הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירת פגיעה חוזרת של שבץ איסכמי במודל חסימת עורק מוח אמצעי משני בעכבר

918 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68806

⸱

16 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה לחסימת עורק המוח האמצעי המשני בעכברים כדי לחקור את התקדמות השבץ האיסכמי החוזר. מתוארים ההליכים הכירורגיים, הטיפול לאחר הניתוח, שינויים פתולוגיים עצביים ושיעור ההישרדות.

תקציר

שבץ מוחי הוא הגורם השני המוביל בעולם לתמותה ונכות, כאשר שבץ מוחי חוזר תורם באופן משמעותי לתוצאות גרועות ולעומס נוירולוגי מוגבר. למרות ההתקדמות בניהול שבץ מוחי קליני חריף, מודלים ניסיוניים לשבץ איסכמי חוזר נותרו מוגבלים בשל מורכבותם הפרוצדורלית ושיעורי התמותה הגבוהים. במחקר זה, מטרתנו הייתה לבסס שבץ איסכמי חוזר במודל של עכבר ולהעריך את השינויים הפתולוגיים במוח והליקויים התפקודיים באמצעות פרוטוקול דו-שלבי של חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO). עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים עברו MCAO חולף תחת ניטור זרימת דם בלייזר דופלר. MCAO משני בוצע 14 יום לאחר הניתוח הראשוני כדי לדמות הישנות שבץ מוחי. ההערכות לאחר הניתוח כללו ניתוח פעילות תנועתית, ניקוד ליקויים נוירו-התנהגותיים באמצעות מערכת ניקוד של שש נקודות, סמנים דלקתיים כולל גורם המעורר היפוקסיה-1α (HIF-1α) וגורם נמק גידול-α (TNF-α), והערכה היסטופתולוגית באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E). לאחר מתן MCAO חוזר, עכברים הראו ירידה משמעותית בפעילות התנועה, ירידה במהירות התנועה וירידה בציונים נוירו-התנהגותיים, כמו גם סמנים דלקתיים מוגברים, בהשוואה לקבוצות הביקורת. גילוי היסטופתולוגי חשף נמק תאי עצב בינוני עד חמור, ואקואולציה נוירופילית ודימום מקומי בקליפת המוח ובהיפוקמפוס של עכברי MCAO חוזרים. הסמנים הדלקתיים הושרו גם בהליך MCAO חוזר זה. מודל עכבר MCAO דו-שלבי זה מציג, לראשונה, שיטה המדמה ביעילות שבץ איסכמי חוזר עם תוצאות נוירולוגיות ופתולוגיות עקביות ומשפרת את ההישרדות לאחר הניתוח. מודל זה יכול לספק פלטפורמה אמינה למחקרים מכניסטיים ועשוי להיות מיושם בהערכה עתידית של טיפולים נוירו-פרוטקטיביים לשבץ מוחי חוזר.

מבוא

שבץ מוחי נותר גורם מוביל למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם, ומהווה נטל קליני וסוציו-אקונומי משמעותי. יותר מ-30 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים משבץ מוחי והשלכותיו, כולל אובדן ניידות, ליקוי קוגניטיבי וסיכון מוגבר למחלות כלי דם 1,2. למרות ההתקדמות בטיפול אקוטי כגון טרומבוליזה וכריתת פקקת אנדווסקולרית, שורדים רבים נותרו בסיכון גבוה להישנות שבץ מוחי, הקשור להחמרה בפרוגנוזה, נכות גדולה יותר ושיעורי תמותה מוגברים. שבץ מוחי חוזר מתרחש בכ-10-20% מהחולים תוך 90 יום מהאירוע הראשוני, עם הסיכון הגבוה ביותר בתקופה של התקף איסכמי חולף או שבץ מוחי קל3. חשוב מכך, שבץ מוחי חוזר משפיע לעתים קרובות על טריטוריות כלי הדם וגורם לאוטם נרחב יותר ולפגיעה חמורה, כגון ליקוי המודינמי במוח4, חוסר ויסות חיסוני חריף וכרוני ונמק עצבי תת-קורטיקלי5, מה שמרמז על כך שהמוח עלול להיות פגיע יותר ולגרום לסיבוכים נוספים בעקבות עלבון איסכמי ראשוני.

כמה מחקרים שנערכו לאחרונה ביצעו מודלים של שבץ איסכמי או דימומי, בחיות ניסוי וחשפו דפוסי פגיעה ספציפיים לאזור, תגובות נוירו-וסקולריות משובשות ומנגנוני תיקון אנדוגניים שונים כדי להתאים למצבים קליניים אנושיים 6,7. עם זאת, המודלים המחקריים של שבץ מוחי חוזר נותרו פחות מבוססים בגלל ההליכים המסובכים שלהם ושיעור התמותה הגבוה. כמה מחקרים קודמים ביססו מודל עכבר פוטוטרומבוטי, שהתגלה ככלי רב ערך לחקר שבץ איסכמי חוזר 8,9,10. הם הדגימו את הפגיעה העצבית המחמירה, התגובה הדלקתית הממושכת והירידה הקוגניטיבית בעכברים עם שבץ חוזר, וחקרו את המנגנונים הבסיסיים, כולל דמנציה מרובת אוטם ותחול דלקתי 8,9,10.

מחקר אחר הראה מודל עכבר מזדקן חדש של דימום תוך מוחי חוזר בסטריאטום הדו-צדדי, שהוזרק לו קולגנאז פעמיים, מה שגרם לעיכוב בהתאוששות בתפקוד התנועתי, וגרם לאובדן קוגניטיבי ולפגיעה נוירולוגית בעכברים חוזרים11. ראוי לציין כי מודלים של עכברי שבץ פוטוטרומבוטיים ודימומיים גורמים לעתים קרובות לנגעים באזורים אנטומיים מובהקים במהלך שבץ חוזר, המשקפים הבדלים מתודולוגיים מובנים. וריאציות כאלה יוצרות דפוסים הטרוגניים של פגיעה עצבית, משבשות את הדינמיקה המיקרו-סירקולטורית ומפעילות השפעות שונות על תגובות חיסוניות היקפיות11,12. לעומת זאת, מודל MCAO, הנחשב לפרדיגמת המכרסמים המייצגת ביותר של שבץ איסכמי, מציע את היתרון של יציבות פרוצדורלית ומאפשר שליטה מדויקת הן על האתר והן על משך החסימה המוחית. עם זאת, MCAO ו-MCAO חוזרים הראו גם סיכון גבוה משמעותית לתמותה13,14, מה שמטיל מגבלות משמעותיות על יישומם הרחב יותר במחקר ניסיוני. במחקר זה, מטרתנו הייתה לבסס מודל עכבר MCAO דו-שלבי יציב וניתן לשחזור המחקה שבץ חוזר. הערכנו את הפגיעה העצבית הקשורה אליה, ליקויים תפקודיים ושינויים היסטופתולוגיים. מודל זה גם הראה שיעור הישרדות יציב, מה שמרמז על יישומו למחקר עתידי על פתופיזיולוגיה חוזרת של שבץ מוחי ואסטרטגיות טיפוליות נוירו-פרוטקטיביות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של טייוואן (תוכנית מחקר ID20230335) ונערכו בהתאם להנחיות אתיות שנקבעו לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת בעלי חיים

  1. עכברי בית C57BL/6J זכרים בני 8 שבועות במשקל 20-25 גרם בתנאי סביבה מבוקרים בטמפרטורה של 22 ±-1 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 55% ומחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך. לספק טיפול אנושי עם גישה חופשית למזון ומים מזוקקים.
  2. הקצה באופן אקראי 28 עכברים זכרים לשלוש קבוצות: דמה (n = 8), MCAO (n = 10) ו- MCAO חוזר (n = 10). בעלי חיים בהסגר למשך שבועיים (-d14); לבצע התאקלמות, שקילה וקיבוץ ב-D7-; לנהל MCAO ב-d0; לערוך בדיקות התנהגות ב-D0, D2, D14 ו-D16; ולבצע ניתוחי MCAO חוזרים ב-d14.

