מאמר שיטה

מטבולומיקה מרחבית רב-מודאלית עם הדמיית ספקטרומטריית מסה מונחית במיקרוסקופ אינפרא אדום בינוני

DOI:

10.3791/68709

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Shanghai Xuhui Central Hospital, Zhongshan-Xuhui Hospital, 3Children's Hospital of Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים זרימת עבודה מטבולומית מרחבית רב-מודאלית המשלבת הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) והדמיית אינפרא אדום בינוני (MIR) על אותו קטע רקמה לניתוח מטבולי וביוכימי שנפתר מרחבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבולומיקה מרחבית היא תחום המתפתח במהירות למיפוי התפלגות המטבוליטים בתוך רקמות, איברים ואפילו תאים בודדים. גישה זו מספקת מידע מטבולי הקשרי, שהוא קריטי להבנת ההטרוגניות הביוכימית של מערכות ביולוגיות. הדמיית אינפרא אדום בינוני (MIR) והדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) התגלו כגישות עוצמתיות למטבולומיקה מרחבית, שכל אחת מהן מציעה יתרונות ייחודיים ומשלימים. במחקר זה, אנו מציגים זרימת עבודה לביצוע הדמיית MIR ו-MSI יינון לייזר בעזרת מטריצה (MALDI-MSI) על אותו קטע רקמה, הכולל פרוצדורות ניסיוניות, רישום משותף של הדמיה, שילוב נתונים וניתוח ביואינפורמטיקה. הדמיית MIR משמשת כשיטה במעלה הזרם, המאפשרת ניתוח ביוכימי לא הרסני של רקמות. לאחר מכן, מטריצה מופקדת ברקמה עבור MALDI-MSI, בהנחיית המידע המרחבי המתקבל מהדמיית MIR. התמונות משולבות לאחר רישום משותף, ומאפשרות ניתוח מטבולומיקה מרחבית רב-מודאלית באמצעות כלים ביואינפורמטיים מתקדמים כגון Seurat. השילוב של הדמיית MIR ו-MSI מייצג התקדמות טרנספורמטיבית במטבולומיקה מרחבית, ומציע הזדמנויות חסרות תקדים לחקור את המורכבות המרחבית והכימית של תהליכים מטבוליים הן בבריאות והן בחולי. גישה רב-מודאלית זו טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי להנעת חידושים בגילוי סמנים ביולוגיים, אבחון מחלות ופיתוח טיפולי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבולומיקה מרחבית כוללת מיפוי מטבוליטים בהקשר הרקמה המקורי שלהם על ידי שילוב הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI), או טכניקות אחרות שנפתרו מרחבית, עם ניתוח מטבולי, המציע תובנות לגבי חילוף החומרים ברזולוציה תת-רקמתית, תאית או תת-תאית 1,2,3,4,5,6,7,8 . בין שיטות ההדמיה הללו, מיקרוסקופ אינפרא אדום בינוני (MIR) זוכה לתשומת לב הולכת וגוברת בשל יכולתו למפות כימית ביומולקולות על סמך ניגודיות רטט מולקולרית 4,7,9,10,11,12. האופי הלא הרסני, נטול התוויות, המהיר והחסכוני 4,7,9,10,11,12 הופך את הדמיית MIR למתאימה במיוחד לאינטגרציה עם MSI, ויוצרת גישה רב-מודאלית מבטיחה לניתוח מרחבי מקיף.

יינון לייזר בעזרת מטריצה MSI (MALDI-MSI) היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במטבולומיקה מרחבית (איור 1A)13. הוא מאפשר זיהוי של מגוון רחב של מטבוליטים, כולל שומנים, חומצות אמינו, סוכרים, נוקלאוטידים ומטבוליטים משניים, עם רגישות גבוהה1. התקדמות בבחירת מטריצות (למשל, 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית [DHB], 9-אמינואקרידין [9AA], או N- (1-נפתיל) אתילנדיאמין דיהידרוכלוריד [NEDC]) וטכניקות יינון (למשל, שיטות פוסט-יינון) הרחיבו עוד יותר את כיסוי הזיהוי, במיוחד עבור מינים בעלי שפע נמוך ומיינון גרוע14. מערכות MALDI-MSI מודרניות תומכות במהירויות הדמיה הנעות בדרך כלל בין 5 ל-50 פיקסלים לשנייה, בהתאם לרזולוציה המרחבית ולסוג מנתח המסה המשמש (למשל, זמן טיסה [TOF], אורביטראף או תהודה ציקלוטרון של יונים טרנספורמציה פורייה [FT-IRC]). יש לציין כי מכשירי MALDI-TOF מהירים השיגו קצבים העולים על 100 פיקסלים לשנייה, מה שמאפשר הדמיה בשטח גדול תוך מספר שעות15. הרזולוציה המרחבית של MALDI-MSI נופלת בדרך כלל בטווח של 5 עד 50 מיקרומטר, מספיק כדי לפתור מבנים תאיים ואפילו תת-תאיים16,17. עם זאת, רזולוציה מרחבית גבוהה יותר באה בדרך כלל במחיר של זמני רכישה ארוכים יותר, יחס אות לרעש מופחת ודרישות חישוביות גדולות יותר במהלך עיבוד הנתונים.

בניגוד ל-MSI, הדמיית MIR היא גישה אופטית בשדה רחב4, מה שהופך אותה מטבעה ללא הרסנית ותפוקה גבוהה. ההתקדמות האחרונה בלייזרים מפלים קוונטיים בעלי הספק גבוה (QCLs) מאפשרת מסגרת חדשה המכונה הדמיית אינפרא אדום בתדר בדיד (DFIR), אשר מגבירה משמעותית את מהירות ההדמיה עד לקצב הווידאו (איור 1B)12,18. בנוסף, מקורות QCL הפכו את גלאי המיקרובולומטר הלא מקוררים לברי קיימא עבור הדמיית MIR, מה שמאפשר שימוש בגלאי מערך מישור מוקד גדול יותר (FPA)12. כתוצאה מכך, ניתן להשיג תמונת MIR בתדר יחיד על פני שטח של 1 ס"מ2 ברזולוציה סלולרית (~5 מיקרומטר) תוך שניות ספורות. הדמיית MIR יכולה לפעול הן במצב נטול תוויות והן במצב מסומן. במחקרים קודמים 4,19,20, הוכנסו בדיקות רטט קטנות הפועלות ב-IR כדי לנטר את הקינטיקה של פעילויות מטבוליות שונות באתרן. בדיקות אלו מאפשרות מעקב בזמן אמת אחר מסלולים מטבוליים על ידי דיווח על טרנספורמציות כימיות גלובליות באמצעות רצועות ספקטרליות ייחודיות של MIR4. לפיכך, הדמיית MIR מספקת הן פרופיל ביוכימי סטטי והן ניטור מטבולי דינמי עם רזולוציה מרחבית גבוהה ומהירות רכישה מהירה.

בכתב יד זה, אנו מציגים זרימת עבודה מקיפה לביצוע מטבולומיקה מרחבית מונחית MIR, המדגים את ההיתכנות של רכישת שתי השיטות מאותה דגימה (איור 2, איור 3). על ידי שילוב הדמיית MIR עם MSI, אנו מבססים גישה רב-מודאלית הממנפת את החוזקות המשלימות של כל טכניקה. הדמיית MIR מציעה מיפוי ביוכימי מהיר ונטול תוויות של כל השקופית ברזולוציה תאית, ומשמשת כמדריך רב ערך לבחירת אזור עניין (ROI) ברכישת MSI לאחר מכן. אסטרטגיה זו מאפשרת זרימת עבודה ממוקדת ויעילה יותר של MSI, תוך הפחתת זמן הרכישה והעלות תוך שיפור יכולת הפרשנות והרלוונטיות הביולוגית של נתוני המטבולומיקה המרחבית. בתורו, MSI מספקת הערות מולקולריות מפורטות ביותר של התמונות ההיפרספקטרליות של MIR, המאפשרות הבנה מעמיקה יותר של ביוכימיה של רקמות. בסך הכל, גישה משולבת זו טומנת בחובה פוטנציאל גדול לקידום גילוי סמנים ביולוגיים, אבחון מחלות ופיתוח טיפולי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול נערך בהתאם לפרוטוקול הניסוי בבעלי חיים (DSF-2024-004) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז למשאבי חיות מעבדה באוניברסיטת פודן.

