מאמר מחקר

תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית של מיקרו-טיפות לזיהוי מדויק של מוטציות בסרטן ריאות של תאים לא קטנים

DOI:

10.3791/68770

⸱

29 ביולי 2025

 ,  ,  ,  , 
1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור רגיש וספציפי של מוטציות EGFR T790M באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית (ddPCR), שניתן להרחיב גם לזיהוי מהיר של מוטציות גידול אחרות כגון G719S, L858R, L861Q ו-S768I.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקנה מידה עולמי, סרטן הריאות ממשיך להיות התורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן, כאשר שכיחותו מדורגת שנייה רק לזו של סרטן הכליה. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה כ-80-85% מכלל מקרי סרטן הריאה המדווחים. מוטציית T790M בגן EGFR היא גורם ראשוני מוכר של עמידות נרכשת למעכבי טירוזין קינאז (EGFR-TKIs) של קולטן גורם גדילה אפידרמלי. נוכחות של מצב זה נצפתה בכ-50-60% מאלה שחווים מחלה מתקדמת. לכן, יישום גישה מהירה ומגיבה מאוד לאיתור מוטציות T790M בגן EGFR חיוני לזיהוי מהיר של סרטן ריאות של תאים לא קטנים. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש ב-ddPCR כדי לזהות את מוטציית T790M עם מגבלת זיהוי של 10 עותקים/מיקרוליטר, שהיא גבוהה פי 10 מהרגישות של qPCR (1 ×-102 עותקים/מיקרוליטר). עבור 15 הדגימות המדומות, ddPCR היה מסוגל לזהות נוכחות של מוטציות T790M בגן EGFR, שנצפו ברמות מופחתות כאשר נותחו באמצעות qPCR. איתור מוטציות T790M בתוך הגן EGFR בשיטת זיהוי מהיר נחקר כדי לקבוע את התאמתו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן ריאות הוא הגורם המוביל לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, והוא עומד כממאיר השני בשכיחותו בסך הכל. סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה רוב משמעותי, כ-80% עד 85%, מכלל מקרי סרטן הריאה המדווחים 1,2,3,4. עבור חולים המאובחנים עם NSCLC מתקדם המכיל מוטציות EGFR, הגישה הטיפולית המבוססת כוללת יישום של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) מהדור הראשון, השני או השלישי של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR)5,6,7. עם זאת, רוב החולים שטופלו ב-EGFR-TKIs מהדור הראשון או השני מפתחים בסופו של דבר עמידות נרכשת לתרופה. עמידות זו מיוחסת לעתים קרובות לנוכחות המוטציה T790M בגן EGFR, הנמצאת בכ-50-60% מהחולים שחווים התקדמות מחלה 8,9,10,11,12.

באופן מסורתי, חריגות גנטיות ב-DNA של גידול מדגימות רקמה מזוהות באמצעות טכניקות כמו הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) או ריצוף מהדור הבא (NGS)13,14. עם זאת, ביופסיות רקמות יכולות להיות מאתגרות עקב חוסר נגישות לגידול, בריאות לקויה של המטופל או תכולת תאי גידול לא מספקת 15,16,17. כחלופה, ביופסיות נוזליות, במיוחד מפלזמה, מציעות דרך פחות פולשנית לזהות מוטציות מניעות על ידי זיהוי DNA של גידול במחזור (ctDNA). תאי גידול שופכים DNA לזרם הדם, נוזל הצדר, הרוק או הצואה, ומספקים מקור רב ערך לניתוח גנטי18,19. הפרופיל הגנטי של ctDNA משקף לעתים קרובות את ההרכב הגנטי של הגידול, ומציע מבט מקיף על הטרוגניות הגידול - גורם מכריע לאבחון מדויק וטיפול מותאם אישית בסרטן20,21.

בין הטכניקות השונות לזיהוי מוטציות EGFR בדם היקפי, כולל ריצוף, תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR), PCR דיגיטלי, דנטורציה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (DHPLC), מערכת מוטציות עקשן הגברה (ARMS) ו-PCR מועשר במוטציות (ME-PCR), PCR דיגיטלי מיקרו-טיפות (ddPCR) התגלה ככלי יעיל ביותר לזיהוי מוטציות ctDNA22,23. הרגישות המעולה שלו, הדיוק והיכולת לזהות מוטציות בשפע נמוך בדיוק גבוה מבדילים אותו. בניגוד ל-PCR מסורתי, ddPCR מחיצות דגימות לאלפי טיפות, מה שמאפשר כימות מוחלט של רצפי DNA מטרה ללא עקומות סטנדרטיות. זה הופך אותו למתאים במיוחד לאיתור מוטציות נדירות כמו מוטציית T790M ב-EGFR. למרות היתרונות של ddPCR, היישום הקליני הנרחב שלו הוגבל על ידי אתגרים בהכנת דגימות, אופטימיזציה של המערכת וניתוח ביצועים השוואתי עם טכניקות מבוססות כמו qPCR. קיים פער קריטי באופטימיזציה של פרוטוקולי ddPCR לזיהוי מוטציות ctDNA, במיוחד בכל הנוגע לרגישות, ספציפיות ושחזור החיוניים לאימוץ קליני.

במחקר זה, אנו משערים כי ddPCR מציע רגישות ואמינות מעולות לזיהוי מוטציית EGFR T790M ב-ctDNA בהשוואה לשיטות qPCR מסורתיות. התמקדנו באופטימיזציה של תהליך מיצוי חומצות הגרעין כדי לשפר את היעילות, ולאחר מכן אופטימיזציה של ddPCR לזיהוי מוטציות. בנוסף, השווינו את ביצועי ddPCR ו-qPCR במונחים של רגישות, ספציפיות ושחזור באמצעות דגימות מדומות. על ידי הערכה שיטתית של הפוטנציאל של ddPCR, אנו שואפים לבסס אותו כחלופה בת קיימא ומעולה ל-qPCR לזיהוי מוטציות EGFR בביופסיות נוזליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, רקמות אנושיות או ניסויים בבעלי חיים חיים; לפיכך, לא נדרש אישור אתי רשמי. כל ההליכים נערכו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות. הפלסמיד המוטנטי T790M סונתז מסחרית. דם חזיר המשמש להדמיית דגימות קליניות הושג מספק מוסמך בהתאם לתקנות רווחת בעלי חיים, ללא מעורבות של בעלי חיים חיים. כל שאר הריאגנטים, כולל חרוזים מגנטיים, פריימרים, בדיקות ואנזימי PCR, הופקו באופן מסחרי ושימשו לפי הוראות היצרנים.

מיצוי חומצות גרעין
מיצוי חומצות גרעין בוצע באמצעות ערכת מיצוי חרוזים מגנטיים ומכשיר חילוץ חומצות גרעין אוטומטי לחלוטין. ההליך הסטנדרטי כלל הוספת 200 מיקרוליטר של דגימה ו-20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לעמודה 1 או 7 של צלחת הבאר העמוקה הארוזה מראש. לאחר מכן, 15 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים שסופקו עם הערכה נוספו לעמודה 2 או 8. תוכנית החילוץ החלה על המכשיר, כאשר השרוול המגנטי ממוקם במיקומו המיועד. לאחר המיצוי, הנוזל מעמודה 6 או 12 הועבר לצינור חדש נטול נוקלאז בנפח 1.5 מ"ל ואוחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

כדי לייעל את המיצוי של חומצות גרעין מטרה בריכוז נמוך, נערכו ניסויי אופטימיזציה. פרמטרי המיצוי המומלצים היו: טמפרטורת ליזה 70 מעלות צלזיוס, זמן ליזה 10 דקות, דקה אחת לכל אחת משלוש תמיסות הכביסה, ייבוש של 2 דקות ופליטה של 3 דקות ב-56 מעלות צלזיוס. הפרמטרים המשפיעים ביותר עברו אופטימיזציה שיטתית: טמפרטורת ליזה (62 מעלות צלזיוס, 66 מעלות צלזיוס, 70 מעלות צלזיוס, 74 מעלות צלזיוס ו-78 מעלות צלזיוס), זמן ליזה (1, 3, 5, 7 ו-9 דקות) וגודל חרוז מגנטי (100 ננומטר, 200 ננומטר, 300 ננומטר, 400 ננומטר, 500 ננומטר ו-1000 ננומטר). אופטימיזציות אלו בוצעו באמצעות הפלסמיד המוטנטי T790M ב-1 × 105 עותקים/מיקרוליטר. החרוזים המגנטיים של 100 ננומטר סופקו עם ערכת החילוץ, בעוד שגדלי חלקיקים אחרים התקבלו מחברת ביוטכנולוגיה. היעילות של כל תנאי מיצוי הוערכה על ידי ניתוח עקומות ההגברה של qPCR וערכי ה-Ct של הדגימות שחולצו. ניתוח סטטיסטי של תוצאות אלה בוצע באמצעות תוכנות סטטיסטיות.

DNA פלסמיד סטנדרטי
הפלסמיד המוטנטי T790M של הגן EGFR סונתז בהתאמה אישית על ידי חברת ביוטכנולוגיה. ארבעה מיקרוגרם של אבקת הפלסמיד היבשה הושעו מחדש ב-100 מיקרוליטר של 1x TE Buffer. ריכוז הפלסמיד נקבע באמצעות ספקטרופוטומטר. מספר העותק למיקרוליטר חושב באמצעות הנוסחה: מספר עותק/מיקרוליטר = [(6.02 × 1023) × (ריכוז DNA (ng/μL) × 10-9)] / (אורך DNA בזוגות בסיסים × 660). ריכוז השבר המסונתז היה 1.26 ×-109 עותקים/מיקרוליטר. פלסמיד מלאי זה דולל לאחר מכן פי 126 כדי להשיג ריכוז עבודה של 1 × 108 עותקים/מיקרוליטר.

תכנון וסינתזה של פריימר
פריימרים ובדיקת TaqMan למוטציה EGFR T790M תוכננו באמצעות פריימר 6 בהתבסס על עקרונות תכנון פריימר סטנדרטיים. פריימר במעלה הזרם: 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′; פריימר במורד הזרם24: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; בדיקה: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. כל הפריימרים והבדיקות סונתזו על ידי שירות סינתזה מסחרי של אוליגונוקלאוטיד.

הקמה ואופטימיזציה של מערכת גילוי כמותי פלואורסצנטי ddPCR ו-TaqMan
מלאי פלסמיד T790M של 1 ×10 8 עותקים/מיקרוליטר דולל ל-1 ×10 6 עותקים/מיקרוליטר באמצעות 1× TE Buffer לשימוש בניסויי אופטימיזציה של מערכת ddPCR ו-qPCR.

אופטימיזציה של מערכת ddPCR: מערכת ddPCR עברה אופטימיזציה על סמך המלצות יצרן האנזים. המערכת המומלצת הראשונית כללה: 7.5 מיקרוליטר של תערובת PCR פי 4, 1.2-3 מיקרוליטר של פריימר במעלה הזרם (10 מיקרומטר), 1.2-3 מיקרוליטר של פריימר במורד הזרם (10 מיקרומטר), 0.3-1.8 מיקרוליטר של בדיקה (10 מיקרומטר), 1-15 מיקרוליטר של תבנית DNA, ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 30 מיקרוליטר. מחזור ההגברה המומלץ כלל 10 דקות ראשוניות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 40 מחזורים של 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס ו-60 שניות ב-55-65 מעלות צלזיוס. טמפרטורת החישול (55-61.8 מעלות צלזיוס), ריכוז הפריימר (1-3 מיקרוליטר), ריכוז הבדיקה (0.75-1.75 מיקרוליטר) וריכוז התבנית (3-15 מיקרוליטר) עברו אופטימיזציה שיטתית. תוצאות האופטימיזציה נותחו סטטיסטית באמצעות תוכנה סטטיסטית.

אופטימיזציה של מערכת qPCR: מערכת ה-qPCR עברה אופטימיזציה בהתאם להמלצות יצרן האנזים. המערכת הראשונית שהוצעה כללה: 5 מיקרוליטר של Taq פולימראז, 0.45 מיקרוליטר של 250 מ"מ MgCl2, 0.5-2.5 מיקרוליטר של פריימר קדמי (10 מיקרומטר), 0.5-2.5 מיקרוליטר של פריימר הפוך (10 מיקרומטר), 0.5-2.5 מיקרוליטר של בדיקה (10 מיקרומטר), 5 מיקרוליטר של דגימת DNA ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 25 מיקרוליטר. תוכנית ההגברה המומלצת הייתה 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס; ואחריהם 45 מחזורים של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ו-30 שניות ב-56-64 מעלות צלזיוס, עם איסוף פלואורסצנטי ב-56-64 מעלות צלזיוס. טמפרטורת החישול (56-64 מעלות צלזיוס), ריכוז הפריימר (1-3 מיקרוליטר), ריכוז הבדיקה (0.5-2.5 מיקרוליטר) וריכוז התבנית (1-5 מיקרוליטר) עברו אופטימיזציה. ניתוח סטטיסטי של תוצאות אלה בוצע באמצעות תוכנות סטטיסטיות.

ddPCR ובדיקת רגישות PCR פלואורסצנטית כמותית של Taqman
כדי להעריך את הרגישות של ddPCR לעומת qPCR, הפלסמיד 1 ×10 8 עותקים/μL T790M דולל באופן סדרתי פי 10 באמצעות 1x TE Buffer כדי ליצור שיפוע ריכוז שנע בין 106 ל-101 עותקים למיקרוליטר. עבור ddPCR, הוכנו שבעה פתרונות תגובה על פי מערכת ddPCR האופטימלית, אחד לכל ריכוז, כולל בקרה שלילית. הדגימות הועמסו על שבב מחולל מיקרו-טיפות ועובדו עם מכשיר ליצירת טיפות כדי ליצור מיקרו-טיפות. טיפות אלו הוגברו לאחר מכן באמצעות מחזורי תרמי PCR ולאחר מכן נותחו על ידי מכשיר זיהוי PCR דיגיטלי. במקביל, הוכנו שבעה פתרונות תגובה המבוססים על מערכת ה-qPCR האופטימלית, עם תבניות זהות. אלה הופעלו על מכשיר PCR בזמן אמת כדי להעריך את הרגישויות המתאימות של שתי הגישות (n = 3).

בדיקות חזרתיות ddPCR
כדי להעריך את יכולת החזרה, DNA פלסמיד סטנדרטי T790M ב-1 ×10 8 עותקים/מיקרוליטר דולל כדי ליצור תקני ריכוז גבוהים (1 × 106 עותקים/מיקרוליטר), בינוניים (1 × 104 עותקים/מיקרוליטר) ונמוכים (1 × 102 עותקים/מיקרוליטר). שישה פתרונות תגובה הוכנו על פי מערכת ddPCR האופטימלית. הדגימות הועמסו על שבב מחולל מיקרו-טיפות ועובדו עם מכשיר ליצירת טיפות ליצירת מיקרו-טיפות. לאחר מכן הוגברו המיקרו-טיפות באמצעות מחזורי תרמי ונותחו על ידי מכשיר זיהוי PCR דיגיטלי. נכללה בקרה שלילית. הניסוי בוצע בשלוש עותקים. יכולת השחזור הוערכה על ידי השוואת פרופילי הגברה וחישוב ערכי מקדם השונות (CV) משלושת השכפולים הניסיוניים.

בדיקת מדגם אנלוגי
על מנת לבדוק את האמינות של מערכות ddPCR ו-qPCR של מוטציות T790M, השתמשנו בדם חזיר מעורבב באופן אקראי עם ריכוזים גבוהים ונמוכים של פלסמידים סטנדרטיים של מוטציות T790M בהתאמה, ודם חזיר ללא פלסמידים סטנדרטיים מעורבים שימש כדגימות שליליות, ו-15 דגימות מדומות הוכנו באופן אקראי, וחומצת גרעין חולצה מהדגימות המדומות. וזוהה באמצעות שיטות ddPCR ו-qPCR, בהתאמה.

ניתוח סטטיסטי
כל הניסויים בוצעו בשלושה שכפולים טכניים לפחות. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ניתוחים סטטיסטיים נערכו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 10. ההבדלים בין הקבוצות נותחו באמצעות מבחן t של סטודנט או ניתוח שונות חד כיווני (ANOVA) לפי הצורך. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטימיזציה של מיצוי חומצות גרעין
זרימת העבודה המבוססת על ddPCR לזיהוי המוטציה EGFR T790M מסוכמת באופן סכמטי באיור 1. ראשית, קבענו את טמפרטורת הליזיס האופטימלית. כפי שמוצג באיור 2A, טמפרטורת מחשוף של 66 מעלות צלזיוס הניבה את ערך ה-Ct הממוצע הקטן ביותר, המציין את המחשוף היעיל ביותר. לכן, 66 מעלות צלזיוס נבחרו לניסויים הבאים. לאחר מכן, ביצענו אופטימיזציה של זמן הליזה בטמפרטורה האופטימלית שנקבעה של 66 מעלות צלזיוס. איור 2B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הריאות, כגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, תמיד היה מוקד במחקר הרפואי. במחקר זה, אנו בוחנים היבטים קריטיים מרובים של סרטן הריאות, במטרה לספק תובנות עמוקות יותר לגבי האבחון, הטיפול והפרוגנוזה שלו. אבן היסוד של אבחון וטיפול מדויק בסרטן ריאות היא בדיקות גנטיות מדויקות. כפי שהודגם על ידי Zhao et al.25, בדיקות גנטיות מסורתיות מסתמכות במידה רבה על דגימות רקמה באיכות גבוהה, והן יקרות וגוזלות זמן. מודל DeepGEM, שפותח על ידי הצוות באמצעות גישת בינה מלא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז יונאן והאוניברסיטה הרפואית של קונמינג פרויקט מיוחד משותף למחקר בסיסי יישומי, 202101AY070001-134

תרומת המחבר
Youming Lei ו-Guoli Lv תרמו באופן שווה לעבודה זו והם מחברים ראשונים שותפים. Youming Lei ו-Guoli Lv הגו ותכננו את המחקר. צ'ינגמיי יאנג תרמה לאיסוף וניתוח נתונים. ג'ין דואן ויונפיי שי פיקחו על ניתוח הנתונים ופרשנותם, תיקנו את כתב היד ואישרו את הגרסה הסופית לפרסום. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 ופעמים; TE BufferSangon BiotechB548144Tris-EDTA מאגר המשמש לדילול DNA
4 פעמים; תערובת אנזימים Unimix-UTargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR תערובת אנזים
A300 מהיר תרמיCycler LongGeneA300PCR
הגברה מנתח BiochipSEED BioDigitalPCR-Biochipמערכת זיהוי עבור PCR דיגיטלי
מכשיר הכנת דגימה סמןXinyi Biotechnologyפלטפורמת PCR דיגיטלית TD-2הכנת מיקרו-טיפות
ערכת מיצוי חומצות גרעין חרוז מגנטיLemnisCare TechnologyMXP-1005מיקרו-טיפות מיצוי חומצות גרעין
TargetingOne BiotechMG-Chip-01משמש ליצירת מיקרו-טיפות עבור ddPCR
NanoDropAllshengNC-500מדידת ריכוז חומצות גרעין לאחר מיצוי דגימה
NanoDrop ND-500 ספקטרופוטומטרAllsheng מכשיריםND-500ספקטרופוטומטר לכימות DNA
מכשיר PCR A300 מהיר תרמי CyclerLongGeneA300מחזור תרמי להגברת PCR
פריימרים ובדיקה TaqManSangon Biotechמסונתזים בהתאמה אישיתובדיקה TaqMan לזיהוי T790M
מכשיר qPCR עדין יותר מיניTianlong טכנולוגיהעדינה יותר מיניPCR מכשיר
T790M מוטציה פלסמידTsingke ביולוגיהT790Mעקומה סטנדרטית ובדיקת גבול זיהוי
טיפה שבב מחולל פריימרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
  2. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  3. Harkati, I., Hilali, M. K., Oumghar, N., Khouchani, M., Loukid, M. Lifestyle and sociodemographic and economic characteristics of patients with lung cancer in Morocco. Can Respir J. 2020 (1), 8031541(2020).
  4. Zhang, X., Zhao, Y., Wang, M., Yap, W. S., Chang, A. Y. -c Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutations in cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 60 (2), 175-182 (2008).
  5. Hackner, K., et al. Detection of EGFR activating and resistance mutations by droplet digital PCR in sputum of EGFR-mutated NSCLC patients. Clin Med Insights Oncol. 15, 1179554921993072(2021).
  6. Hanna, N., et al. Systemic therapy for stage IV non-small-cell lung cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (30), 3484-3515 (2017).
  7. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 378 (2), 113-125 (2018).
  8. Rosell, R., Bivona, T. G., Karachaliou, N. Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment. Lancet. 382 (9893), 720-731 (2013).
  9. Ohashi, K., Maruvka, Y. E., Michor, F., Pao, W. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease. J Clin Oncol. 31 (8), 1070-1080 (2013).
  10. Simarro, J., et al. Technical validation and clinical implications of ultrasensitive PCR approaches for EGFR-Thr790Met mutation detection in pretreatment FFPE samples and in liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Int J Mol Sci. 23 (15), 8526(2022).
  11. Yu, H. A., et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 19 (8), 2240-2247 (2013).
  12. Wang, W., Song, Z., Zhang, Y. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Cancer Med. 6 (1), 154-162 (2017).
  13. Hendriks, L. E., et al. Lung cancer in the Netherlands. J Thorac Oncol. 16 (3), 355-365 (2021).
  14. Visser, E., et al. Up-front mutation detection in circulating tumor DNA by droplet digital PCR has added diagnostic value in lung cancer. Transl Oncol. 27, 101589(2023).
  15. Ilié, M., Hofman, P. Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy. Transl Lung Cancer Res. 5 (4), 420(2016).
  16. Cheng, M. L., et al. Circulating tumor DNA in advanced solid tumors: clinical relevance and future directions. CA Cancer J Clin. 71 (2), 176-190 (2021).
  17. Weber, B., et al. Detection of EGFR mutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays. BMC Cancer. 14, 1-6 (2014).
  18. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  19. Bruhn, N., et al. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor cells and from plasma DNA of patients with lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 906 (1), 72-82 (2000).
  20. Kohsaka, S., Petronczki, M., Solca, F., Maemondo, M. Tumor clonality and resistance mechanisms in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer: implications for therapeutic sequencing. Future Oncol. 15 (6), 637-652 (2018).
  21. Takeda, M., et al. Impact of coexisting gene mutations in EGFR-mutated non-small cell lung cancer before treatment on EGFR T790M mutation status after EGFR-TKIs. Lung Cancer. 139, 28-34 (2020).
  22. Demuth, C., et al. Measuring KRAS mutations in circulating tumor DNA by droplet digital PCR and next-generation sequencing. Transl Oncol. 11 (5), 1220-1224 (2018).
  23. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Rev Mol Diagn. 18 (1), 7-17 (2018).
  24. Yu, Q., et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Mol Med Rep. 16 (2), 1157-1166 (2017).
  25. Zhao, Y., et al. Deep learning using histological images for gene mutation prediction in lung cancer: a multicentre retrospective study. Lancet Oncol. 26 (1), 136-146 (2025).
  26. Williamson, D. F., et al. Detection of EGFR mutations in non-small cell lung cancer by droplet digital PCR. PLoS One. 17 (2), e0264201(2022).
  27. Tang, C., et al. Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients. Clin Chim Acta. 510, 88-96 (2020).
  28. Xu, S., et al. Exploring the impact of egfr T790m neighboring snps on arms-based t790m mutation assay. Oncol Lett. 12 (5), 4238-4244 (2016).
  29. Merker, J. D., et al. Circulating tumor DNA analysis in patients with cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists joint review. J Clin Oncol. 36 (16), 1631-1641 (2018).
  30. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  31. Newman, A., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med. 20 (5), 548-554 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRPCREGFRT790MqPCREGFR TKI
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים