מאמר שיטה

שימוש במיקרופרפוזיה בזרימה פתוחה במוח לאיסוף אורך של נוזל בין-תאי במודל חייתי של גליובלסטומה

DOI:

10.3791/68748

⸱

23 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחיים החיים, תקשורת בין-תאית התומכת במחלות רבות במערכת העצבים המרכזית, כגון גליובלסטומה (GBM), ידועה כקשה מאוד למדידה ולאפיון. כאן, אנו מתארים פרוצדורות של מיקרופרפוזיה מוחית בזרימה פתוחה (cOFM) שניתן להשתמש בהם לדגימת רכיבי נוזל אינטרסטיציאלי במודל חייתי אורך של GBM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) מתבטאות ברשת תקשורת בין-תאית מורכבת ודינמית. גליובלסטומה (GBM), הגידול הראשוני הנפוץ והאגרסיבי ביותר, הוא סמל למורכבות זו, עם התקדמות מהירה ותחזית עגומה שנמדדות בחודשים במקום בשנים. הביולוגיה של GBM מונעת על ידי חילופי מולקולות איתות מורכבים בין תאים ניאופלסטיים לתאי סטרומל, הבסיס להתקדמות מחלה אגרסיבית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מיקרופרפוזיה מוחית פתוחה (cOFM) מפורט במודלים של עכברים GBM, המאפשר ניטור אורך בזמן אמת של דינמיקת מיקרוסביבת הגידול בתוך הנוזל הבין-תחומי (ISF). הגישה שלנו מתארת את השתלת ראשי קנולה מדריכה עמידים, את השימוש בהם להשתלת גליומה תוך-מוחית ישירות דרך המדריך, ואיסוף דגימות cOFM באיכות גבוהה לניתוחי LC-MS מטבולומיים ופרוטאומיים. חשוב לציין, cOFM מתגבר על מגבלות הגודל המולקולרי של מיקרודיאליזה מסורתית. מעבר ל-GBM, מתודולוגיית cOFM מבטיחה תובנות משנות חיים במגוון רחב של הפרעות מערכת העצבים המרכזית, כולל מצבים נוירודגנרטיביים, אפילפטיים ונוירופסיכיאטריים, באמצעות יכולתה לספק סמנים ביולוגיים אטיולוגיים ורגישים לטיפול בתוך המודלים החייתיים שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא אתגר ידוע בשל האיתות הבין-תאי המורכב והרב-מודאלי המתווך על ידי הנוזל הבין-תאי (ISF)1,2,3,4. מורכבות זו בולטת במיוחד בגידולי מוח, כגון גליובלסטומה (GBM), שבה אותות בין-תאיים מועברים בין תאי הניאופלסט והסטרומליים 5,6,7,8,9. במקרים רבים, ההחלפה החריגה של ביומולקולות מגוונות, כולל מטבוליטים ושליחים חלבונים, תורמת לאטיולוגיה הבסיסית של פתולוגיות מערכת העצבים המרכזית. אתגר מחקרי זה מחמיר, במיוחד ב-GBM, בשל העובדה שההרכב המולקולרי של ISF דינמי זמנית ומתפתח לאורך התקדמות המחלה וכן בתגובה לטיפולים התערבותיים10,11.

שיטות המחקר המסורתיות ל-GBM פרה-קליני כוללות מחקרים במבחנה ומודלים בעלי חיים חד-קצהיים. אופיין של גישות אלו מגביל את היישום הקליני הרחב שלהן בשל חוסר יכולתן ללכוד הן את מאפייני המיקרוסביבה של הגידול והן את השינויים הזמניים האורכיים. התקדמות שנעשתה בתחילת שנות ה-80 התגברה על מגבלות ההקשר הללו עם פיתוח מיקרודיאליזה תוך-מוחית (cMD)12,13,14,15. מאז היווסדה לפני 45 שנה, cMD התבססה כשיטה הסטנדרטית לדגימה אורכית של נוזל אינטרסטיציאלי (ISF)בתוך המוח החי. הדבר מושג באמצעות דיפוזיה חופשית והסעה של מומסי ISF בריכוז גבוה דרך ממברנה חדירה למחצה לפרפוזאט זורם ברציפות בריכוז נמוך ומומס, בדרך כלל נוזל מוח-שדרה מלאכותי (aCSF)17. ממברנות חדירות למחצה מורכבות מפולימרים ביו-תואמים שונים עם חיתוך גודל נקבוביות במשקל מולקולרי משותף הנע בין 20 kDa ל-3 MDa18. הליך זעיר-פולשני זה מאפשר איסוף אורכי-אורך במקום של מגוון רחב של אנליטים, החל ממולקולות קטנות כגון מטבוליטים או נוירוטרנסמיטרים, ועד לחלבונים גדולים כמו נוגדנים. עם זאת, הנקבוביות המבנית של ממברנות cMD יחד עם האופי הסופג של הפולימרים ההרכב שלהן יכולים להשפיע משמעותית על ההתאוששות היחסית של אנליטים בעלי מאפיינים ביוכימיים או ממדיים מסוימים, כגון ליפידים או נוגדנים, בהתאמה19,20.

ההתקדמות להתגברות על מגבלה זו של ממברנות cMD החלה בתחילת שנות ה-2010 עם פיתוח מיקרופרפוזיה מוחית בזרימה פתוחה (cOFM)21. פועל תחת עקרונות כלליים דומים ל-cMD, cOFM מסיר מגבלות ביוכימיות שמטילות ממברנות חדירות למחצה על ידי החלפתן בגלאי פלסטי-סריג עם פתחים מקרוסקופיים בעלי ספיחה נמוכה בגודל20 של כ-100 מיקרון. דיווחים רבים הראו את היעילות המשופרת של cOFM על פני cMD באמצעות איסוף רכיבים ניתנים לזיהוי של ISF, כולל הורמוני פפטידים, ננוגופנים/נוגדנים, טיפולים ליפופיליים קטנים וליפוזומים PEGylated 19,22,23,24,25. דוחות קודמים שבחנו את תגובת הרקמה הפיזיולוגית להשתלת גלאי cOFM מראים כי שלמות מחסום הדם-מוח מתחדשת עד 15 ימים לאחר ההשתלה, וכי לא נוצרים צלקות גליאליות עד 30 יום לאחרההשתלה 26. עקב החלפת ממברנות המיקרודיאליזה בפתחים מקרוסקופיים, החוקרים הראו גם את היכולת החדשנית של גלאי cOFM להקל על הזרקת תאי גליומה שנקלטו למוחם של חולדות חסרות חיסון, כך שהשתלת גידול א-טראומטית וגדילה מתרחשת ישירות סביב אזור הדגימהcOFM 27.

שיקולים בשימוש ב-cOFM בחקר פתולוגיות מערכת העצבים המרכזית חייבים עדיין להכיר במגבלות המתודולוגיות שלו. עקב התלות שלו בדיפוזיה פסיבית ובהסעה של אנליטי ISF לפרפוזאט זורם, מגבלות אלו סובבות סביב ריכוז האנליט ונפח הדגימה18. רכיבי ISF שנדגמו ידוללו בתוך הפרפוזאט cOFM שנאסף בהשוואה לרמות אנדוגניות, מה שהוביל מחקרים רבים להשוות יחסי אנליטים יחסיים בין תנאי הניסוי28. קצבי זרימה טיפוסיים נעים בין 0.1 מיקרוליטר לדקה עד 1.0 מיקרוליטר/דקה, המקבילים רק ל-6 מיקרוליטר/שעה עד 60 מיקרוליטר/שעה. כאשר מתחשבים בזמני מרווח של צינורות, יש לקחת בחשבון גם את משך הדגימה הכולל. זה חשוב במיוחד בעת ביצוע איסוף cOFM בבעלי חיים מורדמים, שם יש לטפל בזהירות בדאגויות רווחת בעלי החיים. תיאור מפורט יותר של שיקולים אלו ואחרים זמין בדו"ח שיטות קודם של צוות הפיתוח cOFM29.