הערה: מחקר זה מספק זרימת עבודה לביצוע הדמיית MIR ו-MALDI-MSI באותו קטע רקמה. גישה משולבת זו כוללת הליכים ניסיוניים, רישום משותף של תמונה, היתוך נתונים וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם (איור 1C). הדמיית MIR משמשת כשיטה במעלה הזרם, המאפשרת מיפוי ביוכימי לא הרסני וללא תוויות של הרקמה. בהנחיית המידע המרחבי מהדמיית MIR, מטריצה מיושמת לאחר מכן לרכישת MALDI-MSI. לאחר רישום משותף מדויק, מערכי הנתונים משולבים לניתוח משותף רב-משתני (איור 4), המאפשרים מטבולומיקה מרחבית מקיפה באמצעות כלים חישוביים מתקדמים.

1. הכנת מדגם

  1. הכנת דגימת רקמות
    1. איסוף רקמות עכבר
      1. עכברי בית C57BL/6J (בני 20 שבועות, 40 גרם) בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים (SPF), נשמרים במחזור אור/חושך של 12 שעות, ומספקים גישה אד-ליביטום למזון ומים כדי להבטיח בריאות אופטימלית לפני הניסוי.
      2. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל במינון של 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף כדי להבטיח הרדמה עמוקה. עקוב אחר החיה ואשר את היעדר רפלקסים של דוושה וקרנית לפני שתמשיך בזילוף.
      3. הזרמת כ-20-30 מ"ל של PBS קר המכיל הפרין (5 IU/mL) דרך החדר השמאלי בלחץ מבוקר של 150 מ"מ כספית למשך 6 דקות כדי לשטוף את הדם החוצה ולהוציא את האיבר לפני ההסרה.
      4. הרוו מיד את כל הרקמות שנאספו בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך ניתוח.
        הערה: הקפאה מהירה חיונית למניעת היווצרות גבישי קרח, מה שעלול לעוות את מורפולוגיה של הרקמות.
    2. הטמעת רקמות וחתך בהקפאה
      1. הגדר את המיקרוטום ל-20 מעלות צלזיוס וטהר את החדר והלהב באתנול (EtOH) כדי למנוע שאריות של מדיום הטבעה. אפשר לשקופיות CaF2 , לדואר השקופיות, למחזיק הדגימה ולדגימת הרקמה להתאזן בתוך הקריוסטט.
      2. חתוך את הרקמה לכ-5 מ"מ ×-5 מ"מ ×-3 מ"מ. הטמע אותו ב-10% ג'לטין בתוך קריומולד סטנדרטי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, מה שמבטיח כיוון נכון לחתך. הקפיאו את הדגימה המוטמעת על קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.
      3. חלץ את הרקמה מהתבנית שלה, חתוך עודפי חומר כדי לייעל את החיתוך, והצמד אותה למחזיק הדגימה באמצעות מים טהורים במיוחד כדי להבטיח הידבקות יציבה.
      4. חותכים חלקים בעובי 10 מיקרומטר ומשתקים את החלקים על מצעי CaF2 מצופים מראש ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      5. הנח את חלקי הרקמות המותקנים במייבש הקפאה בוואקום לפני הדמיית אינפרא אדום בינונית. הגדר את לחץ החדר ל-0.1 mPa ואת הטמפרטורה ל-100 מעלות צלזיוס. יבש את הדגימות למשך 30 דקות.
  2. הכנת דגימת תאים
    1. זרע 1.25 × 105 תאי HeLa על מצעי CaF2 עגולים בקוטר 13 מ"מ המונחים בצלחות תרבית סטנדרטיות. השתמשו ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגרו את התאים בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 24 שעות.
    2. לאחר 24 שעות, הסר בזהירות את המדיה וקבע את התאים על ידי דגירה שלהם ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מומס במאגר PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. שטפו את התאים הקבועים שלוש פעמים עם מאגר HBSS, ולאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים נוספות עם ddH2O.
    4. יבש באוויר את מצעי CaF2 לחלוטין ב-RT לפני שתמשיך להדמיית MIR.

