העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול להפעלת אלגוריתם Pathway2Targets, סקריפט R המנבא ומתעדף מטרות טיפוליות על סמך פרופיל מסלולי איתות תוך-תאיים שנוצרו על ידי השוואת דגימות מקרה לעומת ביקורת מניסוי ריצוף RNA בתפזורת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש ברשימות גנים המתבטאות באופן דיפרנציאלי אנושי לביצוע ניתוח העשרה במורד הזרם ותעדוף יעד
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר צינור חישובי רב-שלבי לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות מנתוני ריצוף RNA, כולל התקנת תוכנה רלוונטית, אימות התקנה וניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות edgeR. לאחר מכן אנו מראים כיצד להשתמש באלגוריתם ניתוח השפעת מסלול האיתות (SPIA) כדי לחזות מסלולים מובהקים סטטיסטית. כדי להבטיח ביטחון בתוצאות, אנו מתמקדים במסלולים משמעותיים (p < 0.05) כדי להפחית תוצאות חיוביות כוזבות. בניגוד לקבוצות גנים מסורתיות, מסלולים אלה משקפים רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון, ומציעים תובנות מכניסטיות לגבי תהליכים תאיים כמו מחזור התא, תגובה חיסונית וחילוף חומרים. מסלולים אלה מנותחים לאחר מכן באמצעות אלגוריתם Pathway2Targets, המתממשק עם מסד הנתונים OpenTargets.org באמצעות ממשק תכנות יישומים (API). אלגוריתם זה משלב גישת שקלול חדשה המדרגת מטרות תרופות ידועות במסלולים שזוהו, תוך מתן התקדמות בזמן אמת. זמן הריצה תלוי במורכבות המסלול ובצפיפות היעד. הפלט מורכב משני קבצים מדורגים. הקובץ הראשון מכיל רשימה של מטרות תרופות חזויות והציונים המשוקללים שלהן, ואילו השני מורכב מפרטים שונים עבור הטיפולים הנלווים. יחד, צינור זה מאפשר תעדוף של מטרות וטיפולים הניתנים לתרופות בהקשר של פרופילי ביטוי גנים ספציפיים למחלה.
מבוא
ריצוף RNA בתפזורת מאפשר השוואה של רמות ביטוי של אלפי גנים על פני אוכלוסייה של תאי מקרה לעומת אוכלוסייה של תאי בקרה. ניסויים מתוכננים בדרך כלל לכלול לפחות דגימות משולשות, באופן אידיאלי שכפולים ביולוגיים, אם כי שכפולים טכניים יכולים להספיק. עיצוב זה מביא בחשבון את השונות הביולוגית ומפחית את ההשפעה של דגימות חריגות. ניתוח דפוסי ביטוי אלה מספק תובנה מפורטת לגבי השפעת המחלה המעניינת על תהליכים תאיים נורמליים ויכול לאפשר חיזוי של טיפולים רלוונטיים.
עיבוד מקדים של נתוני ריצוף RNA בתפזורת כולל בדרך כלל: בקרת איכות של קריאות ריצוף (עבור חזרות, מתאמי רצף, GC% וכו'), חיתוך קריאה והסרת מתאם, מיפוי/כימות קריאה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נתוני ריצוף ה-RNA שנותחו במחקר זה נרכשו ממאגרי מידע זמינים לציבור (NCBI Gene Expression Omnibus and Sequence Read Archive)25,26. ככזה, אוספי הנתונים המקוריים הבטיחו איסוף אתי ומתאים של דגימות אלה מנבדקים אנושיים מודעים ומסכימים.
1. הורדה והתקנה של תוכנת R
- התקן את R (גרסה 4.0 ואילך) על ידי לחיצה על קישור מתאים מרשת הארכיון המקיפה R (CRAN) https://cran.r-project.org/mirrors.html והשתמש באפשרות 0-ענן, ולאחר מכן עקוב אחר ההוראות המתאימות למערכת ההפעלה של המחשב. תהליך זה אורך בדרך כלל 5-10 דקות.
- התקן את R Studio (גר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההגדרה המתוארת בשלבים 1-3 של הפרוטוקול נחוצה כדי לאפשר ביצוע עוקב של SPIA והאלגוריתם Pathway2Targets. בסוף כל שלב תיווצר הודעה המאשרת את ההתקנה המוצלחת של התוכנה. שלב 4 מורכב מהורדת קבוצה קיימת של תוצאות ביטוי דיפרנציאלי, שיכולות לכלול את קובץ הדוגמה שסופק, קובץ קיים אחר, או עיבוד מקדים של מערך נתונים מותאם אישית של רצף RNA. הדרישה העיקרית לשלב 4 היא שזרימת העבודה תשתמש ב-edgeR כאלגוריתם הביטוי הדיפרנציאלי, כאשר התוצאות מאוחסנות כאובייקט SingleCellExperiment בתוך קובץ rds.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים 1-3 של הפרוטוקול נוגעים באופן ספציפי להתקנת תוכנת R, סקריפטים ויחסי תלות הבסיסיים כדי להפעיל בהצלחה את התוכנה במורד הזרם. רשימה מפורטת של ספריות R נדרשות זמינה (טבלה משלימה 4). שלב 4 של הפרוטוקול כולל אחזור קובץ נתוני R (פורמט .rds), המכיל את הפלט מניתוח ביטוי דיפרנציאלי. תוכנה נפוצה לשלב זה כוללת edgeR6, DESeq24 ו-limma5. בנינו את זרימת העבודה הזו כך שתהיה תואמת לפלט edgeR בפורמט rds באמצעות ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ל-BEP יש מניות ב-Pythia Biosciences. לא הושג מימון חיצוני לעבודה הנוכחית.
תודות
אנו מודים למשרד מחשוב המחקר באוניברסיטת בריגהם יאנג על המומחיות והתמיכה שלהם בעת גישה לסביבת המחשב בעלת הביצועים הגבוהים בקמפוס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סקריפט Pathway2Targets R | אוניברסיטת בריגהם יאנג (מעבדת פיקט) | גרסה 3.1 | https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R |
| R Software | רשת ארכיון R מקיפה (CRAN) | גרסה: 4.4.3 | https://cran.r-project.org |
| תוכנת שולחן העבודה R Studio | הנחה | גרסה: 2024.12.1+563 | https://posit.co/download/rstudio-desktop/ |
| סקריפט SPIA R | אוניברסיטת בריגהם יאנג (מעבדת פיקט) | גרסה: 3.1 | https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd |
מקורות
- Dobin, A., et al. Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with hisat2 and hisat-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
