מאמר שיטה

הדמיית תאים חיים של הפרדת כרומוזומים במהלך מיוזה של ביציות עכבר

809 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68847

⸱

10 באוקטובר 2025

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מסכמים טכניקות הדמיה של תאים חיים לחקר הפרדת כרומוזומים בביציות עכברים, תוך שימוש ב-H2B-RFP עבור כרומטין ו-SiR-Tubulin להדמיית ציר. אנו מפרטים הכנת דגימות, מיקרו-הזרקה, תרבית, הגדרת הדמיה וניתוח, ומציעים מדריך מעשי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה ופוטוטוקסית מינימלית של דינמיקת כרומוזומים מיוטיים.

תקציר

הפרדת כרומוזומים מדויקת במהלך מיוזה ביצית חיונית להבטחת התפתחות עוברית תקינה ולמניעת הפרעות הקשורות לאנופלואידיה. הדמיית תאים חיים בשילוב עם טכניקות תיוג פלואורסצנטיות הפכו לגישה רבת עוצמה לחקר דינמיקת כרומוזומים מיוטיים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. בפרוטוקול זה, אנו מסכמים מתודולוגיות מפתח להמחשת הפרדת כרומוזומים בביציות עכבר חיות, תוך התמקדות בשימוש בהיסטון H2B-RFP לתיוג כרומטין ו-SiR-Tubulin למעקב אחר ציר. אנו מתארים את ההליכים להכנת דגימה, מיקרו-הזרקת mRNA, תרבית ביציות, הגדרת תא הדמיה של תאים חיים והגדרות מיקרוסקופיה קונפוקלית, כולם מותאמים להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך מזעור פוטוטוקסיות. יתר על כן, אנו מדגישים שיקולים ניסיוניים קריטיים כגון פוטוטוקסיות, עיבוד תמונה וניתוח כמותי של אירועים מיוטיים. על ידי מתן הערכה מקיפה של המתודולוגיות הנוכחיות, פרוטוקול זה משמש כמדריך מעשי לחוקרים המבקשים לחקור דינמיקה של כרומוזומים בביציות חיות ולשפר את הדיוק והשחזור של מחקרים מיוטיים.

מבוא

הדמיה מדויקת של דינמיקה כרומוזומלית וציר במהלך מיוזה של ביציות היא קריטית להבנת המנגנונים השולטים בהבשלת הגמטות הנקביות ובסיכון לאנופלואידיה 1,2,3,4,5. ביציות יונקים עוברות סדרה מתואמת מאוד של אירועים מיוטיים, כולל פירוק שלפוחית הנבט (GVBD), עיבוי כרומוזומים, הרכבת ציר וחלוקה אסימטרית6. בעוד שהדמיה של נקודת זמן קבועה סיפקה תמונות חשובות של תהליכים אלה, היא חסרה רזולוציה זמנית ואינה יכולה ללכוד אירועים חולפים או מהירים המתרחשים בין מרווחי הדגימה. לעומת זאת, הדמיית תאים חיים של כרומוזומים ומיקרו-צינורות המסומנים פלואורסצנטית מציעה גישה רבת עוצמה לניטור תהליכים דינמיים אלה בזמן אמת 2,3,7. זה מאפשר התבוננות ישירה בתזמון, משך ורצף האירועים המיוטיים בתוך ביציות בודדות, ומאפשר זיהוי של אירועים חולפים שאחרת עלולים להחמיץ בדגימות קבועות. עם זאת, שמירה על כדאיות הביציות ושלמות הפיזיולוגית במהלך מיקרו-הזרקה והדמיה דורשת טיפול קפדני ותנאים אופטימליים8.

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מקיפה למיקרו-הזרקת ביציות בשלב שלפוחית הנבט (GV) של עכבר עם H2B-RFP cRNA, המאפשר תיוג פלואורסצנטי של כרומטין, ואחריו הדמיה קונפוקלית של כרומוזומים והתנהגות ציר לאורך מיוזה4. השיטה משלבת שלבים מרכזיים כולל תחול הורמונלי, בידוד ביציות, מיקרו-הזרקה בתנאי טמפרטורה מבוקרים והדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם בקרה סביבתית 4,9. המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג זרימת עבודה חזקה וניתנת לשחזור להדמיה בזמן אמת של דינמיקה כרומוזומלית וציר בביציות עכבר חיות, ולספק פלטפורמה לחקירת המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס ויסות מיוטי וסיכון אנופלואידי.

בעוד שפרוטוקול זה מספק רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה, הוא מסתמך על ביטוי מדווח אקסוגני, שעשוי שלא לשכפל באופן מלא את דינמיקת החלבון האנדוגנית ועלול להפריע לתהליכים מיוטיים מקוריים אם הוא מתבטא יתר על המידה. על החוקרים לשקול מגבלות אלה ולאמת את הממצאים באמצעות גישות משלימות במידת האפשר.

פרוטוקול זה נועד לתמוך במחקרים החוקרים מנגנונים מיוטיים, שגיאות בהפרדת כרומוזומים וההשפעה של הפרעות גנטיות או סביבתיות על איכות הביציות. הוא מספק פלטפורמה חזקה הן למחקר בסיסי והן ליישומים תרגומיים בביולוגיה של הרבייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים חייבים להתבצע בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים. נהלי ניסוי צריכים לדבוק בקפדנות בעקרונות 3Rs - החלפה, הפחתה וליטוש. יש לשכן עכברים במתקן מוסמך לבעלי חיים בתנאי סביבה סטנדרטיים (22 מעלות צלזיוס, 60% לחות) עם גישה חופשית למזון ומים.

1. איסוף והכנת ביציות

הערה: כל הציוד והריאגנטים חייבים להיות סטריליים. בצע את כל הטיפול בביציות באמצעות פיפטה בפה תחת סטריאומיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). כסו את כל טיפות התרבות בשמן מינרלי (איור 1A-E).

  1. גירוי הורמונלי
    1. יש להזריק לעכברים נקבות בנות 3-4 שבועות תוך צפקית 5 יחידות בינלאומיות (IU) של גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון (PMSG; ראה טבלת חומרים) 46-48 שעות לפני איסוף הביציות.
      הערה: B6CBAF1 עכברים (צאצאי F1 של C57BL/6J × CBA/CaCrl) מועדפים בשל תפוקת ביציות מעולה ומאפייני התבגרות נוחים.
  2. הכנת מדיה תרבותית
    1. סנן מדיה M2 ו-M16 (ראה טבלת חומרים) באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. השלם עם IBMX לריכוז סופי של 100 מיקרומטר על ידי דילול ממלאי של 100 מ"מ.
    2. הכינו 5-6 טיפות של M2-IBMX (~30 מיקרוליטר כל אחת) ו-3 טיפות של M16-IBMX בכלי תרבית רקמות פלסטיות 35 מ"מ. שכסו את כל הטיפות בשמן מינרלי. הניחו צלחות M2-IBMX על בלוק חם של 37 מעלות צלזיוס (איור 1A) וצלחות M16-IBMX באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות לפחות לפני בידוד הביציות (איור 1C).
    3. הכינו מנה נוספת המכילה 800-1,000 מיקרוליטר M2-IBMX (ללא שמן) לדיסקציה של שחלות. מניחים על צלחת חימום של 37 מעלות צלזיוס המותקנת מעל סטריאומיקרוסקופ (איור 1B).
  3. בידוד ביציות
    1. להקריב עכברים על ידי פריקת צוואר הרחם. נגב את הבטן התחתונה עם 70% אתנול, ואז בצע חתך אופקי קטן בעור ובצפק כדי להיכנס לחלל הצפק. הארך את החתך על ידי משיכת שולי החתך באצבעות.
    2. בעזרת מלקחיים יש לטאטא את המעי כדי לחשוף את השחלות בבטן העליונה, הממוקמות בקוטב העליון של הכליות. בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים זעירים, כורתים בזהירות את השחלות תוך הימנעות מנזק לרקמה. העבירו מיד את השחלות לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 100-200 מיקרוליטר של מדיום M2-IBMX שחומם מראש.
    3. העבירו את השחלות ל-1 מ"ל של מדיום M2-IBMX שחומם מראש ועברו לשלב מיקרוסקופ דיסקציה מחומם (איור 1B). הסר בזהירות רקמת שומן ושאריות ביציות.
      הערה: טפלו בשחלות בעדינות כדי למנוע נזק לזקיקים או לביציות. שמור על שחלות במדיום חם במהלך ההעברה מחדר החי למעבדה.
    4. שחרר קומפלקסים של קומולוס-ביציות (COCs) על ידי ניקוב זקיקים באמצעות מחט 27 G (איור 1A-B). אוספים COCs ומעבירים לטיפות של 25-30 מיקרוליטר של M2-IBMX (איור 1D).
    5. להפריד תאי קומולוס על ידי פיפטינג חוזר עם פיפטת פסטר מזכוכית צרת קדח (איור 1E).
      הערה: בעוד שפיפטינג פה משמש בדרך כלל לטיפול בביציות, פיפטורים מכניים או מיקרומניפולטורים מספקים חלופות, במיוחד במקומות שבהם פיפטינג בפה מוגבל או לא אפשרי. חלופות אלה יושמו בהצלחה בפרוטוקולים דומים10,11.
    6. זהה ובחר ביציות בעלות גידול מלא בשלב GV על סמך קוטר גדול יותר ו-GV הממוקם במרכז באמצעות סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של 20x-40x. מעבירים ל-30 מיקרוליטר טריים של טיפות M2-IBMX על בלוק חם של 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
      הערה: יש לשמור על הביציות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליכים כדי לשמור על שלמות פיזיולוגית. יש לחמם מראש את כל המדיה ולהשתמש בשלבים מבוקרי טמפרטורה לכל הטיפול וההזרקה המבוססים על מיקרוסקופ.
    7. אפשר לביציות להתאושש במשך 20 דקות בשלב מחומם של 37 מעלות צלזיוס לפני הזרקת מיקרו.

2. הכנת H2B-RFP cRNA

הערה: בצע את כל השלבים בלבישת כפפות בסביבה נקייה ונטולת RNase. השתמש רק במים וריאגנטים נטולי RNase, ורצוי לעבוד בנוכחות מעכבי RNase.

  1. אמת את רצף הפלסמיד H2B-RFP (ראה טבלת חומרים) על ידי ריצוף סנגר באמצעות פריימרים המאגפים את התוספת. הגבירו את הפלסמיד על ידי הפיכת E. coli מוכשר (למשל, DH5α), בחירת מושבה בודדת וגידולו במרק LB עם אנטיביוטיקה מתאימה. טהר את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנה סטנדרטית של MIDI או maxi. לקבלת נהלים מפורטים, ראה Green and Sambrook12.
  2. טהר DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני-הכנה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. כמת את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. ליניאריזציה של 2-4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד במורד הזרם של התוסף באמצעות אנזים הגבלה מתאים שחותך פעם אחת בעמוד השדרה הווקטורי (NotI שימש עבור H2B-RFP). הגדר את תגובת העיכול באמצעות ריכוז המאגר והאנזים המתאים כמתואר בטבלה 1 ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות. אשר ליניאריזציה מלאה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. רצועות מרובות מעידות על עיכול לא שלם. אם אתה משתמש בערכה מסחרית, עקוב אחר הוראות היצרן.
    הערה: בחר אנזים הגבלה החותך במדויק במורד הזרם של התוסף ובתנאי עיכול אופטימליים. אמת ליניאריזציה על ידי הפעלת אליקוט קטן על ג'ל אגרוז.
  4. הסר זיהום RNase על ידי דגירה של תגובת העיכול עם 1 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (10 מיקרוגרם/מ"ל), 5.3 מיקרוליטר של 10% SDS ו-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: שלב זה חיוני לסילוק מזהמי RNase וחלבון. השתמש רק בריאגנטים נטולי RNase ושמור על תנאי עבודה נקיים.
  5. חלץ את ה-DNA המעוכל עם פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1), ולאחר מכן מיצוי כלורופורם.
    הערה: כדי למזער את הרעילות ולייעל את הטיפול בדגימות, ניתן להשתמש גם בשיטות טיהור מסחריות או מבוססות חרוזים (למשל, קרום סיליקה או מערכות חרוזים מגנטיות) במקום מיצוי פנול/כלורופורם.
  6. זרז DNA על ידי הוספת 3 M נתרן אצטט ו-100% אתנול. דגירה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.
  7. גלולה את ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-12,000-14,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את הגלולה עם 70% אתנול, צנטריפוגה שוב באותה מהירות למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, יבשו באוויר לזמן קצר (2-5 דקות), והשעו מחדש ב-6 מיקרוליטר מים נטולי RNase.
    הערה: לאחר משקעי אתנול וצנטריפוגה, אמורה להיווצר גלולה שקופה או לבנה בתחתית הצינור. אם לא נראית גלולה, חזור על הצנטריפוגה במהירות גבוהה יותר או הערך מחדש את ריכוז ה-DNA.
  8. בצע שעתוק במבחנה באמצעות ערכת mMACHINE T7 mMESSAGE (ראה טבלה 2), בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  9. דגרו את תגובת השעתוק ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. הארך את הדגירה אם אורך התמליל עולה על 5 kb.
  10. הסר את התבנית DNA על ידי טיפול ב-DNase באמצעות 1 U של DNase I לכל נפח תגובה של 10 מיקרוליטר, מודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  11. טהר את ה-cRNA המסונתז באמצעות משקעי ליתיום כלוריד13. לאחר משקעים וצנטריפוגה, אמורה להיווצר גלולה שקופה או לבנה גלויה בתחתית הצינור. שוטפים את כדור ה-RNA עם 70% אתנול.
  12. השעו מחדש את גלולת ה-cRNA הסופית ב-20 מיקרוליטר של מים נטולי RNase. מדוד את ריכוז ה-RNA ואשר את נוכחותו ואורכו של זנב הפולי (A) על ידי ביצוע RT-PCR ואחריו ריצוף של תוצר ה-PCR. יש להצמיד את ה-cRNA לנפחים של 1 מיקרוליטר ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

3. הכנה והזרקת מיקרו של ביציות

הערה: לאורך כל ההליך, שמור על ביציות ב-37 מעלות צלזיוס באמצעות מדיה מחוממת מראש ושלבי מיקרוסקופ מבוקרי טמפרטורה כדי לשמור על איכות הביציות.

  1. הכנה
    1. להפשיר את ה-cRNA של H2B-RFP על קרח, לצנטריפוגה קצרה ולדלל לריכוז הרצוי (למשל, 250 ננוגרם/מיקרוליטר).
      הערה: ריכוז ה-cRNA האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למבנה, למערכת הביטוי ולמטרות הניסוי. אנו ממליצים לטטר את ריכוז ה-cRNA (למשל, בטווח של 50-300 ננוגרם/מיקרוליטר) כדי למזער ארטיפקטים של ביטוי יתר תוך הבטחת אות מספיק. על המשתמשים גם לעקוב אחר התקדמות מיוטית (למשל, GVBD, היווצרות ציר ושחול גוף קוטבי) כקריאה פונקציונלית של בריאות הביציות והכדאיות לאחר ביטוי הבנייה. דווח כי ריכוזי ההזרקה של cRNA נעים בדרך כלל בין 0.2 ל-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, כאשר התוצאות האופטימליות מושגות לעתים קרובות ב-0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר 2,3,4,5,7,8,9.
    2. הכן מחטי מיקרו-הזרקה מנימי זכוכית בורוסיליקט (OD = 1.5 מ"מ, ID = 0.86 מ"מ, אורך = 100 מ"מ) באמצעות מושך פיפטה (איור 2A).
      הערה: אנו משתמשים במושך פיפטה אנכי (ראה טבלת חומרים; איור 2A). בצע אופטימיזציה של פרמטרי משיכה באופן אמפירי. קצה המחט צריך להיות בסדר מספיק כדי למזער את נזקי הביציות אך רחב מספיק כדי למנוע סתימה ולאפשר אספקת cRNA חלקה.
    3. טען 0.5-1.5 מיקרוליטר של תמיסת cRNA לתוך קצה המחט באמצעות קצות מיקרו-מעמיס נטולי RNase. הסר את כל בועות האוויר לפני ההזרקה.
  2. הגדרת צלחת מיקרו-הזרקה
    1. הכינו צלחת מיקרו-הזרקה עם 100 מיקרוליטר של מדיום M2-IBMX וכסו לחלוטין בשמן מינרלי למניעת אידוי ושינויי אוסמולריות.
  3. מיקרו-הזרקת ביציות
    1. התקן את פיפטות האחיזה וההזרקה על מערכת המיקרומניפולטור (איור 2B,C).
    2. הנח את צלחת המיקרו-הזרקה על במת המיקרוסקופ. בעזרת פיפטה בפה, העבירו ביציות לטיפה M2-IBMX.
    3. הביאו את פיפטות האחיזה וההזרקה לאותו מישור אופקי כמו הביציות.
    4. לכוד ביצית אחת באמצעות יניקה עדינה עם פיפטת האחיזה (איור 2B ו-C).
    5. הכנס את מחט ההזרקה דרך zona pellucida ו-oolemma, מכוון לציטופלזמה והימנע מהגרעין.
    6. לספק cRNA H2B-RFP באמצעות פולס קצר של קיבוליות שלילית דרך אלקטרומטר תוך-תאי (איור 2B-E). שמור על נפח ההזרקה כ-5% מנפח הביצית. הזרקה מוצלחת נראית בדרך כלל כפיזור קטן אך מובהק של ציטופלזמה. התאם את לחץ ההזרקה ותזמון ההזרקה כדי למנוע נזק לממברנה.
    7. משוך את המחט במהירות ובצורה חלקה באותה זווית כדי למזער את קריעת הממברנה.
    8. שחררו את הביצית מהפיפטה המחזיקה ומקמו אותה מחדש לאזור נפרד של הצלחת כדי להבחין בין ביציות מוזרקות לביציות שלא הוזרקו (איור 2F). עבור הגדרה זו, ארגן את זרימת העבודה על ידי שמירה על ביציות לא מוזרקות בחלק העליון של הכלי והזזת הביציות המוזרקות לתחתית.
    9. חזור על שלבים 3.3.4-3.3.8 עבור כל הביציות הנותרות. שיעורי ההישרדות לאחר ההזרקה משתנים בהתאם לטכניקה ולתכונות ה-mRNA. צפו ל-60%-80% כדאיות.
  4. טיפול לאחר ההזרקה
    1. מעבירים ביציות מוזרקות לטיפה טרייה של מדיום M16-IBMX בכלי תרבית נקי.
    2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-4 שעות כדי לאפשר ביטוי H2B-RFP. התאם את משך הדגירה על סמך ריכוז cRNA, גודל התעתיק ויעילות הביטוי.

4. הדמיית Timelapse של כרומוזומים המסומנים ב-H2B-RFP במהלך מיוזה

  1. הכנת ציוד ומדיה
    1. מחממים מראש את חממת שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת התא הסביבתי ל-37 מעלות צלזיוס למשך ≥-30 דקות לפני השימוש (איור 3A). הפעל את בקר הגז והתחל את זרימת הגז כדי לשמור על התא ב-5% CO2 וסביבה O2. יש לוודא שהתא לח כדי לתמוך בבריאות הביציות במהלך הדמיה ממושכת של תאים חיים.
    2. הכן טיפות תרבית: מניחים 5-6 טיפות של 50 מיקרוליטר של מדיום M16 בתוספת SiR-טובולין (ריכוז סופי של 100 ננומטר) בצלחת פטרי 35 מ"מ. כיסוי עם שמן מינרלי. בצלחת הדמיה נפרדת עם תחתית זכוכית, הניחו שלוש טיפות של 5 מיקרוליטר של M16 + SiR-Tubulin ושכבו בשמן מינרלי. יש לחמם את שתי המנות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ≥-30 דקות לפני השימוש.
  2. העברת ביציות ושטיפה
    1. שטיפת ביציות: העבירו ביציות מוזרקות ברצף דרך טיפות 50 מיקרוליטר M16 + SiR-Tubulin כדי לשטוף שאריות IBMX (מומלץ 5 כביסות). יש לבצע שטיפות בעדינות כדי למנוע נזק לביציות.
      הערה: שאריות IBMX יכולות לעכב את חידוש המיוזה, ולכן שטיפה יסודית היא קריטית.
    2. העברה סופית: לאחר השטיפות, העבירו 15-20 ביציות לתוך טיפת 5 מיקרוליטר של M16 + SiR-Tubulin בצלחת ההדמיה עם תחתית הזכוכית המחוממת מראש.
  3. הגדרת מיקרוסקופ
    1. צלחת הדמיה הרכבה: הנח את צלחת הזכוכית התחתונה על המיקרוסקופ הקונפוקלי tagה (איור 3A). אפשר לביציות לשקוע ~10 דקות.
    2. מיקום במה: באמצעות הדמיית שדה בהיר, ביציות מרכזיות בשדה הראייה. שמור עמדות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.
      הערה: במחקר זה, השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי Leica TCS SP8 עם עדשת אובייקט טבילה במים HC PL APO 20x/1.0 NA. עם זאת, ניתן להשתמש במערכות קונפוקליות אחרות ועדשות אובייקטיביות עם מפרט דומה בהתאם לזמינות.
    3. הגדרת משאבת מים למטרות טבילה במים: אם אתה משתמש בעדשת מטרת טבילה במים, הפעל את מערכת משאבת המים כדי לספק מים לסירוגין במרווחים של 5-10 דקות. זרימה תקופתית זו שומרת על עמוד המים בין העדשה לצלחת ההדמיה עם תחתית הזכוכית, מונעת ייבוש ומבטיחה תנאי הדמיה יציבים במהלך ניסויים ארוכי טווח. עבור עדשות טבילה בשמן, אין צורך בהגדרת זרימת מים זו.
  4. הגדרות הדמיה
    1. עבור למצב סריקת לייזר. הגדר את עוצמות הלייזר באופן הבא: 561 ננומטר ב-0.5% (~100 μW במטרה) עבור H2B-RFP (כרומוזומים); 633 ננומטר ב-3% (~300 μW במטרה) עבור SiR-Tubulin (מיקרו-צינורות ציר; איור 3B,E).
      הערה: פעל לפי הנחיות בטיחות הלייזר המתאימות. צמצם את חשיפת הלייזר כדי להגן על כדאיות הדגימה.
  5. רכישת Z-stack
    1. רכשו ערימות Z המשתרעות על פני 30-50 מיקרומטר עם גודל צעד של 2-4 מיקרומטר (איור 3B,C).
    2. צלם תמונות במרווחים של 5-10 דקות באמצעות מהירות סריקה של 600 הרץ (איור 3B,D). משך ההדמיה הכולל יכול להתפרש על פני 12-16 שעות, תלוי בשלב המיוטי המנוטר, ומוגבל על ידי פוטוטוקסיות וסבילות לביציות לתרבית חוץ גופית מורחבת.
  6. רכישת תמונה רציפה
    1. במערכות המיקרוסקופ, בצע סריקה רציפה עם שני גלאי HyD: H2B-RFP: עירור ב-561 ננומטר; פליטה שנאספה ב-580-630 ננומטר; עירור SiR-טובולין ב-633 ננומטר; פליטה שנאספה ב-650-700 ננומטר (איור 3E).
  7. התחלת הדמיית דולג זמן
    1. לפני שתתחיל ברכישת זמן-lapse לטווח ארוך, ודא את איכות האות על ידי צילום תמונת בדיקה. יש להפיץ אותות פלואורסצנטיים באופן שווה: H2B-RFP צריך לתייג כרומטין בצורה ברורה, ו-SiR-tubulin צריך להדגיש מבני מיקרו-צינורות ללא רקע מוגזם. אשר יציבות מיקוד אוטומטי והלבנת אור מינימלית בריצות הדמיה ראשוניות קצרות.
    2. התחל הדמיית דולג זמן על-ידי לחיצה על התחל.
      הערה: GVBD, המסמן כניסה לשלב M, מתרחש בדרך כלל 60-90 דקות לאחר שטיפת IBMX (איור 4A). במערך זה, ביציות C57BL/6 פולטות את הגוף הקוטבי הראשון בסביבות 8-9 שעות לאחר GVBD (איור 4A). התזמון עשוי להשתנות בהתאם לזן העכבר ולתנאי התרבית.

5. עיבוד לאחר הדמיה

  1. פתח את קובץ ההדמיה בתוכנה לניתוח תמונות על-ידי בחירה באפשרות File > Open ובחירת קובץ .lif מהפעלת ההדמיה.
  2. צור תחזיות Z עבור ערוצי H2B RFP ו-SiR-Tubulin על ידי בחירת עיבוד > יצירת הקרנה. הגדר את סוג ההקרנה להקרנה בעוצמה מרבית. בחר גם את ערוצי RFP וגם את SiR Tubulin ולאחר מכן לחץ על הפעל.
    הערה אל תבצע הקרנת Z עבור ערוץ ה-DIC, מכיוון שהיא עלולה לגרום לתמונה מטושטשת. במקום זאת, זהה ובחר את מישור ה-DIC היחיד הממוקד בצורה החדה ביותר. השתמש בתמונת DIC ממוקדת זו בשילוב עם הקרנות העוצמה המקסימלית של ערוצי H2B-RFP ו-SiR-Tubulin כדי להשיג הדמיה אופטימלית.
  3. חלץ מישור מוקד שדה בהיר יחיד. חזור אל כלי תהליך ובחר ערוך > חיתוך. בחר בערוץ Brightfield, השתמש במחוון Z כדי למצוא את מישור המוקד האופטימלי ולחץ על Apply.
  4. מזג את תמונות ההקרנה והשדה הבהיר על-ידי פתיחת כלי תהליך, בחירה באפשרות Merge > Add Channels. הוסף את הקרנת ה-RFP, הקרנת SiR-Tubulin ותמונת השדה הבהיר היחידה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הערכה הממוזגת ולאחר מכן לחץ על החל.
  5. ייצאו את התמונה הממוזגת הסופית באמצעות בחירה באפשרות File > Export > Image. בחרו בפורמט TIFF לקבלת פלט איכותי ולא דחוס.
    הערה: ייצוא בתבנית TIFF מומלץ לניתוח במורד הזרם והכנת איורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 4A,B, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה איכותית של תאים חיים של כרומוזומים (H2B-RFP) ומיקרו-צינורות ציר (SiR-tubulin) בביציות, ובכך מספק מידע מרחבי-זמני מקיף לאורך ההתבגרות המיוטית.

ערוץ H2B-RFP באיור 4A חושף את כל ההיבטים של תנועת הכרומוזומים מהיישור הראשוני לאחר GVBD (איור 4A, 03:00 - 08:00) ועד להפרדה באנפאזה I (איור 4A, חץ צהוב 09:00) וכלה ביישור הכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה חזקה להזרקת מיקרו והדמיית תאים חיים של ביציות עכבר, המאפשרת הדמיה של דינמיקת הכרומוזומים במהלך מיוזה ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה. קריטי להצלחת גישה זו הוא הטיפול הקפדני בביציות לאורך כל שלב של ההליך, החל מאיסוף והזרקת מיקרו ועד להדמיה. ביציות רגישות מאוד לתנודות סביבתיות, וסטיות בטמפרטורה, pH או אוסמולריות עלולות לפגוע בשלמות הפיזיולוגית ובפוטנציאל ההתפתחותי שלהן 3,4,5,16,17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי קרן התרומות של פרופסור כריסטופר צ'ן, מימון סטארט-אפ מהפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קווינסלנד, ומענקי פרויקט המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (APP1078134 ו-APP1103689) ל-H.A.H.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקים של 1 מ"לטרומוSS+01T טוברקוליןמזרקים להזרקות PMSG מדויקות.
ג'ל אגרוזInvitrogen16500500משמש לאלקטרופורזה של ג'ל DNA ו-RNA להפרדת חומצות גרעין לפי גודל, כדי להתאים לרצף H2B-RFP
מבער אלכוהוללאב טקLW15557-01משמש לעיקור והכנת פיפיטות בפה.
אמצעי תרבית חיידקים (מרק LB)סיגמא-אולדריץ'ל3022מדיום סטנדרטי המשמש לגידול E. coli ותרביות חיידקים אחרות.
כלי תרבית תאים (35 פעמים; 10 מ"מ ו-60 פעמים; 15 מ"מ)סיגמא-אולדריץ'CLS430165, CLS430166משמש לגידול ביציות; ניתן להשיג בגדלים שונים.
צנטריפוגה (ספסל)אפנדורףר5424רצנטריפוגה קומפקטית לנפחי דגימות קטנים הנפוצה במעבדות מחקר.
צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל ו-50 מ"ל)קורנינג352096, 352070צינורות גדולים יותר לצנטריפוגה, המשמשים בדרך כלל לעיבוד תאים וחלבונים.
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'C2432ממס נפוץ בפרוטוקולים של ביולוגיה מולקולרית, במיוחד במיצוי DNA/RNA.
חממת CO2סניו (דגם: MCO-18AIC)חממה שנועדה לשמור על אטמוספירת CO2 מבוקרת לגידול ביציות.
מחטים חד פעמיות עדינות במיוחד (27 גרם ופעמים; 1/2 אינץ')האנקה סאס וולף4710004012מחטים עדינות לאיסוף ביציות
DNase I (ללא RNase)תרמו פישר סיינטיפיקEN0521אנזים המשמש להסרת DNA מזהם מתכשירי RNA.
בלוק חימום יבשמכשירי מענק (דגם: QBD4)בלוק המשמש לחימום דגימות או תגובות בטמפרטורות מדויקות ללא צורך במים.
אתנול (כיתה ביולוגיה מולקולרית)סיגמא-אולדריץ'E7023משמש למשקעי DNA ו- RNA, כמו גם בהליכי עיקור.
מספריים לניתוח עדיןמכשירים מדעיים וכירורגיים של Met-App2235משמש לביציות עכבר חיתוך מדויק
מלקחיים עדיניםמכשירים מדעיים וכירורגיים של Met-App2127משמש לביציות עכבר חיתוך מדויק
מערכת אלקטרופורזה של ג'לביו-ראד1645050מערכת לביצוע אלקטרופורזה של חומצות גרעין או חלבונים בג'לים.
גנטמיצין סולפטסיגמא-אולדריץ'G1264אנטיביוטיקה המשמשת למניעת זיהום חיידקי בתרביות תאים.
פיפטות פסטר מזכוכית (230 מ"מ)VWR6121702פיפטות זכוכית המשמשות לפיפטה לפה ביציות 
יבמקססיגמא-אולדריץ'I5879מעכב פוספודיאסטראז המשמש למניעת GVBD
מיקרוסקופ הפוךניקוןמיקרוסקופ המיועד לתצפית על תאים או אורגניזמים חיים מתחת לצלחת התרבית.
שמן מינרלי קל המתאים לתרבית עוברי עכבריםסיגמא-אולדריץ'M5310משמש לכיסוי ביציות בתרבית למניעת אידוי ושמירה על טמפרטורה.
ליתיום כלורידסיגמא-אולדריץ'L9650משמש בשיטות משקעי RNA.
מערכת הדמיה של תאים חייםלייקהלאס Xמערכת הדמיה המיועדת לתצפית בזמן אמת על תאים חיים בטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות.
M16 בינוני (לתרבית במבחנה)סיגמא-אולדריץ'M7292מדיום המיועד לתרבית ביציות ועוברים של עכברים ויישומים אחרים במבחנה.
צינורות מיקרוצנטריפוגה (0.6 מ"ל ו-1.6 מ"ל)נפטון3735.X, 3745.Xצינורות בנפח קטן לצנטריפוגה, המשמשים לעתים קרובות בפרוטוקולים של ביולוגיה מולקולרית וביוכימיה.
צינורות מיקרוצנטריפוגה (ללא RNase)אפנדורף / נפטון022431081 (אפנדורף)צינורות נטולי RNase ל-RNA פועלים למניעת פירוק של RNA.
מחטי מיקרו-הזרקהסאטר אינסטרומנטסחולץ פיפטות P-30מחטים להזרקה מדויקת לביציות
מערכת מיקרו-הזרקהמנגנון הרווארדפמטו-ג'ט, PicoPumpמערכות המשמשות להזרקת cRNA לביציות עכברים ברמת דיוק גבוהה.
ערכת Miniprepקיגן27106 (ערכת מיני-הכנה לסיבוב QIAprep)ערכה לבידוד DNA פלסמיד מתרביות חיידקים ליישומי ביולוגיה מולקולרית.
מכלול צינור שואב פהסיגמא-אולדריץ'א5177לביציות שאיפה
צבע גלולהמרק מיליפור69049-3מוצר להמחשת היווצרות גלולות במהלך צנטריפוגה.
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמילתרמו פישר סיינטיפיק15593031פתרון המשמש במיצוי H2B-RFP להפרדת פאזות.
קידוד פלסמיד H2B-RFPאדג'ןפלסמיד #20972 פלסמיד המשמש לתיוג כרומוזומים עם חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) 
PMSGפרוספקטהור-272לביוץ עכבר 
פרוטאינאז Kתרמו פישר סיינטיפיקEO0491אנזים המשמש לעיכול חלבונים, נפוץ בהליכי מיצוי DNA/RNA.
אנזים הגבלה NotIמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד (NEB)₪1189Sאנזים הגבלה המשמש ביישומי שיבוט DNA וביולוגיה מולקולרית, לליניאריזציה של פלסמיד H2B-RFP.
מעכב RNase (אופציונלי)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד (NEB)M0314Sאנזים המשמש למניעת פירוק RNA במהלך ניסויים הקשורים ל-RNA.
כפפות ללא RNaseVWR / פישר סיינטיפיקמשתנה לפי גודלכפפות שטופלו למניעת זיהום RNase, המשמשות בפרוטוקולי מניפולציה של RNA.
קצות פיפטה ללא RNaseאקסיג'ן / תרמו פישרטי-300-אר-אסקצות פיפטה נועדו להיות נקיים מזיהום RNase עבור יישומים הקשורים ל-RNA.
מים ללא RNaseתרמו פישר סיינטיפיקAM9932מים מטוהרים להסרת אנזימי RNase, החיוניים לעבודת RNA כדי למנוע פירוק.
SDS (10%)סיגמא-אולדריץ'L3771נתרן דודציל סולפט משמש לדנטורציה של חלבונים באלקטרופורזה וניסויים אחרים.
סיר-טובוליןספירוכרוםSC002צבע פלואורסצנטי הנקשר במיוחד לטובולין לצורך הדמיית תאים חיים של הציר
נתרן אצטט (3 מ')סיגמא-אולדריץ'S7899משמש כחיץ ולמשקעים של DNA בהליכי ביולוגיה מולקולרית.
ספקטרופוטומטרתרמו פישר (NanoDrop)ND-אחד-Wמכשיר המשמש לכימות חומצות גרעין, חלבונים וחומרים אחרים על ידי מדידת ספיגה.
סטריאומיקרוסקופלייקה מיקרוסיסטמס   M165Cמיקרוסקופ המיועד לתצפית על דגימות בתלת מימד בהגדלות נמוכות, שימושי לדיסקציות.
יחידת מסנן מזרק (0.22-& מיקרו; m)מרקSLGP033RSמשמש לסינון סטרילי של נוזלים, במיוחד ביישומי מיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית.
מכלול מזרקים ומחטטרומומזרקי טוברקולין SS+01Tמשמש לאספקה מדויקת של PMSG.
ערכת mMACHINE T7 mMESSAGEתרמו פישר סיינטיפיקAM1344ערכה לשעתוק RNA במבחנה ממקדם T7 להכנת H2B-RFP cRNA.
אמבט מים / בלוק חימוםמכשירי מענקQBD4משמש לשמירה על טמפרטורות מדויקות בניסויים הדורשים חום.

מקורות

  1. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  2. Wei, Z., Greaney, J., Loh, W. N., Homer, H. A. Nampt-mediated spindle sizing secures a post-anaphase increase in spindle speed required for extreme asymmetry. Nat Commun. 11 (1), 3393(2020).
  3. Zhou, C., Hancock, J. L., Khanna, K. K., Homer, H. A. First meiotic anaphase requires Cep55-dependent inhibitory cyclin-dependent kinase 1 phosphorylation. J Cell Sci. 132 (18), jcs233379(2019).
  4. Zhou, C., Homer, H. A. The oocyte spindle midzone pauses Cdk1 inactivation during fertilization to enable male pronuclear formation and embryo development. Cell Rep. 39 (5), 110789(2022).
  5. Zhou, C., Ye, Y., Homer, H. Using FRET to define Cdk1-dependent ordering of events during exit from second meiotic M-phase in oocytes. Methods Mol Biol. 2874, 99-114 (2025).
  6. Jones, K. T. Meiosis in oocytes: Predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age. Hum Reprod Update. 14 (2), 143-158 (2008).
  7. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  8. Verlhac, M. H., Lefebvre, C., Guillaud, P., Rassinier, P., Maro, B. Asymmetric division in mouse oocytes: with or without Mos. Curr Biol. 10 (20), 1303-1306 (2000).
  9. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-Organization of MTOCs Replaces Centrosome Function during Acentrosomal Spindle Assembly in Live Mouse Oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  10. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation, and ploidy assessment. J Vis Exp. (55), e2851(2011).
  11. Yoshida, N., Perry, A. C. F. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  12. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2012).
  13. Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., Green, M. R. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA probes. Nucl Acids Res. 12 (18), 7035-7056 (1984).
  14. Wei, Z., Greaney, J., Zhou, C., Homer, H. A. Cdk1 inactivation induces post-anaphase-onset spindle migration and membrane protrusion required for extreme asymmetry in mouse oocytes. Nat Commun. 9, 4029(2018).
  15. Davydenko, O., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Increased CDK1 activity determines the timing of kinetochore-microtubule attachments in meiosis I. J Cell Biol. 202 (2), 221-229 (2013).
  16. Swain, J. E., Pool, T. B. ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update. 14 (5), 431-446 (2008).
  17. Sun, Q. Y., Schatten, H. Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction. 131 (2), 193-205 (2006).
  18. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  19. Nakagawa, S., FitzHarris, G. Quantitative microinjection of morpholino antisense oligonucleotides into mouse oocytes to examine gene function in meiosis-I. Methods Mol Biol. 1457, 217-230 (2016).
  20. Courtois, A., Solc, P., Kitajima, T. S. Triple-color live imaging of mouse oocytes. Methods Mol Biol. 1818, 89-97 (2018).
  21. Kline, D. Quantitative microinjection of mouse oocytes and eggs. Methods Mol Biol. 518, 135-156 (2009).
  22. Yamagata, K., Suetsugu, R., Wakayama, T. Long-term, six-dimensional live-cell imaging for the mouse preimplantation embryo that does not affect full-term development. J Reprod Dev. 55 (3), 343-350 (2009).
  23. Rémillard-Labrosse, G., et al. Oocyte and embryo culture under oil profoundly alters effective concentrations of small molecule inhibitors. Front Cell Dev Biol. 12, 1337937(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

H2B RFPSiR TubulinmRNA

מאמרים קשורים