2. רכישת תמונה רב-מודאלית

  1. רכישת תמונות MIR בלייזר מפל קוונטי (QCL)
    1. בצע מיקרוסקופ הדמיה QCL MIR באמצעות מיקרוסקופ QCL-MIR המצויד במיקרובולומטר מקורר 2 נוזלים שאינוN גלאי מערך מישור מוקד 520 × 480 וטכנולוגיית הפחתת קוהרנטיות מרחבית.
    2. בחר טווח ספקטרלי מ-950 ס"מ-1 עד 1800 ס"מ-1.
    3. השתמש במטרה של 4× עם צמצם מספרי (NA) של 0.6, והתוצאה היא גודל פיקסל נומינלי של 4.25 מיקרומטר.
    4. אסוף ספקטרום רקע על מצע CaF2 נקי ברזולוציה ספקטרלית של 4 ס"מ-1 .
    5. בחר את אזור הרכישה על סמך מורפולוגיה של רקמות ואסוף נתונים ספקטרליים ברזולוציה ספקטרלית של 4 ס"מ-1. ברזולוציה ספקטרלית זו, מהירות רכישת התמונה היא כ-0.3 מ"מ2/s.
      הערה: כל המדידות מבוצעות במצב שידור באמצעות שקופיות CaF2 , עם התאמת מיקוד ידנית.
  2. רכישת תמונה של ספקטרומטריית מסה
    1. יישום מטריקס
      1. השתמש בקטעי הרקמה שלאחר MIR עבור MALDI-MSI, החל סמנים פידוציאליים סביב הרקמה באמצעות עט Tippex וצלם תמונה אופטית לפני MSI עם סורק שטוח לרישום תמונה.
      2. הכן מטריצת NEDC ב-7 מ"ג/מ"ל במתנול/אצטוניטריל/מים נטולי יונים (V/V/V=75:25:5), ולאחר מכן סנן דרך ממברנה של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים.
      3. טען את מגלשות הרקמה המסומנות לתוך מרסס מטריצה אוטומטי. הוצא את מטריצת ה-NEDC על המדגם באמצעות הפרמטרים המוגדרים מראש.
    2. מדידת MALDI-MSI
      1. הפקידו 0.2 מיקרוליטר של תרחיף זרחן אדום על שקופית CaF2 כדי לשמש כתקן כיול מסה חיצוני.
      2. אבטח את השקופית המצופה מטריצה במתאם השקופיות, והבטיח מגע חשמלי אופטימלי עם המחזיק. טען את הצלחת למערכת MALDI-MSI.
      3. יישר את התמונה האופטית של השקופית עם קואורדינטות מנוע ה-XY של ה-MALDI tagה באמצעות סמנים נאמנים. הגדר החזר ROI לניתוח רקמות וכלול אזור "מטריצה בלבד" כבקרה שלילית.
      4. הגדר את המכשיר במצב יון שלילי עם גודל פיקסל של 20 × 20 מיקרומטר2, המכסה טווח m /z של 50-1000. בצע כיול מסה באמצעות נקודת הזרחן האדום לפני התחלת איסוף הנתונים. בצע איסוף נתונים באמצעות פלטפורמת ניתוח נתונים מסחרית.

3. עיבוד מקדים וניתוח נתוני תמונה

הערה: הקודים המותאמים אישית של MATLAB מועלים כקובץ משלים 1.

  1. עיבוד מקדים וניתוח נתוני QCL-MIR
    1. עיבוד מקדים של נתונים
      1. ייצא נתונים היפרספקטרליים בפורמט מתאים להמשך ניתוח.
      2. בצע עיבוד מקדים של נתונים באמצעות CytoSpec ו-MATLAB, לפי השלבים הבאים 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. ייבא את הנתונים הספקטרליים של MIR לתוך CytoSpec v2.00.07 לעיבוד מקדים.
      4. הערך את האיכות הספקטרלית באמצעות מודול בדיקות האיכות המובנה ב- CytoSpec. בחר קריטריון 2 (עובי המדגם) כדי להעריך את עקביות המדגם. הגדר את טווח האינטגרציה הספקטרלית ל-950-1800 ס"מ-1. הגדר את סף הספיגה בין 50 ל-1000 יחידות כדי לא לכלול ספקטרום מאזורים דקים או עבים מדי.
      5. הפחת רעש באמצעות סינון מבוסס PCA ב-CytoSpec. שמור על 10 הרכיבים העיקריים (PC) הראשונים כדי למנוע רעש בתדר גבוה תוך שמירה על שונות ביוכימית מרכזית.
      6. ייצא את הנתונים הספקטרליים המעובדים מראש מ-CytoSpec בפורמט .mat להמשך ניתוח ב-MATLAB.
      7. בצע תיקון בסיסי ב-MATLAB באמצעות אלגוריתם תיקון רצועת גומי על פני הטווח הספקטרלי של 950-1800 ס"מ-1 כדי למנוע סחיפה בסיסית ולשפר את הדיוק הספקטרלי.
      8. החל נורמליזציה ספקטרלית באמצעות קנה מידה מינימלי-מקסימלי על אותו טווח ספקטרלי כדי לתקנן עוצמות על פני כל הספקטרום ולהבטיח השוואה בכל מערך הנתונים.
    2. ניתוח נתונים
      1. זהה מאפיינים הקשורים לחלבון ב-1,550 ס"מ-1 ו-1,650 ס"מ-1, המתאימים לרצועות אמיד II ואמיד I, בהתאמה. זהה מאפיינים הקשורים לשומנים ב-1,740 ס"מ-1, המייצגים רטט מתיחה של אסטר C=O.
      2. חשב את יחס העוצמה של רצועת Amide I (1650 ס"מ-1) למתיחת האסטר C=O (1740 ס"מ-1) וצור מפות יחס כדי לדמיין התפלגות מרחבית של שומנים לחלבון.
      3. ניתוח אשכולות ללא פיקוח: בצע ניתוח אשכולות היררכי (HCA) על נתונים היפרספקטרליים באמצעות מרחק אוקלידי וקישור וורד כדי לסווג אזורים על סמך דמיון ספקטרלי. צור מפות אשכולות כדי לזהות אזורים מובחנים מבחינה ביוכימית ולחשוף הבדלים מבניים או פתולוגיים.
  2. עיבוד מקדים וניתוח של נתוני MSI
    1. ייבא את נתוני MSI הגולמיים לפלטפורמת ניתוח נתונים מסחרית.
    2. בצע ליקוט שיא בעוצמה יחסית > 0.01%.
    3. אל תכלול פסגות הנגזרות ממטריצה מרשימת השיאים הניסויית על ידי השוואתה לספקטרום המתקבל מאזור בקרה של מטריצה בלבד. הסר את כל הפסגות המופיעות בספקטרום הבקרה ויש להן יחס אות לרעש (SNR) פחות מ-3.
    4. נרמל את מערך הנתונים לריבוע שורש ממוצע (RMS) כדי לקחת בחשבון את השונות בעוצמת אות היונים על פני פיקסלים ודגימות.
    5. לחדד את זיהוי המטבוליטים על ידי סינון תכונות על סמך התפלגות הרקמות שלהם, התאמה לערכים במסד הנתונים של מטבולום אנושי (HMDB), והסכמה עם ערכי m/z תיאורטיים.
    6. בחר מטבוליטים רלוונטיים על סמך מטרות הניסוי והקשר הרקמה.
    7. ייצא את העוצמות של התכונות שנבחרו לכל הפיקסלים כקובץ CSV.
    8. ליישם טכניקות להפחתת מימדים (למשל, PCA, t-SNE או UMAP) כדי להפחית את מורכבות הנתונים ולזהות אשכולות של פיקסלים עם חתימות מטבוליות דומות באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון Seurat ו-Banksy, מה שמקל על הדמיה של הטרוגניות מטבולית מרחבית.

4. רישום משותף וניתוח משותף של תמונות רב-מודאליות

  1. בחר את תמונת ה-MIR שנרכשה ב-1650 ס"מ-1 כהתייחסות מרחבית לרישום משותף. מספר גל ספציפי זה מדגיש את פס החלבון אמיד I, ומציע ניגודיות רקמה חזקה.
  2. נרמל את ערכי העוצמה של תמונות MIR ו- MSI כדי לשפר את יכולת ההשוואה החזותית. החל טכניקות לשיפור ניגודיות, כגון השוואת היסטוגרמה באמצעות פונקציית histeq ב-MATLAB, כדי להפיץ מחדש את עוצמות התמונה ולשפר את הנראות של תכונות מבניות קריטיות לבחירת ציוני דרך.
  3. טען את תמונות ה-MIR וה-MSI ל-MATLAB באמצעות פונקציית cpselect מארגז הכלים לעיבוד תמונה. פונקציה זו פותחת ממשק אינטראקטיבי לבחירת ציוני דרך.
  4. הוסף הערות ידניות לחמש עד עשר נקודות בקרה רלוונטיות מבחינה אנטומית ומבוזרות היטב הן בתמונות MIR והן ב-MSI באמצעות פונקציית cpselect . ציוני דרך אלה צריכים להתאים למאפיינים מורפולוגיים מובהקים כגון גבולות רקמות.
    הערה: פזר נקודות בקרה באופן שווה על פני שדה התמונה כדי למזער עיוות מקומי.
  5. ייצא ורשום את הקואורדינטות של נקודות הבקרה המבוארות משתי התמונות. אחסן אותם כשני מערכים תואמים לחישוב טרנספורמציה (למשל, movingPoints ו-fixedPoints).
  6. חשב מטריצת טרנספורמציה אפינית באמצעות הפונקציה MATLAB fitgeotrans במצב אפין . טרנספורמציה זו לוקחת בחשבון קנה מידה, סיבוב, תרגום וגזירה.
  7. החל את הטרנספורמציה המחושבת על תמונת MSI באמצעות פונקציית imwarp ב-MATLAB. שלב זה יוצר תמונת MSI רשומה מרחבית המיושרת גיאומטרית למסגרת הייחוס של MIR.
  8. בדוק ויזואלית את היישור באמצעות פונקציית imshowpair במצב מיזוג כדי לכסות את תמונות MSI ו-MIR ולאשר רישום נכון של תכונות מבניות.
  9. המר גם את תמונת ה-MSI הרשומה וגם את תמונת ה-MIR ההפניה למסכות בינאריות באמצעות פונקציית imbinarize ב-MATLAB.
  10. חשב את מקדם הדמיון לקוביות (DSC) כדי לכמת את החפיפה המרחבית בין שתי המסכות הבינאריות. ה-DSC מוגדר כ: DSC = 2 × (אזור חפיפה)/(השטח הכולל של שתי המסיכות). ערך DSC המתקרב ל-1.0 מצביע על חפיפה מרחבית גבוהה ודיוק רישום.
    הערה: במידת הצורך, מקד את הרישום על-ידי התאמת המספר או המיקום של נקודות הבקרה וחזרה על תהליך הטרנספורמציה. שקול שיטות רישום לא נוקשות אם חוסר יישור מקומי נמשך.
  11. שמור את התמונה הרשומה, פרמטרי הטרנספורמציה וקואורדינטות ציון הדרך לניתוח תמונה רב-מודאלית במורד הזרם, כגון מתאם מרחבי של תכונות ביוכימיות ומבניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לאמת את אסטרטגיית המטבולומיקה המרחבית הרב-מודאלית שתוארה לעיל, יישמנו אותה במודל עכבר של סרטן. תאי הגידול עברו שינוי גנטי כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), המאפשר לוקליזציה מדויקת של אזור הגידול באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. איור 2A מציג תוצאות הדמיית QCL-MIR ללא תוויות עם כיסוי ספקטרלי של 950-1800 ס"מ-1, המכונה "אזור טביעות אצבע". רצועות MIR מייצגות מסומנות באיור 2A, כגון מתיחת P=O (1240 ס"מ-1, חומצות גרעין ושומנים פוספטים), אמיד II...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים אסטרטגיית מטבולומיקה מרחבית רב-מודאלית המשלבת הדמיית MSI ו-MIR כדי לאפשר פרופיל מטבולי בעל תפוקה גבוהה וספציפית מולקולרית על אותן דגימות. הדמיית MIR מאפשרת מיפוי כימי ללא תוויות ולא הרסני המבוסס על תנודות מולקולריות, ומספק מידע קבוצתי מבני ופונקציונלי מפורט. לעומת זאת, MSI מספק רגישות וספציפיות גבוהות לזיהוי וכימות מטבוליטים, ומבסס אותו כאבן פינה במחקר מטבולומיקה. על ידי שילוב שתי השיטות הללו, הוא יכול לספק הבנה מקיפה יותר של הטרוגניות מטבולית, תוך מינוף החוזקות המשלימות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר יילונג זואו מאוניברסיטת ווסטלייק על תמיכתם בהדמיית MALDI2-MSI, ולמשרד Bruker Scientific Technology Co., Ltd. בשנחאי על הסיוע בהדמיית MIR מבוססת QCL. אנו מודים גם לד"ר שוגואו סאן, אוניברסיטת Huazhong למדע וטכנולוגיה על שסיפק באדיבות עכברי KrasLSL-G12D/+ Tp53fl/fl Rb1fl/fl ZsgreenLSL . מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממחלות כרוניות לא מדבקות - התוכנית הלאומית למדע וטכנולוגיה (2023ZD0500400 ל-L.S., G.W. ו-D.Y.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 22377016 ל-L.S.), והקרן של אוניברסיטת פודאן והמחקר הבסיסי של קאו'ג'יאנג (מס' 24FCA08 עד L.S.). אנו מודים גם למתקן הליבה של המכללה הרפואית של שנחאי, אוניברסיטת פודן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פרפורמלדהיד, תמיסת קיבוע רקמותסנגון ביוטק 
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'126615
C57BL/6JNifdc עכבריצ'ארלס ריבר219
CaF2 שקופיותCrystranCAFP25-1
Cryostat microtomeDakewe BiotechCT520
CytospecPeter Laschגרסה 2.10.01תוכנה לניתוח נתוני MIR, כולל תיקון בסיס, נורמליזציה, יצירת תמונה וניתוח היפרספקטרלי.
מאגר DPBSפישר סיינטיפיק 14-190-250
סרום בקר עובריGibco10270106
מייבשי הקפאהLABCONCOFreeZone
ג'לטין Sigma-AldrichG1890Type A, מעור חזיר
מאגר HBSSSangon Biotech 
DMEM עתיר גלוקוזThermoFisher Scientific 
MatlabMathWorksMatlab R2024aתוכנה לניתוח נתוני MIR, כולל תיקון בסיסי, נורמליזציה, יצירת תמונה וניתוח היפרספקטרלי.
מערכת הדמיית ספקטרומטריית מסה יינון לייזר בעזרת מטריקס (MALDI-MSI)Bruker Daltonics GmbH timsTOF fleX MALDI-2
מתנולסינופארם מגיב כימי10014108
mMassInstitute of Entomology, המרכז לביולוגיה של האקדמיה הצ'כית למדעים, צ'כיהגרסה 5.5.0תוכנה לניתוח נתוני MSI. ייבא את נתוני ה-MSI הגולמיים למעבדת SCILS לעיבוד מקדים.  בצע קטיף שיא ב-mMass בעוצמה יחסית > 0.01%.
מטריצת N-(1-נפתיל) אתילנדיאמין דיהידרוכלוריד (NEDC) סיגמא אולדריץ'222488
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher Scientific 
15140122 לייזר מפל קוונטי  מיקרוסקופיה אינפרא אדום בינוני (QCL-MIR)  Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
זרחן אדוםSigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bתוכנות לניתוח נתוני MSI. ייבא את נתוני ה-MSI הגולמיים למעבדת SCILS לעיבוד מקדים.  בצע קטיף שיא ב-mMass בעוצמה יחסית > 0.01%.
מרססHTX TechnologiesTM
טריפסין, 0.25% EDTAThermoFisher Scientific 
E672002A00321010564011C25200072

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandrov, T. Spatial metabolomics: From a niche field towards a driver of innovation. Nat Metab. 5 (9), 1443-1445 (2023).
  2. Gilmore, I. S., Heiles, S., Pieterse, C. L. Metabolic imaging at the single-cell scale: Recent advances in mass spectrometry imaging. Annu Rev Anal Chem. 12 (1), 201-224 (2019).
  3. Chadha, R. S., Guerrero, J. A., Wei, L., Sanchez, L. M. Seeing is believing: Developing multi-modal metabolic insights at the molecular level. ACS Central Science. 10 (4), 758-774 (2024).
  4. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  5. Steinhauser, M. L., et al. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifies stem cell division and metabolism. Nature. 481 (7382), 516-519 (2012).
  6. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  7. Qian, N., et al. Illuminating life processes by vibrational probes. Nat Methods. 22 (5), 928-944 (2025).
  8. Kim, M. M., Parolia, A., Dunphy, M. P., Venneti, S. Non-invasive metabolic imaging of brain tumours in the era of precision medicine. Nat Rev Clin Oncol. 13 (12), 725-739 (2016).
  9. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
  10. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
  11. Schnell, M., et al. All-digital histopathology by infrared-optical hybrid microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3388-3396 (2020).
  12. Yeh, K., Kenkel, S., Liu, J. N., Bhargava, R. Fast infrared chemical imaging with a quantum cascade laser. Anal Chem. 87 (1), 485-493 (2015).
  13. Ma, S., et al. High spatial resolution mass spectrometry imaging for spatial metabolomics: Advances, challenges, and future perspectives. TrAC Trends Anal Chem. 159, 116902(2023).
  14. Mckinnon, J. C., et al. Enhancing metabolite coverage in MALDI-MSI using laser post-ionisation (MALDI-2). Anal Methods. 15 (34), 4311-4320 (2023).
  15. Bednařík, A., et al. MALDI MS imaging at acquisition rates exceeding 100 pixels per second. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (2), 289-298 (2019).
  16. He, M. J., et al. Comparing DESI-MSI and MALDI-MSI mediated spatial metabolomics and their applications in cancer studies. Front Oncol. 12, 2022(2022).
  17. Wang, G., et al. Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair. Nature Metab. 4 (9), 1109-1118 (2022).
  18. Haase, K., Kröger-Lui, N., Pucci, A., Schönhals, A., Petrich, W. Real-time mid-infrared imaging of living microorganisms. J Biophotonics. 9 (1-2), 61-66 (2016).
  19. Liu, X., et al. Towards mapping mouse metabolic tissue atlas by mid-infrared imaging with heavy water labeling. Adv Sci. 9 (15), e2105437(2022).
  20. Liu, X., Shi, L., Zhao, Z., Shu, J., Min, W. Vibrant: Spectral profiling for single-cell drug responses. Nat Methods. 21 (3), 501-511 (2024).
  21. Gruber, L., et al. Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascade laser mid-infrared imaging microscopy. Nat Commun. 16 (1), 4759(2025).
  22. Heijs, B., et al. Histology-guided high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 87 (24), 11978-11983 (2015).
  23. Rabe, J. H., et al. Fourier transform infrared microscopy enables guidance of automated mass spectrometry imaging to predefined tissue morphologies. Sci Rep. 8 (1), 313(2018).
  24. Wang, G., et al. Spatial quantitative metabolomics enables identification of remote and sustained ipsilateral cortical metabolic reprogramming after stroke. bioRxiv. , (2024).
  25. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  26. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (d2o) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Analytica Chimica Acta. 1242, 340722(2023).
  27. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Commun. 9 (1), 2995(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spatial MetabolomicsMass Spectrometry ImagingMid Infrared ImagingMALDI MSIImaging Co RegistrationBioinformatics AnalysisTissue Metabolite MappingMulti Modal ImagingMetabolic HeterogeneityBiomarker Discovery
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים