כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור רגיש וספציפי של מוטציות EGFR T790M באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית (ddPCR), שניתן להרחיב גם לזיהוי מהיר של מוטציות גידול אחרות כגון G719S, L858R, L861Q ו-S768I.
מאמר מחקר
תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית של מיקרו-טיפות לזיהוי מדויק של מוטציות בסרטן ריאות של תאים לא קטנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בקנה מידה עולמי, סרטן הריאות ממשיך להיות התורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן, כאשר שכיחותו מדורגת שנייה רק לזו של סרטן הכליה. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה כ-80-85% מכלל מקרי סרטן הריאה המדווחים. מוטציית T790M בגן EGFR היא גורם ראשוני מוכר של עמידות נרכשת למעכבי טירוזין קינאז (EGFR-TKIs) של קולטן גורם גדילה אפידרמלי. נוכחות של מצב זה נצפתה בכ-50-60% מאלה שחווים מחלה מתקדמת. לכן, יישום גישה מהירה ומגיבה מאוד לאיתור מוטציות T790M בגן EGFR חיוני לזיהוי מהיר של סרטן ריאות של תאים לא קטנים. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש ב-ddPCR כדי לזהות את מוטציית T790M עם מגבלת זיהוי של 10 עותקים/מיקרוליטר, שהיא גבוהה פי 10 מהרגישות של qPCR (1 ×-102 עותקים/מיקרוליטר). עבור 15 הדגימות המדומות, ddPCR היה מסוגל לזהות נוכחות של מוטציות T790M בגן EGFR, שנצפו ברמות מופחתות כאשר נותחו באמצעות qPCR. איתור מוטציות T790M בתוך הגן EGFR בשיטת זיהוי מהיר נחקר כדי לקבוע את התאמתו.
מבוא
סרטן ריאות הוא הגורם המוביל לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, והוא עומד כממאיר השני בשכיחותו בסך הכל. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה רוב משמעותי, כ-80% עד 85%, מכלל מקרי סרטן הריאה המדווחים 1,2,3,4. עבור חולים המאובחנים עם NSCLC מתקדם המכיל מוטציות EGFR, הגישה הטיפולית המבוססת כוללת יישום של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) מהדור הראשון, השני או השלישי של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR)5,6,7. עם זאת, רוב החולים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, רקמות אנושיות או ניסויים בבעלי חיים חיים; לפיכך, לא נדרש אישור אתי רשמי. כל ההליכים נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות. הפלסמיד המוטנטי T790M סונתז מסחרית. דם חזיר המשמש להדמיית דגימות קליניות הושג מספק מוסמך בהתאם לתקנות רווחת בעלי חיים, ללא מעורבות של בעלי חיים חיים. כל שאר הריאגנטים, כולל חרוזים מגנטיים, פריימרים, בדיקות ואנזימי PCR, הופקו באופן מסחרי ושימשו לפי הוראות היצרנים.
מיצוי חומצות גרעין
מיצוי חומצות גרעין בוצע באמצעות ערכת מיצוי חרוזים מגנטיים ומכשיר חילוץ חומצות גרעין אוטומטי לחלוטין. ההליך הסטנדרטי כלל הוספת 200 מיקרוליטר של דגימה ו-20 מיק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אופטימיזציה של מיצוי חומצות גרעין
זרימת העבודה המבוססת על ddPCR לזיהוי המוטציה EGFR T790M מסוכמת באופן סכמטי באיור 1. ראשית, קבענו את טמפרטורת הליזיס האופטימלית. כפי שמוצג באיור 2A, טמפרטורת מחשוף של 66 מעלות צלזיוס הניבה את ערך ה-Ct הממוצע הקטן ביותר, המציין את המחשוף היעיל ביותר. לכן, 66 מעלות צלזיוס נבחרו לניסויים הבאים. לאחר מכן, ביצענו אופטימיזציה של זמן הליזה בטמפרטורה האופטימלית שנקבעה של 66 מעלות צלזיוס. איור 2B
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
סרטן הריאות, כגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, תמיד היה מוקד במחקר הרפואי. במחקר זה, אנו בוחנים היבטים קריטיים מרובים של סרטן הריאות, במטרה לספק תובנות עמוקות יותר לגבי האבחון, הטיפול והפרוגנוזה שלו. אבן היסוד של אבחון וטיפול מדויק בסרטן ריאות היא בדיקות גנטיות מדויקות. כפי שהודגם על ידי Zhao et al.25, בדיקות גנטיות מסורתיות מסתמכות במידה רבה על דגימות רקמה באיכות גבוהה, והן יקרות וגוזלות זמן. מודל DeepGEM, שפותח על ידי הצוות באמצעות גישת בינה מלא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז יונאן והאוניברסיטה הרפואית של קונמינג פרויקט מיוחד משותף למחקר בסיסי יישומי, 202101AY070001-134
תרומת המחבר
Youming Lei ו-Guoli Lv תרמו באופן שווה לעבודה זו והם מחברים ראשונים שותפים. Youming Lei ו-Guoli Lv הגו ותכננו את המחקר. צ'ינגמיי יאנג תרמה לאיסוף וניתוח נתונים. ג'ין דואן ויונפיי שי פיקחו על ניתוח הנתונים ופרשנותם, תיקנו את כתב היד ואישרו את הגרסה הסופית לפרסום. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 ופעמים; TE Buffer | Sangon Biotech | B548144 | Tris-EDTA מאגר המשמש לדילול DNA |
| 4 פעמים; תערובת אנזימים Unimix-U | TargetingOne Bio | UNIMIXU-4X | ddPCR תערובת אנזים |
| A300 מהיר תרמי | Cycler LongGene | A300 | PCR |
| הגברה מנתח Biochip | SEED Bio | DigitalPCR-Biochip | מערכת זיהוי עבור PCR דיגיטלי |
| מכשיר הכנת דגימה סמן | Xinyi Biotechnology | פלטפורמת PCR דיגיטלית TD-2 | הכנת מיקרו-טיפות |
| ערכת מיצוי חומצות גרעין חרוז מגנטי | LemnisCare Technology | MXP-1005 | מיקרו-טיפות מיצוי חומצות גרעין |
| TargetingOne Biotech | MG-Chip-01 | משמש ליצירת מיקרו-טיפות עבור ddPCR | |
| NanoDrop | Allsheng | NC-500 | מדידת ריכוז חומצות גרעין לאחר מיצוי דגימה |
| NanoDrop ND-500 ספקטרופוטומטר | Allsheng מכשירים | ND-500 | ספקטרופוטומטר לכימות DNA |
| מכשיר PCR A300 מהיר תרמי Cycler | LongGene | A300 | מחזור תרמי להגברת PCR |
| פריימרים ובדיקה TaqMan | Sangon Biotech | מסונתזים בהתאמה אישית | ובדיקה TaqMan לזיהוי T790M |
| מכשיר qPCR עדין יותר מיני | Tianlong טכנולוגיה | עדינה יותר מיני | PCR מכשיר |
| T790M מוטציה פלסמיד | Tsingke ביולוגיה | T790M | עקומה סטנדרטית ובדיקת גבול זיהוי |
מקורות
- Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
- Sung, H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה