הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים לבביים אנושיים מתאי גזע עובריים באמצעות אינדוקציה של מזודרם מדורג וארגון עצמי תלת מימדי

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68738

⸱

7 באוקטובר 2025

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים לבביים אנושיים פונקציונליים מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). הוא כולל הפשרת תאים, התמיינות ושלבי התבגרות, המספקים פלטפורמה חזקה להתפתחות לב ומודלים של מחלות.

תקציר

אורגנואידים לבביים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מבנים תלת מימדיים (תלת מימדיים) רב-תאיים המסכמים היבטים מרכזיים של התפתחות ותפקוד לב אנושי מוקדם. אורגנואידים אלה המארגנים את עצמם מציגים התכווצות ספונטנית, ביטוי סמני קרדיומיוציטים וארכיטקטורה דמוית רקמה המזכירה שריר לב מקומי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזק וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים לבביים מקו H9 hESC באמצעות בידול שושלת מדורג. השראת מזודרם מתחילה על ידי טיפול בספרואידים במשך 36-40 שעות עם אקטיבין A (50 ננוגרם/מ"ל), חלבון מורפוגנטי של העצם 4 (BMP4, 10 ננוגרם/מ"ל), גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2, 30 ננוגרם/מ"ל), לדוביגלוסיב (CHIR99021, 3 מיקרומטר), ומעכב פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K) (LY294002, 5 מיקרומטר). מפרט שושלת הלב מכוון לאחר מכן על ידי חשיפה יומית למשך ארבעה ימים ל-BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), FGF2 (10 ננוגרם/מ"ל), מעכב מסלול Wnt (XAV-939, 5 מיקרומטר) וחומצה רטינואית (0.5 מיקרומטר). התמיינות והבשלה של קרדיומיוציטים מקודמים עוד יותר מהיום ה-5.5 ואילך באמצעות BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), FGF2 (10 ננוגרם/מ"ל) ואינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל). אימות תפקודי מושג באמצעות הדמיית זמן-lapse וניתוח אימונופלואורסצנטי, המאשר את יצירת הקרדיומיוציטים המתכווצים המסומנים על ידי ביטוי טרופונין T (cTnT) לבבי. בנוסף, צביעה חיסונית תלת מימדית חושפת נוכחות של α-SMA ו-CDH5, מה שמעיד על הופעת שריר חלק ואוכלוסיות תאים דמויי אנדותל. אורגנואידים לבביים אלה מדגימים באופן עקבי התכווצויות קצביות; עם זאת, לא בוצע אימות אלקטרופיזיולוגי ישיר של צימוד אלקטרומכני. מגבלות ידועות כוללות חוסר יכולת להעביר אורגנואידים ונמק מרכזי פוטנציאלי במהלך תרביות ממושכות. לסיכום, מודל זה מספק פלטפורמה ניתנת להרחבה ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר קרדיוגנזה אנושית, תגובות לתרופות ומחלות לב מולדות.

מבוא

מחלות לב וכלי דם נותרו הגורם המוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם, מה שמדגיש את הצורך הדחוף במודלים אמינים במבחנה המסכמים את התפתחות ותפקוד הלב האנושי 1,2. תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות מסורתיות (2D) של קרדיומיוציטים, למרות שהן בעלות ערך, אינן מצליחות לשחזר את המורכבות המרחבית, האינטראקציות הרב-תאיות והאינטגרציה האלקטרומכנית של הלב האנושי המקומי 3,4. אורגנואידים לבביים תלת מימדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים התגלו כפלטפורמות עוצמתיות המתייחסות למגבלות אלה, ומספקות מבנים רב-תאיים בארגון עצמי המחקים מורפוגנזה לבבית מוקדמת והתבגרות תפקודית במבחנה5.

ל-hESCs, כגון קו H9, יש את היכולת הפנימית להתמיין לכל סוגי התאים הסומטיים, כולל קרדיומיוציטים, תאי אנדותל ופיברובלסטים לבביים6. בתנאי תרבית מבוקרים, ניתן להנחות hESCs דרך השלבים הרציפים של השראת מזודרם, מפרט מזודרם לבבי והתמיינות קרדיומיוציטים 5,7. ניתן לווסת תהליך מדורג זה באמצעות מולקולות איתות ומעכבים ספציפיים, כולל מעכבי Activin A, BMP4, FGF2, PI3K, CHIR99021, מעכבי Wnt וחומצה רטינואית 5,8. על ידי חיקוי מקרוב של סביבת האיתות in vivo של התפתחות הלב העוברית, רמזים אלה מקדמים קרדיוגנזה יעילה וניתנת לשחזור במבחנה 5,7.

בניגוד למערכות אורגנואידים רבות הדורשות הטמעה ברכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) כגון Matrigel, אורגנואידים לבביים יכולים להרכיב את עצמם בתנאי הידבקות נמוכה ללא תמיכה במטריקס 5,9. צבירה של hESCs מבדלים בתרחיף מניבה מבנים תלת מימדיים כדוריים המציגים פעימות ספונטניות בשבוע הראשון של התמיינות10. אורגנואידים אלה מכילים אוכלוסיות תאי לב רלוונטיות מבחינה תפקודית ומפגינים מאפיינים אופייניים, כגון ארגון סרקומרי, מעברי סידן והתכווצויות קצביות11,12, המציעים מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של רקמת לב אנושית מוקדמת.

היכולת לייצר אורגנואידים לבביים שמקורם ב-hESC מציעה הזדמנויות מרגשות לביולוגיה התפתחותית, מודלים של מחלות, סינון תרופות ובדיקת רעילות לב13,14. יתר על כן, אינטגרציה עם טכנולוגיות עריכת גנום ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ספציפיים לחולה (iPSCs) מאפשרת מידול מחלות מותאם אישית וחקירה טיפולית להפרעות לב תורשתיות.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, ליצירת אורגנואידים לבביים מתאי גזע עובריים אנושיים, תוך הדגשת שלבי מפתח של התמיינות, תנאי תרבית וטכניקות אימות. פלטפורמה זו מספקת מערכת חזקה וניתנת להרחבה לסיכום התפתחות הלב האנושי והקמת בסיס למחקר תרגומי עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים תאי גזע עובריים אנושיים (H9) נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה הביו-רפואית של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט, אישור 20241023-031. כל עבודות תרבית הרקמה המפורטות להלן צריכות להיעשות במכסה זרימה למינרי Class II. ודא תמיד שהמדיה והריאגנטים נמצאים בטמפרטורת החדר, מאוזנים באופן טבעי לפני השימוש. אל תשתמש באמבט מים לחימום מדיה.

1. הפשרה ותרבות שגרתית של HESCs (H9)

  1. ציפוי ויטרונקטין של לוחות תרבית
    1. להפשיר את מלאי הוויטרונקטין על קרח ולדלל לריכוז עבודה של 10 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות מדיום E8 קר.
    2. הוסף 1 מ"ל לבאר של תמיסת הויטרונקטין המדוללת לצלחת של 6 בארות. דגרו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 1-4 שעות לפני השימוש.
    3. לפני זריעת התאים יש לשאוב עודף ויטרונקטין ולא לשטוף.
      הערה: הדגירה בחממת תרבית התאים משפרת את אחידות הציפוי ומשפרת את חיבור התאים, חשוב במיוחד עבור hESCs רגישים. אל תאפשר לתמיסת הציפוי להתייבש. פרוטוקול זה משתמש בלוחות מצופים ויטרונקטין רק במהלך שלבי ההפשרה וההרחבה של hESC כדי לספק תחליף ECM מוגדר וקשור למשטח. אורגנואידים לבביים נוצרים לאחר מכן באמצעות צבירה עצמית בתנאי השעיה עם הידבקות נמוכה, ללא צורך ב-ECM.
  2. הפשרת HESCs שמורים בהקפאה (H9)
    1. לפחות 30-60 דקות מראש, אפשר לכל המדיה והריאגנטים הנדרשים (למשל, מדיום E8, מעכב E8 + ROCK, PBS) להתאזן באופן טבעי לטמפרטורת החדר.
    2. אחזר קריוביאל אחד של תאי גזע עובריים אנושיים H9 מאחסון חנקן נוזלי באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. טבלו מיד את הקריוביאל באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. סובב בעדינות את הבקבוקון ופקח מקרוב.
    3. ברגע שנשאר גביש קרח קטן (~90% מופשר, ~1-2 דקות), העבירו מיד את הבקבוקון לארון בטיחות ביולוגית. יש לחטא את החלק החיצוני של הקריוביאל עם 75% אתנול לפני הפתיחה.
    4. העבירו לאט את תכולת הקריוביאלי לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום E8 בטמפרטורת החדר בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (מעכב ROCK). מערבבים בעדינות על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם קצה פיפטה רחב קדח.
    5. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב -2 מ"ל של מדיום E8 + Y-27632.
    6. צלחת תאים על צלחת מצופה ויטרונקטין בת 6 בארות (מוכנה מראש) בצפיפות הזריעה הרצויה (בדרך כלל 150,000-200,000 תאים לבאר). נדנד בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה, והעביר לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
      הערה: השימוש במעכב ROCK (Y-27632) הוא קריטי במהלך 24 השעות הראשונות לאחר ההפשרה כדי למנוע אנויקיס ולתמוך בהישרדות.
  3. תחזוקה שוטפת ומעבר
    1. החלף מדיום מדי יום באמצעות 2 מ"ל מדיום E8 טרי לבאר.
    2. עקוב מדי יום תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה; תאי מעבר כאשר הם מגיעים למפגש ~70-80%, בדרך כלל כל 3-4 ימים.
      1. כדי לעבור: יש לשאוף בינוני ולשטוף בעדינות עם 1 מ"ל DPBS.
      2. הוסף 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאי גזע ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות. הקש בעדינות על הצלחת כדי לעקור מושבות.
      3. אסוף את תרחיף התא והצלחת מחדש ביחס מפוצל של 1:3-1:4 על בארות טריות מצופות ויטרונקטין במדיום E8 המכיל 10 מיקרומטר Y-27632. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב- E8 ללא ROCKi.
        הערה: להתאוששות אופטימלית ויעילות התמיינות לאחר מכן, יש להעביר HESCs כאשכולות קטנים של 2-10 תאים.
        מומלץ להשתמש בקצות רחבות כדי למזער את מתח הגזירה. ניתן להשתמש בקצה פיפטה של 5 מ"ל או בפיפטה סרולוגית של 10 מ"ל לערבוב.

2. התמיינות של HESCs (H9) לשושלת לב

  1. אינדוקציה של התמיינות מזודרמיס (יום 0-1.5)
    הערה: הימנע מהבדלה ישירה בין HESCs שזה עתה הופשרו (H9) לאורגנואידים לבביים. חיוני שהתאים יעברו תחילה ויישמרו לפחות מעבר אחד לפני תחילת ההתמיינות כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית והתמיינות בריאה. התמיינות תאים מיד לאחר ההפשרה עלולה לגרום לתוצאות גרועות עקב פגיעה בבריאות התאים.
    1. זריעה לפני השראה: כאשר hPSCs מגיעים לכ-70% מפגש, יש לפרק בעדינות את התאים לאשכולות קטנים באמצעות מגיב דיסוציאציה מתאים. השעו מחדש את האשכולות ב-2 מ"ל של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632).
    2. צבירה: זרע 200 מיקרוליטר של תרחיף התא (בדרך כלל 12,000-15,000 תאים) לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 96 בארות ולאחר מכן צנטריפוגה את הצלחת ב-200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על צבירת תאים בתחתית כל באר.
    3. דגירה: מניחים את הצלחת בחממה ותרבית של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים קומפקטיים ואחידים (EBs).
    4. הכן את מדיום התרבית הבסיסית (BC-M) על ידי שילוב של 50% IMDM, 50% תערובת תזונתית F12, 15 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS-G), 450 מיקרומטר של מונותיוגליצרול ו-5 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר שבר V.
    5. הכינו את MD-M על-ידי נטילת תוסף BC-M עם Activin A (50 נ"ג/מ"ל), BMP4 (10 נ"ג/מ"ל), CHIR99021 (3 מיקרומטר), FGF2 (30 נ"ג/מ"ל) ו-LY294002 (5 מיקרומטר).
    6. אינדוקציה מזודרמלית: לאחר 24 שעות של צבירה, יש לגרום ל-EBs למשך 36 שעות עם MD-M.
      הערה: כדי להבטיח את יעילות האינדוקציה והעקביות של אורגנואידים לבביים, הגבלנו בקפדנות את השימוש ב-H9 hESCs לתוך שלושה מעברים לאחר ההפשרה. אסטרטגיה זו היא קריטית לשמירה על יעילות בידול גבוהה ואמינות ניסויית כוללת.
      טיפול עדין במהלך החלפה בינונית הוא קריטי לשמירה על שלמות האגרגטים שנוצרו. הימנע משיבוש המורפולוגיה הכדורית של ה-EBs.
  2. אינדוקציה של התמיינות מזודרמיס של הלב (ימים 1.5-5.5)
    הערה: מעכב האיתות Wnt (XAV-939) הוא קריטי לדיכוי אותות מזודרמליים אחוריים ולקידום מפרט שושלת לב. חומצה רטינואית ממלאת תפקיד רגיש למינון בדפוס אנטרופוסטריורי; דלקת מפרקים מוגזמת עלולה להוביל למפרט המעי הקדמי.
    1. תוסף BC-M (ההרכב המפורט בשלב 2.1) עם BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), FGF2 (10 ננוגרם/מ"ל), חומצה רטינואית (0.5 מיקרומטר) ו-XAV-939 (5 מיקרומטר) להכנת מדיום התמיינות מזודרמלי לבבי (CMD-M).
    2. לאחר 36-40 שעות של אינדוקציה מזודרמלית, יש לשאוב בזהירות את ה- MD-M ולהחליף ב- CMD-M למשך 4 ימים עם שינוי בינוני מדי יום.
      הערה: טפל באגרגטים בעדינות במהלך שינויים בינוניים כדי למנוע הפרעה מכנית או אפופטוזיס הנגרמת על ידי מתח.
      במהלך תקופה זו, הספרואידים הופכים קומפקטיים ומאורגנים יותר. ניתן להבחין בסימנים מוקדמים של מחויבות לשושלת הלב במיקרוסקופ ברייטפילד עד היום החמישי.
  3. מפרט אורגנואיד לב (ימים 5.5-7.5)
    1. תוסף BC-M (ההרכב המפורט בשלב 2.1) עם BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), FGF2 (10 ננוגרם/מ"ל) ואינסולין (10 מ"ג/מ"ל) להכנת מדיום מפרט אורגנואיד לב (COS-M).
    2. ביום 5.5, שאפו בעדינות CMD-M והחליפו ב-COS-M למשך יומיים עם שינוי בינוני בכל יום.
      הערה: BMP4 ו-FGF2 מקדמים באופן סינרגטי את התרחבות אבות הלב ומדכאים גורלות שאינם לבביים בשלב זה. אינסולין תומך בפעילות מטבולית ובהתפתחות מבנית של קרדיומיוציטים מבדילים.
  4. התבגרות אורגנואידים לבביים
    הערה: הימנע מדיסוציאציה מלאה או פיפטינג של ספרואידים במהלך ההעברה. קרדיומיוציטים רגישים מאוד למתח גזירה.
    1. תוסף BC-M (ההרכב המפורט בשלב 2.1) עם אינסולין (10 מ"ג/מ"ל) להכנת מדיום התבגרות אורגנואיד לב (COM-M).
    2. מהיום ה-7.5 ואילך, עברו ל-COM-M. בצע שינויים בינוניים מדי יום כדי לשמור על רמות החומרים המזינים ולהסיר פסולת מטבולית תוך מזעור מתח.
    3. מהיום ה-8 עד היום ה-12, חפשו פעימות ספונטניות של אורגנואידים לבביים, שבדרך כלל מתגלים במיקרוסקופ אור.
    4. עד יום 12+, ודא שקצב ההתכווצות סדיר ומתמשך.
      הערה: ניתן לכמת את קצב הפעימות והמורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse וכלי ניתוח תמונה.
      ניתן לבצע ניתוח אלקטרופיזיולוגי (למשל, הדמיית סידן או MEA) מהיום ה-12 ואילך כדי להעריך את הבשלות התפקודית.

3. הכנה לשימור בהקפאה

  1. העבירו בזהירות אורגנואידים לבביים מלוח התרבית באמצעות פיפטה רחבת קדח כדי למנוע לחץ מכני. הניחו אותם בצינור חרוטי של 15 מ"ל ואפשרו לאורגנואידים להתיישב באופן טבעי על ידי כוח הכבידה למשך 3-5 דקות ללא צנטריפוגה.
  2. הכן מדיום שימור בהקפאה (Cryo-CM) עם הרכיבים הבאים (ריכוזים סופיים): 80% CM-M, 10% FBS, 10% DMSO.
  3. השעו בעדינות אורגנואידים לבביים ב-500 מיקרוליטר של Cryo-CM לכל קריוביאל.
  4. הנח קריוביאלים למיכל הקפאה על בסיס איזופרופנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות כדי להבטיח קירור הדרגתי בטמפרטורה של ~1 מעלות צלזיוס לדקה.
  5. לאחר הקפאת לילה, העבירו בקבוקונים לאחסון חנקן נוזלי לשימור לטווח ארוך.
    הערה: שימרנו בהקפאה את האורגנואידים הלבביים בצפיפות של כ-20-30 אורגנואידים בוגרים לכל קריוביאל, תלויים ב-1 מ"ל של מדיום שימור בהקפאה.

4. התאוששות והפשרה של אורגנואידים לבביים

  1. כדי לשחזר אורגנואידים, יש להפשיר במהירות בקבוקונים באמבט מים, להעביר את האורגנואידים הלבביים למדיום CM-M, לצנטריפוגה בעדינות להסרת DMSO, ולהשעות מחדש את האורגנואידים ב-CM-M טרי.
    הערה: הכאה לאחר ההפשרה מתחדשת בדרך כלל תוך 24-48 שעות, תלוי בבשלות האורגנואידים ובאיכות הטיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההתמיינות המוצלחת של H9 hESCs לאורגנואידים לבביים מתחילה בתחייה ותחזוקה חזקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים. עם ההפשרה, hESCs מפגינים כדאיות גבוהה והיצמדות כאשר הם מצופים על לוחות מצופים ויטרונקטין במדיום E8 בתוספת מעכב ROCK. תוך 24-48 שעות, ניתן לצפות במושבות קומפקטיות עם קצוות מוגדרים ויחסי גרעין לציטופלזמה גבוהים, מה שמעיד על התאוששות של מורפולוגיה לא מובחנת טיפוסית (איור 1A). לאחר ההפשרה, hESCs נכנסים במהירות לשלב התפשטות, ומדגימים התרחבות מושבה חזקה וביסוס מחדש של מאפיינים פלוריפוטנטיים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הייצור המוצלח של אורגנואידים לבביים מ-H9 hESCs מסתמך על ויסות זמני ומרחבי מדויק של מסלולי איתות מרכזיים כדי לחקות התפתחות לב מוקדמת. פרוטוקול זה מסכם את השלבים הקריטיים של השראת מזודרם, מפרט שושלת הלב וארגון עצמי למבנים מתכווצים תלת מימדיים במערכת מוגדרת כימית. השיטה מספקת פלטפורמה חזקה וניתנת לשחזור למידול התפתחות לב אנושית, מחלות לב מולדות ובדיקת רעילות לב.

אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא הבטחת הבריאות והאיכות של H9 hESCs לפני התמיינות 5. יש לתרבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לג'ונפנג ג'י (בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג, סין) וטאו לואו (בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים, אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג, סין) על מתן hESCs (H9). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' U23A20398 ל-CZ), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (מענק מס' 2022YFS0578 ו-2022YFS0614 ל-CZ), קרן סטארט-אפ מחקר של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט (מענק מס' 00040155 ל-CZ), קרן סטארט-אפ מחקר של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט (מענק מס' 00170071 ל-B.W.), תוכניות שיתוף הפעולה האסטרטגי למדע וטכנולוגיה של הממשל העממי העירוני של לוז'ו והאוניברסיטה הרפואית של דרום-מערב (מענק מס' 2024LZXNYDJ088 ל-BW), פרויקט שיתוף הפעולה האסטרטגי למדע וטכנולוגיה של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט (מענק מס' 2024PZXNYD01 ל-BW), וקרן האוניברסיטה הרפואית של סאות'ווסט (מענק מס' 2024ZKZ014 ל-BW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.02% EDTAביוטייםג0198
6 באר  צלחתקורנינג3516
7.5% אלבומין בסרום בקרACMECAC11954
צלחת חיבור נמוכה במיוחד 96 בארקורנינג7007
Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר IgGיאסןברקוד 34106ES60
Alexa Fluor 555 עיזים נגד ארנבInvitrogenא-21428
CHIR-99021 מונוהידרוכלורידיאסןברקוד 52965ES10
DMSO סולארביוD8370
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (D-PBS)יאסןברקוד 60152ES76
FBSג'יבקוברקוד 10099141ג
חלבון FGF2, אנושי, רקומביננטיטרגטמולTMPY-00749-50 & ז 
תערובת התזונה F-12 של האםטכנולוגיות חיים11765054
hPSC-CDM (חיוני 8 בינוני)קוליסל400105
חלבון רקומביננטי BMP-4 אנושיג'יבקוPHC9534
IMDM, תוסף GlutaMAXטכנולוגיות חיים31980030
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G)ג'יבקו41400045
LY294002סלקS1105-50 מ"ג
מונותיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M6145
עכבר אנטי-&אלפא;SMAאבמארטMN50104
תושבת ProLong Diamond Antifade עם DAPIInvitrogenעמ' 36966
ארנב אנטי-CDH5אבמארטת"א 6265
ארנב נגד cTNTInvitrogen701620
חלבון BMP-4 אנושי רקומביננטייאסןברקוד 92053ES20
אינסולין אנושי רקומביננטי יאסןברקוד 40112ES25
רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה אקטין A חלבוןיאסןברקוד 91702ES10
ReLeSRתא גזע100-0483
חומצה רטינואיתסיגמא-אולדריץ'₪525
ויטרונקטיןג'יבקוA14700
XAV-939סלקS1180
Y-27632 2HCl (מעכב ROCK)סלקS1049

מקורות

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game-changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Ni, B., Ye, L., Zhang, Y., Hu, S., Lei, W. Advances in humanoid organoid-based research on inter-organ communications during cardiac organogenesis and cardiovascular diseases. J Transl Med. 23 (1), 380(2025).
  3. Mohr, E., Thum, T., Bär, C. Accelerating cardiovascular research: Recent advances in translational 2D and 3D heart models. Eur J Heart Fail. 24 (10), 1778-1791 (2022).
  4. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  5. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  6. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: A methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  7. Yang, N., et al. Human cardiac organoid model reveals antibacterial triclocarban promotes myocardial hypertrophy by interfering with endothelial cell metabolism. Sci Bull. 70 (3), 342-346 (2025).
  8. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  9. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  10. Liu, C., Feng, X., Li, G., Gokulnath, P., Xiao, J. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76 (1), 103813(2022).
  11. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nat Commun. 11 (1), 4283(2020).
  12. Yang, J., et al. Generation of human vascularized and chambered cardiac organoids for cardiac disease modelling and drug evaluation. Cell Prolif. 57 (8), e13631(2024).
  13. Kim, H., Kamm, R. D., Vunjak-Novakovic, G., Wu, J. C. Progress in multicellular human cardiac organoids for clinical applications. Cell Stem Cell. 29 (4), 503-514 (2022).
  14. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 39 (6), 737-746 (2021).
  15. Klimanskaya, I., McMahon, J. Approaches for derivation and maintenance of human embryonic stem cells. Handb Stem Cells. , 1st ed, Elsevier Academic Press. (2004).
  16. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799(2022).
  17. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3D bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע עובריים אנושייםארגון עצמי תלת-ממדיהתמיינות לתאי שריר לבקביעת שורת התמיינותאנליזה של אימונופלואורסצנציהדימוי במרווחי זמןטרופונין T לבביתאי שריר חלק
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.