ניתוח R ידידותי ועוצמתי של מערכי נתונים בקנה מידה גדול

עם הזמינות המוגברת של מערכי נתונים גדולים בתחום המדעי, חשוב לפתח כלים ידידותיים למשתמש שיאפשרו לחוקרים לנתח במהירות את מערכי הנתונים הגדולים הללו בדיוק ובקלות. סוג אחד של מערך הנתונים הגדול הנפוץ מגיע מהשימוש בגן לוציפראז כמדווח, שאיפשר בדיקה קלה, רציפה ולא פולשנית של ביטוי גנים בתאים ואורגניזמים חיים. אוטומציה ברישום לומינסנציה שינתה את מדידת הזוהר של לוציפראז והובילה להרחבת איסוף הנתונים, בפרט, בשדה השעון הביולוגי ^1,2. באמצעות מיקרו-לוחות של 96 בארות וקורא צלחות אוטומטי עם מערם, ניתן לבחון בנפרד אלפי דגימות המבטאות את הגן לוציפראז בסדרות זמן, לפעמים במרווחים של שעה במשך ימים, בניסוי אחד. ניסויים בעלי תפוקה גבוהה כאלה הביאו לייצור מערכי נתונים גדולים שניסויי ביטוי גנים מסורתיים באמצעות איסוף דגימות ידני, ואחריהם עיבוד RNA, לא יכלו להשיג. ניתוח מערכי נתונים כה גדולים בזמן הוא חשוב אך יכול להיות מאתגר.

למרות שקיים שפע של כלים לניתוח נתונים עבור קצביות, רבים מהכלים מנתחים מבחנים מבוססי התנהגות בעלי חיים ולא ביטוי מדווח זוהר 3,4,5,6,7 (טבלה משלימה S1). כלים מסוימים דורשים מהחוקרים להיות בעלי כישורי תכנות מחשבים קודמים, כגון כישורי Python או גישה ל-MATLAB. כלים אחרים דורשים רכישת תוכנה, שעלולה להיות יקרה. כמה פתרונות מעשיים בחינם זמינים באינטרנט. כלי אחד כזה הוא BioDare2⁸, המציע מגוון שיטות שונות לניתוח נתוני קצב. BioDare2 הוא כלי מקוון ידידותי למשתמש ודורש מומחיות חישובית מינימלית. המשתמשים צריכים להעלות קלט נתונים באופן מקוון ולהוריד פלט נתונים מהממשק המקוון להמשך עיבוד.

כאן, אנו מציגים סקריפטים R ידידותיים למשתמש עם יכולות מרובות לניתוח מערכי נתונים בקנה מידה גדול בקלות. אנו משתמשים בתוכנת הקוד הפתוח החינמית RStudio⁹, ממשק ל-R ו-Python, כדי להריץ את הסקריפטים. ניתן להשתמש ב-RStudio במערכות מחשב שונות, כולל Windows, Mac ו-Linux. בדוח זה, ניתנות הוראות מפורטות בשלבים כדי להדריך את המשתמשים כיצד להשתמש בסקריפטים R, במיוחד בסעיפים 1 ו-2 בפרוטוקול. שיטה זו דורשת קלט מינימלי מהמשתמש. מתחיל שאין לו ידע קודם ב-R ושאין לו ניסיון בתכנות יוכל להשתמש בשיטה כדי לנתח מערכי נתונים גדולים ממבחני לוציפראז או סוגים אחרים של מערכי נתונים עם נתוני סדרות זמן. כל נתוני הקלט והפלט מאוחסנים במחשב מקומי, וכך, ניתן לבצע ניתוח בכל מקום ללא הגבלת הגישה לאינטרנט, לאחר הורדת כל חבילות ה-R הרלוונטיות בפעם הראשונה. נתוני הפלט ממוינים לתיקיות מאורגנות היטב עם תוצאות מוכנות לעיבוד לפרסומים. ניתוחים סטטיסטיים כלולים גם הם כחלק מהפלט כדי לספק הערכה מהירה של ההבדלים בין המדגמים. לפיכך, שיטת R יכולה לספק פתרון קל ורב עוצמה לחוקרים בניתוח מערכי נתונים גדולים.

1. ניתוח שעון ביולוגי מבוסס לוציפראז

1. מערך ניסיוני לבדיקת לוציפראז
   הערה: בדיקת הלוציפראז היא שיטה נפוצה המשמשת למדידת פעילות השעון הביולוגי בזמן אמת. זוהר, הנפלט ממדווח הלוציפראז הנישא על ידי אורגניזמים ו/או תאים טרנסגניים חיים, יכול להיות מתועד באופן אוטומטי, מה שמוביל לייצור מערכי נתונים של סדרות זמן בקנה מידה גדול. המעבדה שלנו משתמשת בעיקר בשתילי Arabidopsis thaliana המבטאים את הגן לוציפראז כמדווח. איור 1 ואיור 2 מציגים תרשים זרימה של מערך הניסוי הטיפוסי לבדיקת לוציפראז עם שתילים בפורמט של 96 בארות במעבדה שלנו, שונה על סמך תיאור קודם².
   1. עקרו זרעים עם אדי אקונומיקה הנוצרים על ידי הוספת 3 מ"ל של 36% HCl (w/w) ל-100 מ"ל אקונומיקה ביתית בכוס למשך 3 שעות. מניחים את הכוס בצנצנת פעמון עם מכסה אטום, מונחת במכסה אדים כימי. לאחר העיקור, צלחו את הזרעים על צלחות 1/2MS המכילות 0.5% סוכרוז ו-0.8% אגר (pH 5.7), באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית סטרילית, בארון זרימה למינרית. אסוף את הפסולת הכימית בצנצנת עם מכסה והשליך אותה על ידי עבודה עם מחלקת שירותי בריאות הסביבה המוסדית.
   2. הכניסו צלחות ל-4 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפני העברתן לתא תרבית רקמות עם מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות אור כהה (LD).
   3. תן לשתילים לגדול במשך 4 ימים ב- LD.
   4. העבירו שתילים לצלחת של 96 בארות; כל באר מכילה 180 מיקרוליטר של חומר בדיקה (1/2MS, 0.5% סוכרוז, 0.4% אגר, 0.25 מ"מ לוציפרין). הנח את הצלחות למשך יום אחד ב-LD ואחריו יום אחד ב-24 שעות של אור קבוע (LL).
   5. הוסף טיפולים או תמיסה מדומה לבארות ורשום זוהר במרווחים של שעה למשך 5-7 ימים ב-LL. הגדר את עדשת מסנן הפליטה ל-3,600 לרווח ואת זמן מרווח המדידה ל-1 שניות.
      הערה: שעת ההתחלה של ההקלטה יכולה להיות בכל עת. עם זאת, מכיוון שסקריפט R לוקח רק מספרים שלמים (מספרים שלמים), מרווחי ההקלטה חייבים להיות מספר שלם. לדוגמה, מרווח של שעה אחת מותר, אך מרווח של 15 דקות אינו מותר עבור קובץ ה- Script R.
   6. בסוף ההקלטה, צלם את הצלחת כדי לתעד את צמיחת השתילים.
   7. שמור נתונים גולמיים כקובץ CSV לניתוח R, באמצעות הפונקציה שמור בשם עם תוכנת ניתוח הנתונים עבור קורא הלוחות.
2. הסבר שלב לניתוח R של נתונים צירקדיים מבוססי לוציפראז
   הערה: ניתוח R זה משתמש בסקריפט Rקובץ משלים 1(LUC_2025.R), שפותח לניתוח נתונים צירקדיים, וקובץ הקלטקובץ משלים 2(NO7.csv). סקריפט R יחד עם קובץ הקלט זמין לציבור דרך פלטפורמת המאגר המקוון Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. הורד את תוכנת RStudio התואמת למערכת המחשב ^9,10.
   2. הורד את החבילות האלגוריתמיות של RStudio הנדרשות על ידי קובץ משלים 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: אלגוריתם ARSER¹² של חבילת MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ ומטאטא²⁰.
      הערה: ראה גם את החלק העליון של קובץ ה- Script R עבור רשימת החבילות.
   3. שנה קלט משתמש I (על פי מערך נתונים ספציפי במחשב מקומי, כולל ספריית העבודה, שם קובץ הקלט, תוויות לטיפולים וזמן ההתחלה היחסי של הבדיקה.
      הערה: יש להשלים את שלבים 1.2.1 ו-1.2.2 פעם אחת בלבד; לאחר מכן קונסולת הממשק RStudio מוכנה לקבל קלט משתמש, עם שינויים עבור כל ניתוח חדש. ישנם שני חלקים בסעיף קלט משתמש (איור משלים S1).
      1. בחר את ספריית העבודה. ציין היכן נמצא קובץ הקלט. אותה תיקיה תהיה המיקום עבור קבצי הפלט.
      2. בחר את קובץ הקלט, קובץ CSV המעוצב כהלכה עבור סקריפט R (איור 2B). באופן ספציפי, בשורה העליונה יש את סדרת הזמן, והעמודה הראשונה מכילה מיקומי מדגם בודדים על צלחת של 96 בארות.
         הערה: דוגמה לקובץ CSV קלט כזה ניתן למצוא בקובץ משלים 2 (NO7.csv).
      3. תן שם לדוגמאות ו/או לטיפולים. מכיוון שניתוח זה משמש לנתונים המתקבלים מהגדרות של 96 בארות עם מהלך זמן, תכנן את הניסויים כ-8 שכפולים לכל טיפול בסך הכל עד 12 טיפולים לצלחת, או כ-12 שכפולים לכל טיפול בסך הכל עד 8 טיפולים לצלחת. הקפד להזין את המספר הנכון של דגימות, 8 או 12, מכיוון שמספר המדגם נחשב; אם ספירת הדגימה אינה 8 או 12, הקוד לא יפעל. עם זאת, אם יש שורות של בארות ריקות, פשוט רשום אותן ככאלה במרחב לשמות הטיפול, למשל, מתן שם כ-1 ריק, ריק 2...
         הערה: עבור שמות לדוגמה, יש להימנע משימוש בלוכסנים הפוכים או בסמלים דומים מכיוון שהם עלולים לגרום לבעיות בשמות הקבצים. בנוסף, יש להימנע גם משימוש ב-"NA" כתווית בעת בחירה להשתמש ב-ANOVA בקלט משתמש II. כל טיפול באותו שם בדיוק ישולב לקבוצת טיפול אחת גדולה.
      4. ציין את זמן ההתחלה היחסי של הבדיקה. עבור יום נתון של 24 שעות, שחר סובייקטיבי הוא כאשר אור החדר נדלק במהלך מחזור אור/חושך רגיל. לדוגמה, אם האור דולק בשעה 7 בבוקר, קחו בחשבון הפעם את הזמן הצירקדי 0. אם בדיקת לוציפראז מתחילה בשעה 9 בבוקר, זמן הבדיקה הוא בזמן הצירקדי 2; הזן 2 כשעת ההתחלה היחסית.
         הערה: שעת ההתחלה היחסית חייבת להיות מספר שלם ואינה יכולה להיות שלילית. זה ישפיע על קריאת הפאזה של הדגימות.
   4. שנה את אפשרויות User Input II בהתאם לצרכים ספציפיים.
      הערה: ההוראות שלהלן מספקות הסבר מפורט יותר על הסעיפים קלט משתמש ומדריך שלב אחר שלב לביצוע השינויים.
      1. כלול גרפים: עקומות זוהר, תרשימים לתקופה, שלב ומשרעת לכל גנוטיפ וטיפול.
      2. השתמש במבחן ANOVA עם Tukey HSD כדי להשוות טיפולים על התקופה, השלב והמשרעת שלהם. בחר פקד עבור פלט הבדיקה של ANOVA; ציין את הפקד לבדיקת ANOVA או השאר את האפשרות ריקה כדי להשתמש בכל טיפול כבקרה בהשוואה הזוגית. לחלופין, בחר אם למספר את קבצי הפלט של ANOVA לעיון וארגון מהירים יותר.
      3. השתמש במבחן t כדי להשוות טיפולים על המחזור, השלב והמשרעת שלהם. בחר אם מבחן ה-t צריך להיות השוואה זוגית; אם נבחר מבחן T זוגי, בחר אם הנתונים מותאמים. בחר פקד עבור מבחן t; ציין את הפקד עבור מבחן t או השאר את האפשרות ריקה כדי להשתמש בכל טיפול כבקרה. בחר אם למספר את קובצי הפלט של t-test לעיון וארגון מהירים יותר.
         הערה: יש להשתמש בזה רק כדי להשוות בין שני טיפולים בו זמנית, כגון שני קווים של אותו גנוטיפ עם תוספת SA או Mock. ערכי ה-p המוצגים אינם מותאמים כדי לקחת בחשבון השוואות מרובות עם אותו קו.
      4. בחר אם לעגל את נקודות הזמן. אם נקודות הזמן רחוקות בדקה או שתיים בלבד, עגל לשעה הקרובה ביותר והשתמש בניתוח זה.
         הערה: קוד זה מחשב את התקופה, הפאזה והמשרעת באמצעות שיטת ARS¹². שיטה זו דורשת סדרת זמנים עקבית בשעות כדי לפעול.
      5. בהתאם לאופן שבו קורא הלוחות מתעד בארות, שנה את אופן קריאת הקלט. בחר את רשימת הנתונים הסטנדרטית של בארות לפי A1, A2, A3... או זה עבור בארות הרשומות על ידי A1, B1, C1...
   5. הפעל את הניתוח פשוט על ידי לחיצה על כפתור המקור בפינה השמאלית העליונה של הקונסולה.
      הערה: השלמת הניתוח נמשכת פחות מדקה אחת. הפלט של ניתוח R יופיע אוטומטית באותה file תיקיית כמו מערך נתוני הקלט.
   6. הצג פלט: בתיקיית הפלט יש מספר מסמכים ותיקיות משנה כדי לספק ניתוח מקיף, כולל מידע סטטיסטי של התקופה, השלב והמשרעת הממוצעים עבור שכפולים של כל גנוטיפ ו/או טיפול.
      הערה: עבור קובץ הקלט Supplemental File 2 (NO7.csv), רשימה של מסמכי הפלט שנוצרו על-ידי קובץ Script משלים 1 (LUC_2025.R) בסעיף פרוטוקול 1 מתוארת בטבלה 1 וניתן להציג אותה בנוחות עם מבנה העץ באיור משלים S2.

2. בדיקת ROS מבוססת לומינול

1. הגדרה ניסיונית לבדיקת ROS
   1. חותכים דיסקי עלים בקוטר 4 מ"מ מהעלים הרביעי עד השביעי של צמחים בני 25 יום בעזרת מנקב ביופסיה.
   2. צף את דיסקיות העלים כשהצד השעיר כלפי מעלה על גבי 100 מיקרוליטר מים סטריליים בצלחת של 96 בארות.
   3. מכסים את הצלחת בנייר כסף נקי ומניחים אותה בתא גידול LD למשך הלילה.
   4. החלף מים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת לומינול (300 מיקרומטר במאגר MOPS של 10 מ"מ עם pH 7.4, ו-1 מיקרומטר flg22 או סם אחר). השתמש בפתרון מדומה במקום flg22 כפקד.
   5. התחל מיד להקליט קריאות זוהר כל דקה למשך 40-60 דקות.
2. הסבר שלב על ניתוח R של נתוני ROS
   הערה: ניתוח R זה משתמש ב-Rstudio, בסקריפט R,  בקובץ משלים 3 (ROS_2025.R) ובקובצי הקלט בקובץ משלים 4 (ROS_flg22.csv) או בקובץ משלים 5 (ROS_elf26.csv). סקריפט R יחד עם קובץ הקלט Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) זמין לציבור דרך פלטפורמת המאגר המקוון Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. הורד חבילות RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ ו-filesstrings¹⁷.
      הערה: יש להשלים את שלבים 2.2.1 פעם אחת בלבד. כדי לסייע למשתמשים להתאים כל ניתוח לקבוצה מסוימת של נתונים במחשב, נוצר קטע שנקרא "קלט משתמש" כדי לאפשר למשתמשים לציין פרמטרים ספציפיים עבור הניסויים שלהם (איור משלים S3).
   2. שנה את קלט המשתמש I בהתאם למערך נתונים ספציפי במחשב מקומי, כולל ספריית העבודה, שם קובץ הקלט, תוויות לטיפולים וזמן ההתחלה היחסי של הבדיקה.
      1. בחר את ספריית העבודה. ציין היכן נמצא קובץ הקלט. אותה תיקיה תהיה המיקום עבור קבצי הפלט.
      2. בחר את קובץ הקלט, קובץ CSV המעוצב כהלכה עבור סקריפט R (איור 2B). באופן ספציפי, בשורה העליונה יש את סדרת הזמן, והעמודה הראשונה מכילה מיקומי מדגם בודדים על צלחת של 96 בארות.
         הערה: דוגמה לקובץ CSV קלט כזה ניתן למצוא בחומר המשלים, קובץ משלים 4 (ROS_flg22.csv) או קובץ משלים 5 (ROS_elf26.csv).
      3. תן שם לדוגמאות ו/או לטיפולים. מכיוון שניתוח זה משמש לנתונים המתקבלים מהגדרות של 96 בארות עם מהלך זמן, תכנן את הניסויים כ-8 שכפולים לכל טיפול בסך הכל עד 12 טיפולים לצלחת, או כ-12 שכפולים לכל טיפול בסך הכל עד 8 טיפולים לצלחת. אם יש שורות של בארות ריקות, פשוט רשום אותן ככאלה במרחב של שמות הטיפול, למשל, מתן שם כ-1 ריק, ריק 2...
         הערה: חשוב להזין את המספר הנכון של דגימות, 8 או 12, מכיוון שמספר הדגימה נחשב. אם ספירת הדגימה אינה 8 או 12, הקוד לא יפעל. עבור שמות לדוגמה, הימנע משימוש בקווים נטויים או בסמלים דומים מכיוון שהם עלולים לגרום לבעיות בשמות הקבצים. הימנע גם משימוש ב-"NA" כתווית בעת בחירה להשתמש ב-ANOVA בקלט משתמש II. בניגוד לסקריפט קובץ משלים 1 (LUC_2025.R), טיפולים בעלי אותו שם אינם משתלבים לקבוצה אחת בסקריפט קובץ משלים 3 (ROS_2025.R) זה.
   3. שנה את אפשרויות User Input II בהתאם לצרכים הספציפיים של המשתמש.
      הערה: דוגמה לקלט משתמש ניתן לראות באיור משלים S3.
      1. השתמש במבחן ANOVA עם Tukey HSD כדי להשוות את סכומי הזוהר של הטיפול.
      2. השתמש במבחן t דו-צדדי כדי להשוות את הנתונים משני טיפולים בלבד בבת אחת.
         הערה: ערכי ה-p המוצגים אינם מותאמים כדי לקחת בחשבון השוואות מרובות עם אותו קו.
      3. גרף את עקומות הקרינה ותרשים עמודות המשווה את הסכום הכולל של הקרינה. הוסף סטיית תקן או שגיאת תקן של ממוצע לגרפים.
      4. בהתאם לאופן שבו קורא הלוחות מתעד בארות, שנה את אופן קריאת הקלט. או להשתמש ברשימת הנתונים הסטנדרטית של בארות לפי A1, A2, A3... או זה עבור בארות הרשומות על ידי A1, B1, C1...
3. הפעל ניתוח פשוט על ידי לחיצה על כפתור המקור בפינה השמאלית העליונה של הקונסולה.
   הערה: השלמת הניתוח נמשכת פחות מדקה אחת. הפלט של ניתוח R יופיע אוטומטית באותה file תיקיית כמו מערך נתוני הקלט.
4. הצג פלט: לתיקיית הפלט יש מספר מסמכים ותיקיות משנה כדי לספק ניתוח מקיף.
   הערה: עבור קובץ הקלט קובץ משלים 4 (ROS_flg22.csv), מבנה עץ של מסמכי הפלט שנוצרו על-ידי קובץ ה- Script המשלים file 3 (ROS_2025.R) המתואר בסעיף פרוטוקול 2 מוצג באיור משלים S4.

מקרה בוחן 1. בדיקת הזוהר לפעילות שעון ביולוגי עם שתילי Arabidopsis

הראינו בעבר כי הגן העשיר בגליצין של חלבון קושר RNA 7 (GRP7) נשלט על ידי חלבון השעון הראשי CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) והביטוי הצירקדי של GRP7 חשוב לתפקידו בהגנת הצמח, תוך שימוש בצמחי Col-0 טרנסגניים המבטאים את מדווח הלוציפראז תחת שליטת מקדם GRP7 מסוג בר (pGRP7wt:LUC)21. ניתחנו את פעילויות השעון הביולוגי של צמחים טרנסגניים אלה יחד עם צמח הבקרה CCA1:LUC/Col-0, באמצעות סקריפט R בשם LUC_2025.R (קובץ משלים 1 בסעיף פרוטוקול 1).

לקובץ הקלט בשם NO7.csv (קובץ משלים 2) יש קריאות זוהר עבור שבעה קווי pGRP7wt:LUC עצמאיים ובקרת CCA1:LUC/Col-0 (קובץ משלים 2 (NO7.csv)). לאחר הפעלת הסקריפט, תיקיית המשנה של הפלט הנקראת פלט NO7 תיווצר תחת אותה תיקיה כמו NO7.csv קובץ הקלט (קובץ משלים 2 (NO7.csv)). הקבצים של תיקיית הפלט NO7 מתוארים בטבלה 1 וניתן לצפות בהם בנוחות עם מבנה העץ באיור משלים S2. הערכים בתיקיית הפלט NO7 עובדו עוד יותר כדי ליצור איור 3 ואיור 4. איור 3 מראה שכתב CCA1:LUC הציג משרעת של 3,000 RLU, תקופה של 23.5 שעות ושלב של 3.5 שעות. פרמטרי שעון אלה תואמים במידה רבה לדיווחים קודמים22,23. דפוס ביטוי שונה נצפה עבור קווי pGRP7wt:Luc. בעוד שכל קווי pGRP7wt:LUC נראו דומים בתקופה ובשלב, היו הבדלים בערכי המשרעת של קווים אלה, ככל הנראה עקב השפעת המיקום של הטרנסגנים בכרומוזומים. תצפיות אלו אושרו עוד יותר כאשר פרמטרי התקופה, המשרעת והפאזה חושבו באמצעות סקריפט R (איור 4). כדי לאמת ניתוח זה, אותו מערך נתונים נותח מחדש באמצעות BioDare2, פלטפורמה מקוונת חינמית לניתוח נתונים צירקדיים8. התוצאות מניתוח R היו דומות לאלו שהתקבלו מאלגוריתם BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8,24 (איור 4).

מקרה בוחן 2. בדיקת הזוהר לפעילות שעון ביולוגי עם תאי יונקים
סקריפט R LUC_2025.R (קובץ משלים 1 שימש עוד לניתוח פעילות השעון הביולוגי המוצגת על ידי תאי יונקים25. קו התאים U2 OS המבטא מדווח שעון ביולוגי הוא קו תאים מודל נפוץ למדידת פעילויות השעון הביולוגי של יונקים26,27. ניתחנו מחדש נתוני סדרות זמן שנוצרו עם תאי U2 OS המבטאים את מדווח Per2d:Luc שתורבת בצלחת של 96 בארות. התאים טופלו במולקולות siRNA המכוונות לגנים ספציפיים. איור 5 מראה שתאי הבקרה השליליים, שלא טופלו ב-siRNA, הראו תקופה של 23.3 שעות, שלב של 2.8 שעות ומשרעת של 184.8 RLU. כצפוי, ה-siRNA המכוון לגן CRY2 הפחית משמעותית את המשרעת והשפיע על התקופה והשלב של המדווח. גנים PSMD4 ו-PSMD7 מקודדים חלבונים המהווים חלק מרכיב מכסה הפרוטאזום 26S לפירוק חלבון. בהתאם לדוח הקודם25, ניתוח R מראה כי הפלת PSMD4 או PSMD7 על ידי ה-siRNA שלהם אינה משפיעה על פרמטרי השעון. לפיכך, סקריפט R זה ישים בקלות למערכות ניסיוניות שונות למחקרי שעון ביולוגי.

מקרה בוחן 3. מבחן ה-ROS לתגובת הגנה
בנוסף למערכי נתונים גדולים ממבחני שעון ביולוגי זוהר, ניתן להתאים את סקריפט R לניתוח סוגי נתונים אחרים. כאן אנו מציגים יישום אחד כזה לכימות מיני חמצן תגובתיים (ROS). ידוע שצמחים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי להילחם בפלישת פתוגנים. אחת האסטרטגיות היא לזהות מולקולות שאינן עצמיות מפתוגן ולאחר מכן להפעיל תגובות חיסוניות מולדות. תגובה חיסונית מוקדמת כזו היא התפרצות ROS, המתרחשת תוך דקות כאשר מארח נתקל במולקולה שאינה עצמית. בדיקת ROS טיפוסית נערכה עם צלחת של 96 בארות, המכילה 12 דיסקיות עלים לכל גנוטיפ לכל טיפול (סעיף פרוטוקול 2). כאן, שתי מולקולות מעוררות נפוצות, flg22, פפטיד של 22 חומצות אמינו שמקורו באזור השמור של חלבוני פלאגלין חיידקים28, ו-elf26, פפטיד של 26 חומצות אמינו מחלבון Tu של גורם ההתארכות29, שימשו כדי לגרום להתפרצות ROS. הסקריפט, קובץ משלים 3 (ROS_2025.R), פותח לניתוח נתוני ROS. ניתן להוריד שני קבצי CVS ממבחני ROS, קובץ משלים 4 (ROS_flg22.csv) וקובץ משלים 5 (ROS_elf26.csv), שהומרו לפורמט של ניתוח R, ממדור חומר משלים. לאחר ניתוח R, תיקיות הפלט ייווצרו באותה תיקיה כמו כל קובץ קלט במחשב שלו, המכילה את עקומות פרץ ה-ROS ואת ערכי ה-ROS הכוללים במהלך זמן הבדיקה, יחד עם ניתוחים סטטיסטיים (איור משלים S4). הנתונים עובדו עוד יותר כדי ליצור איור 6. התוצאות המוצגות כאן דומות לאלה שפורסמו, שעובדו באופן ידני30.

איור 1: תרשים זרימה של בדיקת הלוציפראז עבור ניתוח R. שתילים המבטאים כתב לוציפראז המונע על ידי מקדם שעון עוקרו וגודלו על 1/2 מדיה MS ב-LD למשך 4 ימים. שתילים הועברו לצלחות של 96 בארות המכילות 180 מיקרוליטר של 1/2 מדיום MS המכיל D-לוציפרין. כל באר הכילה שתיל אחד. לאחר יום אחד ב-LD ואחריו יום אחד ב-LL, זוהר נרשם עם קורא צלחות. השתילים בצלחת תועדו בדרך כלל לזוהר ב-LL במרווחים של שעה אחת במשך 5-7 ימים. לאחר ההקלטה, צולמו צלחות כדי להעריך את צמיחת השתילים והנתונים הגולמיים נשמרו כקובץ CSV לניתוח R. קיצורים: LD = 12 שעות בהירות / 12 שעות חושך; LL = אור קבוע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרשים זרימה של קליטת נתוני לומינסנציה וניתוח R. (A) מתואר נוהל בן חמישה שלבים לניתוח שעון ביולוגי באמצעות סקריפט R. שלב 1. הגדר ניסויים כ-8 או 12 שתילים לכל גנוטיפ ו/או לכל טיפול; שלב 2. שיא זוהר ב-LL במרווחים של שעה למשך 5-7 ימים; שלב 3. להשיג ולעצב נתונים בקובץ CSV; שלב 4. לנתח נתונים באמצעות R; ושלב 5. הצג נתוני פלט. שעת ההתחלה של ההקלטה יכולה להיות בכל עת. עם זאת, מכיוון שסקריפט R לוקח רק מספרים שלמים (מספרים שלמים), מרווחי ההקלטה חייבים להיות מספר שלם. (ב) צילום מסך של קובץ CSV קלט המעוצב כהלכה עבור סקריפט R. את קובץ הקלט המקורי, NO7.csv, ניתן למצוא בקובץ משלים 2. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ביטוי צירקדי של pGRP7wt:LUC בצמחים טרנסגניים. עקבות זוהר של pGRP7wt:LUC מוצגים. הפסים מתחת לציר ה-x מציינים יום סובייקטיבי (עמודות פתוחות) ולילה (פסים אפורים). עקבות הזוהר של כל גנוטיפ הם בממוצע 12 שכפולים. פסי שגיאה לא הוצגו בגלל המספר הגדול של עקומות. קיצור: RLU = יחידות זוהר יחסיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה של נתוני פלט מסקריפט R ו- BioDare2. אותה קבוצת נתונים המוצגת באיור 3 נותחה על ידי סקריפט R ועל ידי BioDare2 עבור פרמטרים של שעון ביולוגי, משרעת, תקופה ופאזה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n=12). אותיות שונות מצביעות על הבדל מובהק בין הדגימות (P < 0.05; ANOVA חד כיווני עם מבחן HSD פוסט הוק של Tukey). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח פעילות השעון הביולוגי עם תאי יונקים. נתוני סדרות זמן שנוצרו עם תאי U2 OS המבטאים את מדווח Per2dLuc שתורבת על צלחת של 96 בארות ב-DD תוארו קודם לכן 25. מולקולות siRNA המכוונות ל-CRY2, PSMD4 או PSMD7 שימשו לטיפול בתאים. (A) עקבות זוהר. (ב) משרעת, תקופה ושלב של per2d:Luc. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 3). אותיות שונות בפאנל (B) מצביעות על הבדל משמעותי בין הבקרה השלילית לדגימה שטופלה ב-siRNA (P<0.05; ANOVA חד כיווני עם מבחן HSD פוסט הוק של Tukey). קיצור: RLU = יחידת זוהר יחסית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח פרץ ROS על ידי R. שתילים תועדו ליחידת זוהר יחסית מיד לאחר הטיפול ב-1 מיקרומטר flg22 (משמאל) או 1 מיקרומטר elf26 (מימין). (A) עקבות זוהר בממוצע מ-12 שתילים לכל גנוטיפ (n = 12) במהלך זמן לאחר הוצאה. הערכים הממוצעים לגנוטיפ לטיפול הם חלק מתפוקת ה-R. (B) ספירת זוהר כוללת ממוצעת עבור כל גנוטיפ עם טיפול flg22 או elf26. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 12). אותיות שונות מצביעות על הבדל מובהק בין הדגימות (P < 0.05; ANOVA חד כיווני עם מבחן HSD פוסט הוק של Tukey). קיצור: RLU = יחידת זוהר יחסית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימה של מסמכי הפלט מניתוח R. זוהי רשימה של מסמכי הפלט שנוצרו על ידי סקריפט LUC_2025.R (קובץ משלים 1) וקובץ הקלט NO7.csv (קובץ משלים 2).

איור משלים S1: צילומי מסך עבור קלט I וקלט II בסעיף פרוטוקול 1. יש לשנות את קלט המשתמש I כדי להתאים את הניתוח למערך נתונים ספציפי במחשב מקומי. שינויים בקלט משתמש II הם אופציונליים, בהתאם להגדרת הניסוי. חשוב לציין כי סקריפט הקובץ המשלים 1 (LUC_2025.R) מצפה שכל הבארות יהיו נוכחות בקובץ ולא רק בארות נבחרות או משומשות. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים S2: מבנה עץ עבור מסמכי הפלט. פלט זה נוצר באמצעות קובץ ה- Script LUC_2025.R (קובץ משלים 1) וקובץ הקלט NO7.csv (קובץ משלים 2). קובץ ה- Script LUC_2025.R יוצר תיקיית פלט המבוססת על שם קובץ הקלט. לפרטים נוספים על קבצי הפלט, ראה טבלה 1. תיבות מייצגות תיקיות קבצים. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים S3: צילומי מסך עבור קלט משתמש I וקלט משתמש II בסעיף פרוטוקול 2. קובץ ה- Script המשלים של קובץ 3 (ROS_2025.R) משתמש באותה תבנית קלט כללית כמו קובץ ה- Script של קובץ ה- Script המשלים של קובץ 1 (LUC_2025.R). יש לשנות את קלט המשתמש I כדי להתאים את הניתוח למערך נתונים ספציפי במחשב מקומי. שינויים בקלט משתמש II הם אופציונליים, בהתאם להגדרת הניסוי. חשוב לציין כי סקריפט קובץ משלים 3 (ROS_2025.R) מצפה שכל הבארות יהיו נוכחות בקובץ ולא רק בארות נבחרות או משומשות. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים S4: מבנה עץ עבור מסמכי הפלט. פלט זה נוצר באמצעות סקריפט ROS_2025.R (קובץ משלים 3) וקובץ הקלט ROS_flg22.csv (קובץ משלים 4). קובץ ה- Script ROS_2025.R יוצר תיקיית פלט המבוססת על שם קובץ הקלט. בתוך התיקיה הזו יש קובץ עבור ספירת ROS כוללת וקובץ עבור גרפים. ישנן גם תיקיות משנה לנתוני PRISM וגרפים, מבחן ANOVA ומבחני t. תיבות מייצגות תיקיות קבצים. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

טבלה משלימה S1: רשימה של כלים ביואינפורמטיים זמינים לניתוח נתונים צירקדיים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: LUC_2025.R. זהו סקריפט R המשמש לניתוח נתוני שעון ביולוגי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 2: NO7.csv. זהו קובץ הקלט המכיל דוגמה לנתוני שעון ביולוגי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 3: ROS_2025.R. זהו סקריפט R המשמש לניתוח נתוני ROS. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 4: ROS_fig22.csv. זהו קובץ הקלט המכיל דוגמה לנתוני ROS. ROS הושרה על ידי טיפול של 1 מיקרומטר flg22. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 5: ROS_elf26.csv. זהו קובץ הקלט המכיל דוגמה לנתוני ROS. ROS הושרה על ידי טיפול של 1 מיקרומטר elf26. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.