נורמליזציה מבוססת MTT של שחרור גליצרול לכימות מדויק של ליפוליזה באדיפוציטים אפידידימליים ראשוניים של חולדות

Summary

חפצים ניסיוניים, כולל תנודות בכדאיות התאים והפרעות בדיקה, מעכבים כימות מדויק של שחרור גליצרול באדיפוציטים ראשוניים עשירים בשומנים. כדי להפחית את האתגרים הללו, נעשה שימוש באסטרטגיית נורמליזציה מבוססת MTT להתאמת מדידות הגליצרול לפעילות מטבולית בתאים, ובכך לשפר את האמינות של כימות הליפוליזה.

Abstract

ליפוליזה, מסלול מטבולי קריטי, כרוך בהידרוליזה של טריגליצרידים מאוחסנים לחומצות שומן חופשיות וגליצרול. עם זאת, כימות מדויק של תפוקת הגליצרול באדיפוציטים ראשוניים עשירים בשומנים מבולבל לעתים קרובות על ידי חפצים ניסיוניים, כגון שונות בכדאיות התאים והפרעות בדיקה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, נקבעה שיטה פשוטה לנרמל את מדידות שחרור הגליצרול באמצעות בדיקת כדאיות התאים המבוססת על 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). פרוטוקול זה ממנף את ההבדל במשקל הסגולי בין אדיפוציטים לתמיסות מימיות, ומאפשר כימות בו-זמני של התפוקה הליפוליטית וכדאיות התא. בניסויי סינון תרופות, פראבסטטין וסימבסטטין שיפרו באופן משמעותי את שחרור הגליצרול מאדיפוציטים בטניים, בעוד שאטורבסטטין ולובסטטין לא שינו באופן משמעותי את תפוקת הגליצרול. ממצאים אלה מצביעים על כך שנורמליזציה מבוססת MTT מציעה גישה חזקה ונוחה לכימות מדויק של ליפוליזה, עם יישומים פוטנציאליים בגילוי תרופות המכוונות להשמנת יתר ותסמונת מטבולית. מחקר זה מדגיש את הצורך להעריך מחדש מבחני ליפוליזה קונבנציונליים כדי להבחין בין תגובות מטבוליות אמיתיות לבין דליפת ממברנה לא ספציפית.

Introduction

ניתן לחלק את רקמת השומן לרקמת שומן לבנה (WAT) ולרקמת שומן חומה (BAT)¹. WAT מבצע את הפונקציה של אחסון אנרגיה עודף כטריגליצרידים, בעוד של-BAT יש את הפונקציה של ייצור חום לשמירה על טמפרטורת הגוף, הממירה אנרגיה כימית לאנרגיית חום תחת גירוי קור¹. לרקמת השומן יש גם תפקוד אנדוקריני². הוא יכול להפריש מגוון הורמונים, ציטוקינים ומטבוליטים (המכונים ביחד אדיפוקין), ולשלוט במאזן האנרגיה של הגוף על ידי ויסות התנהגות חיפוש מזון ממערכת העצבים המרכזית והפעילות המטבולית של הרקמות הסובבות².

ליפוליזה היא תהליך הידרוליזה שלב אחר שלב של שומנים תוך תאיים תחת פעולת סדרה של אנזימים ליפוליטיים ^3,4. באדיפוציטים, שומנים מאוחסנים בעיקר בטיפות שומנים בצורת טריגליצרידים⁵. טיפות השומנים מכוסות במשפחת פריליפין החלבון הקשורה לטיפות שומנים, המונעת הידרוליזה של טריגליצרידים על ידי אנזימים ליפוליטיים ^6,7. עם זאת, כאשר אות הליפוליזה מוגבר, רמות הביטוי של משפחת הפריליפינים באדיפוציטים יורדות, ואנזימים ליפוליטיים נכנסים לטיפות שומנים ^3,4. כתוצאה מכך, טריגליצרידים מתפרקים לגליצרול וחומצות שומן חופשיות ^3,4,5.

ליפוליזה, פירוק הטריגליצרידים המאוחסנים לגליצרול וחומצות שומן חופשיות, היא תהליך בסיסי בחילוף החומרים של אדיפוציטים⁸. בעוד שמדידה ישירה של תוצרי ליפוליזה כגון גליצרול מספקת תובנות חשובות, כימות מדויק היה מאתגר, במיוחד באדיפוציטים ראשוניים תלויים עקב טעויות תפעוליות הנובעות מהבדלים במספר התאים בין קבוצות הניסוי. מחקר זה נועד להתמודד עם אתגר זה על ידי שימוש בבדיקת כדאיות תאים כדי לנרמל את כימות שחרור הגליצרול מאדיפוציטים ראשוניים בבטן של חולדות. על ידי סטנדרטיזציה של שיטת המדידה, בדיקת שחרור הגליצרול המנורמל יושמה ככלי פוטנציאלי לגילוי תרופות המכוונות להשמנת יתר ותסמונת מטבולית באדיפוציטים.

Protocol

פרוטוקול זה ממנף את ההבדל במשקל הסגולי בין אדיפוציטים לתמיסות מימיות כדי לאפשר מדידה בו-זמנית של שחרור גליצרול (כאינדיקטור לליפוליזה) ו-3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) באותן בארות של צלחת של 96 בארות, ובכך לייעל את זרימת העבודה הניסיונית ולשפר את היעילות.

כל ההליכים בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE ונערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס' 8023, מתוקן 1978). פרוטוקול המחקר אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר אישור 202112, אושר ב-5 במאי 2021). חולדות הוויסטאר הזכרים ששימשו במחקר זה היו בני 8 שבועות לפחות עם משקל גוף של ≥200 גרם בתנאי דיור סטנדרטיים. רקמת שומן לבנה אפידידימלית נאספה עם תפוקות אופייניות של 0.6-0.8 גרם לחולדה. יש לציין כי חולדות מבוגרות יותר או אלה שניזונו מתזונה עתירת שומן הראו עלייה משמעותית במסת רקמת השומן הלבנה (לעתים קרובות 1.5-3 גרם), מה שדרש התאמה פרופורציונלית של ריכוזי אנזימי העיכול (למשל, קולגנאז) כדי לשמור על יעילות עקבית של דיסוציאציה של רקמות. השימוש הבלעדי בחולדות זכרים מנע השפעות מבלבלות פוטנציאליות מתנודות הורמונליות במחזור הייחום הנקבי. בחירת הזנים (למשל, Sprague-Dawley, Wistar או Long-Evans) נשמרה באופן עקבי בניסויים כדי להבטיח אחידות גנטית בתגובות רקמת השומן. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד אדיפוציטים ראשוניים בבטן של חולדה

1. להרדים חולדת Wistar בוגרת זכר עם הזרקה תוך-צפקית של 7% כלורל הידרט (מומס ב-H₂O מזוקק) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
2. אשר הרדמה מלאה על ידי בדיקת היעדר תגובות רפלקס, ולאחר מכן בצע חתך בקו האמצע בבטן באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים.
3. הסר בזהירות רקמת שומן קרביים מהצד השמאלי והימני של כרית השומן האפידידימלית.
   הערה: אדיפוציטים אפידידימליים הם גדולים וצפים יחסית, מה שמקל על הפרדה וניתוח.
4. העבירו את הרקמה שנאספה לתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS; איור 1A).
5. שטפו את הטישו פעמיים עם PBS כדי להסיר זיהומים, כולל כלי דם דבוקים וקרישי דם.
6. חותכים את הרקמה השטופה לחתיכות קטנות.