במאמר זה אנו מספקים פרוטוקול מעודכן לשימוש בדגימת cOFM לאורך זמן בחקר מחלות נוירולוגיות, עם דגש על GBM. הפרוטוקול כולל שלבים להשתלת קנולה במדריך cOFM, הזרקת תאי גידול והשתלה דרך מדריך cOFM, וכן שתי תצורות דגימה של cOFM בבעלי חיים ערים ונעים בחופשיות. אנו מציגים נתונים מייצגים המדגימים השפעות טיפול על רכיבי ISF מטבולומיים ופרוטאומיים שנמדדו באמצעות cOFM, את השפעת תצורת הדגימה על ריכוזי האנליטים, ואת היעילות של השתלת תאי גידול מונחית cOFM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים במסגרת פרוטוקול זה מאושרים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) באוניברסיטת נורת'ווסטרן (מזהה פרוטוקול: IS00021383) ועוקבים לפי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). פרוטוקול זה פותח לשימוש בעכברי C57BL/6J, זכרים ונקבות, עם גיל מינימלי של 8-10 שבועות. קו תאי הגליומה של העכברים ששימש בפרוטוקול זה, CT2A, סופק על ידי מעבדת סייפריד באוניברסיטת בוסטון והוכן והוכן בהתאם לתנאי תרבית רקמה סטרילית.

1. תכנון והכנה לניתוחים

  1. מידע על בעלי חיים: לניסויי cOFM, השתמש בעכברים בני מינימום 8-10 שבועות כדי לאפשר גדילה והתפתחות מלאה. שתלים גולגולתיים במיקום קבוע עלולים להתנתק או לפגוע בצמיחה תקינה בגולגולת ו/או במוח שעדיין מתפתחים.
  2. בחירת קואורדינטות כירורגית: השתמשו באטלס מוח של בעלי חיים כדי לאתר את הקואורדינטות האורתוגונליות של אזור העניין ביחס לברגמה. לדוגמה, השתלות תאי גליומה מתבצעות בדרך כלל בסטריאטום כדי לשחזר בצורה הטובה ביותר מיקרוסביבות GBM טבעיות ולמקסם את יעילות התפתחות הגידולים בהמשך. קואורדינטות ההשרשה של cOFM המשמשות בפרוטוקול זה הן מדיאולטרלטרלית (ML) = 2.5 מ"מ, אנטרופוסטריור (AP) = 0 מ"מ, ודורסובונטרלית (DV) = 3.5 מ"מ.
    הערה: קואורדינטות הסטריאוטקטיות יכולות להשתנות בין זני עכבר לגילאים מסוימים. אנא השתמשו בקואורדינטות אטלס ספציפיות למין ולזן כדי להבטיח מיקום רצוי של מדריך cOFM.
  3. בחירת תצורות רכיבי cOFM מתאימות: הזמנת רכיבים לקונפיגורציות cOFM מתאימות באורכים כוללים ספציפיים הנעים בין 2 מ"מ ל-22 מ"מ, עם אורכי שטח פתוחים של 1 מ"מ עד 2 מ"מ.
    הערה: בעלי חיים עלולים לשחרר ראשי מדריך cOFM שהושתלו בצורה לא נכונה בזמן ביצוע התנהגויות טיפוח. כדי למזער את המנוף המכני על מתקן הראש במהלך פעילות זו, אנו ממליצים להשתמש במדריכים שאינם ארוכים מ-2 עד 3 מ"מ מהמרחק המיועד של DV.
  4. תכנון נקודות זמן לניתוחים ולפרוצדורות דגימה למטרות ניסוי: בהתאם למחלה הנדרשת ולמאפייני המודל, תכננו בקפידה את התזמון והסדר של הליכים הקשורים ל-cOFM כדי לחקור בצורה מיטבית את הביולוגיה הבסיסית הנדונה.
    1. אם חוקרים הבדלים בהרכב ISF בין מיקרוסביבות מוח בריאות למיקרו-סביבות גידול, יש לבצע הליכי דגימת cOFM לפני ואחרי השתלת הגידול באותו בעל חיים.
    2. אם חוקרים את השפעות ההתערבויות הקליניות על פתולוגיות מערכת העצבים המרכזית, יש לבצע הליכי דגימה של cOFM לפני ואחרי מתן בקבוצות חיות מקבילות המקבלות טיפול ביקורתי או ניסוי.

2. ניתוח מיקום מדריך cOFM

  1. הרכיבו כלים כירורגיים לניתוח מיקום מדריך cOFM ( טבלת החומרים) ועקרו באמצעות אוטוקלאב במידת הצורך.
  2. הכנה למקום עבודה כירורגי:
    1. חיטא ארון בטיחות ביולוגית: בצע הליכים כירורגיים בתוך ארון ביו-בטיחות מחוטא כראוי. הפעל את זרימת האוויר בארון הבטיחות הביולוגית ונק את המשטחים הפנימיים בשיטת חיטוי וניגוב מאושרת על ידי מוסד. רפד את המשטח התחתון של הארון בוילונות סטריליים.
    2. הכינו כלים סטריאוטקטיים: נקו את מסגרת הסטריאוטקטיקה עם חומר חיטוי והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית. באופן דומה, נקה וחטא את מחזיק המקדחה והמדריך המותקן על הסטריוטקטיקה והנח אותו בארון הבטיחות הביולוגית.
    3. כרית חימום בשלב הניתוח: השתמשו בכרית חימום בשלב הכירורגי הסטריוטקטי כדי לספק חום משלים בזמן שהבעל חיים מורדם. נקה וחטא את משטח כרית החימום והניח אותו על המסגרת הסטריאוטקטית שבה תושב החיה. הדליקו את כרית החימום לחום נמוך והניחו 1-2 וילונות סטריליים מעל.
    4. הניחו כלים וציוד ניתוחי נוספים: הניחו באופן אספטי ציוד סטרילי נוסף בארון הבטיחות הביולוגית.
    5. הגדרת כלוב התאוששות: הנח כלוב התאוששות נקי על כרית חימום ומכוון לטמפרטורה הנמוכה ביותר האפשרית. כל בעל חיים יצטרך להיות מאוחסן בכלוב התאוששות נפרד עד שהחיה תתאושש לחלוטין, ולכן מספר הכלובים הכולל תלוי בביצועי הניתוח ובזמני ההחלמה.
  3. הכנות לבעלי חיים לפני ניתוח (מסוכם באיור 1A):
    1. הרדמה: מתן תרכובות ומינונים של הרדמה שאושרו על ידי מוסדות להשגת עומק ההרדמה המתאים, באמצעות בדיקת רפלקס צביטת כף הרגל וכן עומק/קצב נשימתי להבטחת הרדמה מספקת. לדוגמה, הזרקה תוך-פריטונית של קטמין - קוקטייל קסילאזין (100 מ"ג/ק"ג - 10 מ"ג/ק"ג, במי מלח) מספיקה להשגת עומק הרדמה מתאים לעכברי C57BL/6J.
    2. הקלה בכאבים: מתן תרכובות משככות כאבים שאושרו על ידי מוסדות לסיוע בניהול כאב סביב ואחרי הניתוח. לדוגמה, הזרקה תת-עורית של מלוקסיקאם (20 מ"ג/ק"ג, במי מלח) מתאימה לניהול כאב סביב הניתוח.
    3. הסרת שיער (גילוח, קרם להסרת שיער): הסרת שיער מאתר הניתוח המיועד מעל הגולגולת באמצעות מכונת גילוח חשמלית ו/או קרם הסרת שיער. אם משתמשים בקרם הסרת שיער, ודאו שהוא לא נשאר על העור זמן רב מדי כדי למנוע גירוי.
    4. משחת עיניים: השתמשו באפליקציה סטרילית עם קצה כותנה כדי למרוח בעדינות משחה עינית על שתי העיניים ולמנוע ייבוש בקרנית במהלך הניתוח.
    5. מיקום בעל החיים במסגרת סטריאוטקטי: מניחים את החיה נכון במסגרת הסטריאוטקטית על ידי הכנסת חותכות לבלוק הנשיכה, הכנסת מוטות אוזניים בחוזקה אך בעדינות לתעלות האוזן, וחיבור מהדק האף מעל עצם האף של החיה ( איור 1B). אם ממוקמת נכון, גולגולת החיה צריכה להיות מוצמדת היטב ללא תנועה.
    6. הכנות לאתר ניתוח אספטי: נגבו את העור סביב אזור הניתוח עם שלוש דגימות אלכוהול (אתיל או איזופרופיל-) ופובידון יוד לסירוגין כדי לחטא את האזור לצורך חיתוך.
  4. חתך והכנת פני הגולגולת:
    הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע בצורה אטירית ככל האפשר. לשם כך, המנתח הראשי של בעלי החיים צריך ללבוש כפפות כירורגיות סטריליות מעל כפפות מעבדה סטנדרטיות לפני המשך לחתך.
    1. מיקום ואורך החתך: השתמשו בסקלפל סטרילי כדי ליצור חתך סגיטלי במרכז לאורך פני הגולגולת, החל בין העיניים וממשיך בזנב 8-10 מ"מ ( איור 1C).
    2. התכווצות העור: השתמשו במלקחיים סטריליים, מאפליקטורים עם קצה כותנה, ו/או להב סכין כדי למשוך את העור מהחתך האמצעי לרוחב. ודא שגם ברגמה וגם למבדה נראים והאריך את החתך אם לא.
    3. חתך פריוסטאום: השתמש בסכין סטרילית ליצירת חתך לפריאוסטאום ולמשוך את הרקמה לרוחב באמצעות מלקחיים.
    4. מטוש מי חמצן: נקה את פני הגולגולת עם מי חמצן מדולל של 1%-3% עם אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה ( איור 1D). דבר זה גם מסייע בזיהוי ברגמה ולמבדה דרך התפרים הגולגולתיים הסגיטליים, הקורונליים והלמדואידים.
    5. דבק דנטלי עם חריטה עצמית: השתמש במזרק אינסולין של 0.3 מ"ל עד 1.0 מ"ל כדי להניח באופן אחיד 20-40 מיקרו ליטר של דבק דנטלי עם חריטה עצמית על פני הגולגולת ( איור 1D). מרחו מנורת ריפוי דנטלית כדי לסייע בחריטה. לאחר ההתייבשות, השתמשו במאפליקטורים עם קצה כותנה סטרילי ובמלח כדי לנגב את עודפי הדבק.
      אזהרה: דבקים דנטליים עם חריטת עצמית, כגון Bond Force, הם חומרים מסוכנים פוטנציאליים: סיכון דליק (GHS02: H225), סיכון בריאותי (GHS07 ו-GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336), וסיכון סביבתי (GHS09: H412). אנא פעלו לפי ההנחיות המקומיות והמוסדיות לטיפול נכון בפסולת מסוכנת.
  5. איתור וקידוח חורי בור:
    1. הכנס מקדח 0.7 מ"מ מחוטא למקדחה והתקן את המקדחה במסגרת הסטריאוטקטית עם המחזיק המתאים.
    2. מקמו את הברגמה בצומת התפרים הסגיטליים והקורונליים והשתמשו במיקרומניפולטורים סטריאוטקטיים כדי למקם את מקדח הקידוח שם.
    3. הזזת מקדח לקואורדינטת המדריך cOFM (ML = 2.5, AP = 0.0), הפעלת המקדח ל-15,000 סל"ד, וקדח בזהירות חור לבר על ידי כוונון לוח המיקרומניפולטור DV (איור 1E). בצע תצפיות תכופות על עובי הגולגולת בזמן הקידוח כדי למנוע נזק למוח התחתון. השתמש במי מלח פיזיולוגיים במהלך הקידוח כדי לשטוף שאריות עצם ולהפחית חום בין מקדח הקידוח לגולגולת.
    4. חזרה על הליך הקידוח עבור כל קואורדינטת בורג עוגן (איור 1E). מיקומי ברגי העיגון המומלצים הם ML = 2.5, AP = -2.5, ו-ML = -2.5, AP = -2.5.
    5. לאחר שקידוח חורי הבר, נתק את המיקרו-מקדחה ומחזיק המקדחה מהמסגרת הסטריאוטקטית.
    6. השתמש במחט של 30 גרם כדי לנקב בעדינות את הדורה מטר מתחת לחור המדריך של cOFM.
  6. התקן ברגי עיגון באמצעות זוג מלקחיים סטריליים ומברג סטרילי בגודל מתאים (איור 1F). בהתאם לגובה ההברגה של הברג, העיגון מספיק כאשר הברג מוכנס לעומק של אורך הברג עד שניים. היזהר לא לדחוף ברגים עמוקים מדי כדי למנוע נזק לקורטקס.
  7. התקן את מדריך ה-cOFM ואת מכלול הדמה של ה-cOFM בתוך מחזיק המדריך ומחזיק ההרכבה למסגרת הסטריוטקטי. מקם את קצה המדריך cOFM מעל חור הבור (ML = 2.5 מ"מ, AP = 0.0 מ"מ) בגובה DV השווה לזה של ברגמה, וירדו לאט את מדריך ה-cOFM דרך חור הקיץ לעומק שנקבע מראש בקצב של 1 מ"מ/דקה ( איור 1F). לדוגמה, עומק מיקום מדריך cOFM עם השתלת תאי הגידול המיועדים לאחר מכן הוא DV = -3.5 מ"מ.
  8. מרחו חומר דבק על פני הגולגולת, ודאו שהיא מכסה את האזורים מתחת וסביב מדריך ה-cOFM וברגי העיגון בשכבה דקה ואחידה. השתמשו באור ריפוי דנטלי כדי להקשיח כל שכבת חומר דבק לפני יישום השכבות הבאות ( איור 1G). המשיכו למרוח חומר דבק עד שמשטח הגולגולת בין כל רכיב מכוסה, הברגים מכוסים לחלוטין, והאזור מתחת למדריך cOFM עד וסביב החריץ מכוסה. היזהר לא להניח את חומר ההצמדה על או ליד הטריז הנעיל.
    אזהרה: חומרי מלט, כגון Tetric EvoFlow, הם חומרים מסוכנים פוטנציאליים: סיכון בריאותי (GHS07: H317, H319, H335, H360). אנא פעלו לפי ההנחיות המקומיות והמוסדיות לטיפול נכון בפסולת מסוכנת.
  9. נתק את מחזיק המדריך מהמדריך cOFM והרים לאט את מחזיק המדריך עם כפתור הכוונון של המיקרומניפולטור. הסר את המיקרומניפולטור מהמסגרת הסטריוטקטית.
  10. נתק את החיה מהמסגרת הסטריוטקטית על ידי שחרור והסרת מוטות האוזניים, שחרור ומשיכת מהדק האף, ואז הרמת החותכות של החיה מבלוק הנשיכה.
  11. עור התפרים נסגר מעל חומר הדבקת השיניים, כדי להבטיח שגוף המדריך של cOFM יישאר חשוף. מומלץ לתפרים 4-0 נספגים, כגון חומצה פוליגליקולית (PGA) או פוליגלקטין (ויקריל), (איור 1H).
  12. מרחו משחה אנטיביוטית משולשת על אזור העור הסמוך לחתך המקורי.
  13. שיקום ותמיכה בבעלי חיים:
    1. העבר את החיה לכלוב התאוששות מבודד (חיה אחת לכל כלוב) וספק חום נוסף מכרית חימום שמונעת על נמוך.
    2. אופציונלי: ספק לחיה חומר הרדמה כדי לזרז את ההחלמה. לדוגמה, הזרקות תת-עוריות של אטיפמזול (1 מ"ג/ק"ג, בתמי מלח פיזיולוגיים) יאיצו את זמני ההתאוששות מההרדמה מכ-שעה לכ-20 דקות.
    3. לספק תצפית ותמיכה מתמשכת עד שהחיה תתעורר מספיק ותשכיב את עצם החזה. אין להשאיר בעלי חיים ללא השגחה עד שהחלימו לחלוטין מהניתוח וההרדמה.
    4. לאחר שהחיה החלימה לחלוטין, ניתן להחזירו לכלובים משותפים עם בעלי חיים אחרים.
    5. יום לאחר הניתוח, יש לספק תמיכה נוספת למשכך כאבים על ידי מתן משכך כאבים מאושר על ידי המוסד, כגון מלוקסיקאם (ראו שלב 2.3.2).
  14. יש לאפשר זמן החלמה של 14 ימים לאחר ניתוח ההשתלה במדריך cOFM כדי לאפשר ריפוי מלא של מחסום הדם-מוח לפני ביצוע הליכים נוספים על בעלי החיים.

3. השתלת תאי גידול תוך-גולגולתיים באמצעות מדריך cOFM

  1. תרבית תאים והכנה:
    1. תרב והרחיב תאים בהתאם לפרוטוקולים ספציפיים לסוג התא. לדוגמה, תאי גליומה סינגניים של עכברים כמו CT2A יכולים לגדול בצלחות בגודל 10 ס"מ או בבקבוקי T-75 המכילים DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. הכינו תאים מתורבתים להשתלה בהתאם לפרוטוקולים ספציפיים לסוג התא.
      1. לדוגמה, עם תאי גליומה סינגניים מסוג CT2A, יש להסיר את מדיום הגידול, לשטוף בקצרה עם PBS, ולדגור תאים למשך 5 דקות ב-0.05% טריפסין (עם 0.53 מ"מ EDTA) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      2. נטרל טריפסין בנפח שווה של 1% DEMM המכיל FBS, העבר תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לתאי פלט.
      3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא ב-1 מ"ל של PBS (או סליין פיזיולוגי). קבעו את סך כל התאים למ"ל באמצעות המוסיטומטר ידני או אוטומטי. צנטריפוגה שוב את תליית התא ב-300 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנאנט, והשלים מחדש בנפח מתאים של PBS (או מלח) כדי להגיע ל-50,000 תאים למיקרוליטר. הנח את תליית התא על הקרח עד למוכן להשתלה (שלב 3.5.2).
  2. הרכיבו כלים כירורגיים לניתוח השתלת תאי גידול תוך-גולגולתיים (טבלת חומרים) ועיקור באמצעות אוטוקלב במידת הצורך.
  3. הכנת סביבת עבודה כירורגית
    1. חיטוי ארון בטיחות ביולוגית: ראו שלב 2.2.1.
    2. הכינו מכשירים סטריאוטקטיים: נקו את המסגרת הסטריאוטקטית עם חומרי חיטוי והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית. באופן דומה, נקה וחטא את מחזיק המזרק המותקן על הסטריוטקטיקה וחבר אותו למסגרת הסטריאוטקטיקה.
    3. בצע שלבים 2.2.3.-2.2.5. לשאר השלבים המקדימים.
  4. הכנות לבעלי חיים לפני ניתוח:
    1. בצע שלבים 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4., ו-2.3.5. להכנת בעלי חיים.
  5. השתלת תאי גידול:
    1. הרכבה של הזרקה והכנסת עירוי (מסוכם באיור 2)
      1. השרה מחברי צינורות עם שפת ב-70% אתנול למשך לפחות 5 דקות.
      2. הכנס את קצה מזרק זכוכית אטום גז של 10 מיקרוליטר או 25 מיקרוליטר לקצה אחד של מחבר צינורות עם שפתיים.
      3. הניחו את פתח ההזלפה של cOFM בקצה השני של מחבר הצינור.
      4. מקבע את מכלול ההכנסת המזרק לתוך מחזיק המזרקים המותקן סטריאוטקטי.
    2. טעין את מכלול ההכנסת המזרק-אינפוזיציה בנפח מתאים של תליית תא. לדוגמה, טעינת 3 מיקרוליטר של תליית תא ב-50,000 תאים למיקרוליטר, להזרקה כוללת של 150,000 תאים לכל בעל חיים.
    3. החלפת הכנסת דמה בהחדרת עירוי:
      1. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הטריז הננעל ממדריך ה-cOFM ומהמכלול הבובה, ואז להרים בעדינות את בובת ה-cOFM מהמדריך.
      2. השתמש בכפתורי ההתאמה של ML ו-AP על המיקרומניפולטור כדי לתמרן את מכלול ההכנסת המזרק מעל מדריך cOFM. השתמשו בכפתור הכוונון של DV כדי להוריד בזהירות את האינפוזיציה לתוך מדריך ה-cOFM ולקבע אותה במקומו על ידי הכנסת הטריז הנעילה בחוזקה עם מלקחיים.
    4. הזרקו 3 מיקרוליטר של השענת תא מהמזרקה בקצב של 1 מיקרוליטר לדקה. יש להתבונן בזהירות באזור סביב מדריך ה-cOFM והכנסת העירוי כדי לוודא שאין תליית תא שיוצא מהמרכב. לאחר שהנפח כולו הוזרק, המתינו דקה נוספת עד שהלחץ התוך-גולגולתי יתאזן.
    5. החליפו את האינסרטיה בתוספת דמה.
      1. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הטריז הנעול ממדריך ה-cOFM וממערכת האינפוזיה, ואז כווננו בעדינות את כפתור כוונון ה-DV של המיקרומניפולטור כדי להרים את הכנסת ה-cOFM מהמדריך.
      2. החזר את בובת ה-cOFM לתוך המדריך וקבע אותה למקומה על ידי הכנסת הטריז המנעול עם מלקחיים.
  6. נתק את החיה מהמסגרת הסטריוטקטית על ידי שחרור והסרת מוטות האוזניים, שחרור ומשיכת מהדק האף, ואז הרמת החותכות של החיה מבלוק הנשיכה.
  7. שיקום ותמיכה בבעלי חיים:
    1. העבר את החיה לכלוב התאוששות מבודד (חיה אחת לכל כלוב) וספק חום נוסף מכרית חימום שמונעת על נמוך.
    2. אופציונלי: לספק לבעל החיים חומר הרדמה (כגון אטיפמזול) כדי להאיץ את משך ההחלמה, ראו שלב 2.13.2.
    3. לספק תצפית ותמיכה מתמשכת עד שהחיה תתעורר מספיק ותשכיב את עצם החזה. אין להשאיר בעלי חיים ללא השגחה עד שהחלימו לחלוטין מהניתוח וההרדמה.
    4. לאחר שהחיה החלימה לחלוטין, ניתן להחזירו לכלובים משותפים יחד עם בעלי חיים אחרים.
    5. ביום שלאחר הניתוח, יש לספק תמיכה נוספת במשכך כאבים על ידי מתן משכך כאבים מאושר על ידי המוסד, כגון מלוקסיקום (ראו שלב 2.3.2).
      הערה: אם משתמשים בקווי תאים חיוביים ללוסיפראז, ניתן לבצע הדמיה ביולומינצנטית (BLI) שבוע-שבועיים לאחר השתלת התאים כדי לאמת את הצלחת ההשתלה בגידול. בעוד שמאפיינים פיזיים כמו פרווה של בעלי חיים או נוכחות על ראש יכולים להפריע לזוהר מזוהה, ניתן עדיין להשתמש בהם להערכות גסות של נוכחות או היעדרות גידול. חלופה נוספת היא לבצע MRI אם ברגי העיגון ששימשו במיקום מדריך cOFM אינם תואמים לפרומגנטיים ותואמים ל-MRI.

4. דגימת cOFM של נוזל בין-רקעי מוחי

הערה: בהתחשב בהסתמכות על דיפוזיה פסיבית של אנליטים, דגימות cOFM מכילות ריכוזי אנליטים מדוללים בהשוואה לסביבה האנדוגנית של ISF. בשל כך, הוצעו בעבר מספר שיטות לכיול מדידות הדגימה כך שישקפו טוב יותר את ריכוזי ה-18 במקום. סעיף זה מתאר שתי שיטות דגימה שונות. שלב 4.1. מתאר את מצב הקונפיגורציה המומלץ על ידי היצרן (ומכאן נקרא מפורק) שמציע רגישות זמנית גבוהה יותר, אך על חשבון ריכוז האנליטים. שלב 4.2. מפרט שיטת קונפיגורציה חלופית שפיתחנו (ומכאן נקרא recirculated) שיכולה להשיג ריכוז אנליטים גבוה יותר במחיר של ירידה ברזולוציה הזמנית.

  1. דגימת cOFM מפוצלת (מסוכם באיור 3A):
    1. השרתו את מחברי הצינורות עם שפת ב-70% אתנול למשך לפחות 5 דקות כדי להקל על החיבור לצינורות ולתוספות דגימה.
    2. טען את שקית הפרפוזאט עם מספיק פרפוזאט aCSF. לדוגמה, 680 מיקרוליטר מספיק מינימלית גם לשטף קו של 20 דקות ב-10 מיקרוליטר/דקה וגם לדגימה של 8 שעות ב-1 מיקרוליטר/דקה. עם זאת, מומלץ לנפח מינימלי של 2 מ"ל כדי למנוע קריסת שקית פרפוזאט ותקלה בתפקוד.
    3. מלא מראש את שני קווי הצינור בדחיפה ומשיכה בנפח מתאים של aCSF באמצעות מזרקים מזכוכית אטומים. לדוגמה, צינור Universal Push-Pull Low-Bind בקוטר פנימי של 0.25 מ"מ ואורך הצינורות הבודדים הוא 100 ס"מ. זה שווה ערך לכ-1 מיקרוליטר ל-2 ס"מ, ולכן כ-55 מיקרו-ליטר בצינור הדחיפה וכ-100 מיקרו-ליטר בצינור המשיכה.
    4. התקן נכון את החלק הפריסטלטי של הצינור בראש המשאבה של משאבת המיקרופרפוזיה כפי שמוצג באיור 3A.
      הערה: עיין במדריך ההוראות BASi להוראות נוספות במידת הצורך.
    5. חבר את שקית הפרפוסייט לחלק הדחיפה של הצינור באמצעות מחבר Luer Lock (איור 3A, רכיב i).
    6. חבר את הכנסת הדגימה לקווי הצינורות באמצעות מחברי צינורות עם שפתיים. פתח הכניסה לדגימה (אורך ציר ארוך יותר) צריך להיות מחובר לקצה היציאה של צינור הדחיפה, מול קו צינור שקית הפרפוזאט (איור 3A, למעלה משמאל). יציאת הכנסת הדגימה (הציר הקצר יותר) צריכה להיות מחוברת לקצה הכניסה של צינור המשיכה, במקביל לקו צינור שקית הפרפוסייט (איור 3A, למעלה מימין). הניחו את הכנסת הדגימה המחוברת לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי המכיל 750 מיקרוליטר של aCSF כהכנה לשטיפה של המערכת.
    7. חבר את מחט אספן השברים עם מחבר צינור עם שפת לקו היציאה של צינור המשיכה (הקצה הנגדי ליציאת הכנסת הדגימה).
    8. בצע מערכת צינורות עם שטיפה למשך 20 דקות במהירות של 10 מיקרוליטר/דקה כדי להסיר בועות גז כלואות בתוך מערכת הצינור.
    9. הגדרת איסוף שברים:
      1. תייגו ומשקללו צינורות איסוף שברים, תוך הערות לכל משקל להשוואה ואימות של נפח הדגימה שנאסף. הנח צינורות בחריצים המתאימים של קרוסלת אספן השברים.
      2. הפעל את אוסף השברים והגדר את ההגדרות לערכים הרצויים. דוגמאות להגדרות כוללות # של דגימות, זמן דגימה (m), עיכוב (שעות), קירור ריפיגור ומצב _cannula.
        הערה: השלכת נפח נוזל בחלל מת בצינור המשיכה שמעולם לא נגע ב-ISF אורטופי משוערת על ידי i) אורך ונפח הצינור (כ-2 ס"מ/μL עבור OFM-PP2-100-LB), ii) קצב זרימה, ו-iii) עיכוב (שעות). פרמטרים אלו צריכים להילקח בחשבון בקפידה בעת הקמת מערכת הגבייה כדי להבטיח איסוף חלקי תקין.
  2. דגימת cOFM ממוחזרת (מסוכם באיור 3B):
    1. השרה את מחברי הצינורות עם שפת ב-70% אתנול כדי להקל על החיבור לצינורות ולתוספות דגימה.
    2. מילוי מראש קו משיכת צינור בנפח מתאים של aCSF באמצעות מזרקי זכוכית אטומים.
    3. התקן נכון את החלק הפריסטלטי של הצינור בראש המשאבה של משאבת המיקרופרפוזיה.
    4. חבר את הכנסת הדגימה לקווי הצינורות באמצעות מחברי צינורות עם שפתיים. פתח הדגימה (אורך הציר הארוך יותר) צריך להיות מחובר לקצה היציאה של צינור המשיכה. יציאת הכנסת הדגימה (ציר קצר יותר) צריכה להיות מחוברת לקצה הכניסה של צינור המשיכה. הניחו את הכנסת הדגימה המחוברת לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי המכיל 750 מיקרוליטר של aCSF כהכנה לשטיפה של המערכת.
    5. בצע מערכת צינורות עם שטיפה למשך 20 דקות במהירות של 10 מיקרוליטר/דקה כדי להסיר בועות גז כלואות בתוך מערכת הצינור.
  3. מערכת כלוב מסתובב:
    הערה: מערכות כלוב מסתובבות של בעלי חיים, כמו מערכת Raturn, מקלות על דגימת cOFM של בעלי חיים ערים על ידי מניעת קפיצות יתר והסתבכות של צינור הדחיפה והמשיכה. דבר זה יכול גם לסייע באוטומציה של דגימת cOFM על ידי ביטול הצורך בפירוק ידני של צינורות במהלך סשנים של איסוף cOFM ערים.
    1. פרש מצעי כלוב נקיים באופן אחיד על רצפת הכלוב המסתובבת וצייד את הכלוב במקורות מזון ומים נגישים בקלות.
    2. הפעל את בקר סיבוב הכלוב ובדק את פעילותו על ידי סיבוב החבל התלוי. הכלוב צריך להסתובב נגד ביחס לכיוון הסיבוב שמוענק על החבל. הגדר את בקר הסיבוב למצב המתנה עד שהחיה מחוברת לחבל.
  4. חיבור בעל חיים למערכת cOFM:
    הערה: חיבור וניתוק בעלי חיים למערכת cOFM מתבצעים בקלות רבה ביותר כאשר החיה תחת הרדמה איזופלורנית זמנית. אם מתבצע נכון, התהליך אורך לא יותר מ-5 דקות לכל בעל חיים; עם זאת, מומלץ מאוד להשתמש במשחת עיניים.
    1. הרדמה של בעלי חיים: הכניסו את החיה לתא ההרדמה האיזופלורן. התחל הרדמה עם זרימת חמצן ב-2 ליטר לדקה ואיזופלוראן מוגדר ל-3%. התבונן בבעל החיים עד שהוא מגיע לרמת הרדמה מתאימה (לא נייד עם קצב נשימה של כ-1 נשימה לשנייה). העבר את בעל החיים מתא ההשראה למסכת ההרדמה שמוגדרת על זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה ו-3% איזופלורן.
    2. מעיל חיה: מניחים את החיה במעיל בגודל מתאים, מושכים את הגפיים הקדמיות לחלוטין דרך חורי הזרוע ומחברים את המעיל היטב לאורך גב החיה (מוצג באיור 3C).
    3. החלפת הכנסת דמה בתוספת דגימה: השתמשו בזוג מלקחיים כדי להסיר את הטריז הננעל מהמדריך ומהרכב הבובה ולהרים בזהירות את הבובה החוצה מהמדריך. התקן בעדינות את הסמפלינג, הכניס אותו למדריך, ואז מכניס מחדש את הטריז הנעיל.
    4. הוציאו את החיה מההרדמה והניחו אותה במערכת הכלוב המסתובבת. חבר את כבל הכלוב למעיל החיה והפעיל את מערכת הכלוב המסתובבת.
  5. ביצוע דגימת cOFM:
    1. כוון את משאבות המיקרופרפוזיה ל-5 מיקרוליטר לדקה ובצע שטיפה של 2 דקות להסרת מיקרובועות שעשויות להיגרם מהתקנת ההכנסת לדגימת cOFM.
    2. שנה את הגדרות משאבת המיקרופרפוזיה לקצב הזרימה הרצוי למצב משאבה (למשל, 1 מיקרוליטר לדקה).
    3. הפעל מצב משאבה. אם מבצעים דגימת cOFM מפורקת, הפעל את אוסף השברים.
    4. בשלבים הראשונים של דגימת cOFM, יש לבצע תצפיות מדוקדקות על צינורות הדחיפה והמשיכה כדי להבטיח היעדר בועות גז, שכן הן יפגעו בתפקוד תקין של המכונה ובאיסוף הדגימות ועלולות לסכן את בעל החיים. אם נצפים בועות גז, עצור את רכיבי המערכת, נתק את בעל החיים ממערכת cOFM והסר בועות גז על ידי זרם aCSF דרך הצינור.
    5. במהלך תהליך הדגימה של ה-cOFM, יש לבצע תצפיות תכופות נוספות על צינורות ה-cOFM והתנהגות בעלי החיים. אם התנהגות בעלי חיים מעידה על שינויים בריאותיים פתאומיים, יש להפסיק מיד את רכיבי המערכת ולטפל בדאגה לבריאות בעלי החיים. יש להתייעץ עם צוות הווטרינר המוסדי במידת הצורך.
  6. ניתוק בעל חיים ממערכת cOFM:
    1. נטרל את מערכת הכלוב המסתובבת ונתק את כבל הכלוב ממעיל החיה.
    2. העבר את בעל החיים לתא ההרדמה האיזופלורני, כאשר צינור הדגימה וצינור ה-cOFM עדיין מחוברים. התחל הרדמה עם זרימת חמצן ב-2 ליטר לדקה ואיזופלוראן מוגדר ל-3%. התבונן בבעל החיים עד שהוא מגיע לרמת הרדמה מתאימה (לא נייד עם קצב נשימה של כ-1 נשימה לשנייה). העבר את החיה מתא ההשראה למסכת ההרדמה שמכוונת על זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה ו-3% איזופלוראן.
    3. החלף את הכנסת הדגימה בתוספת דמה: השתמש בזוג מלקחיים כדי להסיר את הטריז הנעול מהמדריך וממערכת ההכנסה, והרם בזהירות את הכנסת הדגימה מתוך המדריך. התקן בעדינות את הכנסת הדמה חזרה למדריך, ואז הכנס מחדש את הטריז הנעיל.
    4. הסרת הג'קט: הסרת המחברים מהצד האחורי של מעיל החיה והסרת המעיל בעדינות מהחיה.
    5. החלמה ותצפית על בעלי חיים: הוצאת בעל החיים מהרדמה איזופלורנית והכנסתם לכלוב החלמה נקי, תוך מתן תצפית מתמשכת עד שהחיה מתעוררת במלואה ושוכבת סטרנל. העברו אותו לכלוב ביתי לאחר שהחיה מתאוששת לחלוטין.
  7. איסוף ואחסון דגימות:
    1. דגימה מפוצלת:
      1. הסר צינורות איסוף שברים מאוסף השברים והניח על הקרח להובלה לטווח קצר.
      2. שקלו כל צינור איסוף והשוו למשקל שלפני האיסוף כדי לאמת את נפח הדגימה.
      3. המשך לניתוחים במורד הזרם של דגימות cOFM או הניחו אותן במקפיא בטמפרטורה של -80°C לאחסון ארוך טווח.
    2. דגימה ממוחזרת:
      1. השארתי את צינור המשיכה מחובר ליציאת ההכנסת הדגימה של cOFM (ציר קצר יותר), נתק משאר ההתקנה ומניח את הצינור והכנסת הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ונקי.
      2. חבר מחט סטרילית 18G למזרק סטרילי של 1 מ"ל עד 5 מ"ל ומלא באוויר.
      3. הכנס בזהירות את המחט למחבר הצינור עם השפה בקצה הכניסה של צינור המשיכה.
      4. כדי להבטיח שהכנסת הדגימה של cOFM נשארת בצינור המיקרוצנטריפוגה, לחצו על הבוכנה כדי להוציא את נפח הדגימה הממוחזר של cOFM מהצינור עם אוויר. ודא שכל דגימת ה-cOFM נפלטת מצינור המשיכה אל צינור המיקרוצנטריפוגה, תוך ניתוק המזרק וממלא מחדש באוויר במידת הצורך.
      5. הנח את דגימת ה-cOFM הממוחזרת על קרח להובלה קצרה טווח.
      6. המשיכו לניתוחים במורד הזרם או הניחו אותם במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C לאחסון ארוך טווח.
  8. אחסון אספקת cOFM אם חוזרים על דגימת cOFM באותו חיה:
    הערה: שימוש חוזר ב-cOFM חד-פעמיים, כגון תוספות דגימה וצינור כניסה/יציאה, אינו מומלץ על ידי היצרן.
    1. שטף את צינור הדחיפה-משיכה של cOFM בכ-500 מיקרוליטר של aCSF סטרילי או סליין, בקצב של לא יותר מ-10 מיקרוליטר/דקה. אחר כך עם שטיפה דומה של 1-2 מ"ל של 70% אתנול. לבסוף, השתמש במזרק של 5 או 10 מ"ל המצויד במחט 18G ומחבר צינורות עם שפת כדי לשטוף את הצינור החוצה באוויר.
    2. שטף את צינורות הכניסה והיציאה של תוספת הדגימה של cOFM עם 50 מיקרוליטר של נוזל נוזל סטרילי או מלח באמצעות מזרק זכוכית אטום המצויד במחבר צינורות עם שפתיים. לאחר מכן יש 50 מיקרוליטר של 70% אתנול. נתק את תוסף הדגימה של cOFM ממחבר הצינור ואחסן אותו בבקבוקון מלא ב-70% אתנול עד שהוא מוכן לשימוש חוזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדדים הערכתיים שונים לקביעת הצלחת הניסוי יכולים להתרחש בשלבים ביניים או מסתיימים בשלבי הניסוי, בהתאם לאופי הספציפי של הפתולוגיה הבסיסית ולמודל החקירה של בעלי החיים. לבדיקות בביולוגיה של GBM, ניתן להשתמש בהדמיה ביולוגית (BLI) כמדד הערכה ביניים ליעילות השרעת תאי גידול בהנחיית cOFM (איור 4A). עם זאת, זה משמש להערכות גידול דיכוטומיות פשוטות נוכחות או לא קיימות, בהתחשב בכך שהתכונות הפיזיקליות של תושבות ראש מושתלות יכולות להחליש את הבהירות שזוהה בעת השוואת גדלי גי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכי cOFM המתוארים בפרוטוקול זה מחזיקים בפוטנציאל לחולל מהפכה במחקר מחלות מערכת העצבים המרכזית באמצעות יכולתם לדגום רכיבים אנדוגניים לאורך זמן של ה-ISF של רקמות פתולוגיות. עם זאת, ההצלחה החקרית של יישום מתודולוגיה זו תלויה בביצוע נכון של מספר שלבים קריטיים. מתוכן, המיקום הנכון והבטוח של קנולה המדריך של cOFM הוא מהחשובים ביותר. הליכים כירורגיים או אסטרטגיות התקשרות לא נכונות עלולים להוביל לניתוק כל הראש ולנסיגת החיה ממחקרים נוספים. הפרעה של כל החיבור הראשי נובעת בדרך כלל מהתקנת בורג עיגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ 1R01NS096376, 1R01NS112856, ו-SPORE P50CA221747 לגישות תרגום לסרטן המוח (A.U.A.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מקדח 0.7 מ"מכלי המדע המדויק19008-07קידוח בור בור
מזרק 1 עד 5 מ"לBD#309646החזרת דגימת פרפוזאט ממוחזרת
מחט 18GBD#305195החזרת דגימת פרפוזאט ממוחזרת
מחט 30GBD אולטרה-פיין328438דורה מנקבת
תפרי ויקריל 4-0דינרקס9130סגירת ניתוח
מגבוני אלכוהולפישרברנד22-363-750חיטוי עור באתר הניתוח
ברגי עיגוןBASiMD-1310מיקום ראש cOFM
נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400דגימת ISF
תוספת בובה cOFMBASi (Joanneum)cOFM-D- #מיקום ראש cOFM
מדריך cOFMBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #מיקום ראש cOFM
מחזיק מדריך cOFMBASi (Joanneum)OFM-STM-1מיקום ראש cOFM
הכנסת עירוי cOFMBASi (Joanneum)cOFM-I- #הזרקת תאים
טריז נעילה של cOFMBASi (Joanneum)cOFM-LOCKמיקום ראש cOFM
הכנסת דגימת cOFMBASi (Joanneum)cOFM-S-Xדגימת ISF
אפליקטורים עם קצה כותנהפישרבריין22363160ספיגת נוזלים, יישום מי חמצן
קו תאי גליומה של עכבר CT2Aמעבדת סייפריד - אוניברסיטת בוסטוןNAתאי גידול מורכבים
חומר דבק דנטליIvoClar595953USמיקום ראש cOFM
אור ריפוי דנטליהנרי שיין5700253מיקום ראש cOFM
קרם הסרת שיערVeet3116875הסרת שיער באתר הניתוח
מכונת גילוח חשמליתוול קליפר קורפ. 8841הסרת שיער באתר הניתוח
מלקחיים עם קצה דקכלי המדע המדויק5SFחתך, מיקום בורג העוגן
מחברי צינורות עם שפתBASi (Joanneum)MD-1510הזרקת תאים
בקבוקי איסוף שבריםBASi (Joanneum)MF-5281אחסון דגימות מפוצל
מזרק זכוכית אטום (25 & mu; L)המילטון80465הזרקת תאים
מי חמצן (1-3%)וולגרינסNDC: 0363-0268-32ניקוי פני הגולגולת
מזרקי אינסולין (0.3 עד 1.0 מ"ל) עם מחטים של 31 גרםBD אולטרה-פיין328438מתן הרדמה ומשככי כאבים
צינורות מיקרוצנטריפוגהבאסיס02-682-002החזרת דגימת פרפוזאט ממוחזרת
מיקרודריל ומחזיק סטריאוטקטימנגנון הרווארד75-1874קידוח בור בור
ז'קט עכברלומירMJ 02חיבור בעלי חיים למערכת הכלוב המסתובב
צינורות OFM עם חיבור נמוךBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBדגימת ISF
OFM-Pump - משאבת מיקרופרפוזיהBASi (Joanneum)MPP102-PCדגימת ISF
משחה עיניתדקרה211-38שימון עיניים פרי-סוגריקלי
מחט דגימה מתכתית פסיביתיתBASi (Joanneum)MW-2310אחסון דגימות מפוצל
שקית פרפוזאטBASi (Joanneum)OFM-BAGדגימת ISF
תמיסת מלח פיזיולוגיתטיפול נמרץ רפואי  0990-7983-03ניקוי פני הגולגולת, סיוע בקידוח בור בור
מטושי פובידון-יודPDI HealthcareSKU B40600חיטוי עור באתר הניתוח
מחזיק הגשושסטולטינג51633
אוסף שברים מקוררBASi (Joanneum)MD-1201אחסון דגימות מפוצל
מערכת כלוב מסתובבBASi (Joanneum)AMD-R Raturnמגורים אוטומטיים לדגימת cOFM ערים
להבי סכין וידיותפישר סיינטיפיק  22079693חתך
מברגמיקום ראש cOFM
דבק דנטלי עם חריטה עצמית טוקויאמהפריימינג על פני הגולגולת לחומר הדבקה
פקק סיליקון לבקבוקי איסוףBASi (Joanneum)MF-5283אחסון דגימות מפוצל
מסגרת סטרוטקטיתסטולטינג51725

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorders with impaired neurofluid dynamics. Magn Reson Med Sci. 23 (1), 1-13 (2024).
  3. Matsumae, M., et al. Research into the physiology of cerebrospinal fluid reaches a new horizon: Intimate exchange between cerebrospinal fluid and interstitial fluid may contribute to maintenance of homeostasis in the central nervous system. Neurol Med Chir (Tokyo). 56 (7), 416-441 (2016).
  4. Filannino, F. M., Panaro, M. A., Benameur, T., Pizzolorusso, I., Porro, C. Extracellular vesicles in the central nervous system: A novel mechanism of neuronal cell communication. Int J Mol Sci. 25 (3), 1629(2024).
  5. Marcus, H. J., Carpenter, K. L., Price, S. J., Hutchinson, P. J. In vivo assessment of high-grade glioma biochemistry using microdialysis: A study of energy-related molecules, growth factors and cytokines. J Neurooncol. 97 (1), 11-23 (2010).
  6. De Ruiter Swain, J., Michalopoulou, E., Noch, E. K., Lukey, M. J., Van Aelst, L. Metabolic partitioning in the brain and its hijacking by glioblastoma. Genes Dev. 37 (15-16), 681-702 (2023).
  7. Teer, L., Yaddanapudi, K., Chen, J. Biophysical control of the glioblastoma immunosuppressive microenvironment: Opportunities for immunotherapy. Bioengineering (Basel). 11 (1), 93(2024).
  8. De Boeck, A., et al. Glioma-derived il-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression. Nat Commun. 11 (1), 4997(2020).
  9. Yeo, E. C. F., Brown, M. P., Gargett, T., Ebert, L. M. The role of cytokines and chemokines in shaping the immune microenvironment of glioblastoma: Implications for immunotherapy. Cells. 10 (3), 607(2021).
  10. Riviere-Cazaux, C., et al. Longitudinal glioma monitoring via cerebrospinal fluid cell-free DNA. Clin Cancer Res. 31 (5), 881-889 (2025).
  11. Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
  12. Lehmann, A., Isacsson, H., Hamberger, A. Effects of in vivo administration of kainic acid on the extracellular amino acid pool in the rabbit hippocampus. J Neurochem. 40 (5), 1314-1320 (1983).
  13. Sandberg, M., Lindstrom, S. Amino acids in the dorsal lateral geniculate nucleus of the cat--collection in vivo. J Neurosci Methods. 9 (1), 65-74 (1983).
  14. Tossman, U., et al. Brain amino acids measured by intracerebral dialysis in portacaval shunted rats. J Neurochem. 41 (4), 1046-1051 (1983).
  15. Zetterstrom, T., et al. Purine levels in the intact rat brain. Studies with an implanted perfused hollow fibre. Neurosci Lett. 29 (2), 111-115 (1982).
  16. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  17. Darvesh, A. S., et al. In vivo brain microdialysis: Advances in neuropsychopharmacology and drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (2), 109-127 (2011).
  18. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. Chapter 7 (Unit7), 1(2009).
  19. Altendorfer-Kroath, T., et al. Comparison of cerebral open flow microperfusion and microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances. J Neurosci Methods. 311, 394-401 (2019).
  20. Custers, M. L., et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 1178, 338803(2021).
  21. Birngruber, T., et al. Cerebral open flow microperfusion: A new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (12), 864-871 (2013).
  22. Kleinert, M., et al. Time-resolved hypothalamic open flow micro-perfusion reveals normal leptin transport across the blood-brain barrier in leptin resistant mice. Mol Metab. 13, 77-82 (2018).
  23. Le Prieult, F., Barini, E., Laplanche, L., Schlegel, K., Mezler, M. Collecting antibodies and large molecule biomarkers in mouse interstitial brain fluid: A comparison of microdialysis and cerebral open flow microperfusion. MAbs. 13 (1), 1918819(2021).
  24. Altendorfer-Kroath, T., et al. Quantification of the therapeutic antibody ocrelizumab in mouse brain interstitial fluid using cerebral open flow microperfusion and simultaneous monitoring of the blood-brain barrier integrity. Pharmaceutics. 15 (7), 1880(2023).
  25. Birngruber, T., et al. Enhanced doxorubicin delivery to the brain administered through glutathione pegylated liposomal doxorubicin (2b3-101) as compared with generic caelyx,((r))/doxil((r))--a cerebral open flow microperfusion pilot study. J Pharm Sci. 103 (7), 1945-1948 (2014).
  26. Birngruber, T., et al. Long-term implanted cOFM probe causes minimal tissue reaction in the brain. PLoS One. 9 (3), e90221(2014).
  27. Altendorfer-Kroath, T., et al. Atraumatic access to human glioblastoma in a xenograft animal model by cerebral open flow microperfusion. J Neurosci Methods. 393, 109893(2023).
  28. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 52(2021).
  29. Hummer, J., Altendorfer-Kroath, T., Birngruber, T. Cerebral open flow microperfusion to monitor drug transport across the blood-brain barrier. Curr Protoc Pharmacol. 85 (1), e60(2019).
  30. Sundheimer, J. K., et al. Experimental insights and recommendations for successfully performing cerebral microdialysis with hydrophobic drug candidates. Clin Transl Sci. 18 (5), e70226(2025).
  31. Altendorfer-Kroath, T., Hummer, J., Birngruber, T. In vivo monitoring of brain pharmacokinetics and pharmacodynamics with cerebral open flow microperfusion. Biopharm Drug Dispos. 44 (1), 84-93 (2023).
  32. Kreß, S., et al. Innovative platform for the advanced online monitoring of three-dimensional cells and tissue cultures. Cells. 11 (3), 412(2022).
  33. Bjorkli, C., et al. In vivo microdialysis in mice captures changes in alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers consistent with developing pathology. J Alzheimers Dis. 84 (4), 1781-1794 (2021).
  34. Gorska, A. M., et al. Evaluation of cerebrospinal fluid (csf) and interstitial fluid (isf) mouse proteomes for the validation and description of alzheimer's disease biomarkers. J Neurosci Methods. 411, 110239(2024).
  35. Pemmari, T., et al. Screening of homing and tissue-penetrating peptides by microdialysis and in vivo phage display. Life Sci Alliance. 8 (5), e202201490(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bioluminescent Imaging

מאמרים קשורים