מאמר שיטה

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אנדותל (ECs) ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות הובלת חומצות שומן (FA) מזרם הדם לרקמות מטבוליות, אך הכלים לכימות ספיגת EC FA בצורה אמינה וניתנת להרחבה נותרים מוגבלים. כאן, אנו מציגים בדיקה מהירה, כמותית וחסכונית למדידת קליטת FA ב-ECs באמצעות אנלוגים פלואורסצנטיים של FA (BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16), המאפשרים חקירה של דינמיקת קליטה ספציפית לאורך השרשרת בפורמט צלחת של 96 בארות. הפרוטוקול משלב בקרות חיוביות (3-הידרוקסיסובוטיראט, לקטט) ושליליות (ניקלוזמיד) ומאומת הן בקווי EC ראשוניים (HUVECs) והן בקווי EC אלמותיים (EA.hy926). הבדיקה מזהה קליטת FA תלוית זמן ומינון, כאשר התוצאות מנורמלות למספר התאים באמצעות צביעה גרעינית של Hoechst ומתוקנות לרקע באמצעות בקרות מתאימות. ניתן להתאים אותו למגוון סוגי תאים, שיטות הדמיה ותנאי ניסוי, כולל הדמיית תאים חיים ופורמטים של רדיפת דופק. בהשוואה לצביעת שומנים מסורתית או עוקבים עם תוויות רדיו, שיטה זו מציעה בטיחות, מהירות ורב-תכליתיות משופרות תוך לכידת קליטת FA דינמית בתאים חיים. בדיקה זו מספקת פלטפורמה חזקה לחקר ויסות הובלת השומנים האנדותל ותרומתו למחלות מטבוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת שחומרים מזינים הנישאים בדם כגון שומנים ייכנסו לרקמה מטבולית, כגון שריר השלד, עליהם לחצות תחילה את מחסום תאי האנדותל (EC) המרכיב את דפנות כלי הדם הנימים. בעוד שבמשך זמן רב האמינו שחומצות שומן (FAs) פשוט מתפזרות על פני מחסום זה כדי להגיע לרקמה הבסיסית, עדויות מתפתחות מצביעות על כך ש-ECs מווסתים באופן פעיל את התהליך הזה באמצעות מנגנוני הובלה מיוחדים שהתפתחו כדי להעביר מולקולות הידרופוביות על פני עולמות חוץ-תאיים ותוך תאיים מימיים1.

בזרם הדם, FAs קיימים כחומצות שומן חופשיות הקשורות לאלבומין (FFAs) או ארוזים בתוך ליפופרוטאינים עשירים בטריגליצרידים (TRLs) כגון כילומיקרונים וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDLs)2. על פני השטח הלומינליים של ECs, ליפופרוטאין ליפאז (LPL) מבצע הידרוליזה של TRLs כדי לשחרר FFAs לספיגה. מגוון חלבונים מעורבים בהובלת FA, כולל CD36, המבצע את הספיגה בפועל של ה-FA לתוך התא; חלבוני הובלת חומצות שומן (FATPs) וסינתזות acyl-CoA (ACSLs), המתווכים הובלה וקטורית; חלבונים קושרי שומן (FABPs), הפועלים כצ'פרונים ליפופיליים, ואינספור אחרים, חלקם עדיין לא התגלו וסווגו 2,3. הרקמה הבסיסית משתמשת גם במנגנונים דומים כדי לקלוט את השומן המועבר, אם כי האיזופורמים הספציפיים הקיימים לרוב שונים בהתאם לסוג התא.

מחקרים אחרונים הראו כי ECs מתאמים עם תאים שכנים באמצעות איתות פרקריני כדי לווסת את הובלת FA לרקמות המטרה. לדוגמה, מיוציטים בשלד מפרישים אוסף של גורמים פרקריניים כמו 3-הידרוקסיאיזובוטיראט (3-HIB), גורם גדילה אנדותל כלי דם B (VEGFB) ואפלין כדי לקדם הובלת FA על ידיאנדותל 4,5,6 סמוך. מעניין שהמערכת האנדוקרינית עשויה להיות מעורבת גם היא, כפי שקורה כאשר אינסולין מגרה את האדיפוציטים לשחרר לקטט, מה שגם ממריץ ECs לקחת FAs7.

ECs פועלים אפוא כשומרי סף מווסתים של שומן, מה שמרמז על כך שהם ממלאים תפקיד מפתח בהפרעות מטבוליות של שומנים כגון מחלות לב וכלי דם או סוכרת מסוג 2. עדויות אחרונות הראו כי ה-ECs עצמם יצברו טיפות שומן (LDs) בתגובה לעומס יתר של שומן, מה שעשוי לשמש כחוצץ המווסת את אספקת חומצות השומן לרקמות הבסיסיות 8,9. במקרה של צריכת שומן גבוהה, כפי שקורה בדיאטות מודרניות, הצטברות מוגזמת של LDs אלה עלולה לתרום לתפקוד לקוי של כלי הדם ולמחלות, כולל יתר לחץ דם10. בסך הכל, הבנה טובה יותר של האופן שבו ECs קולטים ומעבירים FAs עשויה לספק לנו ידיות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות הנישאות על ידי שומנים.

במחקר זה, אנו מתארים בדיקה פשוטה, מהירה וחסכונית למדידת קליטת FA אנדותל באמצעות אנלוגים פלואורסצנטיים ארוכי שרשרת BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16. ריאגנטים אלה זולים למדי ובטוחים למדי, במיוחד בהשוואה ל-FAs רדיואקטיביים או כבדים המסומנים באיזוטופים, ששימשו באופן מסורתי למדידת ספיגת שומן תאי11,12. חשוב לציין כי ריאגנטים אלה נבדלים מצבע ה-BODIPY ה"חופשי" הלא מצומד, המצטבר באופן פסיבי באזורים הידרופוביים של התא, בעיקר ב-LDs13. לעומת זאת, צימוד BODIPY לשרשרת FA אליפטית (למשל, C12 או C16) מייצר מולקולה המחקה מבנית FAs מקוריים ארוכי שרשרת. שינוי זה מאפשר מדידה ספציפית של ספיגת חומצות שומן דינמיות לתאים, במקום לשקף אחסון שומנים תוך תאי או היווצרות טיפות.

חוזק מרכזי של גישה זו הוא הגמישות שלה. חוקרים יכולים להשתמש בסוגי תאים אחרים, זמני דגירה משתנים ומגוון אנלוגים של FA מצומדים ל-BODIPY כדי לחקור קליטה תלויה באורך השרשרת, או אפילו שומנים פלואורסצנטיים טבעיים כמו חומצת שומן cis-parinaric14. בסך הכל, פרוטוקול זה יספק לחוקרים דרך קלה לבחון את ספיגת ה-FA התאית בתנאים מרובים ויסלול את הדרך לענות על שאלות בסיסיות במטבוליזם של שומנים, ביולוגיה אנדותל ומחלות מטבוליות (איור 1).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל תאי האנדותל שמקורם בבני אדם (HUVECs) ששימשו במחקר זה התקבלו ממקורות זמינים מסחרית ללא זיהוי בהתאם להנחיות מוסדיות וספקים לשימוש אתי בחומרים ביולוגיים אנושיים. בצע את כל השלבים בסביבה סטרילית מתחת למכסה זרימה למינר. ראה טבלת חומרים לרשימה של כל הריאגנטים והציוד.

1. ציפוי ג'לטין של צלחת 96 בארות

  1. הכן תמיסת ג'לטין של 0.1% על ידי דילול 25 מ"ל של מלאי ג'לטין 2% ב-500 מ"ל 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
  2. מערבבים היטב ומעקרים באמצעות מסנן ואקום של 0.2 מיקרומטר (או חיטוי).
  3. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של ג'לטין 0.1% לצלחת שחורה עם תחתית שקופה של 96 בארות.
  4. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות או רצוי למשך הלילה.

2. זריעת תאים

  1. הכן תרחיף תא יחיד של ECs במדיה שלמה.
    1. הכן מדיה מלאה על ידי השלמת המדיום הבסיסי המתאים עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (v/v לשניהם).
      הערה: המדיום הבזאלי ישתנה בהתאם לסוג התא הספציפי; במחקר זה, מדיום גידול אנדותל (EGM-2) ומדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) שימשו עבור תאי HUVECs ו-EA.hy926, בהתאמה.
  2. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר בצפיפות זריעה המאפשרת לתאים להגיע למפגש עד למחרת.

3. הכנה ויישום של ריאגנטים לטיפול

  1. הכן את כל הריאגנטים ב- PBS דו-ערכי (עם Ca2+ ו- Mg2+) וחמם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.
    1. הכן 3-HIB (בקרה חיובית) כפתרון עבודה של 20 מ"מ. ממיסים את תמיסת הציר ב-1 מ' במים מזוקקים כפולים ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. הכן לקטט (בקרה חיובית) כפתרון עבודה של 20 מ"מ. ממיסים את תמיסת הציר ב-1 מ' במים מזוקקים כפולים ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. הכן ניקולוזמיד (בקרה שלילית) בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. ממיסים את תמיסת המלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO. יש לצרוך לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזור הקפאה-הפשרה, ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. שטפו תאים פעם אחת עם PBS דו-ערכי מחומם מראש.
  3. יש להוסיף 50 מיקרוליטר לבאר של המגיב הטיפולי המתאים (3-HIB, לקטט או ניקולוזמיד) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עבור ניקולוזמיד) או 60 דקות (עבור 3-HIB ולקטט).

4. BODIPY-FA: הכנה ויישום מורכבים של BSA

  1. הכן קומפלקסים של BODIPY-FA: BSA בריכוזים סופיים של 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר או 2 מיקרומטר ב-PBS, תוך שימוש ביחס מולארי של 2:1 FA: BSA. עבור תמיסת bodipy-fa של μm 2, דגרו עם BSA נטול FA של μM 1 ב-PBS. עבור 1 מיקרומטר bodipy-fa, השתמש ב-0.5 מיקרומטר BSA וכן הלאה. הגן תמיד על מתחמים מפני אור במהלך הדגירה.
  2. יש לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני השימוש.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר מהקומפלקס לבארות מטופלות.
    הערה: השתמש רק ב-10 העמודות האמצעיות כדי למנוע אפקטים של קצה. שמור עמודות חיצוניות כפקדי אוטופלואורסצנטיות, והוסף רק PBS לבארות אלה.
  4. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה, 5 דקות או 10 דקות.

5. כיבוי פלואורסצנטי וזיהוי אותות תוך תאיים

  1. הכן BSA ללא FA של 1 מיקרומטר ב-PBS כמאגר כביסה וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את BODIPY-FA: BSA ושטוף את כל הצלחת פעמיים עם 50 מיקרוליטר של 1 מיקרומטר BSA ללא FA מחומם מראש ב-PBS. בצע כל שטיפה למשך 1.5 דקות.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר של 0.08% טריפן כחול כדי להרוות את הקרינה החוץ-תאית.
  4. מדוד מיד את הקרינה התוך תאית באמצעות קורא מיקרו-פלטות עם ההגדרות הבאות: עירור: 488 ננומטר, פליטה: 515 ננומטר, חתך: 495 ננומטר, מצב: קריאה מלמטה.
    הערה: הפחיתו את הרקע האוטו-פלואורסצנטי באמצעות בארות עמודה חיצוניות המכילות תאים שלא טופלו ב-BODIPY-FA בשלב 4.