2. טיהור אדיפוציטים ראשוניים בבטן של חולדות

1. דגרו על רקמת השומן המנותחת עם טריפסין וקולגנאז מסוג II (10 מ"ג בתמיסת טריפסין של 10 מ"ל) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים תחת טלטול.
2. סננו את רקמת השומן המעוכלת דרך מסננת תאים (איור 1A).
3. צנטריפוגה את המסנן ב-120 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פעילות אנזימטית שיורית.
4. העבירו את השומנים התלויים (השכבה הלבנה העליונה) לצינור נקי ושטפו אותם עם PBS.
5. צנטריפוגה את המסנן בחום של 120 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר להסרת PBS.
6. דגרו את האדיפוציטים המסוננים (השכבה הלבנה העליונה) במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת 1% פניצילין-סטרפטומיצין למשך לא יותר מ-30 דקות.

3. ניתוח שחרור גליצרול

1. זרעו את האדיפוציטים המסוננים (10 4-10⁵ תאים לבאר; 200 מיקרוליטר) בצלחת תרבית תאים של 96 בארות.
   הערה: אדיפוציטים כומתו באמצעות המוציטומטר סטנדרטי. בשל השונות הגדולה בגודל השומן, לא ניתן היה לספור במדויק כמה תאים גדולים יותר. לכן, ייתכן שספירת התאים לא תשקף במדויק את המספר האמיתי של אדיפוציטים. המטרה העיקרית הייתה להשיג פיזור שווה של תאים על פני בארות ולא כימות מדויק.
2. טפל באדיפוציטים עם 0.05% דימתיל סולפוקסיד (DMSO; כקבוצת ביקורת) ו-50 מיקרומטר אטורבסטטין, פראבסטטין, לובסטטין וסימבסטטין למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס תחת ניעור עדין.
   הערה: תנאי טיפול אלה ניתנים כהתייחסות ועשויים להיות מותאמים לפי הצורך על סמך המטרות הספציפיות והתכנון של הניסוי.
3. אספו את מדיום תרבית התאים (השכבה האדומה התחתונה) כדי לנתח את שחרור הגליצרול, מה שמעיד על תחילת הליפוליזה (איור 1B).
4. השתמש בערכת בדיקה מסחרית לשחרור גליצרול כדי להעריך ליפוליזה של אדיפוציטים בתגובה לטיפולים שונים.
5. מדוד את הספיגה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

4. ניתוח כדאיות התאים

1. ממיסים אבקת MTT בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל ב-H₂O מזוקק ומעקרים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
2. לאחר ניתוח שחרור גליצרול, הוסף תמיסת MTT (ל-0.5 מ"ג/מ"ל סופי) לתאים ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
3. העבירו את האדיפוציטים המרחפים (השכבה הסגולה העליונה) לתוך שפופרת נקייה המכילה DMSO לניתוח כדאיות התא (איור 1B).
4. מערבולת קצרה כדי להמיס גבישי פורמזן סגולים שנוצרו.
5. מדוד את הספיגה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

5. חישוב נורמליזציה

1. ערכו את כל הניסויים בשלוש פעמים וחזרו על הפעולה ארבע פעמים (n = 4).
   הערה: עבור כל ניסוי עצמאי (n = 4), בודדו אדיפוציטים משלוש חולדות, וכל מצב טיפול בוצע בשלוש עותקים.
2. עבור כל קבוצת טיפול, חלקו את ערך הספיגה של שחרור הגליצרול בערך הספיגה של כדאיות התא המתאים.
3. הצג את הנתונים כממוצע ± סטיית תקן (SD).
   הערה: ממוצע ו-SD חושבו באמצעות Microsoft Excel עם הפונקציות =AVERAGE(range) ו-=STDEV. S(טווח). עבור השוואות קבוצתיות, מבחני t דו-זנביים לא מזווגים בוצעו באמצעות GraphPad Prism 6 עם מבחן הפונקציה t של אמצעי השוואה.
4. קבע את המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין קבוצות באמצעות מבחן t של סטודנט, כאשר ערך P קטן מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

Results

לאחר סינון ראשוני של תרופות, נעשה שימוש בתרופה האנטי-היפרליפידמית סטטינים כדי לחקור את ההשפעות הליפוליטיות באדיפוציטים בשיטת שחרור גליצרול מנורמל⁹.

השפעת הסטטינים על שחרור גליצרול מאדיפוציטים ראשוניים בבטן של חולדות
השפעת הסטטינים על ליפוליזה באדיפוציטים בטניים ראשוניים של חולדות הוערכה על ידי טיפול בתאים עם 50 מיקרומטר של פראבסטטין, סימבסטטין, אטורבסטטין, לובסטטין ו-0.5% DMSO במשך 4 שעות. ניתוח שחרור הגליצרול הצביע על כך שטיפול בפרבסטטין וסימבסטטין ...

Discussion

מחקר זה מספק שיטה מדויקת יותר למדידת ליפוליזה באדיפוציטים ראשוניים עמוסי שומנים. נמצא כי פראבסטטין וסימבסטטין גורמים לשחרור גליצרול ומפחיתים את הכדאיות של אדיפוציטים אפידידימליים בחולדות, בעוד שאטורבסטטין ולובסטטין לא הראו השפעות משמעותיות. מתן סימבסטטין הביא לעלייה מינימלית בשחרור הגליצרול מאדיפוציטים. כדי לטפל בבעיה זו, נעשה שימוש בבדיקת MTT כדי לתקנן את מדידת הליפוליזה. גישה זו הראתה שיפור משמעותי בהערכת ההשפעה הליפוליטית הנגרמת על ידי פראבסטטין וסימבסטטין, ככל הנראה מיוחסת להשפעתם על...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-ומיקרו; מסנן M	סנגון ביוטק בע"מ	F513165-0001	מסנן מזרק, מערכת אקו, סטרילי
3-(4,5-דימתילתיאזול-2-יל)-2,5-דיפניל טטרזוליום ברומיד	סנגון ביוטק בע"מ	A600799-0001	1 גרם
צלחות תרבית תאים 96 בארות	סנגון ביוטק בע"מ	F603204-0001	עקר
מלח סידן אטורבסטטין	קיימן כימיקלים	10493-5	5 מ"ג
מסננת סלולרית	סנגון ביוטק בע"מ	F513450-0001	80 רשת מסך
כלורל הידרט	סנגון ביוטק בע"מ	A500288-0250	250 גרם
דימתיל סולפוקסיד	סנגון ביוטק בע"מ	A460700-0100	100 מ"ל
מדיום הנשר השונה של דולבקו	סנגון ביוטק בע"מ	E600003	500 מ"ל, גלוקוז גבוה, סטרילי
סרום בקר עוברי	סנגון ביוטק בע"מ	E600001	100 מ"ל, סטרילי
ערכת בדיקה קולורימטרית של גליצרול	קיימן כימיקלים	10010755-96	96 בארות
לובסטטין	קיימן כימיקלים	10010338-5	5 מ"ג
חולדות בוגרות זכרים	אוניברסיטת פוטיאן	וויסטאר	כ-10-12 שבועות
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין	סנגון ביוטק בע"מ	B540732-0010	10 מ"ל, סטרילי
מי מלח חוצץ פוספט	סנגון ביוטק בע"מ	E607009-0500	500 מ"ל, סטרילי, ללא סידן או מגנזיום
מלח נתרן פרבסטטין	קיימן כימיקלים	10010343-5	5 מ"ג
סימבסטטין	קיימן כימיקלים	10010344-5	5 מ"ג
תמיסת טריפסין	סנגון ביוטק בע"מ	E607003-0100	100 מ"ל, ללא EDTA ופנול אדום, סטרילי
קולגנאז סוג II	סנגון ביוטק בע"מ	A004174-0100	100 מ"ג