2. מתן MCAO כירורגי ראשון

  1. יש לעקר את כל המכשירים הכירורגיים על ידי חיטוי, לשקול כל עכבר, לתת קרפרופן דרך הפה במינון של 5 מ"ג/ק"ג שעה לפני החתך הראשוני, ולגרום להרדמה עם איזופלורן 3% בגז מעורבב בחמצן.
  2. עקוב אחר קצב הנשימה (100-120 נשימות לדקה, BPM) והעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקת העפעף ורפלקס הבליעה. מקם את הנבדק על לוחית חימום אלקטרונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס.
  3. גלחו את הגב והצוואר ליד הראש והסירו את הפרווה והפסולת של עכברים באמצעות ואקום. מרחו משחה עיניים, שפשפו את העור וחיטאו בהליכים אספטיים לניתוח הישרדות מכרסמים.
  4. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע את החתך הראשוני של 0.5 ס"מ בין האוזניים כדי לחשוף את הצד השמאלי של קו האיחוי המרכזי והאחורי לברגמה בגולגולת. הסר את הרקמה הרכה על גבי הגולגולת באמצעות מלקחיים.
  5. מרכז את מתאם דופלר הלייזר במוח העכבר והצמד אותו עם דבק רקמות במיקום 3 מ"מ לרוחב משמאל ו-2 מ"מ זנב לברגמה, וודא שקצה המתאם גזוז מראש כך שיתאים לבסיס הגולגולת, ולאחר מכן אבטח את מכסה דופלר הלייזר עם דבק כדי לאפשר ניטור רציף של זרימת הדם.
    הערה: בשלב זה, הצמד את מכסה דופלר הלייזר היטב בברגמה באמצעות דבק רקמות, ומקם אותו בצומת התפרים העטרתיים והסגיטליים בקו האמצע העליון של הקלווריה כדי להבטיח ניטור יציב של זרימת הדם המוחית.
  6. כאשר אתה בטוח עם האזור החתוך, משוך דבק רקמות באמצעות המיקרופיפטה ומרח את הדבק סביב בסיס המתאם.
  7. הכן מלט דנטלי והחל כמות מספקת כדי להקיף את מכסה הדופלר כדי להבטיח את יציבותו לאורך כל ההליך.
  8. סובב את החיה למצב שכיבה ובצע חתך עור של 1 ס"מ מכניסת בית החזה לכיוון הסנטר לאורך קו האמצע של הצוואר.
  9. המשך בדיסקציה קהה כדי להפריד את הבטן האחורית של השרירים הדיגסטריים, הסטרנוהיואידים והסטרנומסטואידים, ולאחר מכן השתמש במחזירים כדי למשוך בעדינות את השרירים כדי לחשוף את עורקי הצוואר המשותפים (CCA), החיצוניים (ECA) והפנימיים (ICA), והנח קטע של משי 6-0 סביב ה-CCA.
    הערה: בשלב זה, יש להפנות את בלוטות הרוק כלפי מעלה כדי להקל על בידוד ההסתעפות של CCA ו-ECA. ה-ICA ממוקם טוב יותר מה-CCA. דיסקציה קהה עם מלקחיים של העור משמשת למניעת קרע בכלי הדם ולבידוד הרקמות הרכות והעצבים שמסביב.
  10. אתר ענף קטן (עורק בלוטת התריס העליון, STA) הבולט מה-ECA. השתמש בצריבה הדו-קוטבית כדי לשרוף את הענף הקטן הזה. המשך לחתוך את הכלי השרוף; זה יבודד עוד יותר את ה-ECA.
    הערה: STA הוא בדרך כלל הענף הראשון של ה-ECA היוצא מתחת לגובה הקרן הגדולה יותר של עצם ההיואיד. כדי למנוע פציעה, השתמש בצריבה דו קוטבית כדי לשרוף את ענף הכלי כדי להשיג המוסטזיס.
  11. הנח שני חלקים של תפר משי 6-0 סביב ECA. צור קשר קבוע בצד הדיסטלי של ה-ECA וקשר רופף באתר ההתפצלות.
  12. הנח את בדיקת מחט הלייזר דופלר לתוך מתאם הבדיקה שעל הגולגולת. ודא שתוכנת הרכישה מציגה ערך קריאת זרימת דם מוחית (CBF). הקלט את הקריאה הבסיסית.
    הערה: המדד הסטנדרטי של CBF שהושג על ידי לייזר דופלר הוצג כיחידות זלוף (PU), כאשר ערכי הבסיס מכוילים בדרך כלל בטווח של 350 עד 450. אם נצפים ערכי יחידת זלוף (PU) מופחתים, כוונן את המיקום של מתאם בדיקת דופלר לייזר בעכבר כדי להבטיח מדידה מדויקת (ראה שלב 2.5).
  13. מהדק את ה-ICA באמצעות מהדק כלי הדם המיקרו-וסקולרי והשתמש בקטע המשי 6-0 סביב ה-CCA כדי ליצור קשר החלקה כדי לקשור את ה-CCA באופן זמני.
    הערה: בשלב זה, מתגלה הפחתה של CBF בצג דופלר הלייזר.
  14. הכן את מונופילמנט הניילון המצופה גומי סיליקון. סמן את החוט באמצעות ה-Sharpie הכסוף במרחק של 9-10 מ"מ מקצה ראש הסיליקון, והשתמש במספריים מיקרו-כירורגיים כדי לבצע חתך קטן בין התפר ההדוק לתפר הרופף ב-ECA.
    הערה: יש לנקות ולשטוף את שאריות הדם באתר החתך במי מלח עם פוספט (PBS) כדי לשמור על שלמות כלי הדם.
  15. הכנס בזהירות את החוט (ראש הסיליקון תחילה) לתוך ה-ECA דרך החתך הקטן.
    הערה: שלב החדרת נימה זה מושמט בחיות הדמה.
  16. כאשר כמחצית מראש הסיליקון הוכנס, הדק מעט את התפר הרופף סביב העורק והחוט, והסר את המהדק על ה-ICA.
  17. חותכים את ה-ECA מתחת לקשר ההדוק הראשון, סובבו בזהירות את כלי ה-ECA והחוט כלפי מטה (נגד כיוון השעון) כך שראש הסיליקון יפנה כלפי מעלה, ודחפו את קצה החוט כלפי מעלה לכיוון ה-ICA.
    הערה: שלב זה הוא קריטי ויש לבצע אותו לאט נגד כיוון השעון כדי למזער את ההפרעה בכלי הדם ולהפחית את הסיכון להסתבכות או קרע.
  18. ברגע שכל חלק הסיליקון נמצא בכלי הדם, הדק מעט את תפר האחיזה, שחרר את קשר ההחלקה על ה-CCA והמשך לדחוף את החוט פנימה, תוך שימוש בסימון הכסף על החוט להנחיית מיקום.
  19. עקוב באופן רציף אחר תוכנת הלייזר דופלר, וכאשר ההתנגדות מונעת התקדמות נוספת של החוט בכוח מתאים תוך כדי ירידה חדה ב-CBF, הפסק את ההחדרה לעורק המוח האמצעי הדיסטלי.
    הערה: הפחתת CBF לפחות מ-30% מהמצב הפריאסכמי היא הליך סטנדרטי המכונה שיטת לונגה15.
  20. שמור את החוט בתוך MCA למשך 40 דקות כדי לגרום לפגיעה איסכמית מוחית.
  21. הסר את החוט לאחר התקופה האיסכמית המיועדת של 40 דקות כדי להקים מחדש CBF, מרח דבק רקמות כדי להשיג המוסטזיס, רשום את מדידת ה-CBF המשוחזרת המתאימה, נתק את כל המחזירים והסר את המתאם המותקן על הגולגולת.
  22. סגור את חתך העור ליד הכלי בעזרת קליפ פצע, שמור על ניטור רציף של טמפרטורת הגוף ב-37 מעלות צלזיוס והעריך את קצב הנשימה. לאחר אישור לחץ דם ונשימה יציבים בטווח של 160-200 פעימות לדקה, יש להפסיק את ההרדמה ולאפשר התאוששות.

3. מינהל MCAO שני

  1. הסר את קליפס הפצע 14 יום לאחר ניתוח ה-MCAO הראשוני, ולאחר מכן חזור על שלבים 2.1 עד 2.9 כדי להשלים את הכנת הגולגולת, לאבטח את מיקום בדיקת דופלר הלייזר ולחשוף את ה-CCA.
  2. בודד CCA מהרקמה הסובבת והניח שלושה מקטעים של תפר משי 6-0 סביב CCA.
  3. הנח את בדיקת דופלר הלייזר במתאם ורשום את ה-CBF הבסיסי.
  4. צור קשר החלקה בצד הדיסטלי של CCA, קשר קבוע בקצה הפרוקסימלי וקשר רופף ביניהם.
  5. הכן את הניילון המצופה גומי סיליקון של חוט החסימה למתן MCAO לפי שלב 2.14 המתואר.
  6. בצע חתך קטן על ה-CCA קרוב לקבוע, והכנס את החוט לתוך ה-CCA.
    הערה: יש לנקות ולשטוף את שאריות הדם באתר החתך עם PBS כדי לשמור על שלמות כלי הדם. זה חשוב מאוד.
  7. הדק מעט את הקשר הרופף ושחרר את קשר ההחלקה. קדם את החוט לתוך ה-ICA עד שהחוט נמצא בכוח מתאים ומתגלה ירידה ניכרת ב-CBF.
    הערה: הפחתת CBF לפחות מ-30% מהמצב הפריאסכמי נחשבת גם היא להליך סטנדרטי.
  8. שמור על החוט במקומו למשך 40 דקות כדי לגרום לפגיעה איסכמית, כמפורט בשלב 2.20.
  9. עם השלמת המרווח האיסכמי המיועד, משוך את החוט וסגור את חתך העור בהתאם להליכים המתוארים בשלבים 2.21 ו-2.22 של ניתוח MCAO הראשוני.

4. טיפול לאחר ניתוח

  1. יש לתת מי מלח חמים רגילים תת עוריים במינון של 10 מ"ל ק"ג-1 יום פעמיים ביום במשך 3 ימים רצופים כדי למנוע התייבשות לאחר ניתוח MCAO. יש למרוח תמיסת פובידון-יוד 10% על מקום הניתוח ולתת אמוקסיצילין (10 מ"ג/ק"ג) למניעת זיהום. יש לספק קרפרופן דרך הפה (5 מ"ג/ק"ג) למשך 3 ימים כדי להקל על הלחץ שלאחר הניתוח ולהקל על ההתאוששות בפיקוח וטרינרי לאחר ההליך הראשון והשני של MCAO.
  2. ערכו הערכות יומיות של מצב בריאותם של עכברים. רשום שינויים במראה, כמו גם צריכת מזון ומים במהלך ההליך הראשון והשני.

5. פעילות תנועתית של בעלי חיים והערכת פגיעות נוירוביולוגיות

  1. להעריך פעילות תנועתית על ידי הערכת מסלול תנועה, מרחק ומהירות. מקם עכברים בתוך קופסאות בדיקה (10 x 20 x 15 ס"מ) והגדר בתנאי בהירות נמוכה.
  2. התאקלמו את העכבר לסביבת הבדיקה באמצעות תקופת ייצוב של 30 דקות, ואחריה הערכה רשמית של 10 דקות. רשום ונתח את כל הפרמטרים, כולל מרחק תנועה (ס"מ), מהירות (ס"מ לשנייה), משך תנועה, משך זמן כולל באזור, חביון של המופע הראשון (ים) ומעלות כיוון (זמנים) כדי לקבוע פעילות תנועתית.
  3. להעריך פגיעה נוירוביולוגית באמצעות מערכת ניקוד תפקוד מוטורי מותאמת (0-6 נקודות)16 והתייחסות לציוני mNSS (בחלק מהערכת תפקוד מוטורי, 6 נקודות)17.
  4. הגדר את רמות הפציעה באופן הבא: ציון 0 עבור היעדר ליקוי נוירולוגי, ציון 1 עבור כיפוף הגפיים הקדמיות המשפיע על שורש כף היד או הכתף, ציון 2 עבור כיפוף הגפיים הקדמיות המלווה בהתנגדות מופחתת לדחיפה לרוחב, ציון 3 עבור סיבוב חד כיווני לכיוון צד הגירעון, ציון 4 עבור סיבוב אורכי לכיוון הצד החסר, ציון 5 עבור סיבוב אורכי המלווה בפעילות התקפים, וציון 6 על אובדן תנועה מוחלט.

6. פרוטוקול צביעת המטוקסילין ואאוזין

  1. תקן MCAO ורקמת מוח MCAO חוזרת במאגר פורמלדהיד של 10%, ונתח את הדגימה לארבעה חלקים שווים באמצעות פורס מוח עכבר עטרה 1 מ"מ. עבד את החלק הקדמי השלישי להערכה פתולוגית.
  2. בצע התייבשות של דגימות משובצות פרפין: קסילן למשך 10 דקות, 95% אתנול למשך 10 דקות, 75% אתנול למשך 10 דקות, 50% אתנול למשך 10 דקות, מים מזוקקים (ddH2O) למשך 10 דקות ו-PBS למשך 10 דקות.
  3. מכתים את הדגימות: כתם המטוקסילין למשך 45 שניות ושטיפה ב-ddHחם 2O ב-30 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; כתם אאוזין למשך 30 שניות ובקור ddH2O למשך 45 שניות.
  4. יש לייבש ולייבש את הדגימות ב-75%, 95%, 100% אתנול ובקסילן למשך 45 שניות כל אחד, ולייבש באוויר למשך 60 שניות.
  5. הרכיבו את המגלשות ואחסנו אותן בתא חשוך.
  6. להעריך את חומרת הנגע על פי קריטריון קבוע בסולם של חמש נקודות: 1 = מינימלי (<1%); 2 = קל (1-25%); 3 = בינוני (26-50%); 4 = בינוני עד חמור (51-75%); 5 = חמור (76-100%). לבצע בדיקה פתולוגית של רקמת המוח בהערכה עיוורת על ידי פתולוג וטרינרי.

7. פרוטוקול הכתמה מערבית

  1. הומוגניזציה של רקמות מוח מ-MCAO ועכברים חוזרים במאגר RIPA בתוספת מעכב פרוטאז ופוספטאז (נתרן פלואוריד 30 מ"מ, נתרן אורתוואנדט 30 מ"מ ונתרן פירופוספט 30 מ"מ).
  2. צנטריפוגה ליזאטית ב-10,000 x גרם ואוספת את הסופרנטנט. כמת את ריכוז החלבון העל-טבעי באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA).
  3. בצע ספיגה מערבית כפי שתואר קודם לכן18: טען 20 מיקרוגרם של חלבון כולל מפורק, שהוכן על ידי רתיחה במים רותחים של 100 מעלות צלזיוס, לתוך ג'לים של 8-12% נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE).
  4. מעבירים עם 100 וולט למשך 90 דקות כדי להפריד חלבונים על ממברנות PVDF בחדר הקירור ולחסום ממברנות עם אלבומין סרום בקר 3% למשך 60 דקות.
  5. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם גורם נמק גידול אלפא (TNF-α, 1:1000 דילול), גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH, 1:2,000 דילול), ופקטור אלפא 1 המעורר היפוקסיה (HIF-1α, 1:1,000 דילול). דגרו ממברנות עם נוגדנים משניים מתאימים למשך שעה.
  6. זהה ביטוי חלבון באמצעות ערכת מצע כימילומינסנציה משופרת (ECL) והדמיה באמצעות מערכת הדמיית צילום דיגיטלית.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג נתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) ובצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ניתוח שונות חד כיווני (ANOVA), ולאחר מכן מבחן הפוסט הוק של טוקי כדי לקבוע הבדלים בין מספר קבוצות. לפרש את התוצאות כמובהקות סטטיסטית כאשר p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פעילות תנועתית והערכת פגיעה עצבית בעכברי MCAO ראשונים וחוזרים
בהליכי MCAO הראשונים, הוכנס מונופילמנט ניילון מצופה גומי סיליקון מה-ECA, ICA ל-MCA למשך 40 דקות. ניתן היה לזהות את זרימת הדם המוחית (CBF) יורדת באופן בולט (ירידות <30% מקו הבסיס) על ידי ציוד הלייזר דופלר, כאשר החוט נשאר באזור ה-MCA. בהליך זה, כל העכברים הגיעו ביציבות לסף זה ושרדו. כמה מחקרים קודמים הצביעו על כך שהשינויים במשקל הגוף מתאוששים19 ותנאי ההישרדות יציבים לאחר טיפול כירורגי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שבץ מוחי נותר הגורם השני המוביל לתמותה ונכות ברחבי העולם, עם סיכון גבוה לשבץ מוחי חוזר. נכון לעכשיו, למרות ההתקדמות בפיתוח הטכנולוגיה והאסטרטגיות הרפואיות, מניעת שבץ מוחי והישנותו נותרו לא מספיקים לשיפור. בעשורים האחרונים נעשה שימוש נרחב במודלים שונים של שבץ מוחי בחקירת מחקר של פגיעה ומנגנונים איסכמיים של שבץ מוחי. ביניהם, השיטה הכירורגית MCAO נחשבת לקרובה ביותר להפרעות וסיבוכים איסכמיים בבני אדם ביותר מ-40% מחקר המנגנון הנוירולוגי ומחקרי ההגנה24. עם זאת, מעט מחקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה טכנית על ידי צוותי המרכז הלאומי לחיות מעבדה ונתמכה כספית על ידי מענקים מקרן בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן, טייוואן (112-S0074), בית החולים האוניברסיטאי הרפואי של סין, טייוואן (CMU113-S-06), והמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טאיפיי, טייוואן (112-2314-B-002 -219).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר משי 6-0  שין-טה בע"מ. אזהרת מידעST1N-ST6
חותך מוח עכבר קורונלי בקוטר 1 מ"מתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, ארה"בV11335
מכונת תספורת שיער של בעלי חייםאורבן. תקשורת בע"מMB033
חותך מוח עכבר קורונליכלי זיוויק. Inc USA BSMAS001-1
מערכת צילום דיגיטליתAzure Biosystem, Inc., דבלין, קליפורניה, ארה"בAzure -300
קוטריזר דו-קוטבי אלקטרוניאינדיאמארטAARON 940
פלטת חימום אלקטרוניתרפטיזוAHM23
משחת עינייםלודי וטרינרי קר. אותנו17033-21-38
גלאי לייזר דופלרMoor Instruments UK  moorVMS-LDF1-HP
מתאם לייזר דופלרתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.05-700-76
גלאי פעילות מוטורית Orchid scientific Inc.כל תוכנות המעקב אחרי מבוך.
(מערכת כל המבוך)Orchid scientific Inc.טרקזי. גרסה 7.39
מהדק כלי דם מיקרו-וסקולרישין-טה בע"מ. אזהרת מידעST-M104
מספריים לכלי דם מיקרוכירורגייםשין-טה בע"מ. אזהרת מידעST-V108
מד קצב נשימהSDR מדעי בע"מ. ארה"בSAR-830/AP
מונופילמנט ניילון מצופה סיליקון בגומיפישר סיינטיNC1773962
מלקחי עורשין-טה בע"מ. אזהרת מידעST-H212
מספרי עורשין-טה בע"מ. אזהרת מידעST-S014PK
מטלית כותנה סטריליתווינר מדיקל401 003
מערכת העברותמערכת חצי-יבשה. מעבדת Bio-rad, ארה"ב)1703940
<חזק>כימיקלים
10% povidone– תמיסת יודיושידה פארמה בע"מ JAPPVP– I  10%
75% תמיסת אתנול  סיגמא-אלדריץ'. ארצות הברית111727
אמוקסיציליןסיגמא-אלדריץ', ארה"ב  A5955
אלבומין סרום בקרסיגמא-אלדריץ', ארה"ב.A2153
קרפרופןPlexx Inc. בריטניהMD150-2
נוגדן GAPDHSanta Cruz Biotechnology, קליפורניה, ארה"בSC-32233
H& פתרון EBioPioneer Tech. CO. TWG1005
נוגדן אלפא 1 המושרה להיפוקסיהטכנולוגיית איתות סלולרי, מסצ'וסטס, ארה"ב#36169
איזופלורן (הרדמה)מדעי החייםR510-22-10
סליין רגיל סטרילינובה-טק בע"מ ארה"ב1760RX
פקטור נמק הגידול אלפאטכנולוגיית איתות סלולרי, מסצ'וסטס, ארה"ב#3707

מקורות

  1. Johnson, W., Onuma, O., Owolabi, M., Sachdev, S. Stroke: a global response is needed. Bull World Health Organ. 94 (9), 634-634A (2016).
  2. Wu, C. T., et al. Low intensity pulsed ultrasound prevents recurrent ischemic stroke in a cerebral ischemia/reperfusion injury mouse model via brain-derived neurotrophic factor induction. Int J Mol Sci. 20 (20), (2019).
  3. Coull, A. J., Lovett, J. K., Rothwell, P. M., Oxford Vascular , S. Population based study of early risk of stroke after transient ischaemic attack or minor stroke: implications for public education and organisation of services. BMJ. 328 (7435), 326(2004).
  4. Hartkamp, N. S., et al. Relationship between haemodynamic impairment and collateral blood flow in carotid artery disease. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (11), 2021-2032 (2018).
  5. Khanevski, A. N., et al. Recurrent ischemic stroke: incidence, predictors, and impact on mortality. Acta Neurol Scand. 140 (1), 3-8 (2019).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  8. Schmidt, A., et al. Progressive cognitive deficits in a mouse model of recurrent photothrombotic stroke. Stroke. 46 (4), 1127-1131 (2015).
  9. He, X. F., et al. Extracellular ASC exacerbated the recurrent ischemic stroke in an NLRP3-dependent manner. J Cereb Blood Flow Metab. 40 (5), 1048-1060 (2020).
  10. Feng, Y., et al. Cortical microinfarcts potentiate recurrent ischemic injury through NLRP3-dependent trained immunity. Cell Death Dis. 15 (1), 36(2024).
  11. Wang, L. M., et al. A novel aged mouse model of recurrent intracerebral hemorrhage in the bilateral striatum. Neural Regen Res. 18 (2), 344-349 (2023).
  12. Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Transl Stroke Res. 9 (5), 437-451 (2018).
  13. Wen, Z., et al. The effect of anterior communicating artery flow on neurovascular injury and neurobehavioral outcomes in mice with recurrent stroke. Brain Res. 1724, 146440(2019).
  14. Shvedova, M., et al. Modified middle cerebral artery occlusion model provides detailed intraoperative cerebral blood flow registration and improves neurobehavioral evaluation. J Neurosci Methods. 358, 109179(2021).
  15. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), (2011).
  16. Zhang, Y., et al. Treadmill exercise promotes neuroprotection against cerebral ischemia-reperfusion injury via downregulation of pro-inflammatory mediators. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 3161-3173 (2016).
  17. Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
  18. Hsu, Y. M., Yin, M. C. EPA or DHA enhanced oxidative stress and aging protein expression in brain of d-galactose treated mice. Biomedicine (Taipei). 6 (3), 17(2016).
  19. Sayed, M. A., et al. Stroke promotes the development of brain atrophy and delayed cell death in hypertensive rats. Sci Rep. 10 (1), 20233(2020).
  20. Kotoda, M., et al. Role of myeloid lineage cell autophagy in ischemic brain injury. Stroke. 49 (6), 1488-1495 (2018).
  21. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  22. Maddahi, A., Kruse, L. S., Chen, Q. W., Edvinsson, L. The role of tumor necrosis factor-alpha and TNF-alpha receptors in cerebral arteries following cerebral ischemia in rat. J Neuroinflammation. 8, 107(2011).
  23. Mojsilovic-Petrovic, J., et al. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is involved in the regulation of hypoxia-stimulated expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) and MCP-5 (Ccl12) in astrocytes. J Neuroinflammation. 4, 12(2007).
  24. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: a review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  25. Qiao, M., et al. Development of a model of recurrent stroke consisting of a mild transient stroke followed by a second moderate stroke in rats. J Neurosci Methods. 184 (2), 244-250 (2009).
  26. Fan, C., et al. Reduced severity of outcome of recurrent ipsilateral transient cerebral ischemia compared with contralateral transient cerebral ischemia in rats. J Stroke Cerebrovasc Dis. 26 (12), 2915-2925 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68806

תגיות

MCAO

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.