב סוגי התאים. לבארות המשושה העליונות יש קוטר עיגול חרוט וגובה של 50 מיקרומטר כדי להכיל חרוזים הנעים בדרך כלל בין 30 ל-50 מיקרומטר. המערכת משפרת את יעילות לכידת התאים המבוססת על לכידה מצטברת תוך הימנעות מהכפלות תאים באמצעות מיקרו-בארות החרגת גודל. כדי למטב את פרוטוקול טעינת התאים, חקרנו את יעילות לכידת התאים ואת יחס תפוסת המיקרובאר בתנאי קלט תאים שונים (איור 3C). התוצאות הראו כי הגדלת קלט התא לא הפחיתה את יעילות הלכידה; במקום זאת, זה שיפר משמעותית את יחס התפוסה. עבור שבב הלכידה של 60,000 בארות, יחס התפוסה של המיקרובאר התייצב כאשר קלט התא הגיע ל-80,000, ולא הראה עלייה נוספת עם קלט נוסף. כדי למזער את התרחשותם של כפילות עקב עומס תאים מוגזם, בחרנו 80,000 תאים כקלט האופטימלי. כפי שמוצג באיור 3D, שבב הברקוד של תא יחיד השיג יחס תפוסת חרוזים של 85.6% תא ו-95.7% ברקוד, וכתוצאה מכך שיעור זיווג של 81.9%. בנוסף, בוצעו הגדרות מרובות על פי הפרוטוקול, מה ששיפר משמעותית את יעילות הלכידה וקצב ההתאמה באמצעות אפקט הלכידה המצטבר (איור 3D). יש לציין כי ההבדל הנצפה ביחסי התפוסה בין תאים לחרוזים מיוחס לצפיפות ולמסה הגדולה יותר של החרוזים בהשוואה לתאים, מה שמאפשר להם להתיישב בצורה יעילה יותר במיקרו-בארות תחת כוח הכבידה. לכן, בתנאי העמסה אופטימליים, שיעור תפוסה של כ-80% נחשב בדרך כלל לאידיאלי.

figure-results-2
איור 3 : טכנולוגיית ברקוד וריצוף תא יחיד בתפוקה גבוהה מבוססת Microwell. (A) זרימת עבודה של פרוטוקול ריצוף CTC יחיד. (B) מיקרו-קופי מדגים מבני באר לכידת חרוזים חד-תאיים/ברקודים מיקרופלואידיים. תהליכים של לכידת תאים, לכידת חרוזים ושחזור חרוזים מוצגים משמאל לימין. סרגל קנה מידה 30 מיקרומטר. (C) תרשימי קו ממחישים את יעילות לכידת התאים ויחס תפוסת המיקרובאר של שבב הברקוד החד-תאי (60000 בארות כפולות) בתנאי קלט תאים שונים. (D) שיעורי תפוסה של תאים וחרוזים מקודדים בתנאי קלט תאים אופטימליים, יחד עם יחס ההתאמה בין תא לחרוז. הפאנלים השמאלי והימני מציגים את גישת הלכידה תוך שימוש בניסיונות התייצבות מרובים והתייצבות בודדת בלבד, בהתאמה. קווי שגיאה, ממוצע ± SD, n = 3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, כדי לאמת את הפרוטוקול המשולב למיון CTC ו-scRNA-seq, ערבבנו תאי PC3, LNCaP ו-Jurkat ביחס משוער של 1:3:4000 והעמסנו אותם על השבבים המיקרופלואידיים ללכידה, טיהור וריצוף תאים בודדים. באמצעות פלטפורמת בידוד תאי הגידול היעילה, השגנו תאי גידול חיוביים ל-EpCAM טהורים ביותר (איור 4B). במקביל, שבב scRNA-seq מבוסס מיקרופלואידיקה הדגים יכולת פרופיל מדויקת מסוג תא, כאשר התוצאות הוצגו באמצעות ניתוח t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) (איור 4A). זיהינו בהצלחה שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות, שכל אחת מהן יכולה להיות מובחנת על ידי סמנים ייחודיים (איור 4C). בנוסף, פרופורציות התאים בפלט הסופי תואמות מאוד את אלה של הקלט המטוהר, מה שמאשר שתהליך הברקוד של תא בודד היה בלתי מוטה ונטול זיהום (איור 4B). אשכול אחד זוהה כתאי ג'ורקט בהתבסס על הביטוי הספציפי של TRBC1, IGLL1, CD1E ו-CD3D (איור 4D). ניתוח העשרת המסלול אישר עוד יותר את החוסן של סיווג זה (איור 4E). יתר על כן, שני קווי תאי סרטן הערמונית הופרדו באופן מובהק לאשכולות בודדים על פי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) (איור 4F-G). אשכול PC3 התאפיין בביטוי גבוה של מיקרוסמינופרוטאין (MSMP), הידוע גם בשם מיקרו-חלבון המופרש PC3. מצד שני, אשכול LNCaP ביטא באופן ייחודי סמנים הקשורים להידבקות תאים, התפשטות ופלוריפוטנטיות, כגון NEDD4, CTNNA1 (α-catenin 1) ו-RBBP7.

figure-results-3
איור 4: אימות של מיון CTC וריצוף תא בודד באמצעות ניסוי ספייק-אין. (A) תרשים t-SNE המציג פרופיל סוג תא של התאים שנלכדו ומטוהרים. (B) תרשים עמודות המתאר את הפרופורציות של שלושת סוגי התאים בשלושה שלבים: קלט ראשוני, לאחר טיהור ופלט רצף סופי. (C) תרשים נקודות שממחיש את הביטוי של גנים סמנים ייחודיים על פני אשכולות תאים שונים. (D) רמות ביטוי של TRBC1, IGLL1, CD1E ו-CD3D בכל התאים. (E) ניתוח העשרת מסלול GO ו-KEGG של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) באשכול ג'ורקאט. (F) דפוסי ביטוי של NEDD4 ו-MSMP בכל התאים. (G) תרשים הר געש המציג DEGs בין אשכולות PC3 ו-LNCaP. נקודות אדומות מייצגות גנים המווסתים ב-PC3; נקודות כחולות מייצגות את אלה המווסתים ב-LNCaP. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מיקס מאסטרמגיבדילול סופיסוג מאגר
0.5% F-68F-680.50%DEPC מים מטופלים
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8.0)10 מ"מDEPC מים מטופלים
EDTA1 מ"מ
Tween-20 (טווין-20)0.01%
20× TE (pH=7.5)Tris-HCl (pH=7.5)200 מ"מDEPC מים מטופלים
EDTA20 מ"מ
TE-SDSTris-HCl (pH=8.0)10 מ"מDEPC מים מטופלים
EDTA1 מ"מ
SDS0.50%

טבלה 1: הרכב תערובת ריאגנטים להכנת ריצוף CTC יחיד. מוצגים חלקים מהריאגנטים הנדרשים ל-scRNA-seq, אותם ניתן להכין לפני פעולת השבב כדי להבטיח תהליך מהיר וחלק.

איור משלים 1: תכנון עבור שבב HB. (A) דיאגרמה סכמטית של המבנה המיקרופלואידי הדו-שכבתי. חלק עליון: שכבה עליונה הכוללת את מבנה האדרה. שיבוץ מוגדל מציג את הגיאומטריה המפורטת של עצם האדרה, המכוונת בזווית של 45° ביחס לדופן התעלה, עם רוחב חריץ של 100 מיקרומטר וגובה של 200 מיקרומטר. תחתון: שכבה תחתונה המורכבת ממערך עמודי תמיכה (28 עמודות × 7 שורות), ממוספרות מ-#1 עד #28 לאורך כיוון הזרימה. (B) מבט מהצד של שבב האדרה. רוחב חריצי האדרה הוא 100 מיקרומטר. הגבהים של מבני האדרה ועמודי התמיכה הם 50 מיקרומטר. (C) מבט מלמעלה על שבב האדרה. רוחב כל עמוד תמיכה הוא 500 מיקרומטר ואורך 1150 מיקרומטר, עם מרווח של 550 מיקרומטר בין העמודים הסמוכים. (D) תצלום של שבב HB מפוברק. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: תמונה מייצגת המציגה תאי גידול מוכתמים פלואורסצנטיים ותאי דם הנמצאים בנוזל הפסולת שנאסף מיציאת שבב הבידוד של CTC. תאי LNCaP נצבעו ב-Hoechst ו-Calcein AM, בעוד שתאי הדם נצבעו ב-Hoechst בלבד. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה: רצפי אוליגונוקלאוטידים המשמשים בתעתיק הפוך והכנת ספרייה אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTCs משמשים כסמנים ביולוגיים חשובים לאבחון סרטן, הדרכה לטיפול ומחקרים על התחלת גידול, התקדמות וגרורות25. עם זאת, שיטות בידוד CTC קיימות אינן מצליחות להשיג הן יעילות גבוהה והן תפוקה גבוהה26. בנוסף, יעילות השחרור הנמוכה של CTCs מביאה לעתים קרובות לטוהר נמוך ולנזק גבוה לתאים, מה שמגביל את תאימותם לניתוחים במורד הזרם27. כאן, הצענו פרוטוקול משולב למיון CTC בתפוקה גבוהה וריצוף CTC יחיד, המורכב משלושה הליכים עיקריים: לכידת CTC, טיהור ו-scRNA-seq.

פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה זו מציעה גמישות ומדרגיות. ניתן לכוונן את מספר הערוצים המקבילים בשבבי HB, כמו גם בארות לכידה בשבב הברקוד, בהתאם לדרישות הדגימה השונות, ובכך לעמוד בדרישות תפוקה גבוהות. בשבב לכידת ה-CTC, ניתן לבצע אופטימיזציה של IMBs בהתאם לסוג הסרטן הספציפי. לדוגמה, בדגימות מחולי סרטן הערמונית, ניתן לתפקד IMBs עם קוקטייל של נוגדנים EpCAM ו-PSMA כדי לשפר את יעילות הלכידה. יתר על כן, הסתמכות אך ורק על לכידה מבוססת EpCAM עלולה לגרום לאובדן CTCs מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT). כדי לטפל בבעיה זו, ניתן לשלב נוגדנים נוספים נגד חלבון הלם חום 70 (HSP-70) או וימנטין פני התא (CSV) כדי ללכוד CTCs בשלבי EMT שונים.

מכיוון ששבבי HB ללכידה וטיהור CTC מבוססים על מיקרופלואידיקה, טיפול זהיר חיוני במהלך הניסויים. לפני הכנסת ריאגנטים לכניסת השבב, יש להסיר את כל בועות האוויר, ולאטום גם את הכניסה וגם את היציאה כדי לחסל אוויר כלוא. בנוסף, יש להכניס ריאגנטים במהירות (תוך 1-2 שניות), שכן בועות אוויר כלואות עלולות לחסום את המעבר של IMBs ותאים, ולהפחית משמעותית את יעילות הלכידה והטוהר. יתר על כן, כפי שצוין קודם לכן, ההתפלגות האחידה של IMB היא קריטית ללכידת CTC מוצלחת. לאחר טעינת ה-IMB, יש למקם את השבב אנכית על המגנט ולקבע אותו במקומו למשך חמש דקות לפחות כדי למנוע משינויים בשדה המגנטי לשבש את חלוקת ה-IMB. יש לציין כי יש לייעל את קצב זרימת טעינת התאים המצוין בפרוטוקול על סמך סוגי דגימות שונים. לדוגמה, דגימות לויקופק מציגות רמות גבוהות של ריכוז וצמיגות לויקוציטים. אם קצב הזרימה מהיר מדי, הוא עלול לעכב אינטראקציות יעילות בין CTCs ו-IMBs, למנוע לכידה מגנטית מצטברת ובכך להפחית את טוהר ה-CTC. כדי להעריך את הביצועים של פלטפורמת הבידוד והטיהור של CTC שלנו בעיבוד דגימות דם קליניות, אספנו PB ממספר תורמים בריאים והכנסנו מספר קטן של תאי LNCaP (כ-50-100 תאים למ"ל) לתוך הדגימות. יש לציין כי למרות שהפלטפורמה הפגינה יעילות לכידה וטוהר גבוהים עבור תאי גידול בדגימות PB, הביצועים שלה היו מעט נמוכים מאלה שנצפו בדגימות התאים המבוססות על PBS (איור 2D, איור 2E ואיור 2G). אנו משערים כי פער זה נובע מצמיגות גבוהה יותר של הדם ונוכחותם של תאי דם אדומים וטסיות דם בשפע בהשוואה ל-PBS. לכן, בעת טיפול בדגימות דם קליניות, ניתן לשקול שלבי טיפול מקדימים כגון ליזיס תאי דם אדומים או מיצוי PBMC כדי לשפר את הביצועים.

בדומה לשבבי HB, שבב הברקוד החד-תאי מבוסס מיקרופלואידיקה דורש טיפול זהיר כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. בהתחשב במגוון הריאגנטים המעורבים, ניתן להכין מראש כמה ריאגנטים לפני תחילת פעולות השבב (טבלה 1). בעת העמסת תאים וחרוזים, יש צורך בשליטה קפדנית על מהירות ההזרקה כדי להבטיח פיזור אחיד, שכן לתאים יש צפיפות נמוכה יותר בעוד שחרוזים ברקודים צפופים יותר. בדרך כלל, יש להוסיף את תרחיף התא לאט במשך 3 ~ 5 שניות, ואחריו הוספה מהירה של תרחיף החרוזים תוך 1 ~ 2 שניות. לאחר העמסת התאים והחרוזים, בצע שני סבבים של שאיפה וחלוקה, ולאחר מכן הנח את השבב על שייקר כדי להשלים את תהליך הלכידה המצטבר. שלב זה הוא קריטי לשיפור יחס התפוסה ושיעור ההתאמה. במהלך ליזה של תאים, נעשה שימוש בשיטת איטום שמן לבידוד משטחי המיקרו-באר, ומונעת זיהום צולב בין בארות. יש לציין כי יש להוסיף שמן מינרלי מיד לאחר הליזה ללא דיחוי. לאחר הליזה, שחזור חרוזים ברקודים מתבצע על ידי הזזה איטית של המגנט מהכניסה ליציאה כדי להבטיח קצב התאוששות חרוזים גבוה. במידת הצורך ניתן לחזור על שלב זה מספר פעמים. לבסוף, החרוזים המגנטיים ששוחזרו בצינור הצנטריפוגה עוברים RT, סינתזת גדיל שני, הגברת PCR ובניית ספרייה, ואחריה ריצוף מהדור הבא (NGS).

פלטפורמה מיקרופלואידית משולבת זו טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי ליישומים קליניים. על ידי שיפור היעילות והתפוקה של בידוד CTC, הוא מגביר את זיהוי ה-CTC בשלבי עומס גידול נמוך, ומאפשר הקמת מודל סיווג המקשר בין ספירת CTC לשלב הגידול. התקדמות זו מספקת גישה חדשה לאבחון סרטן, ניטור טיפול, הערכת פרוגנוזה וחיזוי הישנות המחלה. בנוסף, ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד של CTCs מאפשר זיהוי של מאפיינים מולקולריים מרכזיים, כולל מסלולי גנים חיוניים, רשתות אינטראקציה וגנים של סמנים ביולוגיים. ניתוח זה מספק תובנות לגבי הגורמים הקריטיים המניעים גרורות סרטניות מוקדמות וחושף את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס היווצרות נגעים גרורתיים, ומציע מטרות טיפוליות פוטנציאליות לחולים עם סרטן חוזר או גרורתי. יתר על כן, פלטפורמה זו ניתנת להרחבה רבה. ניתן להתאים אותו כדי לעמוד בדרישות אנליטיות ספציפיות ולהרחיב אותו כדי לתמוך בניתוחים מולטי-אומיקס, כולל טרנסקריפטומיקה וגנומיקה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-מרקפטופרופיל) טרימתוקסילאן  סיגמא אולדריץ'175617-100Gפתרון MPTS
20&00; בופר SSCסאנגון ביוטקB548109-0200
5× RT Bufferסאנגון ביוטקB610020-0500
נוגדן מונוקלונלי CD45 ביוטינילציהמדעי הביולוגיה האלקטרוניים13-0459-82אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
נוגדן מונוקלונלי EpCAM ביוטינילציהמדעי הביולוגיה האלקטרוניים13-9326-82אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
אלבומין סרום בקר (BSA)סאנגון ביוטקA600332-0100אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
שבב מחסנית DECODERמערכות ביולוגיות דינמיות2203106אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
ערכות מחסניות DECODERמערכות ביולוגיות דינמיות2203206אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
מים מטופלים ב-DEPCסאנגון ביוטקB501005-0500
D-PBSסאנגון ביוטקE607009-0500מכיל: NaCl 136.89mM; KCl 2.67 מ"מ; Na2HPO4 8.10 מ"מ; KH2PO4 1.47 מ"מ. pH=7.2-7.4 
DTTתרמו-סיינטיפיקR0861אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 & mu; m
EDTAסאנגון ביוטקB540625-05000.5 M, pH=8.0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixרושKK26012× תערובת תגובה PCR
משקעים כלוריד ליתיום סולן.InvitrogenAM94800.2 ומיקרו; m מסונן
אסטר N-γ-מלימידובוטיריל-אוקסיסוקינימידתרמו-סיינטיפיק22309פתרון GMBS
פלורוניק F-68סאנגון ביוטקA600749-0025
קיוביט 1& ערכת בדיקת dsDNA HSתרמו-סיינטיפיקQ33231
פתרון SDSסאנגון ביוטקB648118-010010% SDS
סטרפטווידיןסיגמא אולדריץ'189730אחסון ב-2 ומעלות גבוה; C עד 8&00; C 
SU-8 פוטוריסטמיקרוכימיהSU-8 3050
ערכת סיליקון אלסטומר SYLGARD 184דאו קורנינג4019862
טריס-HCl (pH 7.5)ליג'יןNR00721 mol/L, pH=7.5, חופשי מ-RNase
טריס-HCl (pH 8.0)ליג'יןNR00731 מול/ליטר, pH=8.0, ללא רנז
טריטון X-100סאנגון ביוטקA600198-0500
ערכת ההכנה לספריית DNA של Trueprep V2 עבור Illumina ואזימהTD502ערכת הכנת ספריית DNA
טווין-20סאנגון ביוטקA600560-0500
חרוזי DNA נקיים של VAHTSואזימהN411חרוזי מגנטיים מסוג מוצק עם קיבוע הפיך (SPRI) לטיהור DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles