הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור ושימוש בתבניות אגרוז הניתנות להתאמה אישית לתרבית זקיקי שחלות עכבר ללא פיגומים

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטות לתרבית זקיקי שחלות בתבנית אגרוז חדשה ללא פיגומים המשלימים את הגמטוגנזה במבחנה .

תקציר

זקיק השחלה הוא היחידה התפקודית של השחלה המייצרת הורמונים וגמטות הדרושים לשמירה על תפקוד הרבייה הנשי ובריאותו. ליכולת לסכם זקיקים, ביוץ ולוטאיניזציה במבחנה יש תועלת בסיסית, תרגומית וקלינית רחבה. מערכות גידול הזקיקים המתקדמות ביותר במבחנה שומרות על הארכיטקטורה התלת מימדית (תלת מימדית) של הזקיק, שהיא חיונית להתפתחות ביציות מטאפאזה II מוכשרות מיוטית בבני אדם. לאחרונה פותחה ותוקף שיטה נטולת פיגומים לגידול זקיקים במבחנה של זקיקים משניים רב-שכבתיים של עכבר. לשם כך, נעשה שימוש בתבניות מודפסות בתלת מימד מותאמות אישית למיקרו-דפוס אגרוז עם מיקרו-בארות המתאימות להתרחבות נפחית של זקיקים. זקיקים שגדלו בסביבה נטולת פיגומים זו הראו ייצור הורמונים וכדאיות דומים ביחס למערכות מבוססות אלגינט מבוססות היטב עטופות בגידול זקיקים במבחנה (eIVFG). חשוב לציין, מיקרו-בארות אגרוז הן שיטה ניתנת להרחבה, פחות תובענית מבחינה טכנית, ומציגות שיפור בצמיחת הזקיקים ושיעורי הביוץ ביחס ל-eIVFG. מתודולוגיה זו מייצרת תבניות הניתנות להתאמה אישית התואמות ביולוגית לביצית, תא רגיש מאוד לתשטיפים ספציפיים לחומר ולמזהמים סביבתיים אחרים. יתר על כן, זקיקים במערכת זו מתורבתים באותו מישור מוקד, מה שמאפשר הדמיה וניתוח בזמן אמת. כדי להגביר את הנגישות של גישה חדשה זו, מאמר זה מפרט את השיטות הדרושות לעיצוב והדפסת תבניות מאסטר בתלת מימד, יצירת תבניות סיליקון לצלחות של 24 או 96 בארות, ותרבית זקיקי שחלות משניים רב-שכבתיים מבודדים בתבניות האגרוז. ניתן לשלב הגדרה זו גם עם מערכת הדמיה חסכונית בזמן-lapse, המאפשרת ניתוח מורפוקינטי. בנוסף, ניתן להטמיע תבניות בפרפין לניתוחים היסטולוגיים במורד הזרם. בסך הכל, שיטה ידידותית למשתמש זו היא כלי רב-תכליתי לתרבית זקיקים וניתן להתאים אותה עוד יותר כדי לקדם את ההתמיינות וההתבגרות של תאי נבט בהקשר של הזקיק כדי לקיים גמטוגנזה מלאה במבחנה .

מבוא

הביצית, או הגמט הנקבי, תורמת את עיקר הציטופלזמה ומחצית מהחומר הגנטי לעובר בעת ההפריה, החיונית להתפתחות הדור הבא. אוגנזה מתחילה במהלך ההתפתחות העוברית כאשר תאי נבט קדמוניים נכנסים למיוזה ונעצרים בפרופאזה I. ביציות אלו שוכנות בתוך זקיקים קדמוניים ומהוות את הרזרבה השחלתית, מאגר סופי ובלתי מתחדש ממנו הן מגויסות בהדרגה. זקיקים מתפתחים בתהליך המכונה זקיקים, במטרה לייצר בסופו של דבר גמט בוגר המסוגל להפרות 1,2,3,4,5. התפתחות הזקיק מתחילה בשלב מוקדם, שאינו תלוי בגונדוטרופין, שבו איתות פרקריני חיוני להישרדות ולצמיחה של הזקיק. כאשר הזקיקים מבשילים לשלב המשני, הם מסתמכים על גונדוטרופינים ומסמנים מעבר לאיתות אנדוקריני. מאפיין מרכזי של זקיקים משניים הוא ביצית המוקפת במינימום של שתי שכבות שלמות של תאי גרנולוזה קובואידיים, יחד עם שכבת ה-theca שפותחה לאחרונה. תאי Theca יוצרים את השכבה החיצונית ביותר של הזקיק, ומספקים אנדרוגנים ותמיכה מבנית 6,7. לבסוף, חלל אנטרלי מלא בנוזל נוצר ונקרע בתגובה לנחשול הורמון לוטניזציה (LH) במהלך הביוץ, ומשחרר גמט בעל יכולת הפריה שנעצר במיוזה II 2,8,9.

הביצית משיגה יכולת התפתחותית להפריה ויכולת לתמוך בהתפתחות מוקדמת של עובר טרום השרשה, המכונה התבגרות גרעינית וציטופלזמית, במהלך אוגנזה וזקיקים 10,11,12. התבגרות ציטופלזמית ניכרת מבחינה מורפולוגית, כאשר הביציות מתרחבות לאורך הזקיקים. כתוצאה מהתפשטות תאים סומטיים, כולל תאי תקה, גרנולוזה וקומולוס, הזקיקים עצמם חווים התרחבות נפחית משמעותית. בעכברים, קוטר הזקיק גדל פי חמישה מזקיקים משניים מוקדמים לזקיקים טרום ביוץ. תקשורת דו-כיוונית בין הביצית לתאים הסומטיים שמסביב חיונית לביציות. בזקיקים ראשוניים, ה-zona pellucida נוצר מחלבונים המופרשים על ידי הביצית, והתקשורת בין תאי הזקיקים הללו מתווכת בחלקה על ידי הקרנות טרנס-אזוריות, המספקות מגע פיזי בין שני תאי הזקיקים הללו13,14. לפיכך, המיקרו-סביבה הזקיקית חיונית לתזמור נכון של הצמיחה כמו גם ההתבגרות הגרעינית והציטופלזמית של הביצית 2,5. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הבדידים התומכים בתהליכים אלה, יש צורך בטכניקות מתקדמות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית בתרבית חוץ גופית. ליכולת לתרבת זקיקים במבחנה יש יישומים רחבים, כולל טכנולוגיות רבייה מסייעות ושימור פוריות 15,16,17,18, שימור מינים19,20, פיתוח תרופות21 ובדיקת טוקסיקולוגיה22,23.

מערכות תרבית זקיקים במבחנה הן גם שלב ביניים חיוני ליכולת לייצר גמטות מתאי גזע פלוריפוטנטיים, הידועים גם בשם גמטוגנזה במבחנה (IVG)24. חוקרים השתמשו בתאי גזע עובריים, תאי גזע מזנכימליים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי לפתח גמטות במגוון מינים, ולעתים קרובות הסתמכו על תאים סומטיים כדי ליצור מחדש את המיקרו-סביבה המקומית של הזקיקים 25,26,27,28,29,30 . בעוד שאבני דרך עיקריות של הוכחת היתכנות הושגו באמצעות שיטות אלה, עדיין קיים אתגר של ביציות באיכות נמוכה, המתבטא בהתפתחות נמוכה של עוברים ושיעורי צאצאים חיים לאחר הפריה חוץ גופית בעכברים 31,32. עדיין לא הושגו לידות חי במינים אחרים, מה שמדגיש את הצורך בחידוד מתמשך של פרוטוקולים לתמיכה מלאה בביציות וזקיקים.

נכון לעכשיו, נעשה שימוש במספר אסטרטגיות לתרבית זקיקים. הגישות הפחות תובעניות מבחינה טכנית והתפוקה הגבוהה ביותר הן שיטות ללא פיגומים, שבהן זקיקים מונחים בצלחת פלסטיק או בתוספת ממברנה33,34. כאן, תאי גרנולוזה נצמדים למשטח התרבית, ומאבדים מגע עם הביצית33,34. התמוטטות ארכיטקטורת הזקיקים מגבילה את השימושיות והרלוונטיות הביולוגית של טכניקות אלה. עם זאת, תרבית ללא פיגומים בלוחות הצמדה נמוכים או טיפות הפוכות מאפשרת לזקיק לשמור על שלמות מבנית במספר מיני יונקים 35,36,37. למרבה הצער, בטכניקות אלה, קשה לשלוט באינטראקציה בין הזקיקים ובכמות התמיכה המכנית שהם מקבלים. לפיכך, כדי לסכם טוב יותר את הפיזיולוגיה in vivo, פותחו שיטות תרבית שבהן זקיקים עטופים בהידרוג'לים עם הרכבים כימיים מוגדרים וניתנים לכוונון ו/או תכונות מכניות 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. לדוגמה, מערכת גידול הזקיקים במבחנה העטופה באלגינט יכולה לסכם חתימות טרנסקריפטומיות מרכזיות שנצפו in vivo21.

למרות ההצלחה והערך של פרוטוקולי תרבית מכוסים, ישנם מספר חסרונות. הם יכולים להיות מאתגרים מבחינה טכנית, מייגעים, בעלי תפוקה נמוכה ואינם תואמים לשיטות הדמיה אוטומטיות. יתר על כן, שיטות תרבית עטופות זקוקות לגישות רב-שלביות עבור מיני יונקים גדולים יותר בשל ההתרחבות הנפחית הגבוהה יותר של זקיק37. יתר על כן, טכניקות עטופות מפעילות תמיכה אחידה לכל הכיוונים, ויש לשחרר זקיקים מההידרוג'ל לפני הביוץ. זה לא קורה in vivo, כאשר הזקיק מקיים אינטראקציה עם המיקרו-סביבה השחלתית שמסביב, המספקת תמיכה ביומכנית דינמית54. לדוגמה, קליפת השחלה הנוקשה שומרת על שקט של זקיקים קדמוניים, בעוד שזקיקים גדלים גדולים נמצאים בדרך כלל בתא המדולרי הרך יותר55,56. ברגע שזקיק עם ביצית מוכשרת הגיע לגודלו הסופי, שינויים בדופן הזקיק ובאפיתל פני השחלה מאפשרים ביוץ. לכן, טכניקות תרבית שבהן מותר לזקיקים לצמוח בכיוון אחד עם התנגדות מועטה יכולות לחקות טוב יותר את הפיזיולוגיה in vivo.

בגישה חדשנית, פותחה שיטת תרבית ניתנת לשחזור, ניתנת להרחבה, פחות תובענית מבחינה טכנית וחסכונית עבור זקיקים משניים רב-שכבתיים של עכברים57. כאן, מיקרו-בארות אגרוז עם הידבקות נמוכה במיוחד עם גיאומטריה הניתנת לשליטה מדויקת (צורה, מידות) וסידור מרחבי (מספר, קרבה) מיוצרות בשיטות משתלמות. זקיקי תבניות האגרוז חווים תמיכה מכנית בכל הכיוונים מלבד כיוון אחד ומתורבתים באותו מישור מוקד, מה שמאפשר הדמיית זמן-lapse לניתוח מורפוקנטי מתקדם. הדפסת תלת מימד סטריאוליתוגרפיה (SLA) שימשה כשיטה נגישה לייצור תבנית מאסטר, ואחריה שלבי יציקה היוצרים תבניות סיליקון נטולות תשטיפים ליציקת האגרוז. שיפור בצמיחת הזקיקים ותוצאות הביוץ הושגו באמצעות המערכת החדשה בהשוואה ל-eIVFG מסורתי, מבלי לפגוע בהישרדות הכוללת של הזקיקים, התבגרות או לוטניזציה57. נייר פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להתאמה אישית וייצור של תבניות אגרוז, כיצד לזרוע ולתרבית זקיקים משניים רב-שכבתיים, לעבד ולבסוף לבצע ניתוח זמן-lapse (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים הקשורים לפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. התאם עיצוב תבנית מאסטר

סעיף זה מתאר את השלבים הראשונים שבוצעו במהלך שלב התכנון (איור 1), שבו מיקרו-בארות מותאמות אישית מוצגות בתכן בעזרת מחשב (CAD) של תבנית אב עבור לוחות תרבית של 24 בארות, הנקראת תכן בסיס תבנית מאסטר של 24 בארות (קובץ משלים 1). מידות המיקרו-בארות מכתיבות את כמות התמיכה וגודל הגידול המרבי של הזקיקים, בעוד שמספר הבארות קובע את המספר המרבי של זקיקים לכל תבנית אגרוז. לאחר מכן ישמש עיצוב תבנית המאסטר המותאם בסעיף הבא ליצירת תבניות סיליקון תואמות ביולוגית ליציקת אגרוז.

  1. פתח את קובץ ה-.step של עיצוב בסיס תבנית מאסטר עם 24 בארות באמצעות תוכנת CAD (איור 2A).
  2. בחר את שטח הפנים הפנימי של האובייקט, ולאחר מכן נווט אל הכרטיסייה Solid בסביבת העבודה Design, ובחר Create Sketch כדי להוסיף את עיצוב המיקרו-תבנית הרצוי (איור 2Bi).
  3. הציגו את מידות ה-xy הרצויות ואת מספר המיקרו-בארות ובחרו סקיצה סופית בסרגל הכלים (איור 2Bii).
    הערה: עבור זקיקים משניים רב שכבתיים, נעשה שימוש בעבר בצורה גיאומטרית של אצטדיון בגודל 500 x 700 מיקרומטר57. רזולוציית ההדפסה יכולה להשתנות בהתאם לשרפים ולמדפסות SLA המשמשות; מאפשרים מרווח מינימלי של 400 מיקרומטר בין מיקרו-בארות.
  4. צור את המיקרו-בארות בעומק 800 מיקרומטר באמצעות פונקציית האקסטרודה (לחץ על מוצק | יצירה | Extrude). הקפד לבחור את פעולת החיתוך , ליצור את חלל המיקרווול (איור 2Biii).
  5. בחר פילה ברדיוס 0.100 מ"מ (לחץ על עיצוב | מוצק | שינוי | פילה) לחלק העליון של המיקרו-בארות
    הערה: כדי ליצור מיקרובאר תחתונה עגולה, השתמש שוב בפעולת הפילה לתחתית באר התרבות וערך הרדיוס שווה לרדיוס של עיצוב המיקרווול. לדוגמה, בעת תכנון בארות של 500 μm x 700 μm, בחר ערך רדיוס של 0.250 מ"מ (איור 2Biv).
  6. ייצא עותק של עיצוב תבנית המאסטר החדש בפורמט .step (לחץ על קובץ | ייצוא).

2. יצירת מיכלי תבנית סיליקון

הערה: כדי למנוע שטיפת תרכובות ציטוטוקסיות מהחלקים המודפסים בתלת מימד, ייוצרו שתי תבניות סיליקון תואמות ביולוגית. סעיף זה מתאר את השלבים האחרונים בשלב התכנון (איור 1) ויביא לשני המיכלים המשמשים ליציקת סיליקון. כאן ישמשו שלושה קבצי CAD שונים, כלומר עיצוב תבנית המאסטר החדש שנוצר מסעיף 1, ומיכלי יציקת סיליקון 24 בארות 1 ו-2 (איור 2Ci-ii וקובץ משלים 2, קובץ משלים 3, בהתאמה).

  1. פתח את מיכל יציקת הסיליקון בן 24 הבארות קובץ 1.step והכנס את עיצוב תבנית המאסטר החדש כרכיב חיצוני (נווט אל מוצק | הוספה | הכנס קומפוננטה).
    1. לחץ לחיצה ימנית על הרכיב ובחר Break Link כדי להסיר את ההפניה המקושרת לעיצוב תבנית המאסטר החדשה.
  2. מרכז את עיצוב תבנית המאסטר החדש עם משטח 1 מיכל יצוק סיליקון 24 בארות , וודא שהוא פונה פנימה.
    1. לחץ לחיצה ימנית על אובייקט עיצוב תבנית המאסטר החדש בדפדפן ובחר באפשרות העבר/העתק .
    2. בחר את הפעולה Free Move באזור Move Type וסובב את האובייקט ב- 180° על ציר ה- x במידת הצורך.
    3. בחר את פעולת Point to Point בקטע Move Type עם אמצע אובייקט עיצוב תבנית המאסטר החדש כנקודת המקור ומרכז משטח יציקת הסיליקון 24 בארות 1 כנקודת היעד.
    4. בחר אישור כדי ליישר את האובייקטים.
  3. בחר את פעולת החיתוך עם המיכל כגוף היעד ואת תבנית המאסטר כעיצוב גוף הכלי (איור 2Ciii). זה יוצר את המיכל עבור השלב הראשון של יציקת סיליקון (איור 2Civ).
    הערה: המיקרו-בארות שתוכננו בסעיף הראשון הן כעת מיקרו-עמודים שיודפסו בתלת מימד כמתואר בסעיף 3. הדפסת SLA היא שיטת ייצור תוספת; לפיכך, הדפסת מיקרו-עמודים משפרת את רזולוציית ההדפסה בהשוואה להדפסת מיקרו-בארות.
  4. שמור וייצא את תבנית הסיליקון החדשה עם 24 בארות 1 שהתקבלה כקובץ .stl ו- .step.

3. 3D הדפסת מיכלי סיליקון

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים הראשונים שבוצעו בשלב הייצור (איור 1) שבו עיצובי ה-CAD החדשים עם תכונות העיצוב הרצויות של מיקרובאר מודפסים בתלת מימד.

  1. פתח את קבצי ה- .stl של תבנית סיליקון חדשה עם 24 בארות 1 ומיכל יצוק סיליקון 24 באר 2 עם תוכנת הכנת הדפסת תלת מימד.
  2. כוון את ההדפסה כשהמיקרו-עמודים פונים כלפי מעלה והשתמש בפונקציית חור הקידוח כדי ליצור פתח ברוחב 1 מ"מ (איור 2D). ודא שערוץ זה פתוח לצד ההדפסה.
    הערה: חור הקידוח המונע אפקטים של כוסות רוח במהלך ההדפסה וניתן למלא אותו לאחר ההדפסה, או שניתן להסיר את חומר הסיליקון העודף לאחר יציקת הסיליקון הראשונה.
  3. הדפיסו את שני תכני המיכלים בעובי שכבה של 25 מיקרומטר (איור 3A).
    הערה: הדפס כל דגם בשלוש עותקים כדי להתחשב בפגמים בהדפסה או נזק במהלך העיבוד.
  4. מוציאים את התבניות ממשטח ההדפסה ושוטפים באיזופרופנול 95% לפי הוראות היצרן. רססו את קטע המיקרו-עמוד בהרחבה עם 95% איזופרופנול (איור 3B). הסר את כל האתנול שנותר עם אוויר דחוס.
  5. תן לאתנול הנותר להתאדות לפחות 30 דקות.
    הערה: בשלב זה ניתן לאטום את תעלת המקדחה ברוחב 1 מ"מ. ניתן לעשות זאת על ידי מריחת טיפה קטנה של שרף לא פולימרי עם קצה פיפטה p200 בחלק החיצוני של ההדפס. כוחות נימיים ימלאו את התעלה.
  6. רפאו את הדפסות התלת מימד ב-60 מעלות צלזיוס עם אור אולטרה סגול למשך 15 דקות.
  7. בדקו כל הדפסה באמצעות סטריאומיקרוסקופ והשליכו כל הדפס תלת-ממדי עם פגמים (איור 3C-F). בדוק ביסודיות כל הדפס מבחינה ויזואלית, וודא שכל המיקרו-עמודים מופרדים ואחידים בגודל ובמראה (איור 3D). השליכו תבניות ראשיות פגומות עם מיקרו-עמודים ממוזגים (איור 3E).
    הערה: בעיות נפוצות הן מיקרו-עמודים או גשרים פגומים משרף לא שטוף שנותר (איור 3Fi,ii).
  8. מכסים את החלק החיצוני של ההדפס בפרפילם אם תעלת המקדחה לא מלאה ושומרים עד לשימוש נוסף.

4. ייצור תבניות סיליקון

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים האחרונים של שלב הייצור (איור 1), שבו יתרחשו שני שלבי יציקת סיליקון. זה הכרחי כדי למנוע שחרור של תשטיפים רעילים על ידי חלקים מודפסים בתלת מימד.

  1. מכינים את הסיליקון לפי הוראות היצרן, לסיכום:
    1. מערבבים היטב את תכולת מיכלי Part A ו-B, מניחים על משקל ויוצקים למיכל ביחס של 1A:1B לפי משקל. הקפידו על עודפי חומר.
    2. מערבבים היטב במשך 3 דקות, מקפידים לגרד את הדפנות והתחתית.
    3. מניחים את החומר במייבש ואקום ומשאירים למשך 5 דקות כדי לחסל בועות אוויר כלואות. חזור על הסרת הגז עד פי 2 אם נותרו בועות אוויר.
  2. יוצקים את התערובת בזרימה אחידה למיכל תבנית סיליקון 1. ודא שרמת התערובת תהיה באותה רמה כמו הדפסת התלת מימד או מעט מתחתיה כדי להבטיח שטוחות של תבנית הסיליקון (איור 4Ai,ii).
    1. הסר את כל האוויר הכלוא באמצעות קצה פיפטה p200 והשתמש בהסרת גז בוואקום במידת הצורך.
  3. מרפאים את הסיליקון בטמפרטורת החדר למשך 5 שעות לפחות ורצוי למשך הלילה לפני הפירוק.
  4. הסר את הסיליקון מהתבנית המודפסת בתלת מימד ואשר חזותית את תקינות המיקרו-תבניות באמצעות סטריאומיקרוסקופ (איור 4Aiii,B). הסר עודפי חומר מתעלת הקידוח במידת הצורך (איור 4Aiv). השלך תבניות עם מיקרו-בארות גישור או פגיעה (איור 4C).
  5. הנח את תבנית הסיליקון במיכל תבנית סיליקון 2 לשלב יציקת הסיליקון השני (איור 4Av). למיכל סיליקון 2 יש פתח של 1 מ"מ בדופן הצדדית שיכוסה לאחר הנחת תבנית הסיליקון.
  6. רססו קלות את תבנית הסיליקון בשמן מינרלי בטוח לעוברים והוציאו עודפי שמן מהמיקרו-בארות. זה ישמש כחומר שחרור להפרדת שני חלקי הסיליקון לאחר הריפוי.
  7. חזור על שלבי הערבוב המתוארים בשלב 4.1 ושפך את התערובת למיכל תבנית סיליקון 2. ודא שרמת התערובת נמוכה או בגובה זהה להדפסת התלת מימד כדי להבטיח שטוחות של תבנית הסיליקון (איור 4Avi).
  8. הניחו לסיליקון להתרפא בטמפרטורת החדר למשך 5 שעות לפחות, רצוי למשך הלילה, לפני הפירוק.
  9. הסירו את הסיליקון מהתבנית המודפסת בתלת-ממד והפרידו את תבניות הסיליקון 1 ו-2 זו מזו (איור 4Avii). אשרו חזותית את שלמות המיקרו-עמודים באמצעות סטריאומיקרוסקופ (איור 4D). השליכו את התבנית אם היו בועות או עודפי שמן במיקרו-בארות (איור 4E).
  10. שטפו את תבנית הסיליקון עם 70% אתנול ותנו לאוויר להתייבש במשך 30 דקות בקולט אדים למינארי.
  11. מניחים בשקית עיקור ובחיטוי באמצעות מחזור יבש לעיקור (לחץ מעיל: 20 psi, טמפרטורת החדר: 250 מעלות צלזיוס, זמן עיקור: 15 דקות).

5. הכנת מדיה תרבותית

הערה: עיכול רקמת השחלה לבידוד ותרבית של זקיקים, הבשלת ביציות במבחנה ולוטאיניזציה דורש שישה סוגים של מדיה: אמצעי דיסקציה (DM), מדיה אנזימטית (EM), אמצעי תחזוקה (MM), מצע גדילה (GM), אמצעי התבגרות (IVM) ואמצעי לוטיניזציה (LM). ניתן למצוא הכנה של מדיה זו כפי שתוארה קודם לכן על ידי Converse et al.38 עם הסבר על חשיבותם של רכיבי מדיה שונים שנותחו על ידי Simon et al.33, ומטרתם מוזכרת בקצרה בטבלה 1.

  1. מכינים את המדיה עד שבוע מראש ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

6. יציקה ואחסון של עובש אגרוז מותאם אישית ותרבות זקיקים

הערה: סעיף זה מתאר כיצד ליצוק תבניות אגרוז מותאמות אישית לתרבית זקיקים מתבניות הסיליקון שנוצרו בסעיף 4. ניתן להכין ולאחסן תבניות אגרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים לפני תרבית הזקיקים.

  1. מניחים תבניות לתוך שקית עיקור וחיטוי באמצעות מחזור יבש כמתואר בסעיף 4.11. הניחו לתבניות להתקרר לפני השימוש.
  2. הכינו תמיסת אגרוז על ידי המסת תמיסת אגרוז סטרילית של 1.5% (w/v) בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) במיקרוגל או בפלטה חמה. השתמש בצינור חרוטי סטרילי המונח בכוס עם מים כדי לאפשר חימום אחיד יותר של האגרוז ולהאט את ההתמצקות של תמיסת אגרוז נוזלית.
  3. פיפטה את תמיסת האגרוז הסטרילית לתוך סיליקון יוצקת בקולט אדים למינארי. פיפטה לאט וחלק כדי למזער את היווצרות הבועות ולהבטיח שהחלק העליון של התבנית שטוח ולא קמור או קעור. החלק העליון בעת היציקה יהיה החלק התחתון של התבנית בעת התרבות וצריך לשכב שטוח. השתמש בכ-600 מיקרוליטר אגרוז עבור מיקרו-תבנית צלחת של 24 בארות ו-85 מיקרוליטר עבור מיקרו-תבנית שמתאימה לצלחת של 96 בארות.
  4. הניחו למיקרו-תבניות להתקרר ~ 3 דקות עד להתמצקות. הפוך יציקת סיליקון כדי להוציא מיקרו-תבניות על צלחת פטרי 100 מ"מ.
  5. העריכו את המיקרו-תבניות במיקרוסקופ לאיתור עיוותים, כולל סדקים, מיזוג של מיקרו-בארות או גבולות לא שלמים. מניחים את המיקרו-תבניות ב-PBS סטרילי + 1% פניצילין-סטרפטומיצין ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים לפני השימוש.
    הערה: הכינו יותר תבניות מהנדרש כדי להסביר השפלה לאורך זמן או נזק למיקרו-תבניות בעת העברה בין צלחות.
  6. אזנו מיקרו-תבניות ב-750 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה פעמיים למשך שעה אחת לפחות (סה"כ שתי דגירות) ביום בידוד הזקיקים.
  7. הסר את כל אמצעי התחזוקה, הוסף 750 מיקרוליטר של אמצעי גידול והנח בחממה למשך שעה.
  8. החלף במצעי גידול טריים ומאוזנים לפני הזריעה.

7. בידוד ותרבית של זקיקים משניים מאוחרים

הערה: סעיף זה מסביר כיצד לבודד ולזרוע זקיקים במיקרו-תבניות אגרוז לתרבית זקיקים. משניים רב-שכבתיים מתורבתים במשך 8 ימים, חייבים להיות בעלי חיוניות של מעל 80% ומייצרים ביציות בוגרות. בידוד ותרבית של זקיקים משניים תוארו בפירוט משמעותי במקום אחר38. בידוד ובחירת זקיקים לאנקפסולציה מבוססת של אלגינט ולזריעה בתבניות אגרוז הם עקביים.

  1. לנתח שחלות מעכברים ולהוציא מרקמת השומן הפרי-שחלות והבורסה. מניחים את השחלות ב-2.5 מ"ל של מדיה אנזימטית ודוגרים בשייקר אורביטלי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כפי שתואר קודם לכן57.
  2. פיפטה 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה בצלחת IVF ומניחים באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לפני בידוד הזקיקים.
  3. להרוות את התגובה עם 250 מיקרוליטר של FBS. בחר זקיקים משניים מאוחרים לאחר בידוד אנזימטי והעבר אותם למנת הפריה חוץ גופית עם DM.
  4. העבירו את הזקיקים לצלחת הפריה חוץ גופית עם אמצעי תחזוקה מאוזנים מראש והניחו באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך שעה.
    הערה: הגודל ההתחלתי של זקיקים משניים מאוחרים הוא 150-180 מיקרומטר עם יותר משתי שכבות של תאי גרנולוזה.
  5. הוסף 750 מיקרוליטר של GM טרי למיקרו-תבניות אגרוז ואחסן בחממה כדי להתכונן לזריעה. הוסף PBS סטרילי לבארות סמוכות המקיפות מיקרו-תבניות אגרוז כדי לשמור על לחות ולמזער את אידוי המדיה לאורך כל תקופת התרבית.
  6. זקיקי זרעים לתבניות אגרוז שעברו שיווי משקל מראש ושקועים ב-GM. העבירו זקיקים משניים רב-שכבתיים איכותיים למיקרו-תבניות אגרוז תחת מיקרוסקופ באמצעות קצה חשפנית של 200 מיקרומטר. ודא ש-10 זקיקים מועברים לכל מיקרו-תבנית בצלחת של 24 בארות ושכל זקיק נמצא במיקרו-באר נפרדת אך סמוכה.
    1. כופפו את קצה החשפנית כדי לאפשר מניפולציה מדויקת יותר והעברה של הזקיקים למיקרו-בארות.
    2. העבירו זקיקים במהירות כדי למזער את שינויי הטמפרטורה וה-pH מכיוון ש-MM ו-GM חוצצים CO2 .
    3. ודא שהזקיקים בתוך מיקרו-תבנית הם בגודל התחלתי דומה לאחר העברת כל 10 הזקיקים.
  7. הנח את המיקרו-תבניות המוזרעות בחזרה לתוך החממה למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לזקיקים להתאושש לפני ההדמיה.
  8. דמיין זקיקים בהגדלה של פי 4 ו-10x כל יומיים כדי לכמת את הישרדות הזקיקים ותוצאות הצמיחה.
    הערה: ניתן להגדיר הדמיית Timelapse גם לביצוע מדידות מורפוקינטיות ומתוארות ביתר פירוט בסעיף 9.
  9. לשנות 50% מאמצעי התרבות כל יומיים.
  10. יש להקפיא את המדיה המושקעת עם קרח יבש ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. השתמש במדיה מותנית זו כדי להעריך את ייצור ההורמונים באמצעות אסטרדיול ELISA.
    הערה: אם GM מיוצר ביום הזריעה (תחילת תקופת התרבית), ניתן לאחסן את המדיה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לכל תקופת התרבות.
  11. הסר והקפיא בהצמדה את כל אמצעי הגידול (750 מיקרוליטר) ביום השמיני של התרבית.
  12. החלף את מצע הגדילה באמצעי IVM כדי לאפשר ביוץ חוץ גופי .
    הערה: ביוץ יכול להתרחש גם בהדמיית זמן-lapse כדי להעריך את התזמון ותווי הקרע.
  13. הסר קומפלקסים של קומולוס-ביציות (COCs) 14-16 שעות לאחר הוספת מדיית IVM וציון סטטוס התבגרות.
    1. הגדר את מצב ההתבגרות הוא כדלקמן: זיהוי MII על ידי שחול של הגוף הקוטבי הראשון (תוצאה צפויה לביציות בריאות), GVBD/MI על ידי היעדר גוף קוטבי או שלפוחית נבט (התבגרות מאוחרת), GV על ידי הגרעין הכדורי הנראה במרכז הביצית (חוסר התקדמות מיוטית) או ביצית מנוונת-שטוחה ו/או כהה.
  14. אופציונלי: מכיוון שפרמטרי הציר של ביציות MII, כולל יישור כרומוזומלי, צורה ונפח, נמצאים בקורלציה הדוקה עם איכות הביציות ותוצאות העובר 58,59, השתמש בהם כדי להעריך את ההצלחה של ביציות במבחנה. כדי להעריך את המורפולוגיה של הציר, לתקן ולהכתים ביצי MII באמצעות אימונוציטוכימיה שלמה.
    1. קיבוע: מקבעים את הביצים ב-3.8% PFA עם 0.1% טריטון X-100 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטפו את הביצים פי 3 במאגר חוסם (PBS עם סידן ומגנזיום (PBS +/+) עם 10% Tween-20 ו-0.3% BSA).
    2. צביעת ציר:
      1. דגרו את הביצים במאגר חדירות (PBS +/+ עם 0.1% טריטון X-100 ו-0.3% BSA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר
      2. יש לשטוף פעמיים במאגר חוסם.
      3. דגרו את הביצים באנטי-אלפא-טובולין מצומד Alexa Fluor 488 בריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל על נדנדה עטופה בנייר כסף למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
      4. שטפו את הביצים במשך 3 x 20 דקות במאגר חוסם לפני ההרכבה על שקופיות מיקרוסקופ עם מדיום הרכבה המכיל DAPI.
      5. כדי לצפות בשלד הציטו של הביצית, יש לכלול 1:50 רודמין פלואידין במהלך הצביעה.
    3. דגימות תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות אובייקט פי 63 עם ערימת z ברוחב של 1.0 מיקרומטר לאורך כל הציר.

8. יישומים במורד הזרם של תבניות אגרוז מותאמות אישית

הערה: ניתן להשתמש במיקרו-תבניות אגרוז לניתוח היסטולוגי, המאפשר כימות ולוקליזציה של גנים או חלבונים שונים מעניינים. המיקרו-תבניות יוצרות מיקרו-מערך זקיקים המאפשר להכתים זקיקים מרובים במקביל. ניתן לבצע טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) גם ללא צורך בהעברת זקיקים (איור 1, יישום). טומוגרפיה קוהרנטית אופטית היא טכניקת הדמיה המאפשרת שחזור תלת מימדי של דגימות ובעלת עומק ורזולוציה גבוהים יותר בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, המאפשרת הדמיה משופרת של דגימות תלת מימד כגון זקיקים שגודלו במבחנה60.

  1. עבור יישומי היסטולוגיה, הכינו תמיסת אגרוז (1.5% w/v) כמתואר בשלב 6.2.
    1. הסר את כל המדיה המקיפה מיקרו-תבניות אגרוז בבאר והסר בזהירות את המדיה בחלל המיקרו-תבנית באמצעות פיפטה p200 בפינות החלל.
    2. פיפטה בזהירות 100 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז נוזלית כדי למלא ולאטום את המיקרו-בארות והחלל מבלי לעורר את הזקיקים; ודא שהחלק העליון שטוח. הסר את כל הבועות בעזרת קצה פיפטה P10 סטרילי.
    3. נותנים לאגרוז להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. ודא תחת מיקרוסקופ שהמיקרו-תבנית אטומה לחלוטין.
    4. מקבעים את המיקרו-תבניות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין ב-750 מיקרוליטר של קיבוע (תמיסת דוידסון שונה או 3.8% פרפורמלדהיד).
    5. שאפו את הקיבוע ושטפו את המיקרו-תבניות האטומות בריכוזים עולים של אתנול, החל מ-50% ולבסוף 70% EtOH.
    6. תהליך באמצעות מעבד רקמות אוטומטי תוך שימוש בפרוטוקולי עיבוד סטנדרטיים (טבלה 2) והטמעה בשעוות פרפין. בעת ההטבעה, שימו לב לכיוון המיקרו-תבניות. ודא שיש שעווה לפני ואחרי הדגימה במהלך תהליך ההטבעה כדי למזער את אובדן הרקמות במהלך החיתוך.
    7. חתכו באופן סדרתי דגימות משובצות בעובי של 5 מיקרומטר והניחו על שקופיות מיקרוסקופ טעונות.
    8. בצע צביעה של H&E על ידי מכתים אוטומטיים ואטום עם אמצעי הרכבה לפני ההדמיה.
  2. בעת ביצוע OCT, הנח את המיקרו-תבנית עם הזקיקים בכלי 50 מ"מ המכיל חומר IVM.
    1. כדי לבצע את ההליך המשמש ליצירת תמונות OCT מייצגות, תמונה באמצעות מערכת OCT מותאמת אישית הפועלת בטווח הספקטרלי של האור הנראה ברזולוציה צירית של 1.3 מיקרומטר ורזולוציה רוחבית של 9.4 מיקרומטר61,62.
    2. סרוק זקיקים בשדה ראייה של 1.58 x 1,58 מ"מ2 , המורכב מ-512 קווי A ו-512 סריקות B, החוזרות על עצמן פעמיים לכל סריקה B ו-3x לכל נפח.
    3. עבד תמונות OCT באמצעות ImageJ כדי לדמיין את המבנה התלת מימדי של זקיקים ולכמת נפחים.
      1. העלה תמונות ל-ImageJ כמחסנית Z על ידי גרירת קבצים ליישום פתוח.
      2. הצג באופן חזותי את z-stack כתמונה תלת-ממדית על-ידי מעבר אל תוספים|3D|מציג עוצמת הקול. סובבו את התמונה התלת-ממדית כדי להציג זוויות שונות בנקודות זמן שונות.
      3. נווט אל קובץ| שמירה בשם |Tiff כדי לשמור את התמונה במיקום הרצוי.

9. ניתוח Timelapse של תרבית זקיקים

הערה: זקיקים הגדלים במערכת התרבית נטולת הפיגומים שוכנים באותו מישור מוקד ותואמים להדמיית זמן-lapse בחממה. ניתן להתחיל בהדמיית Timelapse לאחר זריעת זקיקים בשלב 7.7 (איור 1, יישום).

ודא שכל השינויים מדויקים לאורך כל הזמן-lapse. לפיכך, עברו את כל הערימה לאחר כל שלב כדי לוודא שאין אי התאמות במדידות.

  1. הגדרת קיטועי זמן:
    1. הנח מכסה מיקוד/רכז אור על המיקרוסקופ הידני.
    2. הכניסו את המיקרוסקופ הידני עם מחזיק התושבת לחממה והתחברו למחשב נייד עם תוכנה מותקנת.
    3. הנח ויישר את התרבית היטב מתחת למיקרוסקופ והתאם את הגובה והמיקוד של המיקרוסקופ כך שכל הזקיקים יהיו בפוקוס. באמצעות איזון לבן אוטומטי (AWB), בחר תנאי תאורה אופטימליים באמצעות בקרת LED, כבה את החשיפה האוטומטית (AE) ובחר את זמן החשיפה האופטימלי.
      הערה: ודא כי יישור התבנית זהה לפני ואחרי כל החלפת מדיה; אחרת, יהיה צורך לבצע ניתוח בנפרד עבור כל יומיים של תרבות.
    4. התחל הדמיית זמן-lapse, בחירת משך של 8 ימים ומרווח של 30 דקות. בחר תמונה וכבה את LED כאשר אינך מצלם.
  2. ציינו אילו מדידות יירשמו בתיבת הדו-שיח 'קביעת מדידות' (לחצו על 'נתח' | קבעו מדידות) לפני ניתוח ImageJ.
    הערה: למידע נוסף על מדידות אפשריות המשולבות בתוכנת ImageJ, עיין במדריך למשתמש תת-סעיף 30.763.
  3. מקם את כל התמונות בתיקיית ניתוח נפרדת כדי להתחיל בניתוח.
  4. גרור ושחרר את תיקיית הניתוח לתוכנת ImageJ כדי לפתוח את קיטועי הזמן כערימה. ודא שהאפשרות מיון שמות מספרית נבחרה ואם רצפי התמונות אינם מתאימים לזיכרון ה-RAM של המחשב, בחר מחסנית וירטואלית.
  5. השתמש בכלי הבחירה המלבני כדי לבחור אזור שבו נמצאים כל הזקיקים לאורך קיטועי הזמן. לשם כך, השתמש תחילה בתמונה האחרונה וגלול בערימה כדי לוודא שאף אחד מהזקיקים לא ייחתך. לאחר מכן, חתוך את הבחירה (נווט אל תמונה | חתוך או Ctrl+Shift+X, איור 5Ai,ii).
  6. הגדר את סרגל קנה המידה עבור מחסנית קיטועי הזמן (ניתוח | הגדר סולם). השתמש בתמונת יום 0 שנעשתה עם ההדמיה ומדוד שלוש תכונות ניתנות לזיהוי כגון זקיקים או מיקרווולות. השתמש באותה תמונה של אותו יום 0 מערימת קיטועי הזמן והגדר את קנה המידה עבור אחת מהמדידות; השתמש בשתי המדידות האחרות כדי לאשר את הגדרת קנה המידה המדויק.
  7. יישור כל התמונות באמצעות תוסף SIFT (נווט אל תוספים | הרשמה | יישור מחסנית ליניארית עם SIFT, (איור 5Bi,ii). השתמש בהגדרות הסטנדרטיות הבאות, הניתנות להתאמה על בסיס כל מקרה: יישור מחסנית ליניארי עם SIFT, initial_gaussian_blur = 1.60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 הקרוב ביותר/next_closest_ratio = 0.92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0.05 expected_transformation = אינטרפולאט קשיח.
  8. המרת האוסף לגווני אפור של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות).
  9. הסר את הרקע באמצעות חיסור הרקע של הכדור המתגלגל (לחץ על תהליך | חיסור רקע, איור 5Ci,ii) באמצעות ההגדרות הבאות, הניתנות להתאמה על בסיס כל מקרה: רדיוס כדור מתגלגל = 70.0 פיקסלים; בחר Disable Smoothing.
  10. סף התמונה (נווט אל תמונה | התאם | Threshold) כדי לחלק את תמונות קיטועי הזמן לשתי מחלקות של פיקסלים, באמצעות ההגדרות הבאות: setThreshold(35, 255, "raw"); run("Apply LUT", "stack"); setOption("BlackBackground", true); run("Convert to Mask", "method=Intermodes background=Dark Calculate black").
  11. מדוד כל זקיק בנפרד באמצעות בחירת המלבן, ולאחר מכן בחר את פונקציית ניתוח החלקיקים (לחץ על נתח | לנתח חלקיקים). השתמש בהגדרות הבאות: נתח חלקיקים...", "גודל= 8000-תצוגה אינסופית לא כולל סיכום שכבת-על הוסף מחסנית מורכבת (איור 5Di,ii).
    1. לפני שמירת התוצאות, ודא שהחזר ה-ROI עבור כל תמונה מדויק (איור 5Ei,ii). שמור סיכום ותוצאות ב . תבנית CSV.
    2. חזור על פעולה זו עבור כל הזקיקים האחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לקבוע אם הישרדות וצמיחה של זקיקים נתמכו באמצעות טכנולוגיה חדשנית זו כמתואר בסעיף פרוטוקול 7, זקיקים מאותם עכברים בודדו וגודלו במקביל במיקרו-תבניות אגרוז או נעטפו ב-0.5% אלגינט. תמונות מייצגות של זקיקים מכל יום אחר של תרבית הדגימו התפתחות תקינה, צמיחה והיווצרות של חלל אנטרלי לאורך תקופת התרבית (איור 6A). תוצאות שפורסמו בעבר הראו כי הישרדות הזקיקים אינה מראה הבדלים משמעותיים בין שיטות התרבית וקוטר גדול משמעותית עבור זקיקים שגודלו באגרוז57...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גמטוגנזה והתבגרות במבחנה הן טכנולוגיות מפתח להבנה בסיסית של ביולוגיה של ביציות, עם יישומים פוטנציאליים בטכנולוגיית רבייה מסייעת, שימור פוריות ושימור מינים. השיטות לתמיכה בהפריה חוץ גופית מסתמכות לעתים קרובות על תרבית משותפת עם תאים סומטיים ליצירת שחלות משוחזרות30. חשיבותם של תאי תמיכה אלה ידועה היטב in vivo, כאשר המיקרו-סביבה הסומטית הזקיקית היא קריטית לצמיחה והתפתחות בריאה של ביציות 2,3,8,9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות הילד והתפתחות האדם (R01HD105752 ל-F.E.D ו-T32HD094699 ל-E.J.Z) ותוכנית SenNet של הקרן המשותפת של ה-NIH (U54AG075932 ו-UH3CA268105 ל-F.E.D) ומענק קרן ביל ומלינדה גייטס (INV-003385 ל-F.E.D). על פי תנאי המענק של קרן ביל ומלינדה גייטס, רישיון Creative Commons Attribution 4.0 Generic License כבר הוקצה לגרסת כתב היד המקובל על ידי המחבר שעשויה לנבוע מהגשה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים וכימיקלים
  צינורות צנטריפוגה פוליסטירן בנפח 50 מ"לגלוב סיינטיפיק941-11017-CS
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר סיינטיפיקMCT-150להקפיא במהירות ולאחסן מדיה
צלחת 100 מ"מ, לא מטופלתפישר סיינטיפיק08-757-100D ליצור ולאחסן מיקרותבניות אגרוז
100% אתנולמרצדס סיינטיפיק1200עיבוד רקמות
1000 ומיקרו; L  טיפים לפיפטה, שמירה נמוכהMIDSCIPR-1000BKטיפים תרבותיים  
200 ומיקרו; L  טיפים לפיפטה, שמירה נמוכהMIDSCIPR-200BKטיפים תרבותיים  
פלטת 24 בארותקורנינג353047תרבות
צלחות 35 מ"מפלקון351008לבודד שחלות ולדגור במדיה אניזמטית
95% אתנולמרצדס סיינטיפיק1210עיבוד רקמות
אגרוזהופרGR140מיקרו-מולד
שמן מינרלי BioXtra, שמן קל, מתאים לתרבות תאי עובר של עכברסיגמא-אלדריץ'M5310-500MLמשמש כסוכן להסרת תבניות ביוקואמילנטי
אלבומין סרום בקר ביומדיקל MP103700מדיה צמיחה
אבקת ניקוי, 10 אונקיות, חבילה של 6Office Depot 110284אוויר דחוס
שרף Clear V4 1 ליטרפורמלאבס, בע"מRS-F2-GPCL-04שרף הדפסה תלת-ממדית
קורנינג פלסטיק רב-פעמי בצורת נמוכה 100 מ"ל, בקבוק פוליפרופילן, מדורגקורנינג1000P-100בקבוק לערבוב רכיבי סיליקון 
DNAse Iקיאגן79254מדיה אנזימטית
Ecoflex 00-45 קרוב לניקויסמות-און, בע"מB09M8Y9PTVחומר סיליקון
F-12 + גלוטמקסגיבקו31765-035מדיה צמיחה
פיטואין בקר עובריסיגמאF-3385מדיה צמיחה
סרום בקר עוברי (FBS)סרום השיאPS-FB2Dissection Media, Enzymatic Media,  מדיה תחזוקה & מדיית התבגרות
פישרברנד  שקי עיקורפישר סיינטיפיק01-812-50 שקי עיקור
הורמון מגרה זקיקים (FSH)EMD סרונו, בע"מ.גונאל-F מרשם בלבד מדיה וצמיחה מדיית התבגרות
Gibco  DPBS, סידן, מגנזיוםפישר סיינטיפיק14-040-182 המלח הממופר בפוספט של דולבקו
גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG)סיגמא אולדריץ'C1063-1VLמדיית התבגרות
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS)תרמופישר41400045מדיה צמיחה
גשושי מולקולות של Invitrogen Rhodamine Phalloidinפישר סיינטיפיקR415כתם שלד תא ביצה
מנות IVFתרמו-סיינטיפיק150260לבודד, לבחור ולאזן מראש את הזקיקים
לייבוביץ' 15 (L15)גיבקו11415-064Dissection Media & מדיה אנזימטית
ליברזסיגמא אולדריץ'5401119001מדיה אנזימטית
מם? + GlutaMAXגיבקו32561-037Maintenance Media,  מדיה וצמיחה מדיית התבגרות
גורם גדילה אפידרמלי של העכבר (EGF)BD ביוסיינסס354010מדיית התבגרות
מייבש פוליקרבונט שקוף Nalgene Classic Designתרמו-סיינטיפיק5311-0250מייבש ואקום 
פרפיןפישר סיינטיפיק83-30עיבוד רקמות ועיבוד רקמות הטמעה
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140-122מדיית דיסקציה, מדיה אנזימטית & מדיה תחזוקה
טיפים לחשפניותאוריג'יוMXL3-200תרבות
מדיום הרכבה נגד פייד VECTASHIELD PLUS עם DAPIמעבדות וקטורH-2000כתם גרעין הביצה
קסילןמרצדס סיינטיפיק9840עיבוד רקמות
α-Tubulin (11:10) ארנב mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)טכנולוגיית איתות סלולרי5063Sכתם ביצה טובולין
<חזק>ציוד
בנה פלטפורמה 2פורמלאבס, בע"מBP-F3-02-01 רכיב מדפסת תלת-ממד
Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0דינו-לייטAF4915ZTLImager להגדרת טיימלפס
מיכל שרף צורה 3 v2.1 פורמלאבס, בע"מRT-F3-02-01רכיב מדפסת תלת-ממד
מדפסת תלת-ממד טופס 3B+פורמלאבס, בע"ממדפסת F3B-Pמדפסת תלת-ממד סטריאוליתוגרפיה (SLA) של Formlabs
Form cure פורמלאבס, בע"מFH-CU-01פלטפורמת ריפוי  
שטיפת צורהפורמלאבס, בע"מFH-WA-01פלטפורמת כביסה
בקבוק ריסוס עם משאבה מאדהVWR0309-3005למרוח חומר הסרת תבניות
פקק פוקוס/קונקנטרטור אור לסדרת Edge (למעט דגמי T5 ו-T8)דינו-לייטN3C-Rרכיב Imager להגדרת טיימלפס
חבילת מחזיק הרכבת המשלבת את מתקן ה-RK-10 והרחבת הזרוע RK-10-EXדינו-לייטRK-10Aרכיב Imager להגדרת טיימלפס
הטמעת רקמותלייקההיסטוקור ארקדיהלהטמעת מיקרו-תבניות
מעבד רקמותלייקהTP1020לעיבוד מיקרו-תבניות
211DS אינקובטור רעידות (Orbital Shaker)לבנט אינטרנשיונלI-5211-DSלדגור שחלות במדיה אנזימטית לשחרור זקיקים
Software 
אוטודסק פיוז'ןAutodesk, Incתוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD). Autodesk מציעה גישה חינוכית חינמית דרך תוכנית Autodesk Education.
DinoCapture 3.0 גרסה 1.1.1.3 דינו-לייט
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותלנתח תמונות OCT ולמדידת זקיקים
PreFormפורמלאבס, בע"מתוכנת הכנת הדפסה חופשית שנועדה לעבוד עם מדפסות סטריאוליתוגרפיה (SLA) של Formlabs. 

מקורות

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Time LapseIn Vitro
ייצור ושימוש בתבניות אגרוז הניתנות להתאמה אישית לתרבית זקיקי שחלות עכבר ללא פיגומים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.