הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעה ומנגנון של חומצה Tauroursodeoxycholic במרה של שועל כחול על פגיעה חריפה בכבד הקשורה לאלכוהול בעכברים

743 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68763

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  , 
1School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה העריך את ההשפעות המגנות על הכבד של מרה של שועל כחול על פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול בעכברים. מרה של שועל כחול, המכילה TUDCA, UDCA, בילירובין ו-TCDCA, הפחיתה את סמני הנזק לכבד ופעלה דרך מסלול AGE-RAGE, AKT1 ו-PPARG, והדגימה תכונות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון.

תקציר

מרה של בעלי חיים, כמו מרה של דובים, משמשת זה מכבר ברפואה המסורתית בשל היתרונות הטיפוליים שלה. מרה של שועל כחול, בדומה למרה של דובים, מאמינים בשיטות מסורתיות מסוימות כבעלת תכונות הגנה על הכבד. מחקר זה בדק את המרכיבים וההשפעות של מרה של שועל כחול על פגיעה בכבד הקשורה לאלכוהול בעכברים. המרה נאספה מ-30 שועלים כחולים ועובדה לאבקה מיובשת. ההרכב הכימי של מרה של שועל כחול נותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים וכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית יחד עם ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה מרובע. פרמקולוגיה של רשת שימשה לזיהוי תרכובות ביו-אקטיביות פוטנציאליות, מטרות ומסלולים הקשורים לפגיעה בכבד הקשורה לאלכוהול. מודל עכברי של פגיעה בכבד הקשורה לאלכוהול הוקם באמצעות עכברי קונמינג, שקיבלו אבקת מרה של שועל כחול במינונים נמוכים וגבוהים. נמדדו רמות אלנין אמינוטרנספראז בסרום, אספרטט אמינוטרנספראז ורמות הכולסטרול הכוללות. רקמות הכבד הוערכו על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין ובדיקת מלונדיאלדהיד. עגינה מולקולרית בוצעה כדי לחזות את זיקת הקישור בין תרכובות פעילות למטרות ליבה. מרה של שועל כחול נמצאה מכילה חומצה טאורוסודאוקסיכולית (TUDCA), חומצה אורסודאוקסיכולית, בילירובין וחומצה טאורוכנודאוקסיקולית. ניתוח היסטופתולוגי לא גילה חריגות משמעותיות או השפעות רעילות באיברים עיקריים לאחר מתן פומי של אבקת מרה של שועל כחול. מטרות הליבה של מרה של שועל כחול כללו חלבון AKT1, PPARG, IGF1, MMP9 ו-CASP3. טיפול במרה של שועל כחול הפחית את רמות ALT, AST, כולסטרול ו-MDA במודלים של עכברים של פגיעה בכבד הקשורה לאלכוהול. פרמקולוגיה של רשת ועגינה מולקולרית מצביעות על כך שההשפעות המגנות על הכבד של מרה של שועל כחול עשויות להיות קשורות לקולטן המוצר הסופי המתקדם של גליקציה למסלול איתות מתקדם של מוצר סופי גליקציה. בסך הכל, מרה של שועל כחול, עם תכולת TUDCA הדומה לזו של מרה של דובים, מכוונת לחלבונים כגון AKT1 ו-PPARG, ומדגימה השפעות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון פוטנציאליות בניהול פגיעה בכבד הקשורה לאלכוהול.

מבוא

מחלת כבד הקשורה לאלכוהול (ALD) מקיפה ספקטרום של פגיעות כבד החל מהפרעות מעבדה אסימפטומטיות ועד למחלת כבד מתקדמת עם שחמת, ובצורתה החמורה ביותר, מחלת כבד מסכנת חיים בשלב הסופי המלווה באי ספיקת איבריםמרובה 1. השכיחות של ALD, כולל מחלת כבד שומני הקשורה לאלכוהול, מייצגת צורה קלה יחסית והפיכה של ALD1. דלקת כבד הקשורה לאלכוהול מאופיינת בדלקת, עם מצגים קליניים הנעים בין דלקת כבד אסימפטומטית לדלקת כבד אלכוהולית חריפה, המופיעה בצהבת חריפה ועלולה להתקדם לאי ספיקת כבד עם תמותה גבוהה לטווח קצר1. אלכוהול והמטבוליטים שלו משנים את חילוף החומרים של השומנים ומקדמים הצטברות שומנים (סטאטוזיס) באמצעות מספר מנגנונים, כולל עיכוב חמצון β של חומצות שומן מיטוכונדריאליות וגירוי ליפוגנזה2. אתנול מווסת את הביטוי של קולטן טרנספרין 1, ובכך מגביר את ספיגת הברזל בכבד2. גם אלכוהול וגם אצטאלדהיד יכולים לפגוע ישירות בהפטוציטים, מה שמוביל למתח חמצוני מוגבר, עיכוב התחדשות s-adenosylmethionine, שחרור דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPS), חשיפה לאנדוטוקסינים חיידקיים במחזור הפורטל והיווצרות תוספות חלבון2. הטיפול ב-ALD נותר מאתגר בשל המסלולים הפתוגניים הרבים המעורבים3. אסטרטגיות עתידיות הנחקרות כוללות פרוביוטיקה אמפירית, גורמי גדילה, נוגדי חמצון, נוגדנים חד שבטיים המכוונים לגורמים הקשורים לדלקת והתערבויות התנהגותיות משופרות בטכנולוגיה. עם זאת, אסטרטגיות טיפוליות מקיפות נוספות עדיין צריכות להיבדק.

עדויות מתפתחות מצביעות על כך שלמרה של בעלי חיים עשוי להיות פוטנציאל טיפולי בניהול מחלות כבד הקשורות לאלכוהול (ALD) בשל תכונותיה האנטי דלקתיות ונוגדות החמצון 4,5. מרה של בעלי חיים היא מרכיב חשוב ברפואה הסינית המסורתית (TCM)6. ברפואה הסינית המסורתית, מרה של בעלי חיים משמשת לחיזוק תפקוד הכבד וכיס המרה ולהקלה על כאבים, חום, שיעול ודלקת. הוא שימש לטיפול במחלות כבד, כולל שחמת6. למרה של בעלי חיים יש תכונות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון6, ודלקת ועקה חמצונית ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של ALD7. תוספי חומצת מרה דווחו גם כמשפרים סטיאטוזיס בכבד8. נכון לעכשיו, מרה של דובים היא התרופה הנפוצה ביותר שמקורה במרה, עם חומצה אורסודאוקסיכולית (UDCA) וחומצה טאורוכולית (TUDCA) כמרכיביה הפעילים העיקריים 6,9. יש לציין כי TUDCA נעדר מהמרה של בעלי חיים אחרים, כגון כבשים, פרות, תרנגולות ונחשים6. TUDCA הוכיחה פוטנציאל טיפולי בטיפול בפגיעה חריפה בכבד10. נכון לעכשיו, TUDCA מתקבל באמצעות ניקוז מרה של דובים (מה שמעלה חששות לרווחת בעלי חיים), סינתזה כימית (שהיא יקרה), או טרנספורמציה ביולוגית של אבקת עפצים למקבילה למרה של דובים (שאינה שוות ערך למרה אמיתית של דובים)11,12. השועל הכחול (Alopex lagopus), הידוע גם בשם השועל הארקטי, גדל בשבי בעיקר בגלל פרוותו. סין היא אחת משלוש היצואניות הגדולות ביותר של בגדי פרווה בעולם, והאיברים הפנימיים של שועלים כחולים שנקטפו מושלכים בדרך כלל13. זה מהווה הזדמנות להעריך את כיס המרה כמשאב רפואי פוטנציאלי. שועלים כחולים ודובים הם שניהם טורפים, וחולקים קווי דמיון בפיזיולוגיה של מערכת העיכול, חילוף החומרים והתזונה, מה שמרמז על כך שהרכב המרה וההשפעות שלהם עשויים להיות דומים גם הם. עם זאת, אפשרות זו טרם נבדקה.

לכן, מחקר זה נועד לבחון את הפעולות הפרמקולוגיות והמנגנונים הבסיסיים של מרה של שועל כחול במודלים של ALD. הממצאים עשויים לספק אפיקי מחקר חדשים לפיתוח תחליפי מרה של דובים, לבסס בסיס מדעי לשימוש בכיס המרה של השועל הכחול כמשאב רפואי, להפוך פסולת תעשייתית למוצרים בעלי ערך ולהודיע על פיתוח טיפולי עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת היילונג-ג'יאנג לרפואה סינית (אישור #2023021101). כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In Vivo) והנחיות לאומיות ומוסדיות רלוונטיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. מכיוון שמחקר זה כלל ניסויים בבעלי חיים, הסכמה מדעת לא הייתה ישימה. כל הליכי גידול בעלי החיים וקצירת הפרווה הקפידו על התקנות הטכניות הסיניות לניהול גידול חיות בר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת היילונג-ג'יאנג לרפואה סינית, סין (אישור #2023021101).

הכנת דגימת מרה של שועל כחול
המשאב של מרה של שועל כחול מסופק בטבלת החומרים. בסך הכל 30 שועלים כחולים (Vulpes lagopus) הומתו בהמתת חסד באמצעות שוק חשמלי, ולאחר מכן קצירת פרוות ואיסוף כיס המרה. כיס המרה של השועל הכחול הוא בצורת אליפסה, עם חלק עליון צר וחלק תחתון נפוח. פני השטח החיצוניים שלו חומים כהים עם קפלים גלויים, וקרום הקפסולה דק. המרה נשאבה מיד באמצעות מזרק חד פעמי סטרילי של 1 מ"ל ונראתה בצבע שחור כהה או ירוק כהה. לאחר מכן כיס המרה יובש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לקבל אבקת מרה מיובשת של שועל כחול (איור 1). אבקת המרה שהתקבלה הציגה גוון צהוב-חום עם מרקם מבריק ופריך. התשואה הממוצעת של אבקת מרה מיובשת לכיס המרה הייתה כ-0.82 ±-0.30 גרם. להכנת דגימה, 250 מ"ג של אבקת מרה מיובשת משועל כחול (כמתואר לעיל) או דוב (ראה טבלת חומרים) הומסו ב-1 מ"ל של 70% מתנול בדרגת כרומטוגרפיה. התמיסה עברה סוניקציה אולטרסאונדית (40 קילו-הרץ, 300 וואט), סוננה דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר, דוללה לנפח סופי של 50 מ"ל (כלומר, ל-5 מ"ג/מ"ל), ודוללה עוד יותר לריכוז עבודה של 0.5 מ"ג/מ"ל לניתוח שלאחר מכן. זרימת העבודה הניסויית הכוללת מסוכמת באיור משלים 1.

במחקר זה, טווח המינון של אבקת מרה שועל כחול ששימשה לניסויים בבעלי חיים היה 5-10 גרם/ק"ג בהתבסס על הערכות רעילות קודמות ומחקרים פרמקולוגיים, ללא תופעות לוואי משמעותיות בריכוזים אלה14,15. במהלך הכנת אבקת המרה, כיס המרה יובש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות; עם זאת, זמן הייבוש עשוי להשתנות בהתאם ללחות המקומית ולנפח הדגימה, ולכן יש לבדוק את תכולת הלחות כדי להבטיח התייבשות מלאה. לצורך המסה, ריכוז של 5 מ"ג/מ"ל במתנול בדרגת כרומטוגרפיה היה אופטימלי עבור ניתוחי HPLC ו-UPLC-Q-TOF-MS; פירוק לא שלם או שאריות חלקיקים עלולים להשפיע על הדיוק האנליטי, ולדרוש סוניקציה או סינון נוספים. מגבלה ידועה היא השונות בהרכב המרה עקב הבדלים פיזיולוגיים עונתיים, תזונתיים ואינדיבידואליים בין שועלים כחולים, מה שעלול להשפיע על השפע היחסי של תרכובות פעילות כגון TUDCA ו-UDCA16. לכן, אימות אצווה על ידי פרופיל כרומטוגרפי מומלץ לפני שימוש פרמקולוגי כדי להבטיח פרופילי רכיבים עקביים.

ניתוח פרמקולוגי ברשת
ההרכב הכימי של מרה של שועל כחול נותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (ראה טבלת חומרים) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד יחד עם ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה מרובע (UPLC-Q-TOF-MS). HPLC בוצע באמצעות עמודת SB-C18 (4.6 מ"מ x 150 מ"מ, 5 מיקרומטר) עם פאזה ניידת המורכבת מ-0.03 M נתרן דימימן פוספט (pH מותאם ל-4.4 באמצעות חומצה זרחתית) כשלב A ומתנול (ראה טבלת חומרים) כשלב B (טבלה 1). אורך גל הזיהוי נקבע על 210 ננומטר, עם קצב זרימת פאזה נייד של 1.0 מ"ל לדקה, וטמפרטורת העמודה הייתה 40 מעלות צלזיוס. נפח ההזרקה היה 10 מיקרוליטר. ניתוח UPLC-Q-TOF/MS נערך באמצעות עמודת UPLCTM HSS T3 (ראה טבלת חומרים). השלב הנייד כלל תמיסה מימית של אצטוניטריל (A)-0.1% חומצה פורמית (B; ראה טבלת חומרים). תוכנית שיפוע השיפוע הייתה כדלקמן: 0-25.0 דקות, 98%-2% A, ו-25.0-28.0 דקות, 2%-2% A בקצב זרימה של 4 מ"ל/דקה. טמפרטורת העמוד נשמרה על 35 מעלות צלזיוס. ספקטרומטריית מסה בוצעה באמצעות מקור יינון אלקטרו-ספריי (ESI) עם הפרמטרים הבאים: קצב זרימת גז ממס של 650 ליטר לשעה, טמפרטורת גז ממס של 350 מעלות צלזיוס, קצב זרימת גז חרוט של 50 ליטר לשעה, טמפרטורת מקור יונים של 120 מעלות צלזיוס, מתח נימי של 2.8 קילו וולט (מצב יונים חיובי) ו-2.0 קילו וולט (מצב יונים שליליים), מתח חרוט של 25 וולט, ואנרגיית התנגשות של 6 וולט. ספקטרום נאסף כל 0.2 שניות במרווח של 0.02 שניות. לאוצין-אנקפלין (ראה טבלת חומרים; [M+H]+=556.2771) שימש כתמיסת כיול הייחוס בריכוז של 40 fmol/μL וקצב זרימה של 15 μL/min17.

ניתוח הרכב כימי וחיזוי מטרות
המרכיבים הפעילים של מרה של שועל כחול זוהו באמצעות HPLC ו-UPLC-Q-TOF/MS, עם חומצה אורוכולית ונתרן טאורורוסודאוקסיכולאט (ראה טבלת חומרים) כתקנים פנימיים18. נוסחאות מבניות של התרכובות שזוהו אוחזרו ממסד הנתונים של PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). כדי לחקור מטרות ביו-אקטיביות פוטנציאליות, הרכיבים הפעילים של מרה של שועל כחול נשאלו במסד הנתונים של PharmMapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/) כדי לזהות מטרות גנים קשורות.

באמצעות פגיעה בכבד אלכוהולי ופגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול כמילות מפתח, גנים הקשורים למחלה התקבלו ממאגרי הנתונים GeneCards (https://www.genecards.org/) ו-OMIM (https://omim.org/). במסד הנתונים של GeneCards, המטרות סוננו על פי ציון הרלוונטיות, עם סף שנקבע על ≥-20. חתך אמפירי נפוץ זה מבטיח איזון בין רגישות לספציפיות, תוך שמירה על רוב הגנים הרלוונטיים הפוטנציאליים (זיכרון גבוה) תוך סינון גנים קרובים או רועשים (דיוק גבוה). לעומת זאת, לא הוחל סינון נוסף במסד הנתונים של OMM, מכיוון שהוא לוכד מטרות עם ראיות גנטיות חזקות, ובכך משלים את ציוני הרלוונטיות החישובית של GeneCards. נתוני היעד שהושגו מוזגו ושוכפלו כדי לזהות מטרות הקשורות ל-ALD. מטרות החומר הפעיל ויעדי המחלה הושוו באמצעות Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) להדמיה. הצמתים זוהו כמטרות פוטנציאליות למרה של שועל כחול נגד ALD ויובאו למסד הנתונים של STRING (http://version10.string-db.org/). במסד הנתונים של STRING, רשת האינטראקציה נבנתה עם פרמטרי ברירת המחדל (ציון ביטחון בינוני ≥ 0.4), וצמתים חופשיים הוסתרו כדי לשפר את בהירות ההדמיה. צמתים חופשיים הוסתרו כדי ליצור את דיאגרמת הרשת של אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI), שהומחשה באמצעות תוכנת Cytoscape (גרסה 3.9.1). הניתוח הטופולוגי בוצע לחישוב ערכי מעלות, וששת היעדים עם ערכי הדרגה הגבוהים ביותר זוהו באמצעות מסד הנתונים להערות, הדמיה וגילוי משולב (DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) עם סף מובהקות של p < 0.05. מסד הנתונים של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) שימש לניתוח העשרת מסלול.

עגינה מולקולרית
עגינה מולקולרית בוצעה כדי להעריך את האינטראקציות בין חלבוני המטרה המרכזיים לבין הרכיבים הביו-אקטיביים של מרה של שועל כחול. המבנים התלת-ממדיים של חלבוני המטרה המרכזיים אוחזרו ממאגר נתוני החלבונים של מעבדת המחקר לביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) (https://www.rcsb.org/), והמבנים של רכיבי המרה התקבלו ממסד הנתונים של PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). סימולציות עגינה נערכו באמצעות תוכנת סביבת הפעלה מולקולרית (MOE) (גרסה 2022.02). עבור AKT1, הורד מבנה הגביש (PDB ID: 4EKL), והעיבוד המקדים ב-MOE כלל הסרה של מולקולות מים וליגנדים מקוריים, הוספת מימן עם פרוטונציה ב-pH פיזיולוגי (7.0) ומזעור אנרגיה. מבני ליגנד (TUDCA, UDCA, TCDCA, TCA ובילירובין) נאספו מ-PubChem והאנרגיה ממוזערת לפני העגינה. במהלך תהליך העגינה, נוצרו קונפורמציות ליגנד מרובות, וכל קונפורמציה הוכנסה לכיס הקישור של הקולטן בכיוונים מרחביים שונים. העגינה בוצעה באמצעות פרוטוקול Induced Fit, עם London dG למיקום ראשוני ו-Affinity dG כפונקציית הניקוד. שלושים קונפורמציות נוצרו עבור כל ליגנד, והתנוחות הסופיות שוכללו על ידי אופטימיזציה של שדה הכוח. כל שאר הפרמטרים הוגדרו לברירות מחדל של MOE ללא כוונון עדין נוסף. הזיקה בין כל קונפורמציה של ליגנד לקולטן הוערכה באמצעות פונקציית הניקוד של התוכנה. תוצאות העגינה הוערכו על ידי קשירת אנרגיה חופשית, כאשר קונפורמציה של אנרגיה שלילית ביותר בצביר הגדול ביותר נבחרה כמצב הקישור המייצג. מצב הכריכה עם הזיקה החזקה ביותר והקונפורמציה האופטימלית נבחר להדמיה. ערכי זיקה מתחת ל-4.25 קק"ל/מול מצביעים על קשירת ליגנד-מטרה, ערכים מתחת ל-5.0 קק"ל/מול מצביעים על קשירה בינונית, וערכים מתחת ל-7.0 קק"ל/מול מצביעים על זיקה חזקה של קשירה 19.

דגמי עכבר של ALD
למחקר זה נרכשו 30 עכברי קונמינג ספציפיים נטולי פתוגנים (SPF) (18-22 גרם, בני 6-8 שבועות, 15 זכרים, 15 נקבות). בעלי החיים שוכנו בתנאים מבוקרים בטמפרטורה של 25 ±-2 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 60% ±-10%, עם גישה אד-ליביטום למזון ולמים. לפני הניסוי, העכברים התאקלמו במשך שבוע אחד.

מודל ALD הוקם כדלקמן. תמיסת אתנול של 70% v/v הוכנה על ידי מדידת 70.21 מ"ל של אתנול נטול מים לבקבוק נפחי והוספת מים טהורים במיוחד לנפח סופי של 100 מ"ל. התמיסה ערבבה עם מערבל מגנטי למשך דקה אחת והניחה לעמוד במשך 5 דקות עד שלא נצפתה הפרדת פאזה. המינון היה 2 מ"ל/ק"ג משקל גוף, שניתן פעם ביום במשך 7 ימים רצופים. בבוקר היום השביעי, 4 שעות לאחר הבדיקה האחרונה, נאספו דגימות דם ורקמות כבד להמשך ניתוח. הקמת המודל אושרה על ידי הערכת אינדיקטורים אופייניים לפגיעה בכבד. נמדדו רמות אלנין אמינוטרנספראז (ALT), אספרטט אמינוטרנספראז (AST), כולסטרול כולל (T-CHO) ומאלונדיאלדהיד (MDA) בסרום. בנוסף, רקמות הכבד עברו בדיקה היסטופתולוגית באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי להעריך מורפולוגיה של הפטוציטים, ואקואוליזציה ציטופלזמית, נמק וחדירת תאים דלקתיים. העכברים חולקו באופן אקראי לחמש קבוצות (n=6 לקבוצה): קבוצת ביקורת ריקה קיבלה 2 מ"ל/ק"ג מים מזוקקים; קבוצת המודל קיבלה 2 מ"ל/ק"ג 70% אתנול ללא טיפול; קבוצת ביקורת חיובית קיבלה טבליות מגן על הכבד במינון של 0.4 גרם/ק"ג (ראה טבלת חומרים); קבוצת אבקת מרה של שועל כחול במינון גבוה קיבלה 10 גרם לק"ג אבקת מרה של שועל כחול; קבוצת אבקת מרה של שועל כחול במינון נמוך קיבלה 5 גרם לק"ג אבקת מרה של שועל כחול. כל הקבוצות מלבד הביקורת הריקה קיבלו דרך הפה 70% אתנול (2 מ"ל/ק"ג) פעם ביום במשך 7 ימים רצופים כדי לגרום לפגיעה אלכוהולית בכבד. ביום 7, 4 שעות לאחר מתן אתנול, ניתנו הטיפולים המתאימים (טבליות מגן על הכבד או אבקת מרה של שועל כחול), ונערכו ניסויים עוקבים. קבוצת הביקורת הריקה קיבלה מים מזוקקים לאורך כל הניסוי.

מדידת טרנסאמינזות בסרום (ALT ו-AST) וערכת כולסטרול כוללת (T-CHO)
דגימות הדם עברו צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לקבל סרום. הדגימות אוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. ערכות מסחריות שימשו למדידת רמות ALT, AST ו-T-CHO (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.

ניטור משקל גוף
לאחר 7 ימים רצופים של מתן אתנול, ניתנו טיפולים ביום השביעי, וניסויים נערכו 4 שעות לאחר מינון הבוקר. משקל הגוף נרשם פעמיים ביום במהלך תקופת התצפית. משקל גוף ללא צום נמדד באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני בימים 1, 2, 3, 5, 7, 10 ו-14 לאחר מתן השירות.

עיבוד דגימות רקמות
ביום ה-14 לאחר מתן המשקל נרשמו משקל הגוף וצריכת המזון שנותרה. לאחר מכן צמו בעלי החיים אחר הצהריים עם גישה חופשית למים. למחרת (לאחר תקופת צום של 12-16 שעות) נמדד משקל הגוף בצום לפני המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם. בדיקות פתולוגיות מקרוסקופיות בוצעו כדי להעריך שינויים מורפולוגיים באיברים עיקריים, כולל אך לא רק הלב, הכבד, הטחול, הריאות, הכליות, בלוטות יותרת הכליה, המוח, הקיבה, המעיים, האשכים, הערמונית, השחלות והרחם. דגימות רקמה מהלב, הכבד, הטחול, הריאות, הכליות, הקיבה והמעיים נאספו באופן אקראי מקבוצת הביקורת הריקה (CN) ומקבוצת המרה של השועל הכחול במינון נמוך (LH), מקובעות ב-4% פרפורמלדהיד, משובצות בפרפין, נחתכות ומוכתמות בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) להערכה היסטופתולוגית. קטעי רקמה נבדקו וצולמו במיקרוסקופ.

צביעת H&E
דגימות כבד נקבעו עם 4% פרפורמלדהיד בתמיסת מלח עם פוספט (PBS), משובצים בפרפין וחתכו. החלקים עברו דה-פרפיניזציה בקסילן I ו-II, התייבשו בריכוזי אתנול יורדים (100%, 95%, 85% ו-75%), ונשטפו במים, התמיינו, נשטפו שוב וכחולים באמצעות תמיסת הכחול. לאחר השטיפה, חלקים יובשו ב-85% ו-95% אתנול למשך 5 דקות כל אחד, נצבעו באאוזין למשך 5 דקות, ויובשו באתנול נטול מים I, II ו-III (5 דקות כל אחד). לבסוף, החלקים נוקו בקסילן I ו-II (5 דקות כל אחד) והורכבו עם מסטיק ניטרלי. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור (פי 100).

קביעת מלונדיאלדהיד (MDA) ברקמות הכבד
דגימות הכבד הומוגניות ב-9 נפחים של מי מלח פיזיולוגיים באמצעות מטחנת רקמות. ההומוגנאט צנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בדיקת מד"א בוצעה על הסופרנטנט באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.

ניתוח סטטיסטי
הנתונים מוצגים כאמצעים ± סטיות תקן (SDs). השוואות קבוצתיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט הוק של ההבדל הכי פחות מובהק (LSD). ערכי p דו-צדדיים <0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי התרכובות הפעילות במרה של שועל כחול
שועלים כחולים ודובים הם שניהם טורפים, החולקים פיזיולוגיה וחילוף חומרים דומיםבמערכת העיכול 20. לכן, למרה שלהם עשויים להיות קומפוזיציות דומות. באמצעות התנאים הכרומטוגרפיים שתוארו לעיל, כל תרכובת הופרדה היטב (איור 2). בניסוי זה, זמן השמירה של תקן TUDCA21 שימש לזיהוי TUDCA במרה של שועל כחול (איור 2). שיאים בזמני שימור של כ-10 דקות, 12 דקות ו-21 דקות זוהו כ-TU...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על פי דו"ח המצב העולמי של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לשנת 2018, צריכת האלכוהול לנפש בסין עלתה מ-4.1 ליטר בשנת 2005 ל-7.2 ליטר בשנת 2016, המייצג עלייה של 76%. ALD הנגרמת על ידי צריכת אלכוהול כרונית נותרה אטיולוגיה עיקרית של תחלואה ותמותה הקשורה לכבד22. בו ועמיתיו ביססו מודל פגיעה בכבד הנגרמת על ידי פחמן טטרכלוריד (CCl4) בעכברים וראו כי מרה של שועל כחול הפחיתה משמעותית את רמות AST, ALT, T-CHO ו-MDA23. באופן עקבי, הניסויים הפרמקולוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של קרן המדע לנוער של סין (מס' 82204562).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.03 מיליון נתרן דימימן פוספטלא ישיםלא ישיםHPLC נייד שלב א'
0.1% חומצה פורמית במיםפישר סיינטיפיק, ארה"בלא ישיםשלב נייד עבור UPLC
0.22 μ מסנן ממברנה Mלא ישיםלא ישיםסינון לדוגמא
4% פרפורמלדהידלא ישיםלא ישיםקיבוע רקמות
אצטוניטריל, דרגת כרומטוגרפיהפישר סיינטיפיק, ארה"בלא ישיםשלב נייד עבור UPLC
ערכות ALT, AST, T-CHOשנחאי Yuanye ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןלא ישיםניתוח ביוכימי בסרום
איזון אנליטילא ישיםלא ישיםמדידת משקל בעלי חיים
חומצה אורוכוליתהמכון הסיני לבקרת מזון ותרופותלא ישיםתקן פנימי ל-HPLC/MS
אבקת מרה של דוביםהמכון הסיני לבקרת מזון ותרופות, בייג'ינגלא ישיםחומר עזר
בילירוביןלא צויןלא ישיםתרכובת פעילה מזוהה במרה
שועל כחולחוות Suihua Fox , היילונגג'יאנג, סיןלא ישיםמקור המרה
אבקת מרה של שועל כחולהכנה פנימיתלא ישיםמדגם לניתוח רכיבים
עמודת HPLC C18אג'ילנט טכנולוגיות, ארה"בZORBAX SB-C18 (4.6&; 150 מ"מ, 5 μ m)הפרדת HPLC
ציטוסקייפhttps://cytoscape.org/גירסה 3.9.1ויזואליזציה של רשת וניתוח טופולוגי
דודה-NIHhttps://david.ncifcrf.gov/ניתוח העשרה GO/KEGG
כרטיסי GeneCardמכון ויצמןhttps://www.genecards.org/אחזור גנים הקשורים למחלה
המטוקסילין ואאוזין (H& E)לא ישיםלא ישיםצביעה היסטולוגית
מערכת HPLCאג'ילנט טכנולוגיות, ארה"ב1200 אינסוףניתוח הרכב מרה
עכברי קונמינג (SPF, 18– 22 גרם)ליאונינג צ'אנגשנג ביוטכנולוגיה ושות', בע"מSCXK (ליאו) 2020-0010מודל פגיעה בכבד אלכוהולי
לאוצין-אנקפליןSigma, ארצות הבריתלא ישיםתקן כיול MS (40 fmol/μ L)
ערכת גילוי מד"אשנחאי Yuanye ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןלא ישיםמדידת עקה חמצונית בכבד
מתנול, דרגת כרומטוגרפיהפישר סיינטיפיק, ארה"בלא ישיםממס להכנת מדגם
מוקבוצת מחשוב כימיMOE 2022.02ניתוח עגינה מולקולרית
OMIMה-NIHhttps://omim.org/אחזור גנים הקשורים למחלה
מיקרוסקופ אופטילא ישיםלא ישיםתצפית היסטולוגית
PharmMapperECUSThttp://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/חיזוי מטרות תרכובות פעילות
חומצה זרחתיתלא ישיםלא ישיםהתאמת pH של שלב נייד
פאב צ'םNCBIhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/אחזור מבנים מורכבים
בנק נתוני חלבון RCSBhttps://www.pdbus.org/לא ישיםמקור מבנה תלת מימד של חלבון
צנטריפוגה בקירורלא ישיםלא ישיםהפרדת סרום ורקמות
נתרן טאורורוסודאוקסיכולאט (TUDCA)המכון הסיני לבקרת מזון ותרופותלא ישיםתקן פנימי ל-HPLC/MS
מחרוזתאמבלhttp://version10.string-db.org/ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון
יוניפרוטEMBL-EBIhttps://www.uniprot.org/סטנדרטיזציה של יעד
מערכת UPLC-Q-TOF-MSWaters, ארצות הבריתUPLC HSS T3 (פי 100; 2.1 מ"מ, 1.8 ו-mu; m)זיהוי רכיבים
אנונימיCSIChttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlויזואליזציה של צומת יעד

מקורות

  1. Thursz, M., et al. EASL Clinical Practice Guidelines: Management of alcohol-related liver disease. J Hepatol. 69 (1), 154-181 (2018).
  2. Sugimoto, K., Takei, Y. Pathogenesis of alcoholic liver disease. Hepatol Res. 47 (1), 70-79 (2017).
  3. Adekunle, A. D., Adejumo, A., Singal, A. K. Therapeutic targets in alcohol-associated liver disease: progress and challenges. Therap Adv Gastroenterol. 16, 17562848231170946(2023).
  4. Wang, Y., et al. bile powder prevents drunkenness and alcohol-induced liver injury in mice via the gut microbiota and metabolic modulation. Chin Med. 19 (1), 39(2024).
  5. Li, L., Liu, C., Mao, W., Tumen, B., Li, P. Taurochenodeoxycholic Acid Inhibited AP-1 Activation via Stimulating Glucocorticoid Receptor. Molecules. 24 (24), 4513(2019).
  6. Wang, D. Q., Carey, M. C. Therapeutic uses of animal biles in traditional Chinese medicine: an ethnopharmacological, biophysical chemical and medicinal review. World J Gastroenterol. 20 (29), 9952-9975 (2014).
  7. Yang, Y. M., Cho, Y. E., Hwang, S. Crosstalk between Oxidative Stress and Inflammatory Liver Injury in the Pathogenesis of Alcoholic Liver Disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 774(2022).
  8. Quintero, P., et al. Bile acid supplementation improves established liver steatosis in obese mice independently of glucagon-like peptide-1 secretion. J Physiol Biochem. 70 (3), 667-674 (2014).
  9. Feng, Y., et al. Bear bile: dilemma of traditional medicinal use and animal protection. J Ethnobiol Ethnomed. 5, 2(2009).
  10. Song, G., et al. Potential therapeutic action of tauroursodeoxycholic acid against cholestatic liver injury via hepatic Fxr/Nrf2 and CHOP-DR5-caspase-8 pathway. Clin Sci (Lond). 137 (7), 561-577 (2023).
  11. Li, J., et al. Pharmacological studies on the comparison between the drainage and certified Fel Ursi. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 16 (12), 749-763 (1991).
  12. Allegri, F. Respect, Inherent Value, Subjects-of-a-Life Some. Reflections on the Key Concepts of Tom Regan's Animal Ethics. Relations Beyond Anthropocentrism. 7, 1-2 (2020).
  13. Underwood, L. S., Reynolds, P. Photoperiod and fur lengths in the arctic fox (Alopex lagopus L). Int J Biometeorol. 24 (1), 39-48 (1980).
  14. Wu, L., et al. Toxicological evaluation of porcine bile powder in Kunming mice and Sprague-Dawley rats. Front Pharmacol. 15, 1424940(2024).
  15. Chen, D. X., et al. Therapeutic Effects of Different Animal Bile Powders on Lipid Metabolism Disorders and Their Composition Analysis. Chin J Integr Med. 28 (10), 918-923 (2022).
  16. Liu, J., et al. Effect of Dietary Supplementation with Calcium, Phosphorus and Vitamin D(3) on Growth Performance, Nutrient Digestibility, and Serum Biochemical Parameters of Growing Blue Foxes. Animals (Basel). 12 (14), 1814(2022).
  17. Desiderio, D. M., Dass, C. The Measurement of Leucine Enkephalin at the Femtomole Level by Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry/Mass Spectrometry Methods. Anal Lett. 19 (19-20), 1963-1971 (1986).
  18. Li, S., et al. Substitutes for Bear Bile for the Treatment of Liver Diseases: Research Progress and Future Perspective. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 4305074(2016).
  19. Ji, L., et al. Identification of bioactive compounds and potential mechanisms of Scutellariae Radix-Coptidis Rhizoma in the treatment of atherosclerosis by integrating network pharmacology and experimental validation. Biomed Pharmacother. 165, 115210(2023).
  20. Shi, J., Zhou, B., Ding, C. Study on the Chemical Components of Blue Fox Gall Powder. J Trad Chinese Med Herald. 31 (03), 83-88 (2025).
  21. Gómez, C., Stücheli, S., Kratschmar, D. V., Bouitbir, J., Odermatt, A. Development and Validation of a Highly Sensitive LC-MS/MS Method for the Analysis of Bile Acids in Serum, Plasma, and Liver Tissue. Metabolites. 10 (7), 282(2020).
  22. Wu, M., et al. Estimated projection of incidence and mortality of alcohol-related liver disease in China from 2022 to 2040: a modeling study. BMC Med. 21 (1), 277(2023).
  23. Bo, Z., Rui, W., Jingbo, J. Arctic fox bile can alleviate carbon tetrachloride-induced acute liver injury. Intl J Clin Exp Med. 9 (2), 5050-5055 (2016).
  24. Zhou, C. F., Gao, G. J., Liu, Y. Advances in studies on bear bile powder. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40 (7), 1252-1258 (2015).
  25. Zhou, C. S., Yin, Z. Y., Zhao, W. X. Bear bile affects immunologic feature of hepatic stellate cells. J Hepatol Surg. 20 (3), 204-208 (2012).
  26. Wang, N., et al. A comparative study on the hepatoprotective action of bear bile and Coptidis Rhizoma aqueous extract on experimental liver fibrosis in rats. BMC Complement Altern Med. 12, 239(2012).
  27. Ratziu, V., et al. A randomized controlled trial of high-dose ursodesoxycholic acid for nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 54 (5), 1011-1019 (2011).
  28. Moorhouse, T. P., et al. Substitutes for wildlife-origin materials as described in China's "TCM" research literature. Global Ecol Conservation. 34 (April), e02042(2022).
  29. Steyn, W. J., Wand, S. J., Jacobs, G., Rosecrance, R. C., Roberts, S. C. Evidence for a photoprotective function of low-temperature-induced anthocyanin accumulation in apple and pear peel. Physiol Plant. 136 (4), 461-472 (2009).
  30. Intagliata, S., et al. Discovery of a Highly Selective Sigma-2 Receptor Ligand, 1-(4-(6,7-Dimethoxy-3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)butyl)-3-methyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one (CM398), with Drug-Like Properties and Antinociceptive Effects In Vivo. AAPS J. 22 (5), 94(2020).
  31. Contreras-Zentella, M. L., Villalobos-Garcia, D., Hernandez-Munoz, R. Ethanol Metabolism in the Liver, the Induction of Oxidant Stress, and the Antioxidant Defense System. Antioxidants (Basel). 11 (7), 1258(2022).
  32. Lala, V., Zubair, M., Minter, D. A. Liver Function Tests. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  33. Seo, E., Kang, H., Choi, H., Choi, W., Jun, H. S. Reactive oxygen species-induced changes in glucose and lipid metabolism contribute to the accumulation of cholesterol in the liver during aging. Aging Cell. 18 (2), e12895(2019).
  34. Freitas, I. N., et al. Insights by which TUDCA is a potential therapy against adiposity. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1090039(2023).
  35. Lu, W., Xi, R., Huaiwu, H. Ursodeoxycholic acid (UDCA) reduces hepatocyte apoptosis by inhibiting farnesoid X receptor (FXR) in hemorrhagic shock (HS). Curr Mol Med. 23 (6), 550-558 (2022).
  36. Reyes-Gordillo, K., et al. Akt1 and Akt2 Isoforms Play Distinct Roles in Regulating the Development of Inflammation and Fibrosis Associated with Alcoholic Liver Disease. Cells. 8 (11), 1337(2019).
  37. Li, J., Guo, C., Wu, J. The Agonists of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma for Liver Fibrosis. Drug Des Devel Ther. 15, 2619-2628 (2021).
  38. Dichtel, L. E., Cordoba-Chacon, J., Kineman, R. D. Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor 1 Regulation of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. J Clin Endocrinol Metab. 107 (7), 1812-1824 (2022).
  39. Takahashi, Y. The Role of Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor-I in the Liver. Int J Mol Sci. 18 (7), 1447(2017).
  40. Feng, M., et al. Kupffer-derived matrix metalloproteinase-9 contributes to liver fibrosis resolution. Int J Biol Sci. 14 (9), 1033-1040 (2018).
  41. Ma, X. Y., et al. Ursolic acid reduces hepatocellular apoptosis and alleviates alcohol-induced liver injury via irreversible inhibition of CASP3 in vivo. Acta Pharmacol. 42 (7), 1101-1110 (2021).
  42. Taguchi, K., Fukami, K. RAGE signaling regulates the progression of diabetic complications. Front Pharmacol. 14, 1128872(2023).
  43. Lino Rodrigues, K., et al. Aerobic Exercise Training Improves Microvascular Function and Oxidative Stress Parameters in Diet-Induced Type 2 Diabetic Mice. Diabetes Metab Syndr Obes. 15, 2991-3005 (2022).
  44. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metab Dispos. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  45. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  46. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: an important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.