6. צביעה גרעינית של Hoechst לנורמליזציה של תאים

  1. יש להסיר את תמיסת Trypan Blue ולשטוף בעדינות עם PBS.
    הערה: התאים עשויים להיות שבירים במקצת ונוטים להחליק. היזהר בעת הכביסה.
  2. הוסף 4 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst במדיה של 10% ודגירה 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זמן הדגירה של Hoechst עשוי לדרוש אופטימיזציה. בהתאם לסוג התא, ייתכן שיהיה צורך ב-5 דקות עד 60 דקות כדי להשיג תיוג גרעיני אחיד ועוצמת אות מספקת. אל תוסיף Hoechst לעמודות חיצוניות.
  3. שטפו את הצלחת פעם אחת עם PBS.
  4. הוסף PBS טרי ומדוד את הקרינה של Hoechst באמצעות ההגדרות הבאות: עירור: 350 ננומטר, פליטה: 461 ננומטר, ניתוק: 455 ננומטר, מצב: קריאה למטה.
    הערה: הפחיתו את הרקע האוטופלואורסצנטי של הוכסט באמצעות בארות עמודים חיצוניות.
  5. נרמל את הקרינה של BODIPY-FA למספר התא על ידי חלוקת הערכים המתוקנים באוטופלואורסצנטי משלב 5.3 בערכי Hoechst המתאימים שהתקבלו בשלב 6.4. השתמש בערכים מתוקנים ברקע עבור אותות BODIPY ו-Hoechst כאחד.
    הערה: הערכים הסופיים מייצגים את קליטת BODIPY-FA מנורמלת למספר התא, מתוקנת עבור אוטופלואורסצנטיות הן בערוצי BODIPY והן בערוצי Hoechst.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח סטטיסטי עבור איור 2 באמצעות ANOVA דו-כיווני כדי להעריך את השפעות הזמן, הריכוז והאינטראקציה ביניהם. החל את מבחן הפוסט הוק של טוקי להשוואות מרובות.
  2. עבור איור 3 ואיור 4, השתמש במבחן t דו-זנבי לא מזווג של סטודנט בעת השוואה בין שני מצבים. עבור ניסויים הכוללים שלושה תנאים או יותר, השתמש ב-ANOVA חד-כיווני ואחריו במבחן של דונט להשוואות מרובות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמוצג באיור 1, בדיקה זו משתמשת בפורמט צלחת של 96 בארות שבה ECs נזרעים ישירות לבארות. FAs המסומנים על ידי BODIPY מצומדים לאלבומין בסרום בקר (BSA) ומיושמים הן על בארות ניסוי והן על בארות בקרה. לפני הטיפול ב-FA, ניתן לתמרן ECs באמצעות טיפולים תרופתיים או הפרעות גנטיות כגון טרנספקציה של siRNA או עריכת גנים של CRISPR. באופן מכריע, מניפולציות כאלה מאפשרות גם הכללה של בקרות חיוביות ושליליות מתאימות כדי להבטיח אמינות בדיקה.

עלייה ברורה תלוית מינון וזמן באות BODIPY-C12 תוך-תאי נצפתה לאחר דגירה של BODIPY-C12 ב-0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר ו-2 מיקרומטר למשך 1 דקה, 5 דקות ו-10 דקות הן בתאי HUVEC והן בתאי EA.hy926 (איור 2). כדי להסביר את השינויים הפוטנציאליים במספר התאים לבאר, ערכי BODIPY-C12 נורמלו לצביעה גרעינית של הוכסט ונמדדו באופן פלואורסצנטי. אוטופלואורסצנטיות ברקע תוקנה באמצעות בארות בקרה ללא BODIPY וללא Hoechst.

כדי לאמת את יכולת השחזור והטווח, מודולטורים ידועים של חילוף חומרים של חומצות שומן נבדקו ב-EA.hy926 ECs באמצעות BODIPY-C12 (איור 3). טיפול של שעה אחת עם ריכוזים הולכים וגדלים של לקטט (0 מ"מ, 5 מ"מ, 20 מ"מ) או 3-HIB (0 מ"מ, 5 מ"מ, 20 מ"מ) שיפר את ספיגת BODIPY-C12 באופן תלוי מינון, ואישר את תפקידם כמווסתים חיוביים של קליטת FA. לעומת זאת, הוכח בעבר כי הכימיקל ניקולוזמיד יכול לעכב את ספיגת חומצות השומן באמצעות ניתוק מיטוכונדריה15. ואכן, תוצאות דומות שוחזרו כאן, שכן 30 דקות של טיפול בניקלוזמיד (1 מיקרומטר) הפחיתו משמעותית את אות BODIPY-C12 ביחס לבקרת הרכב, ואישרו את התועלת שלו כבקרה שלילית. בעוד שנתונים אלה מנורמלים להוכסט כדי להסביר את כל ההבדלים במספר התאים, אף אחד מהטיפולים הללו לא שינה את כדאיות התא או את ערכי הקרינה של הוכסט.

על מנת להעריך את יכולת ההסתגלות של הבדיקה לאנלוגים שונים של חומצות שומן, BODIPY-C16, שיכול להיחשב כפרוקסי לחומצת שומן ארוכת שרשרת מאוד, ניתן ל-HUVECs, וספיגתו נמדדה לאחר דגירה של 5 דקות (איור 4). נצפה כי טיפול בלקטט (0 מ"מ, 10 מ"מ, 20 מ"מ) הגדיל את אות BODIPY-C16 באופן תלוי מינון, בעוד שניקלוזמיד (1 מיקרומטר) הפחית את האות, ושיקף את התוצאות שנצפו עם BODIPY-C12.

