מאמר שיטה

גירוי של תאי אנדותל בכלי הדם באמצעות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנוכחות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה

981 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

12 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

במאמר זה

סיכום

מתוארת סדרה של שיטות, כולל בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) מפלזמה אנושית, התמיינות של תאי HL-60 לתאים דמויי נויטרופילים, הכנת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בנוכחות LDL, וגירוי של תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים עם תערובת של NETs ו-LDL.

תקציר

מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs) התגלו כגורמים סיבתיים במחלות שונות שאינן זיהומיות והיו מעורבות בהפרעות לב וכלי דם כגון טרשת עורקים ופקקת. היווצרות NET נצפתה בדופן כלי הדם, וישנן ראיות משכנעות לכך שסמני הפלזמה של היווצרות NET עולים עם חומרת המחלה. רכיבי NET שמקורם בנויטרופילים, כולל מיאלופרוקסידאזות ופרוטאזות, משפיעים על ליפופרוטאינים בפלזמה ועל הומאוסטזיס כלי דם. כאן מתוארת סדרה של שיטות לגירוי תאי כלי דם עם NETs שנוצרו בנוכחות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). LDL הופרד מפלזמה אנושית על ידי אולטרה-צנטריפוגה. תאי HL-60 טופלו בחומצה רטינואית טראנס כדי להבדיל אותם לתאים דמויי נויטרופילים ולאחר מכן עוררו עם פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) כדי לגרום להיווצרות NET. לאחר ההסרה והשטיפה של PMA, התאים הודגרו עוד יותר עם LDL. הסופרנטנטים שנאספו המכילים NETs ו-LDL שימשו מיד לגירוי תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים (HAECs). כתגובה מייצגת, השינוי המורפולוגי של HAECs המושרה על ידי טיפול ב-NET שופר על ידי נוכחות LDL, מה שמצביע על כך שהיווצרות NET, בשילוב עם LDL, משפרת את התגובה של HAECs. שיטות אלו מועילות לחקר ההשפעות של LDL על תאי אנדותל תחת הפעלת נויטרופילים ודלקת הקשורה ל-NET, ובכך מספקות תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מחלות לב וכלי דם הקשורות לעלייה ב-LDL בפלזמה.

מבוא

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), המיוצרות על ידי נויטרופילים מופעלים בעת זיהום חיידקי, כמו גם בתנאים לא זיהומיים סבירים מבחינה פיזיולוגית, משחררות DNA וחלבונים מעובים, כגון היסטונים, מיאלופרוקסידאז (MPO) ונויטרופילים אלסטאז1. מכיוון שרכיבים אלה יכולים לפרק תאים ורקמות שוליים ולגרום לדלקת מתמשכת, היווצרות NET התגלתה כגורם סיבתי בהתחלה והתקדמות של מחלות חריפות וכרוניות שונות, כולל דלקת מפרקים שגרונית, פסוריאזיס, סוכרת, מחלת אלצהיימר, גרורות סרטניות ומחלות לב וכלי דם2. ניתוחים היסטולוגיים של נגעים בכלי הדם האנושיים של טרשת עורקים3 ומפרצת אבי העורקים הבטני4 הראו כי חדירת נויטרופילים והיווצרות NET היו משותפים. במחזור הדם, רמות סמני NETs, כגון היסטונים ציטרולין, NET-DNA ו-MPO, עולות עם חומרת מחלת העורקים הכליליים5. בשלבים המוקדמים של טרשת עורקים, היווצרות NET מקדימה לעתים קרובות הצטברות שומנים, המתרחשת באמצעות היווצרות תאי קצף מונעת מקרופאגים 6,7. תופעות אלו מצביעות על כך ש-MPO ואנזימים פרוטאוליטיים המשתחררים מחוץ לתאית במהלך היווצרות NET יכולים לפעול לא רק על רקמות כלי הדם אלא גם על רכיבי דם, כגון ליפופרוטאינים. ליפופרוטאינים הם קומפלקסים של חלבון שומנים שבירים שעלולים להינזק על ידי חלבונים שמקורם ב-NET כגון MPO8; לפיכך, היווצרות NET עלולה לגרום לשינויים מבניים וביוכימיים בליפופרוטאינים, ובכך להשפיע על הומאוסטזיס בכלי הדם. עם זאת, ההשפעות הסינרגטיות של היווצרות NET וליפופרוטאינים על חוסר ויסות תאי כלי דם ותגובות דלקתיות נותרו לא ברורות.

כאן, כתב יד זה מספק שיטה לבחינת התגובות התאיות של תאי אנדותל כלי דם אנושיים המושרים על ידי טיפול ב-NETs שהוכנו מתאים דמויי נויטרופילים שמקורם ב-HL-60 וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL) שהופרדו מפלזמה אנושית. תוצאות מייצגות מדגימות את הפיצול של LDL מפלזמה אנושית על ידי אולטרה-צנטריפוגה ואת התגובות התאיות של תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים (HAECs) המגורים עם NETs לאחר דגירה משותפת עם LDL. שיטה זו ישימה באופן נרחב לחקר תאי כלי דם הכוללים ליפופרוטאינים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול להכנת LDL אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרוקחות של האוניברסיטה הרפואית Showa (מס' 231). הסכמה מדעת בכתב הושגה בהתאם להצהרת הלסינקי, וכל המשתתפים סיפקו מרצונם את חתימתם להשתתפות במחקר זה. התאים עברו מניפולציה אספטית באמצעות מכסה זרימה למינר. קריטריון ההכללה היה טווח גילאים של 22-65 שנים. הקריטריונים להחרגה כללו הרגלי עישון, מחלות לב וכלי דם קיימות (כגון מחלות לב כליליות, שבץ מוחי ומחלות עורקים היקפיים), תפקוד כבד חמור ומצבים כרוניים בלתי נשלטים, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, דיסליפידמיה, מחלות דלקתיות קשות וסרטן. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד LDL מפלזמה אנושית

  1. יש לאסוף דם מלא ממתנדב אנושי בריא בנוכחות הפרין נוגד קרישה (10 יחידות/מ"ל).
  2. צנטריפוגה 45-50 מ"ל של דם מלא אנושי המתקבל בשפופרת הפרין (700 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס). הקפד להפחית לאט את מהירות הצנטריפוגה. אוספים את השכבה העליונה הכוללת את שבר הפלזמה.
  3. בצע צנטריפוגה פעמיים (700 × גרם, 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) באותה הגדרת האטה כמו בשלב 1.2 כדי לחסל תאי דם. הוסף נפח של 1:1,000 של 250 מ"מ EDTA (pH 7.4) כדי למנוע חמצון מתכת דו-ערכי בתיווך יונים של ליפופרוטאינים.
  4. מניחים 2.7 מ"ל פלזמה בצינור 4 מ"ל-פוליקרבונט (4 יחידות), מכסים 900 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) המכיל 250 מיקרומטר EDTA (PBS/EDTA), ואולטרה-צנטריפוגה (600,000 × גרם, 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס).
  5. השליכו 900 מיקרוליטר מהשכבה העליונה כדי לחסל כילומיקרון. ערמו 900 מיקרוליטר של PBS/EDTA על פלזמה ואולטרה-צנטריפוגה (600,000 × גרם, 2.5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס).
  6. השליכו 900 מיקרוליטר מהשכבה העליונה כדי לחסל ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL). שלב זה חשוב כדי למנוע זיהום של LDL עם חלקיקי ליפופרוטאין אחרים.
  7. הוסף 540 מיקרוליטר של תמיסת KBr של 0.5 מ"ג/מ"ל כדי להתאים את הצפיפות ל-d = 1.063, ולאחר מכן ערבוב עדין עם פיפטה ולאחר מכן אולטרה-צנטריפוגה (600,000 x גרם, 2.5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס).
  8. אסוף 540 מיקרוליטר מהשכבה העליונה המכילה LDL. שכבה צהובה-כתומה מצביעה על הפרדת LDL מוצלחת9. מעבירים לקרום דיאליזה.
  9. דיאליזה של שבר ה-LDL שלוש פעמים כנגד 2 ליטר של PBS/EDTA ב-4 מעלות צלזיוס בחושך כדי לחסל KBr.
  10. יש לאחסן LDL בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך לפני השימוש.

2. הכנת בארות מצופות פולי-ליזין או ג'לטין

  1. הכן תמיסת פולי-L-ליזין 0.01%10 על ידי דילול תמיסת פולי-L-ליזין 0.1% במים סטריליים, ולאחר מכן סינון עם מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. הוסף 152 מיקרוליטר / באר של תמיסת פולי-L-ליזין 0.01% לכל באר של צלחת של 12 בארות ודגירה למשך 5 דקות לפחות.
  3. הסר את התמיסה ולאחר מכן שטוף פעם אחת עם 200 מיקרוליטר/באר מים סטריליים וייבש לפחות שעתיים.
  4. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לפני השימוש בהכנת NETs.

3. הכנת בארות מצופות ג'לטין

  1. הכינו תמיסת ג'לטין 0.1% לפני השימוש על ידי דילול תמיסת ג'לטין 2% במים סטריליים.
  2. הוסף 152 מיקרוליטר/באר מתמיסת הג'לטין של 0.1% לכל באר של צלחת של 12 בארות ודגר לפחות 5 דקות11.
  3. הסר את התמיסה ולאחר מכן שטוף פעם אחת עם 200 מיקרוליטר/באר מים סטריליים וייבש לפחות שעתיים.
  4. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

4. תחזוקה והכנה של תאי אנדותל אבי העורקים האנושי (HAECs)

  1. תרבית HAECs ראשוניים בבקבוק תרבית לא מצופה באמצעות מדיום שלם המכיל 2% סרום עגל עוברי (FCS), גורם גדילה אפידרמיס 5 ננוגרם/מ"ל, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי של 10 ננוגרם/מ"ל, גורם גדילה דמוי אינסולין 20 ננוגרם/מ"ל, גורם גדילה אנדותל כלי דם 0.5 ננוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית, 22.5 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, כפי שמצוין בהוראות היצרנים. החלף את המדיום כל יום לסירוגין עד שהתאים יהיו מתכנסים 70%-80%.
  2. לגירוי, זרעו HAECs בצלחות מצופות ג'לטין בעלות 12 בארות. החלף את המדיום כל יום לסירוגין עד שמגיעים למפגש. בצע את הניסוי בין פסקאות 4 ו-7.

5. הכנת תאים דמויי נויטרופילים שמקורם ב-HL-60 ואחריהם NETs

  1. שמרו על תאי HL-60 עם מדיום RPMI-1640 בתוספת 5% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין, באמצעות כלים לא מטופלים.
  2. להכנת תאים דמויי נויטרופילים שמקורם ב-HL-60, תרבית 2 ×-106 תאים לכל 10 מ"ל של תאי HL-60 למשך 4 ימים במדיום RPMI-1640 המכיל 2 מיקרומטר חומצה רטינואית טראנס (AtRA).

6. הכנת NETs עם LDL

  1. אסוף תאי HL-60 4 ימים לאחר הטיפול ב-2 מיקרומטר AtRA. לאחר התמיינות של תאי HL-60 לתאים דמויי נויטרופילים, התאים הופכים קטנים יותר.
  2. תאי צנטריפוגה (220 × גרם, 4 דקות בטמפרטורה של 18-22 מעלות צלזיוס). שאפו את הסופרנטנט ושטפו את התאים בנפח שווה של RPMI-1640 ללא סרום.
  3. צנטריפוגה של התאים (220 × גרם, 4 דקות בטמפרטורה של 18-22 מעלות צלזיוס) ולאחר מכן השעו מחדש את התאים עם RPMI-1640 ללא סרום.
  4. ספור את התאים, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ל-2 ×-106 תאים/מ"ל ב-RPMI-1640 ללא סרום וזרע 0.5 מ"ל של תרחיף תאים בבארות של צלחת בת 12 בארות מצופה מראש בפולי-L-ליזין. תרבות למשך 30 דקות לפחות.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של RPMI-1640 ללא סרום עם או בלי 300 ננומטר פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) לריכוז הסופי של 0 או 50 ננומטר PMA. תרבות למשך 30 דקות.
  6. הסר את המדיום ושטוף את התאים פעם אחת עם RPMI-1640 ללא סרום. החלף את המדיום ב-RPMI-1640 ללא סרום עם או בלי 20 מיקרוגרם/מ"ל של LDL ולאחר מכן תרבית למשך שעתיים.
  7. אוספים מדיום תרבית וצנטריפוגה (700 × גרם, 3 דקות בטמפרטורה של 18-22 מעלות צלזיוס) כדי להסיר פסולת תאים.

7. גירוי של HAECs עם NETs ו-LDL

  1. החלף את המדיום ב -0.5 מ"ל של מדיום תרבות טרי. תרבית לפחות 30 דקות לפני הגירוי.
  2. הוסף 167 מיקרוליטר ממדיום התרבית המכיל NETs ו- LDL (שלב 6.7) ו- LDL למנות HAEC. בדוק את השינויים המורפולוגיים ב-HAECs המושרים לאחר גירוי במשך 12 שעות או יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הסרת הכילומיקרונים, ואחריהם שברי VLDL מפלזמה אנושית באמצעות אולטרה-צנטריפוגה עוקבת, פלזמה אנושית עורבבה עם תמיסת KBr כדי להתאים את הצפיפות ל-d = 1.063. בשלב זה, המשקעים שנותרו לא הומסו לחלוטין בתמיסה, ונמנע ערבוב חמור, שיצר בועות גז, כדי לשמור על ה-LDL שלם. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, LDL הוערך ויזואלית על השכבה העליונה על ידי צבעו הצהוב-כתום9 (איור 1), שהבדיל אותו מהתמיסה חסרת הצבע ממש מתחתיו. בדרך כלל, לאחר דיאליזה של מקטע LDL שנאסף כנגד PBS/EDTA, ניתן היה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את הכנת ה-NETs מתאי dHL-60 המושרים על ידי דו-קיום של LDL, המשמשים לאחר מכן לניתוח תגובות HAEC. המשמעות של פרוטוקול זה היא השימוש במדיום טרי המכיל NETs ו-LDL לגירוי התאים, למרות שמחקרים רבים אחרים משתמשים בתמיסת מלאי של NETs שהוקפאו ב-20 מעלות צלזיוס. מכיוון שליפופרוטאינים הם קומפלקסים של חלבון שומנים, המבנים והמאפיינים השלמים שלהם הולכים לאיבוד במהלך ההפשרה, מה שגורם לדנטורציה וצבירה של LDL. היתרון של השיטה הנוכחית הוא שתוצרי היווצרות NET המשתחררים מתאים דמויי נויטרופיל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי האגודה היפנית לקידום המדע, KAKENHI (מענקים מספרי 23K10897 ו-19K07069). ברצוננו להודות ל-Editage (www.editage.jp) על עריכת השפה האנגלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% פולי-L-ליזיןסיגמאאולדריץ'P8920-100 מ"ל
צלחת 10 ס"מקורנינג430591
צלחות תרבית רקמות 12 בארותבז353043
2% ג'לטיןסיגמאאולדריץ'G1393-20 מ"ל
צינור 4 יחידותהימאקS404332A
חומצה רטינואית All-Transוואקו188-01113ניתן להחליף בכל ספק
צינורות דיאליזה צלורוזקבוצת MISUMI בע"מ0327-23-37-07 (UC18-32-100)ניתן להחליף בכל ספק
EDTADojindo345-01865ניתן להחליף בכל ספק
ערכת צמיחת תאי אנדותל בינונית 2פרומוסלג-22111
סרום בקר עובריג'יבקו10270-106ניתן להחליף בכל ספק
נתרן הפרין (5,000 יחידות/5 מ"ל)מוצ'ידה פרמצבטיקה ושות', בע"מניתן להחליף בכל ספק
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההטומיSRX-201תאוצה: 9, האטה: 7
תאי אנדותל אבי העורקים האנושייםלונזהסמ"ק-2535
KBrוואקו168-03475ניתן להחליף בכל ספק
תוכנת KEYENCE Microscopyקיינסמנתח BZ-II
מיקרו אולטרה-צנטריפוגההימאקCS150GX
מיקרוסקופאולימפוסCK40
מיקרוסקופקיינסBZ-9000להדמיית דולג זמן (אופציה)
מצלמת מיקרוסקופיהניקוןDS-Fi3
תוכנת מצלמת מיקרוסקופיהניקוןDS-L4
פניצילין/סטרפטומיציןג'יבקו15140-122 100 מ"לניתן להחליף בכל ספק
חוצץ פוספט מי מלח (ופעמים; 10)יש להמיס 2.6 גרם NaH2PO4· 2H2O, 29 גרם של Na2HPO4· 12H2O, 80 גרם NaCl ו-2.0 גרם KCl במים מזוקקים והתאמה לנפח של 1 L.  (ניתן להחליף בכל ספק)
PMA (פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט)וואקו162-23591ניתן להחליף בכל ספק
ריאגנט פאקלונזהCC-5034(CC-5022: תמיסת מלח חוצצת HEPES, CC-5012: טריפסין/EDTA, CC-5002: תמיסת נטרול טריפסין) 
רוטורהימאקS100AT6-0242
RPMI-1640 (עם פנול אדום)וואקו189-02025ניתן להחליף בכל ספק
RPMI-1640 (ללא פנול אדום)וואקו186-02155ניתן להחליף בכל ספק
בקבוק T-25קורנינג3275

מקורות

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NETHL 60

מאמרים קשורים