הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל גליומה במחזור לחקירות טיפול בתאי T של קולטני אנטיגן כימריים

410 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

17 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מבסס מודל גליומה במחזור על ידי הזרקת החדר הצדדי כדי לחקור את ההשפעה הטיפולית של טיפול בתאי T בקולטן אנטיגן כימרי in vivo.

תקציר

תאי גידול במחזור בנוזל המוח השדרתי (CSF) הם גורם משמעותי בהישנות הגידול ובגרורות תוך גולגולתיות בגליומה. מחקרים רבים מנסים לזהות אסטרטגיות יעילות למיקוד וחיסול הגידול במחזור ב-CSF. טיפול בתאי T בקולטן אנטיגן כימרי (CAR) שימש לעתים קרובות לגידולים שונים במחזור הדם. עם זאת, המחקר מוגבל בשל היעדר מודל גליומה מתאים במחזור הדם. כאן, פותח מודל גליומה במחזור ויושם בחקירות טיפול בתאי T CAR. מודל זה נבנה באמצעות הזרקת החדר הרוחבי, הנמצאת בשימוש נרחב בטיפול מקומי במחלות תוך גולגולתיות. תאי הגליומה הוזרקו לחדר הצדדי כדי ליצור את הגידול הראשוני התוך גולגולתי. הגידולים שנשפכו מהחדר הצדדי שימשו לציון הגידול המסתובב ב-CSF. המודל קל לבנייה וניתן ליישם אותו במחקרים שונים על טיפול בתאי T CAR בגליומה במחזור הדם. כתוצאה מכך, מודל הגליומה במחזור מספק מודל גרורות גליומה ייחודי למחקרי טיפול יעילים בתאי T של CAR בגידול במחזור הדם.

מבוא

גליומה היא גידול המוח הממאיר הראשוני השכיח ביותר בקרב מבוגרים 1,2. הטיפולים הנוכחיים, כולל ניתוח, הקרנות וכימותרפיה, מראים יעילות מוגבלת, עם הישרדות חציונית של 14-15 חודשים בלבד 3,4,5. תאי גליומה במחזור ב-CSF ממלאים תפקיד מכריע בהישנות הגידול ובגרורות תוך גולגולתיות 6,7. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות טיפול יעילות יותר לחיסול תאי הגליומה במחזור הדם.

מחקרים אחרונים על גליומה התמקדו בעיקר בגידולים ראשוניים תוך גולגולתיים 8,9. עם זאת, הבעיה החשובה ביותר שיש לטפל בה במרפאה היא כיצד למקד ולחסל את תאי הגליומה במחזור הדם. לכן, מחקרים על הגליומה במחזור לפני או אחרי הניתוח זקוקים לתשומת לב רבה יותר. טיפול בתאי T בקולטן אנטיגן כימרי (CAR) הוא האסטרטגיה הנפוצה ביותר המשמשת במחקרים על תאי גידול במחזור10,11. עם זאת, בשל המבנה האנטומי המיוחד של גידולים תוך גולגולתיים, קשה לפתח מודל גליומה מתאים במחזור הדם, שהוא קריטי לחקר גליומה במחזור 12,13,14,15,16.

מחקר זה יצר מודל גליומה ייחודי במחזור המבוסס על הזרקת החדר הרוחבי. במודל זה, תאי הגליומה מוזרקים לחדר הרוחבי, והגידול הראשוני התוך גולגולתי והגידול במחזור ב- CSF מתגלים על ידי הדמיה ביולוגית in vivo וניתוח ציטומטריית זרימה ביום 10. הטיפול ב-CAR-T החל כאשר עומס הגידול בעכברי מודל הגליומה במחזור הגיע לכ-6.5 ×-105p/s. עומס הגידול נוטר כל 5 ימים כדי להעריך את ההשפעה הטיפולית של תאי CAR-T. מודל זה מחקה את מצב ההשתקעות של תאי הגידול של חולי גליומה וניתן להשתמש בו במחקרים שונים על גליומה במחזור הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו כולם ופיקוחו על ידי מועצת הביקורת המוסדית וועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג (IACUC-1905048). עכברים נקבות C57BL/6J, בגילאי 6-8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. שכן את העכברים במחסום, מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, טמפרטורת סביבה של 24 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50% כלוב.
  2. שקלו את העכברים, והרדימו אותם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) בהזרקה תוך-צפקית של 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין17.
    הערה: השילוב של נתרן פנטוברביטל וקסילזין נמצא בשימוש נרחב בהליכי הזרקה סטריאוטקסיים של עכברים. הרדמה נכונה אושרה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן, מה שמבטיח שהחיה הייתה מחוסרת הכרה לחלוטין לפני הניתוח. כדי למנוע יובש ונזק בקרנית, נמרחה משחת עיניים וטרינרית על העיניים במהלך ההרדמה.
  3. הסר את השיער על ראשו של עכבר בעזרת מכונת גילוח של חיות מעבדה וקבע את הראש והגפיים של העכבר על המנגנון הסטריאוטקסי.
  4. עקרו את ראש העכבר באמצעות היודופור בעזרת צמר גפן, וכסו את שאר גוף העכבר במגבת כירורגית סטרילית.
  5. חותכים את הקרקפת כ -1 ס"מ לאורך קו האמצע בחלק העליון של המצח הימני בעזרת אזמל.
    הערה: יש לעקר כראוי את כל המכשירים הכירורגיים לפני השימוש כדי למנוע זיהום. יש להקפיד לטפל במכשירים בזהירות כדי למנוע פציעה, ויש לבצע את כל ההליכים בסביבה סטרילית.
  6. כוונן את תפס האף ואת מוט האוזן, וודא שהפרש הגובה של ציר ה-Z בין תפר הלמבדה לברגמה קטן או שווה ל-0.05 מ"מ.

2. בניית מודל הגליומה במחזור

  1. סמן את הנקודה 1.5 מ"מ לצד ימין של קו האמצע ו-1.1 מ"מ לצד האחורי של הברגמה באמצעות צמר גפן טבול בסגול ג'נטיאן (קואורדינטות: AP -1.1 מ"מ, ML -1.5 מ"מ מברגמה).
  2. בעזרת מקדחה גולגולתית מיניאטורית בקוטר 0.5 מ"מ, קדחו חורים בקואורדינטות היעד כדי לחשוף את הדורה מאטר.
  3. יש לשטוף במי מלח כדי להסיר שאריות עצם.
  4. צייר 5 מיקרוליטר של תרחיף תאי גידול באמצעות מיקרו-מזרק עם פקק מגביל עומק (GL261-Luc-Gfp, 1×105 תאים/מיקרוליטר ב-PBS המכיל 0.1% BSA).
  5. הכנס את המחט בקצב של 0.2 מ"מ לשנייה לעומק של 3.0 מ"מ והחזר את המחט ב-0.5 מ"מ, השהה למשך 10 שניות כדי לייצב את לחץ הרקמות.
  6. הזרקת תאים ב-1 μL/min באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה מכוילת, עם זמן שהייה של 10 דקות לאחר ההזרקה כדי למזער זרימה חוזרת.
  7. משוך את המיקרו-מזרק לאט, הפעל לחץ על מקום ההזרקה בעזרת צמר גפן סטרילי למשך 30-60 שניות.
  8. לתפור את הקרקפת בתפר כירורגי נספג (6-0), ולחטא מחדש את החתך ביודופור.
  9. הנח את העכבר על כרית חימום בטמפרטורה מדויקת של 37 מעלות צלזיוס לחימום מחדש ועקוב אחר מצבו הבריאותי.
  10. החזר את העכבר לכלוב נקי לאחר הפגנת רפלקס יישור מתמשך ותנועה ספונטנית.
  11. דמיין את העכבר עם מערכת הדמיה ביולומינסנט in vivo (ספקטרום IVIS) כדי לזהות את הגידול המושתל ביום העשירי לאחר נשיאת הגידול.
  12. יש להזריק לעכבר מלח אשלגן D-luciferin תוך צפקי (150 מ"ג/ק"ג).
    הערה: מדללים מלח אשלגן D-לוציפרין באמצעות D-PBS סטרילי.
  13. השראת הרדמה באמצעות איזופלורן 2% ב-1 ליטר/דקה O2 במהלך תקופת ההמתנה של 10 דקות.
    הערה: יש להשתמש באיזופלורן במכסה מנוע כימי מאוורר כדי למזער את החשיפה לאדי הרדמה. זאת על מנת להבטיח את בטיחותם של בעלי החיים והחוקרים במהלך ההליך.
  14. שמור על הרדמה ב-1.5% איזופלורן דרך חרוט האף.
  15. בצע הדמיה ביולומינסנט באמצעות ספקטרום IVIS.
  16. בצע איסוף CSF על ידי ניקוב בור המוח הקטן בעכבר.
    הערה: CSF נאסף על ידי ניקוב בור המוח הקטן בעכברים תחת הרדמה איזופלורנית. כל ההליכים, כולל הרדמה, חשיפה כירורגית ואיסוף דגימות, בוצעו בתנאי SPF כדי למזער את הזיהום והסיכון לזיהום. עכברים הונחו בתנוחת שכיבה על מסגרת סטריאוטקסית, ובור המים נחשף בזהירות תחת מיקרוסקופ מנתח. מחט מזרק המילטון 27 G שימשה לניקוב הבור ואיסוף CSF בטכניקה ביד חופשית. כ-5-10 מיקרוליטר של CSF שקוף התקבל מכל עכבר. כדי להפחית עוד יותר את הסיכון לזיהום, אתר הניתוח עבר חיטוי ביודופור לפני הניקוב, וכל כלי הניתוח עברו חיטוי. לאחר איסוף CSF, אתר הניקוב נדחס בעדינות עם כותנה סטרילית כדי לעצור כל דליפת נוזלים. לאחר מכן העכברים הונחו על כרית חימום והיו במעקב רציף עד להתאוששות מלאה מההרדמה. משככי כאבים לאחר הניתוח ניתנו כדי להקל על אי הנוחות. בעלי חיים נצפו מדי יום במשך שלושה ימים רצופים לפחות כדי להבטיח היעדר תסמינים נוירולוגיים או סימני זיהום.
  17. בצע ציטומטריית זרימה לאיתור תאי גידול ב- CSF. אוכלוסיית GFP+ מייצגת תאי גידול.
    הערה: קו תאי הגליומה של העכברים GL261 תוכנן לשאת את הלוציפראז (Luc). כאשר ערך הקרינה מגיע ל~5 × 105תאי גידול p/sand מתגלים ב-CSF, ההליך מצליח. תוכנת ההדמיה ששימשה הייתה Living Image 4.5.2, ופרמטרי ההדמיה הוגדרו ל-Luminescent.
  18. בחר את העכברים עם נושאת גידול מוצלחת כדי להעריך את היעילות הטיפולית של תאי CAR-T.

3. טיפול בגליומה במחזור הדם על ידי הזרקת תאי CAR-T לחדר הצדדי

  1. כאשר גודל הגידול בעכברי מודל הגליומה במחזור הופך ל~6.5 ×-105 p/s, בחר עכברים אלה לטיפול ב-CAR-T.
  2. שקלו את עכברי מודל הגליומה במחזור הדם, והרדימו את העכברים בהזרקה תוך-צפקית של 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל ו-50 מ"ג/ק"ג קסילזין.
  3. חזור על התהליך של שלבים 1.3-1.5.
  4. הפרד את הקרקפת והגולגולת, ואתר במדויק את חור הקידוח שנעשה במהלך בניית מודל הגליומה במחזור ובצע את ההליך המוזכר בשלבים 2.2-2.3.
  5. שאב 10 מיקרוליטר של מתלה תאי CAR-T עם מזרק מיקרו, הכנס בזהירות את המחט לחדר הצדדי של העכבר, כוונן את עומק ההזרקה באמצעות המנגנון הסטריאוטקטי ומתן לאט את תמיסת תאי ה-CAR-T.
    הערה: בהתאם להזרקת תאי GL261, תאי CAR-T הוזרקו לחדר הצדדי הימני (קואורדינטות: AP -1.1 מ"מ, ML -1.5 מ"מ מברגמה), עם עומק הזרקה של 2.5 מ"מ. קבוצת הביקורת טופלה ב-PBS במקום בתאי CAR-T.
  6. שמור את המחט למשך 10 דקות, ולאחר מכן הסר לאט את המחט ולחץ קלות על נקודת ההזרקה עם גזה סטרילית כדי למנוע דימום לאחר השלמת ההזרקה. לתפור את הקרקפת בתפר כירורגי נספג (6-0), ולחטא את החתך.
  7. הנח את העכבר על כרית חימום בטמפרטורה מדויקת של 37 מעלות צלזיוס לחימום מחדש ועקוב אחר מצבו הבריאותי.
  8. החזר את העכבר לכלוב נקי לאחר הפגנת רפלקס יישור מתמשך ותנועה ספונטנית.
  9. בצע הדמיה ביולוגית in vivo כדי לעקוב אחר צמיחת גידולים בעכברים. הדמיה אופטית מאפשרת להעריך את היעילות הטיפולית של תאי CAR-T.
  10. שקלו את העכברים כל יומיים, ובצעו הדמיית BLI כל 5 ימים כדי לעקוב בצורה מדויקת יותר אחר צמיחת הגידול עד להגעה לנקודת הקצה הסופית.
  11. המתת חסד של העכבר וקיבוע רקמת המוח ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24-48 שעות.
  12. הטמיעו את הרקמות בפרפין וחתכו אותן לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר.
  13. הפזר את החלקים, התייבש מחדש באמצעות אלכוהול מדורג, הכתים בהמטוקסילין, כתם נגד עם אאוזין והרכיב את החלקים עם כיסוי.
    הערה: במחקר הנוכחי, נקודת הקצה הסופית הייתה היום ה-30, והעכברים הומתו על ידי מנת יתר של נתרן פנטוברביטל עם זריקה תוך-צפקית. פגרי העכברים הועברו למרכז הרפואי לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג לסילוק. מחטים שהושלכו הונחו במיכל חד והועברו למחלקה לניהול מעבדות וציוד של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג לסילוק מרכזי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התרשים הסכמטי של מודל הגליומה המסתובב לטיפול ב-CAR-T מוצג באיור 1. תאי CAR-T הוזרקו לחדר הצדדי באמצעות מיקרו-מזרק כדי להדגים את השפעתם הטיפולית. שיטה זו מאפשרת העברה ישירה של תאי ה-CAR-T למוח, תוך התמקדות בתאי הגליומה במחזור הדם. הליך ההזרקה בוצע ביום ה-11, לאחר השתלת תאי GL261 בחדר הצדדי של העכבר. בנקודות זמן שונות (ימים 15, 20, 25 ו-30), תגובת הגידול נוטרה באמצעות הדמיה ביולומינסנציה in vivo וזרימה ציטומטרית לאיתור תאי גידול GFP+<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל הגליומה במחזור שנקבע במחקר זה באמצעות הזרקת חדר לרוחב מספק התקדמות משמעותית, ומציע מספר יתרונות על פני המודלים הקיימים. טכניקת הזרקת החדר הרוחבי ניתנת לשחזור רב, ומאפשרת מידול גידול עקבי במסגרת זמן קצרה יחסית. זה הופך אותו לכלי רב ערך עבור חוקרים המבקשים לחקור את התפשטות תאי הגידול לתוך ה-CSF ולהעריך את יעילותם של טיפולים, כגון תאי CAR-T. בניגוד לעירוי CAR-T תוך ורידי מסורתי, הנתקל בקשיים בחציית מחסום הדם-מוח, הזרקה תוך חדרית מאפשרת אספקה מדויקת של תאי CAR-T לפריפריה של הגידול

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82230059), תוכנית פיתוח המחקר המרכזי של מחוז ג'יאנגסו של סין (BE2022770).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר כירורגי נספגשנחאי Pudong Jinhuan מוצרים רפואיים ושות', בע"מ₪111
קאר-טימעבדות ביולוגיות יצירתיות
מלח אשלגן D-לוציפריןMCEHY-12591B
GL261-Luc-GFPשנחאי Zhong Qiao Xin Zhou ביוטכנולוגיה ושות', בע"מZQ0932
מערכת הדמיה ביו-לומינסנט in vivoטאנוןטאנון ABL X6
מכונת גילוח לבעלי חיים במעבדהביוטיים ביוטכנולוגיהFS600
עכבריםמתקן הליבה לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג
משאבת מיקרו-הזרקהRWD₪100
מיקרו-מזרקהמילטון87943
מקדחה מיני גולגולתRWD78001
פנטוברביטל נתרן ChemSrc57-33-0
מנגנון סטריאוטקסיRWD68043
קסילזיןChemSrc7361-61-7

מקורות

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CAR T
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.