Method Article

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים אוקריוטיים עוקבים אחר מחזור תאים משומר המווסת תהליכים מגוונים, כולל תחזוקת DNA והומאוסטזיס של אברונים. חקר תהליכים תאיים באופן תלוי במחזור התא נחוץ לעתים קרובות כדי לפרש כראוי את תוצאות הניסוי. ישנן שיטות כימיות וגנטיות זמינות לייצור סנכרון מחזור התא בתאים מתורבתים על פני מגוון רחב של אורגניזמים, כולל מודלים של בעלי חוליות, המאפשרים לחקור תהליכים תלויים במחזור התא. עם זאת, בקרב אורגניזמים מודל, שמרים ניצנים נותרו תחנת כוח לניתוח מחזור התא בשל שיטות הסנכרון החזקות במיוחד, זמן הדור הקצר ויכולת המעקב הגנטית. שמרים חולקים את מנגנון מחזור התא המרכזי עם איקריוטים אחרים, מה שאפשר תגליות פורצות דרך בוויסות מחזור התא. פרוטוקול זה מפרט שיטות לניתוח מחזור התא בשמרים, תוך התמקדות בניסויי מעצר-שחרור G1 ושחרור מעצר-מיטוטי, כולל בניית זנים, הכנת תרבית ומיקרוסקופיה. מוצגות שיטות תיוג PCR לייצור זנים מתאימים למעצרי מחזור התא ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מעצר G1 מושג באמצעות פקטור α פרומון פפטיד, ושטיפות קצרות מביאות לשחרור סינכרוני והתקדמות מחזור התא. הדגימות נלקחות בנקודות זמן שונות לאחר השחרור למחזור התא ומקובעות למיקרוסקופיה. שיטה שנייה עוצרת תאי שמרים במיטוזה על ידי דלדול מווסת מחזור התא Cdc20 כדי להשיג אוכלוסייה שנעצרה על ידי מטפאזה, כמו גם שחרור אופציונלי לאנאפאזה. הדגימות מקובעות ומוכנות להדמיה לפני ואחרי השחרור, והן מצולמות ומנותחות. ניתוח תמונות מתמקד בקטלוג לוקליזציה דינמית ושינויי שפע אוכלוסייה של חלבונים במחזור התא. שיטות סנכרון אלו מתאימות למניפולציות מגוונות של מחזור התא, ובעוד שהשימוש בהן בהדמיית תאים קבועים מודגש כאן, ניתן להתאים אותן לניתוחים רבים אחרים, כולל הדמיית תאים חיים כמו גם בדיקות ביוכימיות ומולקולריות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלוקת תאים אוקריוטית מווסתת מאוד באמצעות תוכנית הנקראת מחזור התא. התהליכים השמורים והדינמיים המתרחשים במחזור התא הופכים את המחקר למעניין כשלעצמו, אך יש להם גם השלכות נרחבות המשפיעות על חקירות של תהליכים ביולוגיים אחרים בתא - לדוגמה, אברונים רבים עוברים שיפוץ דרמטי במהלך חלוקת התא, והשפע והלוקליזציה של חלבונים רבים מווסתים מאוד לאורך 1,2,3. למרות שישנן כמה שכבות נוספות של מורכבות הקיימות במערכות מטזואן בהשוואה לשמרים, כולל מגוון רב יותר של קינאזות וחלבונים רגולטוריים, כמו גם קלט נוסף מאותות חיצוניים במטזואנים, חלוקת התאים נשמרת

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית זנים לניתוח והדמיה של מחזור התא

  1. תכנן פריימרים לתיוג C-terminally של הגן המעניין באמצעות פלסמידים לתיוג פרינגל (פלסמידים pFA6a)24. בקיצור, עיצוב פריימרים F2 ו-R1 שכאשר משתמשים בהם עם פלסמיד מסדרת pFA6a, מייצרים מוצר PCR שניתן להפוך ישירות לשמרים כדי ליצור גרסה 'מתויגת' של הגן המעניין. השתמש בזוגות הפריימרים והפלסמידים הכלולים בטבלה 1 כדי לתייג את הגנים המעניינים בפרוטוקול זה. אסטרטגיות עיצוב פלסמיד ופריימר לתיוג C-terminal של גנים שמרים מתוארות בפירוט על ידי Longtine et al.24.
    הערה: ניתן להשתמש בשיטה זו לייצור חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים להדמיה, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח שינויים בלוקליזציה של חלבון תלוי מחזור התא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכול להתבצע בקלות באמצעות השיטות שאנו מתארים כאן. הקבוצה שלנו מתעניינת זה מכבר בוויסות ובתפקוד הדינמי של הציר המיטוטי. בשמרים, גופי קוטב ציר (המסומנים על ידי רכיב Spc110) מתפקדים כמרכזי ארגון מיקרו-צינוריות שמהם נובעים חוטי מיקרו-צינוריות ליצירת מבנה הציר המיטוטי30. חלבון קושר המיקרו-צינורות, Stu2, ממלא תפקיד ביצירת ציר על ידי פילמור מיקרו-צינורות

