הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

678 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

תקציר

מעקב קבוע ומדויק הוא מרכזי לניהול יעיל של מחלות צמחים. זה יכול להצביע על דרך הפעולה המתאימה ביותר, והאם נדרשת מניעה, מיגור או אי פעולה. מעקב המבוסס על סימפטומולוגיה בצמחים מארחים בלבד לרוב אינו אמין בשל דמיון בתסמינים הנגרמים על ידי עקות ביוטיות ואביוטיות. שיטות מולקולריות מבוססות מעבדה כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) וכמותית (q)PCR הן הנפוצות והאמינות ביותר לזיהוי פתוגנים בצמחים, אך מסתמכות על ציוד יקר ומפעילים מיומנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשלב מיצוי DNA מפושט, הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA), וחזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות (CRISPR)/Cas12a (RPA-Cas12a) לזיהוי הפתוגן הפולשני, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4 (Foc TR4). הטכניקה מספקת חלופה פשוטה לזיהוי צינור יחיד שהיא חזקה מבחינה אנליטית עם ספציפיות משופרת בהשוואה למבחני זיהוי מולקולרי זמינים ושוללת את הצורך בציוד מעבדה יקר ומתוחכם.

מבוא

נבילת פוסריום, הנגרמת על ידי הפתוגן הפטרייתי הנישא בקרקע Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), נחשב בעולם לאחד הפתוגנים הצמחיים חוצי הגבולות ההרסניים ביותר בהיסטוריה1. לאחר שהוכנס לאזור חדש, פוק נשאר בלתי נראה עד שצמחים נגועים מפתחים תסמינים. זה יכול לקחת חודשים, מה שמאפשר לפטרייה להתבסס ולהתפשט ללא ידיעתה. לאחר הקמתו, כמעט בלתי אפשרי למגר כלכלית בשל ייצור כלמידוספורים עמידים והאופי הרב-שנתי של ייצור בננות. החשיבות של מניעה וגילוי מוקדם, אם כן, היא בעלת חשיבות עליונה בהגנה על מגדלים פגיעים1. המגיפה הנוכחית של המחלה, הנגרמת על ידי הגזע הטרופי Foc 4 (TR4), מחייבת גילוי על ידי מעקב קבוע כדי לזהות צמחי בננה סימפטומטיים באזורים בסיכון גבוה. אילוצים אביוטיים כגון עקת מים ומחסורים תזונתיים מסוימים גורמים להצהבה חיצונית, הדומה לתסמינים הנוצרים על ידי זיהום Foc TR4. בנוסף, לא ניתן להבחין בתסמינים הנובעים מזיהום על ידי גזעי פוק שונים. טיהור מבוסס מעבדה וזיהוי פנוטיפי ומולקולרי לאחר מכן נחוצים, אם כן, לזיהוי אמין של Foc TR42. בדיקות מולקולריות שונות זמינות לזיהוי Foc TR4, כולל PCR, PCR כמותי (q) ובדיקות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) 3,4,5,6,7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים הללו עדיין דורשים מיומנויות וציוד יקרים ומיוחדים, שחייבים להתבצע בתנאי מעבדה. הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA) יכולה להתבצע באופן איזותרמי ולכן מבטלת את הצורך בציוד כזה וניתן לשקול אותה עבור פרוטוקולי גילוי בשטח8.

מערכות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR)-Cas שימשו יותר ויותר לאבחון מולקולרי משופר9. מערכות אלו מופעלות מכיוון שהן זולות, פשוטות ואינן דורשות שימוש במכשור מיוחד, ולכן ניתן לשקול אותן לגילוי בשטח. אבחון מבוסס CRISPR כולל בדרך כלל הגברה איזותרמית של רצף מטרה, ואחריו זיהוי מטרה באמצעות חלבוני CRISPR-Cas ופיצול בטחוני של צבע מדווח פלואורסצנטי של DNA או RNA כדי להצביע על נוכחות המטרה10,11. במערכות CRISPR-Cas12a, באופן ספציפי, CRISPR RNA (crRNA) מנחה את Cas12a לזהות ולבקע מטרות של חומצות גרעין. ניתן לתכנן crRNA זה כך שיכוון לאזור ספציפי של DNA או RNA מעניין באמצעות הכלאה לרצף משלים. לאחר שנקשר, זה גורם ל-Cas12a לבקע את המטרה עם ספציפיות של נוקלאוטיד יחיד, ואחריו פיצול צדדי של מולקולות מדווחות12. לאחרונה נעשה שימוש במערכות CRISPR-Cas12a לאיתור פתוגנים שונים של צמחים פטרייתייםחשובים מבחינה כלכלית 13,14,15,16,17,18,19,20.

בפרוטוקול זה מתוארת הפיתוח של טכניקת זיהוי צינור יחיד, המשלבת מיצוי DNA מפושט, הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA) וטכנולוגיית CRISPR/Cas12a (RPA-Cas12a) לגילוי Foc TR4, אשר הוצג הן על פלואורומטר נייד והן בעין בלתי תחת משדר אור כחול זול דיודה פולטת אור (LED)21. ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של השיטה לזיהוי בשטח כדי לשפר את אסטרטגיות המניעה והבלימה. ניתן להשתמש בגישה דומה גם כדי לתכנן מבחני זיהוי מבוססי Cas12a עבור פתוגנים צמחיים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מיצוי DNA פשוט מחומר צמחי

הערה: ראה איור 1 לסקירה כללית.

  1. בצע מיצוי DNA.
    1. העבירו 250 מ"ג מכל חתיכה של פסאודוסטם סימפטומטי לשקית מיצוי נפרדת (ראה טבלת חומרים).
    2. הוסף 2 מ"ל של 0.5 מ' NaOH-PVP (טבלת חומרים) לשקיות עם חומר צמחי. טוחנים כלים נגועים בשקית מיצוי בעזרת מטחנה ידנית כמו עלי.
      הערה: יש להוסיף 1-2 מ"ל תוסף של 0.5 M NaOH-PVP במידת הצורך כדי לקבל מספיק תמצית נוזלית מהשקית.
    3. הוסף 195 מיקרוליטר של 100 מ"מ Tris-HCL (pH 8.0) (טבלת חומרים) לצינורות של 1.5 מ"ל.
    4. פיפטה 5 מיקרוליטר של תמצית מהשקית לתוך שפופרת 1.5 מ"ל עם 195 מיקרוליטר של 100 מ"מ Tris-HCL (pH 8.0), מדללת את התמצית פי 40.
    5. מערבל את הצינורות למשך 15-30 שניות ושומר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. סינתזת crRNA ובקרת איכות

  1. בצע תמלול.
    1. באמצעות ערכת שעתוק RNA (טבלת חומרים), הוסף את הדברים הבאים לצינור PCR של 0.2 מ"ל: 1.5 מיקרוליטר של מאגר תגובה 10x T7, 1.5 מיקרוליטר מכל dNTP, 1.5 מיקרוליטר של תערובת פולימראז T7 DNA, 1 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז, ו-10 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר תבנית T7 DNA לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.
    2. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או במכונת PCR למשך 4 שעות לפחות.
    3. השתמש בספקטרופוטומטר (טבלת חומרים) כדי לקבוע את כמות ה-RNA המתועתק. לדלל את ה-RNA ל-250 ננוגרם/מיקרוליטר (10 מיקרוגרם) בנפח של 40 מיקרוליטר באמצעות מים נטולי נוקלאז או חוצץ TE (קובץ משלים 1).
      הערה: ניתן לאחסן את ה-RNA המתומלל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך טיפולי DNase ושלבי ניקוי.
  2. בצע טיפול DNase וניקוי crRNA.
    הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. שמור על אנזים RNA ו-DNase I על קרח.
    1. טפל בדגימת ה-RNA עם DNase I הכלול בערכת ניקוי ה-RNA (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן22.
    2. נקה את ה-RNA דampשימוש בערכת ניקוי ה-RNA בהתאם להוראות היצרן, בהתאם לפרוטוקולII 22.
    3. Nanodrop את ה-crRNA הנקי כדי לקבוע את הכמות והאיכות הקיימת. יש לדלל את ה-RNA ל-100 ננוגרם/מיקרוליטר באמצעות מים נטולי נוקלאז ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    4. מחממים את ה-crRNA עם צבע טעינת RNA (טבלת חומרים) ל-70°C למשך 10 דקות באמבט מים, ומכניסים את ה-crRNA לאלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5% כדי להמחיש את ה-crRNA המסונתז (איור 2).

3. הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA)-Cas12a תגובה חד-שפופרית לזיהוי Foc TR4 במבחנה

הערה: ראה איור 3 לסקירה כללית.

  1. הכן את תערובות התגובה RPA ו-Cas12a.
    הערה: ודא ששלבים אלה מבוצעים בחלל נטול DNA על קרח, כאשר הריאגנטים והחומרים מקוררים מראש. נגב את משטח העבודה והפיפטות באקונומיקה ואתנול 70% לפני הניסוי. ראה טבלה 1 למידע על כל האוליגונוקלאוטידים ששימשו במחקר זה.
    1. הכן תערובת תגובה של 20 מיקרוליטר Cas12a בשפופרת נפרדת של 0.5 מ"ל (טבלת חומרים) עם נפחי הריאגנטים הבאים: 2 מיקרוליטר של 10x NEBuffer r2.1 (50 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ MgCl2, 100 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין רקומביננטי, pH 7.9), 0.4 מיקרוליטר של חלבון 10 מיקרומטר LbCas12a, 0.6 מיקרוליטר של 100 ננוגרם/מיקרוליטר crRNA, 0.4 מיקרוליטר של 10 מיקרומטר מדווח, ו-16.6 מיקרוליטר של מים נטולי יונים.
      הערה: הריכוזים הסופיים של חלבון LbCas12a, crRNA ו-reporter הם 200 ננומטר, בהתאמה.
    2. הכן תערובת תגובת RPA של 9.5 מיקרוליטר בשפופרת נפרדת של 0.5 מ"ל עם נפחי הריאגנטים הבאים: 5 מיקרוליטר של מאגר תגובה 2x (ריכוז סופי פי 1 לפי הנחיות היצרן), 1.6 מיקרוליטר של תערובת dNTP (ריכוז סופי 1.6 מ"מ), 1 מיקרוליטר של 10x E-Mix בסיסי (ריכוז סופי פי 1 לפי הנחיות היצרן), 0.5 מיקרוליטר מכל פריימר RPA ב-10 מיקרומטר (ריכוז סופי 0.5 מיקרומטר כל אחד), 0.5 מיקרוליטר של תערובת תגובת ליבה פי 20 (ריכוז סופי פי 1 לפי הנחיות היצרן), ו-0.4 מיקרוליטר של מים נטולי יונים.
    3. הנח רצועה בעלת 8 צינורות לתוך מתלה צינורות (טבלת חומרים) על קרח.
    4. העבירו את תערובת התגובה של 20 מיקרוליטר Cas12a לבסיס הצינור.
    5. העבירו את תערובת תגובת ה-RPA של 9.5 מיקרוליטר למכסה רצועת הצינור. הוסף 0.5 מיקרוליטר של 280 ננומטר MgOAc (ריכוז סופי 14 ננומטר) לתערובת תגובת ה-RPA במכסה רצועת הצינור וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    6. הוסף 0.5 מיקרוליטר של מים נטולי יונים למכסה הצינור שאינו בקרה על תבנית (NTC) וסגור בזהירות כדי להבטיח שתערובות התגובה RPA ו-Cas12a אינן משולבות.
      הערה: פקד שאינו תבנית (NTC) כלול כדי להבטיח את מהימנות התוצאות.
  2. הוסף DNA של תבנית והתחל את התגובה.
    1. הוסף 0.5 מיקרוליטר של DNA תבנית לתערובת התגובה של 10 מיקרוליטר RPA המכילה MgOAc במכסה רצועת הצינור, למעט ה-NTC, עם מים נטולי יונים במקום DNA. הוסף תמיד DNA Foc TR4 חיובי ידוע בבאר אחת כדי להבטיח שהבדיקה עבדה כמתוכנן. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    2. סגור בזהירות את מכסי רצועות הצינור כדי להבטיח שתגובת RPA ו-Cas12a לא תתערבב.
    3. הפעל את הפלואורומטר הנייד (טבלת החומרים) וצור פרופיל הפעלה עבור בדיקת RPA-Cas12a (קובץ משלים 2). פתח את פרופיל ההפעלה השמור והנח את רצועת הצינור לתוך הפלואורומטר הנייד כדי לדגור למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: היזהר לא לגעת בתחתית הצינורות בעת הטיפול ברצועת הצינור; במקום זאת החזק את הקצוות החיצוניים בקצה השמאלי והימני העליון.
    4. הסר את רצועת הצינור מהפלואורומטר הנייד לאחר 30 דקות. הפוך את הצינורות שש פעמים כדי לערבב את תגובות ה-RPA וה-Cas12a וסובב כלפי מטה במיני צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) למשך 5 שניות.
    5. הנח את רצועת הצינור בחזרה לתוך הפלואורומטר הנייד ודגר למשך 30 דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס באמצעות פרופיל ההפעלה השמור.
  3. דמיין את התוצאות.
    1. פרש את יחידות הקרינה היחסית הממוצעות (RFUs) הנמדדות על הפלואורומטר הנייד (משלים file 2 והמדריך למשתמש23).
    2. דמיין את הצינורות תחת אור כחול LED באורך גל עירור של 465 ננומטר באמצעות טרנסמאייטור אור כחול (קובץ משלים 3). צלם תמונות באמצעות מצלמת טלפון.

   

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי מוצלח של Foc TR4 מחומר צמחי נגוע באמצעות מיצוי DNA פשוט ואחריו בדיקת RPA-Cas12a המשולבת כאשר נערכה בפלואורומטר הנייד Genie III מודגם באיור 4A. דגימות חיוביות מראות פלואורסצנטיות גלויה (נתיב 6-8), בעוד שדגימות שליליות מראות פלואורסצנטיות נמוכה (נתיב 1-5). כאשר צינורות הדגימה נצפו תחת אור כחול LED, הדגימות הנגועות ב-Foc TR4 הראו גם פלואורסצנטיות גלויה (איור 4B). לעומת זאת, DNA מרקמת צמח שאינה נגועה ב-Foc TR4 לא הניב פלואורסצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מעקב קבוע הוא אסטרטגיה חשובה למאמצי מניעה והכלה יעילים של Foc TR4 ומזיקים פולשניים חשובים אחרים. פרוטוקולי זיהוי שניתן ליישם בשטח, ולזהות במהירות ובדייקנות פתוגנים, יכולים להאיץ את קבלת ההחלטות ולהגביל את העלויות הכרוכות במאמצי המעקב. לשם כך, הפרוטוקול המוצג כאן שילב מיצוי DNA מפושט, שבוצע ישירות על חומר צמחי שנדגם, אשר נכלל לאחר מכן בבדיקת צינור אחד המשלבת תגובות RPA ו-Cas12a, לזיהוי מהיר ורגיש של Foc TR421.

אחד היתרונות החשובים ביותר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או אינטלקטואליים מתחרים.

תודות

אנו מכירים במימון מקרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה, מספר מענק: 138109, במסגרת תוכנית התמיכה התחרותית לחוקרים לא מדורגים. אנו מכירים גם במימון תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020 במסגרת מספר המענק של פרויקט INDICANTS: 890856.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חלבון EnGen LBA Cas12a (Cfp1)ניו אינגלנד ביולאבסM0653T
EnGen Lba Cas12a Diluentניו אינגלנד ביולאבסB0653A
שפופרות PCR של אפנדורףמרקEP0030124332
אפנדורף מיקרו-מבחן מנעול בטוחמרקEP0030121708
שקיות חילוץ אוניברסליותביורה430100
סולם DNA של GeneRuler 100 bpתרמו פישר סיינטיפיקSM0241 / SM0242
ג'יני צנטריפוגה מיני-6KOOptiGeneאופ-פיוג'
ג'יני IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
מחזיק ג'יני סטריפOptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
ג'יני סטריפסOptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
ערכת סינתזת RNA HiScribe T7 בעלת תפוקה גבוההניו אינגלנד ביולאבסE2040S
ספקטרופוטומטר UV/Vis NanoDrop ND-1000תרמו פישר סיינטיפיקhttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3ניו אינגלנד ביולאבסB7003S
NEBuffer r2.1ניו אינגלנד ביולאבסB6002S
אבקת פוליווינילפירולידון (PVP)סיגמא-אלדריץ'9003-39-8
ערכת RNA Clean ו-Concentrator-5מחקר זימוR1013
צבע טעינה של RNAתרמו פישר סיינטיפיקR0641
טרנסליומיינטור SmartBlue Blue Lightאקיוריס אינסטרומנטסE4000-E
כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH)מרק, אמפרטהK277
טריס (הידרוקסילמתיל) אמינומתאןמרק77-86-1
ערכת TwistAmp Liquid BasicTwistDxTALQBAS01

מקורות

  1. Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
  2. Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
  3. Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
  4. Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
  5. Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
  6. Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
  7. Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
  8. Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
  9. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  10. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  11. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  12. Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
  13. Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
  14. Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
  15. Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
  16. Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
  17. Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
  18. Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
  19. Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
  20. Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
  21. Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
  22. RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
  23. Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
  24. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
  25. Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
  26. Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
  27. Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
  28. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  29. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
  30. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
  31. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  32. Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
  33. Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
  34. Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
  35. Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Fusarium oxysporumRPA Cas12aDNA
בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.