בסך הכל, בדיקה זו אפשרה כימות חזק וניתן לשחזור של קליטת FA הן ב-ECs ראשוניים (HUVEC) והן באלמוות (EA.hy926). יתר על כן, ממצאים אלה מדגימים את הרבגוניות של הבדיקה על פני FAs באורכי שרשרת משתנים, כמו גם מציגים את התוקף של בקרות חיוביות ושליליות כאחד.

figure-results-1
איור 1: סכמטי של בדיקת ספיגת חומצות השומן באמצעות חומצות שומן המסומנות על ידי BODIPY. תאי אנדותל נזרעים לתוך צלחת שחורה עם תחתית שקופה של 96 בארות ומודגרים עם אנלוגים של חומצות שומן מצומדות (FA) של BODIPY כדי לאפשר ספיגה תוך תאית. לאחר הדגירה, הקרינה החוץ-תאית מרווה עם טריפן כחול, והאות התוך-תאי נמדד באמצעות קורא מיקרו-פלואורסצנטי בקריאה תחתונה. כתם גרעיני של הוכסט מוחל לאחר מדידת הקרינה כדי לכמת את מספר התאים לנורמליזציה. ניתן ליישם טיפול תרופתי או הפרעות גנטיות לפני הדגירה של BODIPY-FA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: כימות ספיגת BODIPY-C12 בתאי אנדותל ראשוניים ואימורטליים. (A) עלייה תלוית זמן וריכוז בספיגת BODIPY-C12 ב-HUVECs לאחר דגירה של דקה אחת, 5 דקות ו-10 דקות ב-0.5 μM, 1 μM ו-2 μM BODIPY-C12 מורכבים ל-0.25 μM, 0.5 μM ו-1 μM BSA נטול FA, בהתאמה. (B) תאי EA.hy926 הראו קליטה דומה של BODIPY-C12 תלוית זמן ומינון בתנאים זהים. עוצמת הקרינה הממוצעת נורמלה לגרעינים מוכתמים ב-Hoechst (מספר תאים) ובקרות ללא BODIPY. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני כדי להעריך את ההשפעות של זמן, ריכוז והאינטראקציה ביניהם, ואחריו מבחן הפוסט הוק של טוקי להשוואות מרובות. השפעות עיקריות משמעותיות נצפו עבור זמן (p < 0.0001), ריכוז (p < 0.0001) והאינטראקציה ביניהם (p = 0.0443). השוואות זוגיות מובהקות סטטיסטית שזוהו על ידי המבחן של טוקי מסומנות בגרף העמודות כדלקמן: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ו-****p < 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אימות הבדיקה באמצעות בקרות חיוביות ושליליות ב-EA.hy926. (A) טיפול לקטט של שעה אחת (0 מ"מ, 5 מ"מ, 20 מ"מ) הגדיל את ספיגת BODIPY-C12 באופן תלוי מינון. (B) טיפול 1-h 3-HIB (0 מ"מ, 5 מ"מ, 20 מ"מ) הגדיל באופן דומה את ספיגת ה-FA. (C) טיפול של 30 דקות בניקלוזמיד (1 מיקרומטר) דיכא באופן משמעותי את ספיגת BODIPY-C12 ביחס לבקרת הרכב (DMSO). עוצמת הקרינה הממוצעת נורמלה לגרעינים מוכתמים ב-Hoechst (מספר תאים) ובקרות ללא BODIPY. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. 2 מיקרומטר BODIPY-C12 (מורכב ל-1 מיקרומטר BSA נטול חומצות שומן) הודגר במשך 5 דקות עבור כל הניסויים. הסטטיסטיקה עבור (A) ו-(B) נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן דאנט להשוואות מרובות, ועבור C באמצעות מבחן T דו-זנבי לא מזווג של סטודנט. עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אימות מבחן באמצעות BODIPY-C16 ב-HUVECs. (A) טיפול בלקטט (0 מ"מ, 10 מ"מ, 20 מ"מ למשך שעה) הגביר את ספיגת BODIPY-C16 באופן תלוי מינון. (B) טיפול בניקלוזמיד (1 מיקרומטר למשך שעה) הפחית משמעותית את אות BODIPY-C16 בהשוואה לביקורת שטופלה ברכב. עוצמת הקרינה הממוצעת נורמלה לגרעינים מוכתמים ב-Hoechst (מספר תאים) ובקרות ללא BODIPY. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. 2 מיקרומטר BODIPY-C16 (מורכב ל-1 מיקרומטר ללא חומצות שומן BSA) הודגר במשך 5 דקות עבור כל הניסויים. הסטטיסטיקה עבור (A) נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן Dunnett עבור השוואות מרובות, ועבור B באמצעות מבחן T דו-זנבי לא מזווג של סטודנט. *p < 0.05, ***p < 0.001 ו-****p < 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה זו מציעה שיטה מהירה, כמותית וחסכונית למדידת קליטת FA ב-ECs באמצעות פורמט מבוסס צלחת של 96 בארות ואנלוגים פלואורסצנטיים ארוכי שרשרת של FA. על ידי שילוב בקרות חיוביות ושליליות ואימות על פני ECs ראשוניים (HUVECs) ואמורטליים (EA.hy926), פרוטוקול זה מדגים חוסן, שחזור וישימות רחבה.

ניתוחים מבוססי פלואורסצנטיות היו חיוניים בחשיפת מווסתים פרקריניים של הובלת שומנים אנדותליים, כפי שהוזכר קודם לכן 4,5,7. דוגמאות אלו מדגישות כיצד מערכת סטנדרטית יכולה להמשיך להבהיר באופן אמין ויסות מונע מטבוליט של הובלת שומנים בסביבה מבוקרת במבחנה. הפרוטוקול המתואר כאן קובע פרמטרים מרכזיים למדידות קליטה אמינות של FA, כולל שימוש ב-BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 בריכוזים מרובים (0.5-2 מיקרומטר) וזמני דגירה (1 דקה, 5 דקות ו-10 דקות). הוא גם זיהה ביעילות ספיגה מוגברת בתגובה ל-3-HIB ולקטט, וירידה בספיגה בעקבות טיפול בניקלוזמיד, מה שאישר הן את הרגישות והן את הטווח הדינמי שלו. בעוד שאופטימיזציה כאן עבור ECs, ניתן להתאים בדיקה זו בקלות לסוגי תאים אחרים כגון אדיפוציטים, מיוטיובים או הפטוציטים עם התאמות ל-BODIPY: יחסי BSA ותנאי טיפול. ניתן גם לשנות אותו להדמיית תאים חיים באמצעות לוחות תואמים או להתאים אותו לפורמט מרדף דופק כדי להעריך שימור FA תוך-תאי, חילוף חומרים או פליטה.

בהשוואה לגישות אחרות, שיטה זו מציעה יתרונות ברורים: היא ניתנת להרחבה, כמותית וניתנת להתאמה לאורכי שרשרת FA שונים. בנוסף, הוא חסכוני, כרוך רק בקומץ שלבים, ודורש מכשירים שאינם מורכבים יותר מקורא מיקרו-פלטות נפוץ, המאפשר למשתמשים חדשים, כולל סטודנטים, לשלוט במהירות בפרוטוקול זה. לבסוף, בניגוד לשיטות מבוססות מיקרוסקופיה איכותית או כתמי קצה כמו Oil Red O, המשקפים תכולת שומנים מצטברת, פרוטוקול זה לוכד קליטת FA בזמן אמת ללא צורך בקיבוע או ליזה.

עם זאת, יש לציין מספר מגבלות. השימוש במערכת תרבית סטטית דו-ממדית אינו מסכם באופן מלא את המורכבות הפיזיולוגית של סביבת כלי הדם. גורמי מפתח כגון מתח גזירה או ליפוליזה בתיווך LPL, כמו גם אינטראקציות אנדותל-פרנכימליות, נעדרים מהמודל הפשוט הזה. מערכות מתקדמות, כגון תרבויות תלת מימד מבוססות מיקרופלואיד או אורגנואיד, מחקות טוב יותר ארכיטקטורה ואיתות in vivo, אם כי הן דורשות מומחיות טכנית ותשתית רבה יותר16,17. לדוגמה, ביו-ריאקטורים מיקרופלואידיים מספקים סביבה שבה ECs יכולים לחקות היווצרות מיקרו-כלי דם ולקיים אינטראקציה עם סוגי רקמות אחרים, מה שמאפשר לחוקרים למדל דינמיקה פרקרינית בסביבה פיזיולוגית יותר18. יתר על כן, עבודות אחרונות הראו שניתן לפתח מערכות מיוחדות לביצוע הדמיה פלואורסצנטית חיה בתרביות הידרוג'ל תלת מימדיות19. התקדמות כזו מספקת ביטחון שיום אחד ניתן יהיה להתאים את הבדיקה הזו למערכות תרבית תאים שהן מייצגות יותר מבחינה פיזיולוגית, אך יהיה צורך לבצע אופטימיזציה.

לסיכום, בדיקה זו מייצגת פלטפורמה גמישה, נגישה וניתנת לשחזור לחקירת קליטת FA סלולרית בתנאים מגוונים. בעוד שהיא מתאימה ביותר למחקרי מבחנה מכניסטיים, תובנות המתקבלות ממערכת זו עשויות להודיע על עבודה עתידית באמצעות מודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של הובלת שומנים אנדותליים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הצהירו כי לא קיים ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טנישה צ'ודהורי מומנה על ידי מלגת מחקר קיץ לתואר ראשון מהמשרד למחקר לתואר ראשון באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל. בואה קים נתמכה על ידי NHLBI (R56HL162660) ו-AHA (24CDA1264317). איון איברהים נתמך על ידי קרן המחקר הפקולטית של יוניון קולג'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-הידרוקסיאיזובוטיראט (3-HIB)קיימן כימיקלים26105בקרה חיובית, ריכוז סופי של 5 או 20 מ"מ
מיקרופלטת פוליסטירן שחורה 96 וול, תחתית שקופהסיגמא-אלדריץ'CLS3603-48EAכדי לבדוק את תאי הציפוי
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)תרמו פישר סיינטיפיקD3822חומצת שומן ירוקה פלואורסצנטית בשרשרת ארוכה
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)תרמו פישר סיינטיפיקD3821חומצת שומן ירוקה פלואורסצנטית בשרשרת ארוכה מאוד
תמיסת אלבומין לסרום בקרסיגמא-אלדריץ'A9205-50MLמשמש להכנת קומפלקס Bodipy:BSA
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אלדריץ'D2650ממס למלאי תרופות
מאגרי צנרת חד-פעמייםVWR89094-680מכיל את התמיסות השונות שיש לפיפט על התאים
דולבקו' s Modified Eagle' S Mediumקורנינג לייף סיינס10-013-CVמדיה לתאי EA.hy926
תאי EA.hy926ATCCCRL-2922 קו היברידי של תאי אנדותל מונצח
ערכת כדורים EGM-2 Endothelial Growth Cell Medium-2לונזהCC-3162מדיה ל-HUVECs
סרום בקר עוברי (FBS) VWR97068-08510% תוסף ב-EGM-2 ו-DMEM
קורא מיקרופלט פלואורסצנטימגווןלא זמיןכל קורא מיקרופלט המסוגל למדידות פלוראסצנטיות
תמיסת ג'לטיןסיגמא-אלדריץ'G1393-100mlמשמש לציפוי לוחות בריכוז עבודה של 0.1%
פתרון Hoechst 33342מדעי החיים62249צביעת גרעינית לנרמול תאים (4 & mu; M)
תאי האנדותל של ורידי הטבור האנושיים (HUVECs)לונזהC2519Aתאי אנדותל ראשוניים בבני אדם
פיפטה רב-ערוציתVWR76627-768לפיפיפטינג לפלטת 96 בארות
Niclosamide מיליפור סיגמאN3510-50Gשליטה שלילית, 1 & mu; M  ריכוז סופי
PBS, עם סידן ומגנזיוםפישר סיינטיפיק21031CVמשמש להכנת טיפולים וכבופר שטיפה (עם BSA)
PBS, ללא סידן ומגנזיוםג'נסי סיינטיפיק25-508לדילול ג'לטין, צביעת Hoechst ושטיפות כלליות
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140122תוסף 1% ב-EGM-2 ו-DMEM
נתרן L-לקטטסיגמא-אלדריץ'L7022-5Gבקרה חיובית, ריכוז סופי של 5 או 20 מ"מ
תמיסת Trypan Blueסיגמא-אלדריץ'T8154-20MLמשמש ב-0.08% לכיבוי פלואורסצנציה חוץ-תאית
מערכות סינון ואקום, ממברנת PES 500 מ"ל, 0.45&מיקרו; mGenClone25-227לחטא את תמיסת הג'לטין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BODIPY Fatty AcidEndothelial CellsFatty Acid Transport96 Well Plate AssayHoechst Nuclear StainingLive Cell ImagingDose Dependent UptakeMetabolic Disease

מאמרים קשורים