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בסנכרון מחזור התא בשמרים ניצנים מאפשר לחקור מנגנונים חשובים למגוון תהליכים תאיים. השימוש בשחרור מעצר G1 עם טיפול α גורמים מאפשר התקדמות סינכרונית של אוכלוסיית תאים בשלבי מחזור התא, וכפי שהראנו, יכול לחשוף דפוסי לוקליזציה דינמיים של מווסתים תאיים כמו Stu236. ניתן לבצע עצירות מחזור תא גם באמצעים גנטיים באמצעות דלדול מווסתי מחזור התא כמו Cdc20, המשמש לעצירת תאים במטאפאזה. זה מאפשר הערכה של תהליכים ספציפיים למיטוזה, כמו גיוס Bub1 לקינטוכורים בהיעדר מתח .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לליבת הדמיית התאים של אוניברסיטת יוטה על תחזוקת מתקן המיקרוסקופ Delta Vision. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH F31CA2717405 (ל-M.G.S) ו-T32GM141848 (ל-M.G.S. ו-T.C.S.), 5 For the Fight (ל-M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (ל-M.P.M.), ומענקי NIH R35GM142749 (ל-M.P.M).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-גורםמתקן הסינתזה המרכזית של אוניברסיטת יוטהרצף: WHWLQLKPGQPMY
צינורות אפנדורף 1.5 מ"לאקסיגןMCT-175-C
תערובת dNTP של 10mMתרמו-סיינטיפיקR0193
צינורות קוניים של 50 מ"לגריינר ביו-וואן227 261
5x בופר תגובת Phusion HFמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדB0518S
חומצה אצטית, קרחוניתפישר כימיקלBP2401C-212
מלח המיסולפט אדניןסיגמא-אלדריץ'A9126-100G
אגר, גרגרכימיקלים ותגובות של אפקס20-275
אגרוזהאפקס ביוריסרץ' פרודקטס20-102GP
אוטוקלב Amsco Century Steam StrailizerסטריסSV-1262
מי DI מאוטוקליבים
אוקסיןסיגמא-אלדריץ'קטגוריה#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
נוזל לייזר קרגילמעבדות קרג'יל20130
D-סורביטולסיגמא-אלדריץ'S1876-500G
DAPI (40,6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)גשושיות מולקולריותCat#D1306
מלח נתרן מחומצה דאוקסיריבונוקלאית מאשכי סלמוןסיגמא-אלדריץ'D1626
דקסטרוזפישר כימיקלD16-10
די-סודיום אתילנדיאמין טטראצטטפישר כימיקלS811-10
DMSOתרמו-סיינטיפיק20688
FIJI/ImageJ2 לעומת 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
מערבל מערבולת במהירות קבועהVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי DV Ultraלייקהhttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEסריאל #: NV01063. לא נתמך עוד
פורמלדהידפישר כימיקלCat#F79-500
מכשיר ג'לתרמו-סיינטיפיקאול איזיקאסט B1
תערובת סולם DNA של GeneRulerפרמנטאסSM0333
חרוזי זכוכיתפישר סיינטיפיק11312A
שקופיות זכוכיתVWR48300-026
מנער פלטפורמה אינובה 2300ניו ברונסוויקNB-2300
קימווייפסקימטק06-666
צנטריפוגה מעבדה לצינורות 1.5 מ"לאפנדורף2525
צנטריפוגה מעבדה לצינורות 50 מ"לאפנדורף5804
ליתיום אצטט דיהידרטסיגמא-אלדריץ'L4158-250G
מאסטר סייקלר נקסוס X2אפנדורףhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
מיקרופיפטות p2, p20, p200 ו-p1000 והקצוות המתאימיםרייניןL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
זכוכית כיסוי מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12541014
נוקודאזולקלביוכימיהCat#487928; CAS: 31430-18-9; מגרש#B35705
אורנג' Gסיגמא-אלדריץ'O7252
יתדהמפטון ריסרץ'HR2-591
פפטון גרעיני  ביוריאגנטים של פישרBP9725-5
פולימראז DNA של פיוזיון HFמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0530L
פיפט-XרייניןPX-100R
פוספט אשלגן, די-בסיסיתרמו-סיינטיפיק424195000
פוספט אשלגן, מונובסיסיתרמו-סיינטיפיק424200025
מקור כוחביו-ראד23786
Start Acquire Ultra 1.2.2softWoRx Cytivaהשגה עם DV Ultra
בסיס טריסביוריאגנטים של פישרBP152-10
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'9002-93-1
סיבוב צינורותVWR10136-084
אמבט מיםVWRWBE10A11B
מים, אולטרה טהוראפקס ביוריסרץ' פרודקטס18-194
תמצית שמרים גרנולטיביתביוריאגנטים של פישרBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles