מאמר שיטה

SCAnED - מאקרו פילוח עור בקוד פתוח לזיהוי אוטומטי למחצה של תאים וגרעינים בתאי עור האפידרמיס והעור

DOI:

10.3791/68746

⸱

8 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי לזיהוי וכימות תאים חיסוניים ולא חיסוניים בחלקי עור באמצעות SCAnED, מאקרו חינמי מבוסס ImageJ לסגמנטציה של העור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפלגות המרחבית של תאים חיסוניים ולא חיסוניים בתוך רקמות וביטוי סמנים ספציפיים לתא מספקים מידע חיוני על תפקוד התא באתרו. עור האדם הוא איבר מורכב ביותר עם תאים מוגדרים המורכבים מתאים שונים עם פנוטיפים מגוונים. על ידי שימוש בתיוג רב-פלואורסצנטי, ניתן לקבוע ולאפיין אוכלוסיות תאי עור מובהקות. עם זאת, נכון לעכשיו, הזמינות של כלים לא מסחריים לניתוח תמונה של דגימות עור המאפשרים פילוח סיליקו של תאים במיוחד בתוך האפידרמיס או הדרמיס ברזולוציה של תא בודד מוגבלת. אנו מספקים כאן פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית של חלקי עור, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה באמצעות הכלי הזמין בחינם שלנו SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis ו-Dermis). המאקרו SCAnED מאפשר זיהוי וסיווג מדויקים של תאים וגרעינים הן באפידרמיס והן בעור האדם. אנו מספקים הנחיות כיצד לקבוע רמות עוצמה ממוצעות של ביטוי יוצר בתאים ובתאים תאיים שונים, כגון הציטופלזמה והגרעין, וכיצד לכמת תאים המבטאים כמויות משתנות של סמנים אלה באמצעות צינור Python נלווה המסופק כמחברת Jupyter מוכנה לשימוש המבוצעת ב-Google Colab. פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים חסרי ניסיון לקבוע פרופילי ביטוי ספציפיים לתאים בתוך רקמת העור ולספק תובנות לגבי ההתפלגות המרחבית של תאים בתוך תאי האפידרמיס והעור, מה שיאפשר הבנה מעמיקה יותר של מבנה הרקמה המורכב והרכב התאים של עור האדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת רקמות העור ברמה התאית והבחנה בפנוטיפים של תאים, מורפולוגיה ולוקליזציה שלהם הן בתא האפידרמיס והן בתא העור הם מרכזיים במחקר דרמטולוגי ובהיסטופתולוגיה 1,2. ההרכב התאי בתוך האפידרמיס, הכולל קרטינוציטים, מלנוציטים ותאי לנגרהנס בתנאים בריאים, הופך לבלתי מאוזן מאוד במחלות עור דלקתיות וסרטן. יתר על כן, הפנוטיפ והלוקליזציה של תאים בתוך הדרמיס, הממוקמים מתחת לאפידרמיס ומכילים פיברובלסטים ורוב תאי החיסון, יכולים להשתנות באופן משמעותי במחלה. לפיכך, פילוח תאים וגרעינים הכרחי להערכת תכונות תאיות כגון מספר תאים, ביטוי חלבון, מורפולוגיה וארגון מרחבי, ומאפייני גרעין כגון גודל, צורה וביטוי גורמי שעתוק, ובכך מסייע בהבנת הומאוסטזיס ומחלות עור 3,4,5.

למרות הזמינות של פלטפורמות ניתוח תמונות למטרות כלליות כגון QuPath6, CellProfiler7 ו-ilastik8, כלים אלה דורשים לעתים קרובות התאמה אישית נרחבת וסקריפטים כדי להסתגל למורכבות המבנית ולמורפולוגיה ההטרוגנית של רקמת העור. מעט כלים הותאמו במיוחד לפילוח אוטומטי של תאי האפידרמיס והעור, ופתרונות זמינים רבים הם מסחריים ואינם נגישים באופן חופשי. מגבלות אלו מקשות על אנשים שאינם מומחים ליישם צינורות יעילים לניתוח ספציפי לעור.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לניתוח תאים וגרעינים בתוך רקמת העור ותאיה, המכסה את כל השלבים החיוניים החל מצביעת רקמות ועד לניתוח תמונה באמצעות צינור ניתוח התמונה האוטומטי למחצה שלנו. אנו מתחילים במידע מפורט על צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמת עור, כולל צביעה עם E-cadherin לפילוח אפידרמיס/דרמיס ו-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לזיהוי תאים/גרעינים. שני סמנים מעניינים, Vimentin (VIM) ו-CD90, נכללו למטרות אימות. אנו ממליצים להשתמש בנוגדנים בריכוזים אופטימליים (ראה טבלה 1) וללכוד תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם הגדרות עקביות לעוצמת הלייזר, זמן החשיפה והרזולוציה כדי להבטיח שחזור.

יתר על כן, אנו מציגים את ה-ImageJ9 macro SCAnED המעוצב בהתאמה אישית, ראשי תיבות של Skin Compartment Aalysis of Epidermis ו-Dermis, ואנו מספקים את כל השלבים הדרושים לפילוח בסיליקו וזיהוי גרעינים ותאים הן בתוך האפידרמיס והן בתוך הדרמיס. משתמשים יכולים לבחור בין שתי שיטות שונות לזיהוי גרעינים, או באמצעות סף פשוט ומהיר או באמצעות כלי הלמידה העמוקה StarDist10 ומודל העור המאומן שלנו, לפני שממשיכים בפרוטוקול SCAnED. בניגוד לכלים כלליים, SCAnED פותח במיוחד עבור היסטולוגיה של העור ועולה עליהם על ידי מתן אפשרות למידור אוטומטי של אזורי האפידרמיס והעור וכימות משולב של סמנים מרובים בשני האזורים. זה שימושי במיוחד עבור חוקרים חסרי מומחיות בתכנות או למידה עמוקה, המציעים כלי מוכן לשימוש המותאם לניתוח תמונת עור.

אנו מראים עוד כיצד רמות העוצמה הממוצעת מופקות לכל תא מתמונות אימונופלואורסצנטיות של עד חמישה סמנים מעניינים מובחנים. לבסוף, אנו מספקים קוד Python לניתוח סטטיסטי של נתוני התא הבודד שהתקבלו שנכתבו ובוצעו ב-Google Colab11 ושותפו כמחברת Jupyter. הפרוטוקול שלנו והמאקרו של SCAnED שואפים לספק לחוקרי עור ללא מומחיות מתקדמת באימונופלואורסצנציה ומחשוב כלי מעשי לתיוג וכימות אוטומטי למחצה של תאים וביטוי סמנים בעור האדם, תוך התמקדות בתאי האפידרמיס והעור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תיוג אימונופלואורסצנטי של E-cadherin, VIM ו-CD90 וצביעה גרעינית עם DAPI בקטעי עור משובצים בפרפין

הערה: הפרוטוקול מציג שלבים עבור מקטעים מוטבעים בפרפין. לדגימות רקמה טריות וקפואות, תקן את חלקי הרקמה והמשך לשלב 1.3 של הפרוטוקול.

  1. ממיסים פרפין בעזרת מאוורר או תנור.
  2. יש להחזיר לחות לחלקים על ידי מעבר דרך אלכוהולים מדורגים עם תכולת מים הולכת וגדלה (למשל, קסילן →-100% אתנול →-85% אתנול →-70% אתנול → מים).
  3. בצע שלבי אחזור אנטיגן בהתאם לאנטיגנים.
  4. לחלחל קטעי רקמה עם 0.3% טריטון X ב-PBS (3 x 20 דקות) (ראה טבלה 2).
  5. שטפו שקופיות עם PBS (1 x 5 דקות).
  6. הקף כל דגימה בעט סימון שקופיות הידרופובי כדי למנוע שפיכת נוזלים ולמזער את נפח הריאגנטים ולתת להתייבש.
  7. החל נוגדנים ראשוניים (מאגר לשרירי הבטן: PBS + 2% BSA) (ראה טבלה 1 וטבלה 2). הניחו את השקופיות בקופסת תא לחה (קופסה רטובה) ודגרו למשך הלילה.
  8. שטפו שקופיות עם 0.3% טריטון X ב-PBS (3 x 5 דקות).
  9. הסר עודפי חומר ניקוי על ידי שטיפת שקופיות עם PBS (1 x 5 דקות).
  10. יש למרוח נוגדנים משניים וסרום עיזים (ראה טבלה 1). דגירה של מגלשות במקום חשוך למשך שעה.
  11. שטפו שקופיות עם 0.3% טריטון X ב-PBS (3 x 5 דקות).
  12. הסר עודפי חומר ניקוי על ידי שטיפת שקופיות עם PBS (1 x 5 דקות).
  13. הוסף DAPI לצביעת גרעינים (ראה טבלה 1). דגרו מגלשות במקום חשוך למשך 30 דקות.
  14. שטפו שקופיות עם 0.3% טריטון X ב-PBS (3 x 5 דקות).
  15. שטפו שקופיות עם PBS (1 x 5 דקות).
  16. מרחו טיפה אחת (~5-15 מיקרוליטר) של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על כל דגימה והניחו בזהירות את הכיסויים (הסירו בועות במידת הצורך). הניחו למגלשות להתייבש בחושך.
נוגדנים וצבעריכוז עבודהדילול
נוגדן אנטי-וימנטין0.8 מיקרוגרם/מ"ל1:50
נוגדן אנטי-E-cadherin1 מיקרוגרם/מ"ל1:333
נוגדן נגד CD901:1000
AF488 נגד עכבר1:500
AF568 נגד ארנב1:500
AF647 נגד עכבר1:500
DAPI1 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 1: נוגדנים וצבע.

1. מאגר מכתים
מגיבריכוז סופיכמות
BSA2%1 גרם
PBS1x50 מ"ל
סךלא ישים50 מ"ל
2. מאגר חדירות
מגיבריכוז סופיכמות
טריטון X0.30%300 מיקרוליטר
PBS1x100 מ"ל
סךלא ישים100 מ"ל

טבלה 2: מתכונים לפתרונות.

2. הדמיה קונפוקלית

הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, המצויד במטרה פי 10 (NA 0.4), ו-4 קווי לייזר (405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר, 640 ננומטר).

  1. רכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו תמונה לדוגמה באיור 1).
  2. השתמש בפרמטר גודל הסריקה הבא כדי ליצור את המאקרו, לאמן את מודל StarDist ובאופן אידיאלי לרכישת תמונה: גודל תמונה = 4,096 x 4,096 פיקסלים (או 1,273 x 1,273 מיקרון), עומק סיביות = 16 סיביות, גודל פיקסל מינימלי = 0.3 מיקרון, יחס אות לרעש (SNR) = מינימום 3.

figure-protocol-1
איור 1: צביעה אימונופלואורסצנטית של קטע העור. DAPI: תוויות גרעינים, CD90: סמן פיברובלסטים, E-cadherin: משמש לתיוג אפידרמיס, VIM: תאים המבטאים VIM, מיזוג: מיזוג של DAPI (מגנטה), CD90 (כחול), E-cadherin (צהוב) ו-VIM (ירוק). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח תמונה באמצעות מאקרו SCAnED (קובץ משלים 1, וידאו משלים S1 ווידאו משלים S2)

  1. הפעל את המאקרו (סרט SCAnED.mp4).
    1. פתח תמונות אימונופלואורסצנטיות בפיג'י/ImageJ באמצעות פורמטים ביולוגיים עם הגדרות ברירת מחדל.
      הערה: אין לפצל ערוצים בשלב זה.
    2. הורד והפעל את המאקרו SCAnED על ידי ניווט אל תוספים | פקודות מאקרו | הפעל ובחר את סקריפט המאקרו SCAnED (קובץ משלים 1).
    3. עקוב אחר ההוראות המפורטות על המסך המסופקות על ידי המאקרו.
  2. בסיליקו סגמנטציה של אפידרמיס ודרמיס באמצעות מאקרו SCAnED.
    1. בחר את ערוץ E-cadherin כאשר תתבקש לעשות זאת.
    2. התאם את הסף באופן ידני על-ידי ניווט אל תמונה | התאם | סף ולחיצה על OK כדי שתעלת E-cadherin תלכוד את אזור האפידרמיס במלואו.
    3. במידת הצורך, אשר את שלב מילוי ההצפה כדי לסגור פערים במסכת ה-E-cadherin על ידי בחירה בסמל כלי מילוי הצפה ב-ImageJ , לחיצה על החלק העליון של האפידרמיס ולחיצה על אישור (איור משלים S1A-E וטיפים לפתרון בעיות בסעיף הדיון).
    4. אם המסיכה הפוכה, בחר כן ואישור כשתתבקש להפוך את הבחירה; אחרת, בחר לא ואישור (ראה איור משלים S1F,G ועצות לפתרון בעיות בסעיף הדיון).
    5. בחר את ערוץ ה- DAPI כאשר תתבקש לעשות זאת. תמונות הגרעינים לפני ואחרי פילוח אפידרמיס-דרמלי מוצגות באיור 2.
  3. פילוח גרעינים באמצעות פונקציית הסף
    1. הגדרה אוטומטית של רמות עוצמה.
  4. פילוח גרעינים באמצעות StarDist
    1. פתח את StarDist ב-ImageJ (איור 3).
    2. טען את מודל גילוי הגרעינים (קובץ משלים 2) לתוך ממשק המשתמש הגרפי של StarDist (איור 4). זוג האימונים המתאים ליצירת מודל StarDist מוצג באיור משלים S2.
      הערה: יש להשתמש ב-Tensor Flow גרסה 1.15 עבור דגם זה אם מתרחשת שגיאת StarDist (ראה איור משלים S3).
    3. לחץ תחילה על ערוץ הגרעין.
    4. התאם את הגדרות האריחים בהתאם (ודא שמספר האריחים תואם לגודל התיקון הצפוי (256 x 256 פיקסלים) (ראה איור 3 ואיור 4).
      הערה: פילוח StarDist עשוי להימשך זמן בהתאם למספר הגרעינים.
  5. מדידת עוצמה וכימות של חלבונים גרעיניים
    הערה: לפני הפעלת ה-SCAnED, עבור אל ניתוח | הגדר מדידות והגדר את הפרמטרים כדי להבטיח פלט נתונים מדויק ורלוונטי (איור 5).
    1. כאשר תתבקש, בחר כן כדי למדוד את עוצמת הסמן בגרעינים.
    2. בחר את ערוץ הסמן המתאים (עד חמישה אפשריים).
    3. שמור את התוצאות כקבצי CSV בהתאם להוראות המאקרו.
    4. חזור על הפעולה עבור כל ערוץ.
    5. לאחר עיבוד כל הערוצים, שמור את התוצאות כקובצי CSV בהתאם להוראות המאקרו.
      הערה: להדמיה טובה יותר, כללנו תצוגה מוגדלת של אזור עור ספציפי להמשך הניתוח (איור 6).
  6. פילוח תאים (אזור ציטופלזמי)
    הערה: פילוח התאים מבוסס על הרחבת ההחזר על ההשקעה הגרעינית ולכן יש להתחיל אותו לאחר פילוח גרעינים.
    1. כאשר פונקציית הסף שימשה לפילוח גרעינים, החל הרחבה בינארית.
    2. כאשר נעשה שימוש ב-StarDist לפילוח גרעינים, השתמש בהרחבת הגדלה, שיש לה זמן עיבוד ארוך יותר (ראה איור משלים S4).
  7. מדידת עוצמה וכימות של חלבונים ציטופלזמיים
    1. בחר כן כדי למדוד את עוצמת הסמן בתאים שלמים.
    2. שמור את קבצי ה- CSV התוצאה לפי הוראות המאקרו.
    3. חזור על הפעולה עבור כל ערוץ סמן לפי הסדר.
    4. שמור על אותו סדר ערוצים הן למדידות הגרעין והן למדידות התא כדי לשמור על עקביות בנתוני הפלט.
    5. בחרו באפשרות 'בטל' בכל פעם שהמאקרו מבקש זאת, כדי למנוע ערבוב של נתוני גרעינים בין האפידרמיס לדרמיס. איור 7 ממחיש את כל השלבים של הפילוח מבוסס הסף.

figure-protocol-2
איור 2: ניתוח והפרדה של גרעינים ספציפיים לערוץ בגרעיני האפידרמיס והעור. צביעה אימונופלואורסצנטית של DAPI מדגימה את המורפולוגיה וההתפלגות המרחבית של גרעינים בעור שלם (תמונה משמאל). ייצוג ערוץ גרעינים של גרעיני אפידרמיס צבועים ב-DAPI, המספק תובנה לגבי התפלגות הגרעינים בתוך תא האפידרמיס (תמונה אמצעית). ייצוג ערוץ גרעינים של גרעיני עור מוכתמים ב-DAPI, המציע הדמיה של התפלגות הגרעינים בתוך תא העור (תמונה מימין). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 3: שימוש באפשרות "StarDist". צילום מסך המדגיש את המיקום של האפשרות "StarDist 2D" בתפריט/תוספים/StarDist/StarDist 2D. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: הוראות לשימוש במודל גילוי גרעינים. הורד את הקובץ "nuclei_detection_model.zip" וספק את נתיב הקובץ שלו בקטע עיון . אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-5
איור 5: קביעת תצורה של הגדרות מדידה. (A) צילום מסך המדגיש את המיקום של האפשרות Set Measurements בתוך התפריט, ומאפשר התאמה-אישית של פרמטרי מדידה עבור ניתוח עוקב. (ב) הגדרת תיבת מדידות המציגה את הממשק להתאמת הגדרות המדידה, ומאפשרת למשתמשים לציין פרמטרים לאיסוף וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-6
איור 6: תצוגה מוגדלת של אזור מסוים. (A) מיזוג של צביעת DAPI (מגנטה) ו-VIM (ירוק). (B) תצוגה מוגדלת של אזור מסוים מ-A, המספקת הדמיה מפורטת של ביטוי VIM בתוך רקמת העור. שימו לב למורפולוגיה השונה של גרעינים בתוך האפידרמיס והדרמיס. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A), 20 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-7
איור 7: סגמנטציה של SCAnED באפידרמיס ובדרמיס עבור גרעינים ותאים באמצעות סף. (A) תמונה שלמה: מיזוג של צביעת DAPI (מגנטה) ו-VIM (ירוק). חלק עליון: (B) מיזוג של גרעיני אפידרמיס מוכתמים ב-DAPI ו-VIM לאחר ההפרדה. (C) מסכה של גרעיני האפידרמיס באמצעות סף. (D) פילוח גרעינים של גרעיני אפידרמיס המונחים על גבי המיזוג של DAPI ו-VIM, המסייע בהדמיה של התפלגות הגרעינים בתוך תא האפידרמיס. (E) פילוח תאים של גרעיני אפידרמיס המונחים על גבי המיזוג של DAPI ו-VIM, המסייע בהדמיה של התפלגות הגרעינים בתוך תא האפידרמיס על ידי שימוש בסף והרחבה, מכיוון שהוא מראה שאזור הברירה גדול יותר מהגרעינים. חלק תחתון: (F) מיזוג של גרעיני עור מוכתמים ב-DAPI ו-VIM לאחר ההפרדה. (G) מסכה של גרעיני עור באמצעות סף. (H) פילוח גרעינים של גרעיני עור המונחים על גבי המיזוג של DAPI ו-VIM, המסייע בהדמיה של התפלגות הגרעינים בתוך התא העורי. (I) פילוח תאים של גרעיני עור המונחים על המיזוג של DAPI ו-VIM, המסייע בהדמיה של התפלגות הגרעינים בתוך התא העורי. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. סיווג והדמיה של נתוני תא בודד שחולצו (סרטון משלים S3)

הערה: כל סמן אימונופלואורסצנטי מייצר שני קבצי CSV: אחד עבור תא האפידרמיס ואחד עבור תא העור.

  1. קבע ספי עוצמה ספציפיים לסמן באמצעות דגימות בקרת איזוטיפ.
    1. ייבא את קבצי הפלט של CSV שנוצרו על ידי המאקרו SCAnED ל-Google Colab באמצעות מחברת Jupyter המצורפת. בהתחלה, הורד את מחברת Jupyter המתאימה (למשל, קובץ משלים 3 או קובץ משלים 4), עבור אל Google Colab (https://colab.research.google.com/), לחץ על קובץ, פתח את המחברת, בחר את הקובץ, הפעל את תאי הקוד בזה אחר זה. כאשר תתבקש עם בחר קבצים, לחץ על הכפתור והעלה את קובץ .csv.
    2. עבור כל נוגדן, חשב את עוצמת הקרינה הממוצעת מבקרות האיזוטיפ. כדי לקבוע את החתך עבור כל נוגדן, פתח את מחברת DotPlot (קובץ משלים 4), העלה את קובץ בקרת האיזוטיפ המתאים והפעל את הקוד.
    3. בהתבסס על התפלגות הנקודות בבקרת האיזוטיפ ובעלילות נוגדנים ספציפיות, בחר סף עוצמה מתאים כדי להפריד בין רקע (בקרת איזוטיפ) לאות (צביעה ספציפית). השתמש בערכים אלה כחיתוכים כדי לסווג תאים בודדים כחיוביים או שליליים עבור ביטוי סמן.
  2. השווה את עוצמות הסמן בדגימות ניסוי לסף המחושב.
    1. סיווג תאים עם עוצמה ≥ סף כחיוביים.
    2. סיווג תאים עם עוצמה < סף כשליליים.
    3. סיווג תת-אוכלוסיות בהתבסס על שילובים של ביטוי סמן, לדוגמה, זיהוי אוכלוסיות תאים חיוביות יחידות, חיוביות כפולות או חיוביות משולשות.
  3. הצג באופן חזותי את ההתפלגות והקשרים של ביטוי סמן באמצעות שני סוגים של עלילות:
    1. צור היסטוגרמות והיסטוגרמות שכבת-על כדי להשוות את התפלגות העוצמה בין מצבים (למשל, ביקורת לעומת עור חולה) על ידי הרצת קוד ההיסטוגרמה (הורד את הקובץ המשלים 3, עבור אל Google Colab (https://colab.research.google.com/), לחץ על קובץ, פתח מחברת, בחר את הקובץ, הריץ את הקוד) (איור 8).
    2. צור תרשימי נקודות כדי לדמות תרשימי פיזור בסגנון ציטומטריית זרימה עבור הערכת דפוסי ביטוי משותף על ידי הרצת קוד DotPlot (הורד קובץ משלים 4, עבור אל Google Colab (https://colab.research.google.com/), לחץ על קובץ, פתח מחברת, בחר את הקובץ, הפעל את הקוד) (איור 9).
    3. ייצוא נתונים מעובדים לניתוחים נוספים והערכה של הבדלים משמעותיים באמצעות מבחנים סטטיסטיים.

figure-protocol-8
איור 8: היסטוגרמה של שכבת-על המשווה את העוצמה הממוצעת של תאים חיוביים ל-VIM. שכבת-על היסטוגרמה המשווה את העוצמה הממוצעת של תאי VIM בדגימות בריאות (H) בדגימות כחולות ופסוריאזיס (P) בכתום בתוך הדרמיס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-9
איור 9: אותות חיוביים כפולים בתרשים נקודות. הדגמה של עלילת נקודות עם צביעה כפולה שיכולה לעזור בהדמיה טובה יותר של אוכלוסיות חיוביות יחידות, חיוביות כפולות ושליליות כפולות. דוגמה זו מציגה את הצביעה הכפולה של CD90 ו-VIM בדרמיס של (A) עור בריא ו-(B) פסוריאזיס, ובאפידרמיס של דגימות עור (C) בריא ו-(D) פסוריאזיס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר קודם, השתמשנו בהצלחה ב-SCAnED כדי לזהות ולכמת תאים ורמות ביטוי של ליזיל אוקסידאז (LOX), חלבון ציטופלזמי, וגורם השעתוק המעורר היפוקסיה 1 (HIF-1) בתאים בתוך הדרמיס של עור האדם12 , מה שמדגיש את הישימות של כלי זה לחקר העור.

כדי להעריך עוד יותר את הדיוק של מאקרו פילוח העור שלנו בזיהוי תאים וגרעינים בתאי האפידרמיס והעור, צבענו דגימות רקמת עור פסוריאזיס בריאה ומודלקת משובצת פרפין ב-DAPI ו-E-cadherin לפילוח גרעינים ואפידרמיס/דרמיס, בשילוב עם VIM ו-CD90 כסמנים מייצגים מעני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול SCAnED הוא שיטה אוטומטית למחצה לניתוח ספציפי לתא של תאים חיסוניים ולא חיסוניים ברקמת העור האנושית. זרימת העבודה משלבת פרוטוקול צביעה מבוסס E-cadherin כדי לאפשר סגמנטציה של אפידרמיס ודרמיס, זיהוי גרעינים ותאים מבוססי DAPI, ולאחר מכן כימות ביטוי הסמנים בגרעינים ובתאים באמצעות המאקרו מבוסס ImageJ שלנו. יתר על כן, אנו מדריכים את המשתמשים בניתוח זרימת העבודה שלנו ב-Python כדי לדמיין נתונים חד-תאיים שחולצו. הפרוטוקול גמיש ותומך בניתוח של עד חמישה סמני עניין שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של צינור ניתוח תמונה זה מומן על ידי Land Niederösterreich כחלק מאשכול מחקר האלרגיה של הדנובה ועל ידי Fellinger Krebsforschung.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.3% Triton X סיגמא-אלדריץ'T9284
BSA (אלבומין סרום בקר)סיגמא אולדריץ'
CD90איתות סלולריD3V8A
DAPI רוש10236276001
מים דה-יוניים
E-cadherin אבקאםab1416
מדיום הרכבה פלואורסצנטי דאקוS3023
נוגדן משני מוצלב IgG1 נגד עכבר עזים, Alexa Fluor 488  (AF 488 נגד עכברים)תרמו פישר סיינטיפיקA-21121
נוגדן משני מוצלב נגד עכבר IgG2a, Alexa Fluor 647 (AF 647 נגד עכברים)תרמו פישר סיינטיפיקA-21241
נוגדן משני מוצלב IgG (H+L) אנטי-ארנב עזים, Alexa Fluor 568 (AF 568 אנטי-ארנב)תרמו פישר סיינטיפיקA-11011
סרום עזים Agilent Technologies & Ouml; סטריייך GmbH, דאקוX0907
PBS גיבקו14190-094
Vimentin דאקוM7020
<חזק>חומרים
תיבת תא (קופסה רטובה)
Coverslips תרמו פישר
עט סימון דוחה נוזלים לצביעה (הידרופובי) דיידו סנגיוZ37782124x50 מ"מ
<חזקים>פתרונות
בופר חדירות (0.3% Triton X ב-PBS) עיין בטבלה 2
בופר צביעה (2% BSA ב-PBS) עיין בטבלה 2
<חזק>תוכנה ומערכי נתונים
מיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי  אולימפוסFV3000 מבוסס על IX83 הפוךמצויד במטרה 10x (NA 0.4), 4 קווי לייזר (405 מייל ימי, 488 מייל ימי, 561 מייל ימי, 640 מייל ימי, קוהרנט)
פיג'י (ImageJ) V1.54h
גוגל קולאבגוגל
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.פריזמה 10לניתוח סטטיסטי נוסף
הילהאינדיקה לאבס
תוכנת פייתוןפייתון 3.11.12
QuPathתוכנה פתוחה (Bankhead, P. ואחרים, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
סטארדיסטהתקנת גרסת מעבד TF1.15.0

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
  2. Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
  3. Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
  4. Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
  5. Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
  6. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  7. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
  8. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
  12. Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
  13. Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
  14. de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
  15. Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
  16. Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
  17. Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
  18. RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

StarDist

מאמרים קשורים