מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

Summary

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

Abstract

תאים אוקריוטיים עוקבים אחר מחזור תאים משומר המווסת תהליכים מגוונים, כולל תחזוקת DNA והומאוסטזיס של אברונים. חקר תהליכים תאיים באופן תלוי במחזור התא נחוץ לעתים קרובות כדי לפרש כראוי את תוצאות הניסוי. ישנן שיטות כימיות וגנטיות זמינות לייצור סנכרון מחזור התא בתאים מתורבתים על פני מגוון רחב של אורגניזמים, כולל מודלים של בעלי חוליות, המאפשרים לחקור תהליכים תלויים במחזור התא. עם זאת, בקרב אורגניזמים מודל, שמרים ניצנים נותרו תחנת כוח לניתוח מחזור התא בשל שיטות הסנכרון החזקות במיוחד, זמן הדור הקצר ויכולת המעקב הגנטית. שמרים חולקים את מנגנון מחזור התא המרכזי עם איקריוטים אחרים, מה שאפשר תגליות פורצות דרך בוויסות מחזור התא. פרוטוקול זה מפרט שיטות לניתוח מחזור התא בשמרים, תוך התמקדות בניסויי מעצר-שחרור G1 ושחרור מעצר-מיטוטי, כולל בניית זנים, הכנת תרבית ומיקרוסקופיה. מוצגות שיטות תיוג PCR לייצור זנים מתאימים למעצרי מחזור התא ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מעצר G1 מושג באמצעות פקטור α פרומון פפטיד, ושטיפות קצרות מביאות לשחרור סינכרוני והתקדמות מחזור התא. הדגימות נלקחות בנקודות זמן שונות לאחר השחרור למחזור התא ומקובעות למיקרוסקופיה. שיטה שנייה עוצרת תאי שמרים במיטוזה על ידי דלדול מווסת מחזור התא Cdc20 כדי להשיג אוכלוסייה שנעצרה על ידי מטפאזה, כמו גם שחרור אופציונלי לאנאפאזה. הדגימות מקובעות ומוכנות להדמיה לפני ואחרי השחרור, והן מצולמות ומנותחות. ניתוח תמונות מתמקד בקטלוג לוקליזציה דינמית ושינויי שפע אוכלוסייה של חלבונים במחזור התא. שיטות סנכרון אלו מתאימות למניפולציות מגוונות של מחזור התא, ובעוד שהשימוש בהן בהדמיית תאים קבועים מודגש כאן, ניתן להתאים אותן לניתוחים רבים אחרים, כולל הדמיית תאים חיים כמו גם בדיקות ביוכימיות ומולקולריות.

Introduction

חלוקת תאים אוקריוטית מווסתת מאוד באמצעות תוכנית הנקראת מחזור התא. התהליכים השמורים והדינמיים המתרחשים במחזור התא הופכים את המחקר למעניין כשלעצמו, אך יש להם גם השלכות נרחבות המשפיעות על חקירות של תהליכים ביולוגיים אחרים בתא - לדוגמה, אברונים רבים עוברים שיפוץ דרמטי במהלך חלוקת התא, והשפע והלוקליזציה של חלבונים רבים מווסתים מאוד לאורך ^1,2,3. למרות שישנן כמה שכבות נוספות של מורכבות הקיימות במערכות מטזואן בהשוואה לשמרים, כולל מגוון רב יותר של קינאזות וחלבונים רגולטוריים, כמו גם קלט נוסף מאותות חיצוניים במטזואנים, חלוקת התאים נשמרת באופן כללי מאוד בכל האיקריוטים ^4,5. עבודה בסיסית רבה ביסוס תובנות מפתח לגבי התקדמות מחזור התא וצעדים רגולטוריים מכריעים נעשתה בשמרים, והוא נותר אורגניזם אטרקטיבי ביותר לחקר שאלות הקשורות למחזור התא מסיבות רבות ^6,7. העיקרי שבהם הוא המגוון הרחב של השיטות הזמינות למניפולציה של מחזור התא, המאפשרות עצירה בשלבים שונים וסנכרון של תאים. יתרונות נוספים כוללים את מחזור התאים הקצר של השמרים (~90-150 דקות בהתאם לטמפרטורה ולתנאי המדיה), קלות המניפולציה הגנטית והרוחב הגדול של אללים מותנים המאפשרים מחקר בהקשר מסוג פראי.

ההתקדמות דרך השלבים השונים של מחזור התא מונעת על ידי פעילותם של מספר קינאזות מפתח, כולל קינאז תלוי ציקלין (Cdk), קינאז דמוי פולו ואורורה קינאזות. נקודות ביקורת של מחזור התא מווסתות את ההתקדמות במחזור התא, ומבטיחות שהתאים לא יתקדמו לשלב הבא של החלוקה אלא אם כן מתקיימים תנאים ספציפיים ^8,9. המחסומים האלה, והמעברים שהם מווסתים, יכולים להיחטף על ידי חוקרים כדי להשיג מעצר לטווח ארוך, או מעצר ושחרור חולפים כדי לסנכרן אוכלוסיית תאים (איור 1). לדוגמה, מחסום המחויבות למחזור התא (נקודת הגבלה או התחלה בשמרים) מבטיח שלתא יש מספיק חומרים מזינים כדי להתחייב לחלוקה לפני תחילת שכפול ה-DNA¹⁰. ניתן לתפעל את המחסום הזה בשמרים הפלואידים כדי להשיג מעצר G1, תוך ניצול תוכנית הזדווגות השמרים המקיימת אינטראקציה עם מחזור התא. בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), לתאים הפלואידים יש אחד משני סוגי הזדווגות, MATa או MATα, אשר נקבע גנטית על ידי לוקוס מסוג הזדווגות. שמרים מסוג הזדווגות אחד רגישים לפרומון ההזדווגות מסוג ההזדווגות השני ומגיבים על ידי הפעלת מפל איתות MAP קינאז שבסופו של דבר מזרחן ומייצב את מעכב ה-Cdk Far1, המונע כניסה למחזור התא על ידי קשירה לקומפלקס Cln1/2-Cdk וחסימת פעילותו 11,12,13. תאים המגיבים לפרומונים מזדווגים יכולים להיקבע ויזואלית על ידי נוכחות של הקרנת הזדווגות או shmoo (איור 1). לפיכך, ניתן להוסיף פקטור α מסונתז כימית לתרביות של תאי MATa כדי להשיג מעצר G1. מעבר נוסף למחזור התא שחוקרים יכולים לכוון אליו כדי לסנכרן תאי שמרים הוא המעבר מטאפאזה לאנפאזה. במהלך המיטוזה, מחסום הרכבת הציר (SAC) עוקב אחר ההצמדה של קינטוכורות למיקרו-צינורות ומעכב את הקומפלקס/ציקלוזום המקדם אנפאזה (APC/C) על ידי בידוד המפעיל שלו, Cdc20, כאשר מתגלים קינטוכורות לא מחוברות. ה-APC/C הוא קומפלקס E3 ליגאז החיוני לכניסת אנפאזה. כאשר ה-SAC מרוצה, Cdc20 קושר את ה-APC/C, ו-APC/C מפעיל מספר חלבונים, בעיקר סקורין וציקלין B, המכוון אותם לפירוק, ומקדם הפרדת כרומוזומים ויציאה מיטוטית^14,15. למרות ש-Cdc20 עצמו אינו מרכיב של ה-SAC, העיכוב שלו הוא היעד להפעלת SAC; לכן, ניתן למנף דלדול השראה של Cdc20 כדי לעצור תרבית שמרים במטאפאזה (איור 1)¹⁶.

פרוטוקול זה מקיף שתי שיטות למניפולציה של מחזור תאי שמרים, כמו גם יישום לדוגמה של כל שיטה. בראשון, α-factor משמש לעצירת תאים ב-G1, ואחריו שלב שטיפה לשחרור תאים מהמעצר, וכתוצאה מכך כניסה חוזרת של מחזור התא הסינכרוני. התאים המסונכרנים ימשיכו לאורך כל מחזור התא, ויאפשרו לחוקרים לעקוב ולחקור תאים בכל שלב במחזור התא. בשיטה זו, לוקליזציה דינמית של חלבון מעניין המתויג GFP, Stu2, מנוטרת לאורך כל הדרך, ומעקב אחר הקשר שלו לציר המיטוטי. שיטה זו ממנפת גם רכיב גוף מוט ציר מתויג (SPB), Spc110-mCherry, המאפשר מדידות של אורך ציר מיטוטי ומהווה פרוקסי מצוין להתקדמות מחזור התא¹⁷. שיטה זו מדגימה כיצד עצירה ושחרור של מחזור התא מאפשרים סנכרון של אוכלוסיות תאים, מה שמקל על חקר חלבון או מרכיב אחר מעניין לאורך מחזור התא.

בשיטה השנייה, עצירה מיטוטית מושגת באמצעות דלדול Cdc20 באמצעות מערכת degron השראת אוקסין (AID)¹⁸. בתאים המבטאים TIR1 (חלבון F-box ממקור צמחי), כל חלבון עם תג AID יהיה בכל מקום ויתפרק עם הוספת אוקסין. כאן, אנו משתמשים ב-Cdc20 מתויג AID כדי לאפשר השפלה ניתנת להשראה של Cdc20, ובכך לגרום לעצירה במטאפאזה. אוכלוסיית תאים זו מנוטרת לאחר מכן לגיוס רכיב ה-SAC המתויג Bub1-GFP לקינטוכורים, תוך שימוש בחלבון הקינטוכור המתויג Mtw1-mCherry כסמן נאמן. למרות ש-Bub1 ממלא תפקידים בלתי תלויים ב-SAC בקינטוכורות ומתמקם בקינטוכור במיטוזה מוקדמת, לוקליזציה מתמשכת של קינטוכור בתאים עצורים מאותתת על חיבורים לא תקינים של קינטוכור-מיקרו-צינוריות¹⁹. הראינו זאת על ידי טיפול בתאים עם רעל המיקרו-צינוריות, נוקודזול, המשבש את התקשרויות הקינטוכור-מיקרו-צינוריות. ניסוי זה מדגיש כיצד ניתן לחקור תהליכים ספציפיים לשלב מחזור תא מובהק באמצעות שיטות מעצר מתכווננות מאוד. אנו מדגימים עוד כי ניתן לשטוף אוקסין מתרביות cdc20-AID, מה שמאפשר שחרור לאנפאזה וכניסה למחזור תאים חדש, אם כי מניסיוננו, תרביות אלה אינן משתחררות באופן סינכרוני כמו שחרור מעצר-גורם α. שתי שיטות העצירה-שחרור הללו יעילות וקלות ליישום, אך שיטות רבות אחרות זמינות לחוקרים בשמרים לעצירת תאים בשלבים שונים של מחזור התא 20,21,22,23. פרטים נוספים על שיטות אלה ניתן למצוא בדיון.

Protocol

1. בניית זנים לניתוח והדמיה של מחזור התא

1. תכנן פריימרים לתיוג C-terminally של הגן המעניין באמצעות פלסמידים לתיוג פרינגל (פלסמידים pFA6a)²⁴. בקיצור, עיצוב פריימרים F2 ו-R1 שכאשר משתמשים בהם עם פלסמיד מסדרת pFA6a, מייצרים מוצר PCR שניתן להפוך ישירות לשמרים כדי ליצור גרסה 'מתויגת' של הגן המעניין. השתמש בזוגות הפריימרים והפלסמידים הכלולים בטבלה 1 כדי לתייג את הגנים המעניינים בפרוטוקול זה. אסטרטגיות עיצוב פלסמיד ופריימר לתיוג C-terminal של גנים שמרים מתוארות בפירוט על ידי Longtine et ^al.24.
   הערה: ניתן להשתמש בשיטה זו לייצור חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים להדמיה, או חלבונים מתויגים Auxin Inductible Degron (AID) כדי להקל על עצירת מחזור התא וניסויים אחרים המתאפשרים על ידי פירוק של חלבון מטרה¹⁸. לדוגמה, כדי לתייג את CDC20 עם תג AID (IAA7), פריימר התיוג קדימה מורכב מ-25-40 בסיסים של הגן CDC20 מיד לפני קודון העצירה, למעט קודון ה-STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), וגם את רצף מתאם Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') המצורף לקצה 3' כדי לייצר את רצף הפריימר הסופי (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
   CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccggtttaattaa 3'). פריימר התיוג ההפוך של CDC20 מכיל את ההשלמה ההפוכה של 25-40 זוגות הבסיסים מיד לאחר קודון ה-STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
   CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTA 3') ורצף מתאם Pringle Plasmid R1 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') כדי לייצר את רצף הפריימר הסופי (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
   TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). כמו כן, חשוב לציין ששימוש בפריימרים PCR קצרים מ-40 זוגות בסיסים יפחית את יעילות האינטגרציה בגנום השמרים.
2. לדלל פריימרים בביולוגיה מולקולרית בדרגת מים ל -10 מיקרומטר.
3. בצע PCR עם זוג הפלסמיד F2 ו-R1 והפלסמיד המתאים לתיוג בשיטות סטנדרטיות, בהתאם לתוכנית המחזורית התרמית הכלולה בטבלה 2, ולאחר מכן אשר את גודל מוצר ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
4. יש לחסן את זן השמרים כדי להפוך ל-25 מ"ל של תמצית שמרים, תרבית פפטון אדנין דקסטרוז (YPAD) ולגדול בן לילה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס. לבניית שמרים cdc20-AID (שיפרקו את Cdc20 עם טיפול באוקסין), הזן המותמר עשוי להכיל כבר OsTIR1 המתבטא מלוקוס חוץ רחמי, או ש-OsTIR1 עשוי להיות חוצה מאוחר יותר^{בגיל 18}.
5. למחרת בבוקר, בדוק את ה-OD600 של תרבית הלילה. אם תרבית OD <2.0 המשך לשלב 1.6. אם OD > 2.0, יש לדלל ל-~0.2-0.4 ולאפשר 2-3 מחזורי צמיחה.
6. קצור תאים ב-OD600 = ~0.4-2.0 כדי להבטיח שהם נמצאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי. קצור 5 ODs של תאים לכל טרנספורמציה (למשל, 5 מ"ל של OD600 = 1.0). אם מבצעים יותר משינוי אחד של אותו זן, ניתן לשלב תאים בשלב זה. קצור תאים על ידי צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 5 דקות ב-23 מעלות צלזיוס.
7. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את כדור התא ב-25 מ"ל מים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 5 דקות ב-23 מעלות צלזיוס.
8. השליכו את התאים הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של 0.1 M ליתיום אצטט (LiAc) והעבירו לצינורות של 1.6 מ"ל. אם מבצעים יותר מטרנספורמציה אחת, פצלו את ההשעיה מחדש של 1 מ"ל למספר צינורות (למשל, עבור 2 טרנספורמציות פיצול 2x 500 מיקרוליטר; עבור 3 טרנספורמציות פיצול 3x 333 מיקרוליטר וכו').
9. תאי צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות ב-23 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
10. הוסף את הדברים הבאים לכדור התא (בסדר זה): i) 240 μL של PEG (50%), ii) 36 μL של 1.0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 מיקרוגרם DNA של זרע סלמון מבושל מראש במשך 5 דקות, iv) 54 מיקרוליטר מים.
11. הוסף 10 מיקרוליטר של מוצר PCR (המתקבל בשלב 1.3) לתאים ולמערבולת למשך דקה אחת, וודא שהכל מעורבב היטב.
12. דגרו תאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוף רולר בחדר חם או בתרמושייקר ב-1000 סל"ד.
13. תאי הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט מים.
    הערה: זמן הלם החום האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם לרקע זן השמרים. פרוטוקול זה מותאם לרקע הזן W303.
14. תאי צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות ב-23 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה בעדינות ב-100 מיקרוליטר מים.
15. לטרנספורמציות באמצעות KanMX או בחירת תרופות אחרת, צלחו תאים ב-YPAD ודגרו את הצלחות ב-23 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העתק צלחת לצלחת תרופה למחרת.
    הערה: מתן יום של צמיחה ב-YPAD הוא קריטי כדי לאפשר ביטוי של גנים עמידים לתרופות בתאים שעברו טרנספורמציה.
16. לטרנספורמציות באמצעות סמנים אוקסוטרופיים (URA, HIS וכו'), תאי צלחת ישירות על מדיום סלקטיבי.
17. דגרו צלחות בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים כדי לאפשר למושבות טרנספורמציה של השמרים לצמוח.
18. ודא את התיוג הנכון של הגן על ידי PCR גנומי או על ידי כתמים מערביים. שיטות אלה מתוארות בפירוט על ידי ברנט²⁵ וצ'ו ואחרים²⁶.
    הערה: לייצור זנים עם אללים מתויגים מרובים, טרנספורמציה חוזרת אינה מומלצת ללא חצייה לאחור, מכיוון שטרנספורמציה יכולה להיות תהליך מוטגני. כדי לייצר את הזן המכיל Stu2-GFP ו-Spc110-mCherry, למשל, אנו ממליצים להפוך זנים בנפרד כדי לייצר Stu2-GFP ו-Spc110-mCherry, ולאחר מכן לשלב את האללים הללו לזן הפלואידי אחד על ידי הכלאת שמרים, נבגים, דיסקציה טטראדית וניתוח גנוטיפי. מידע נוסף על צלבי שמרים זמין מ-Stansfield and Stark²⁷ ו-Morin et ^al.28. כדי לבצע שחרור מעצר-שחרור של α גורמים, הזן הפלואידי המשמש חייב להיות MATa.

2. תרבית שמרים וסנכרון מחזור התא: α גורם מעצר-שחרור

1. חסנו שמרים ל-25 מ"ל של תרבית YPAD למשך הלילה ב-23 מעלות צלזיוס, כדי להיות ב-OD600 = 0.5-2.0 למחרת בבוקר.
   1. אם התאים מעל OD600 = 2.0 בבוקר, יש לדלל בחזרה ל-OD600 = 0.2-0.4 ולתת להם לגדול לפחות מחזור תאים אחד (2-3 שעות ב-23 מעלות צלזיוס).
2. לדלל תאים בחזרה ל-OD600 = 0.5 ולהוסיף גורם α לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל (מלאי 10 מ"ג/מ"ל ב-DMSO). לתאים באופן אידיאלי תהיה מוטציה bar1 (למשל bar1-1), מה שהופך אותם לרגישים יותר לגורם α. תאים מסוג BAR1 פראיים פחות רגישים לגורם α ודורשים ריכוז של גורם α שהוא לפחות בסדר גודל גבוה יותר כדי לעצור כראוי, וזה פחות חסכוני.
3. ב-2.5-3.5 שעות לאחר המעצר, בדוק את מידת המעצר על ידי ספירת אחוז התאים ללא ניצנים. כאשר 90-95% מהתאים נעצרים (נעצרים ב-G1), המשך לשחרור. התזמון ישתנה בהתאם לזן השמרים, מדיום הגידול והטמפרטורה.
4. שחררו תאים ממעצר גורם α על ידי סיבוב מטה בצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 3-5 דקות ב-23 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שפיכת סופרנטנט.
5. שטפו תאים על ידי השעיית הגלולה ב-25 מ"ל של YPAD + 1% DMSO.
6. חזור על שלבים 2.4-2.5 פעמיים בסך הכל שלוש כביסות, והחלף את הצינור המשומש פעם אחת לאחר הכביסה הראשונה.
7. הוסף YPAD לתאים כדי להביא את הנפח הסופי ל-25 מ"ל ולהעביר תאים לבקבוק חדש.
   הערה: שימוש בבקבוק חדש הוא קריטי כדי למנוע כמויות עקבות של גורם α שנותרו שעלולות למנוע את השחרור.
8. קח נקודת זמן (0 דקות) דגימה ותקן (ראה הוראות קיבוע בשלבים 4.1 עד 4.4).
9. המשך לקחת דגימות נקודת זמן כל 15 דקות אם הגידול מתרחש ב-23 מעלות צלזיוס. תזמון זה ישתנה בטמפרטורות אחרות בהתבסס על מהירות הגדילה של התאים.
10. בנקודת זמן 60 דקות, שפטו את הסנכרון של השחרור על ידי בדיקת ניצנים קטנים אחידים (גודל ניצן < 25% גודל תא אם) תחת מיקרוסקופ אור.
11. אופציונלי) 60 דקות לאחר השחרור, הוסף שוב α-פקטור לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל כדי למנוע התקדמות למחזור התא הבא. אשר שחרור תאים סינכרוני על ידי אימות מורפולוגיה אחידה של ניצנים קטנים לפני הוספה.
12. המשך לקחת דגימות נקודת זמן עד 180 דקות, או כמה זמן שתרצה. בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס, מטאפאזה מתרחשת ~45-60 דקות לאחר השחרור, אנפאזה מתרחשת ~60-90 דקות לאחר השחרור, ורוב התאים יהיו ב-G1 החדש עד 120 דקות לאחר השחרור.

3. תרבית שמרים וסנכרון מחזור התא: מעצר-שחרור דלדול Cdc20

1. חסנו תרבית לילה של שמרים ב-23 מעלות צלזיוס כדי להיות ב-OD600 = 0.5-2.0 למחרת בבוקר.
   1. אם התאים מעל OD600 = 2.0 למחרת בבוקר, יש לדלל בחזרה ל-OD600 = 0.2-0.4 ולתת להם לגדול לפחות מחזור תאים אחד (2-3 שעות ב-23 מעלות צלזיוס).
2. לדלל בחזרה ל-OD600 = 0.5 ולהוסיף אוקסין לריכוז סופי של 500 מיקרומטר ממלאי 1 M (500x) לכל התרביות. עבור תרביות המקבלות תרופות אחרות (נוקודזול), הוסף אותן במקביל לאוקסין בריכוז המתאים (למשל, ~10 מיקרוגרם/מ"ל נוקודזול).
3. שעתיים לאחר המעצר, בדוק את מידת המעצר על ידי ספירת אחוז התאים בעלי הניצנים הגדולים (ניצנים גדולים נקבעים כנוכחות של ניצן >-25% גודל תא אם). כאשר 90-95% מהתאים נעצרים במיטוזה, המשך לאיסוף דגימות או לשחרור תאים ממעצר, בהתאם ליישום הניסוי. אם 90% מהתאים לא נעצרים, אפשרו לתרבית להמשיך לגדול, ובדקו אותה כל 15-30 דקות. התזמון ישתנה בהתאם לזן השמרים, מדיום הגידול והטמפרטורה.
   הערה: לא מומלץ לאפשר למעצרים להימשך זמן רב מדי (יותר מ-4 שעות) אם משחררים, מכיוון שמעצרים ממושכים עלולים להפחית את כדאיות התאים.
4. כדי להשתחרר מעצירת דלדול Cdc20, קצרו תרבית על ידי צנטריפוגה ב-3000 x גרם למשך 3-5 דקות ב-23 מעלות צלזיוס.
5. שטפו תאים על ידי השעיית הגלולה ב-25 מ"ל של YPAD + 1% DMSO, ולאחר מכן קציר על ידי צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 3-5 דקות ב-23 מעלות צלזיוס.
6. חזור על שלבים 3.4-3.5 בסך הכל 2 כביסות.
7. הוסף YPAD לתאים כדי להביא את הנפח הסופי ל -25 מ"ל ולהעביר את התאים לבקבוק חדש.
   הערה: שימוש בבקבוק חדש הוא קריטי כדי להסיר כמויות עקבות של אוקסין שעלולות למנוע שחרור.
8. קח את נקודת הזמן 0 ותקן (ראה הוראות קיבוע בשלבים 4.1 עד 4.4).
9. המשך לקחת נקודות זמן כל 10-15 דקות למשך הרצוי של מהלך הזמן. בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס, רוב התאים היו משתחררים מהמעצר לאחר 50-70 דקות.
   הערה: תאים אינם משתחררים באופן סינכרוני ממעצר דלדול Cdc20 זה כפי שהם משתחררים עם מעצר גורם α. עם זאת, זה יכול להיות שימושי לחקור אירועי אנפאזה או יציאה מיטוטית. בנוסף, מגבלה טכנית של מעצר-שחרור זה היא שבנקודות זמן מאוחרות יותר לאחר השחרור, קשה יותר להבדיל בין תאי מטפאזה שעדיין לא השתחררו לבין התאים שהשתחררו מוקדם יותר והגיעו למטאפאזה של מחזור התא הבא שלהם. במידת הצורך, ניתן להתגבר על כך על ידי ביצוע הדמיית תאים חיים כדי לעקוב אחר תאים בודדים כשהם משתחררים מהמעצר או על ידי הוספת גורם α לתרבית (בהנחה שהתאים הם MATa) כדי לעצור תאים ב-G1 לאחר יציאה מיטוטית.

4. קיבוע שמרים

1. צנטריפוגה 1 מ"ל (או 0.5-1.5 ODs) של תרבית למשך דקה אחת במהירות מקסימלית (~20,000 x גרם) ב-23 מעלות צלזיוס.
2. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-500 מיקרוליטר של תמיסה מקבעת (3.7% פורמלדהיד ב-0.1 M אשלגן פוספט (KPi) pH 6.4).
3. דגירה של תאים בתמיסה המקבעת למשך 2-15 דקות בשעה
   23 מעלות צלזיוס. לניסויים במסלול הזמן, בדרך כלל מומלץ לתקן תאים למשך 15 דקות כדי ליישר את התזמון של תאי צנטריפוגה בעת לקיחת דגימות.
   הערה: יש לבצע אופטימיזציה של תזמון הקיבוע עבור פלואורופורים וחלבונים ספציפיים מעניינים.
4. תאי צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות מקסימלית ב-23 מעלות צלזיוס, שואבים את הסופרנטנט ומרחפים ב-500 מיקרוליטר של 0.1 M KPi (pH 6.4). ניתן לאחסן תאים ב-KPi בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לצילום.
   הערה: אות פלואורסצנטי קבוע של תאים יכול להימשך עד שבועיים, תלוי בפלואורופור, עם זאת, לכימות אותות פלורסנט, אסוף תמונות תוך 7 ימים.

5. הכנת שקופיות להדמיה

1. כאשר מוכנים לצילום, תאי צנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות מקסימלית ב-23 מעלות צלזיוס והשליכו סופרנטנט. השעיה מחדש של תאים ב-10-100 מיקרוליטר של תמיסת טריטון/DAPI/סורביטול (1.2 M סורביטול, 1% טריטון, 0.1 M KPi, pH 7.5, 2 מיקרוגרם/מ"ל DAPI).
2. פיפטה ~ 0.8 מיקרוליטר של תאים ישירות על כיסוי נקי. השתמש בקצה פיפטה כדי לפזר בעדינות את טיפת התא^לעיגול בגודל של כ-1 ס"מ 2 במרכז הכיסוי.
3. הנח את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופיה. השתמש ב-Kimwipe כדי ללחוץ בעדינות סביב השקף כדי לפזר את הדגימה.
4. אטום את שולי הכיסוי בעזרת לק.
5. ניתן לאחסן במקום קריר וחשוך עד 4-6 שעות לפני ההדמיה כדי לעזור לתאים להתייצב ולמנוע תנועה עודפת.

6. הדמיה

1. קח את ההחלקה למיקרוסקופ המצויד באובייקט שמן 60x/1.42 וסט לייזר ומסננים אדום, ירוק, כחול, אדום רחוק. ניתן להשתמש גם ביעדי הגדלה גבוהים יותר (עד פי 100).
2. מקד את המיקרוסקופ בתאי השמרים המודבקים לכיסוי.
   הערה: אם תאי שמרים זזים יותר מדי, ניתן להשאיר את השקופיות במקום חשוך וקריר למשך 20-60 דקות להתייצב.
3. ברגע שהשמרים נמצאים בפוקוס, כוונן את הגדרות החשיפה של כל ערוץ כדי לייצר יחס אות לרעש של לפחות 3:1, מה שמבטיח שאף פונקטה פלואורסצנטית לא תיחשף יתר על המידה.
   הערה: לדוגמה, במערכת הדמיה שאנו משתמשים בה עם מצלמת CMOS מדעית, תוך שימוש בשמן אובייקטיבי וטבילה בגודל 60x 550 עם מקדם שבירה של n = 1.516, הגדרת האות המקסימלי של הערוץ האדום ל-1000-2000 au, הערוץ הירוק ל-3000 au, הערוץ הכחול ל-3000 au וערוץ ה-DIC ל-4000-5000 au מייצר תמונות באיכות גבוהה.
4. התאם את הגדרות הרכישה כך שייקח 14-20 ערימות Z של 0.2 מיקרומטר כדי להשתרע על פני 2-4 מיקרומטר בסך הכל.
5. עבור מיקרוסקופים המצוידים במודולים לאחר עיבוד, בחר Deconvolution ו-Quick Projection עבור כל ערימה.
6. אסוף ערימות Z של תאים, וצלם מספיק תמונות כדי ללכוד ~100-200 תאים עבור כל מצב או נקודת זמן.
7. עיין בקובץ המשלים 1 לקבלת הוראות תוכנה עם צילומי מסך מתוכנת ההדמיה.

7. ניתוח תמונות

1. פתח תמונות מוקרנות ב-ImageJ והתאם את הבהירות והניגודיות כדי להציג ערוצים שונים. אם למיקרוסקופ המשמש להדמיה אין מודולים לאחר עיבוד, בצע הקרנה מקסימלית של ערימות ה-Z בשלב זה.
2. כדי לקבוע את התקדמות מחזור התא, ספור 100 תאים לנקודת זמן וסווג אותם כמכילים גרעין אחד או שניים. לחלופין, חשב את אורך הציר או המרחק בין גופי קוטב הציר כדי להגדיר את מצב מחזור התא. המרחק בין מוקדי Spc110 < 1.5 מיקרומטר תואם לתאי מטפאזה, והמרחק > 1.5 מיקרומטר תואם לתאי אנפאזה.
3. כדי לחשב עוצמות של פונקטה חלבונית (למשל, Stu2-GFP), השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר סביב גבול האות המעניין. הוסף אות זה למנהל החזר ההשקעה (אזור עניין) על ידי לחיצה על T או שימוש בתפריט. במנהל ההחזר על ההשקעה , בחר מדידה כדי לחשב את העוצמה של כל פונקטה שנבחרה. כדי להציג שינויים באות הפונקטה לאורך זמן, התווה עוצמה ממוצעת עם רווח בר-סמך של 95% בגרף קו עבור כל נקודת זמן.
4. כדי לחשב את אחוז התאים עם פונקטה Bub1-GFP, ודא שהגדרות הבהירות המינימלית והמקסימלית של הערוץ הירוק זהות בתמונות שונות. תאים עם פונקטה Bub1-GFP המראים חפיפה עם פונקטה Mtw1-mCherry נספרים כ-Bub1 הממוקם בקינטוכור; אחרת, התא נספר כשלילי. ספור ~100 תאים לכל תנאי. Aravamudhan et ^al.29 מכיל מידע נוסף על לוקליזציה של Bub1 לקינטוכורים.
5. כדי לחשב את אחוז התאים החד-גרעיניים בעלי ניצנים גדולים, ספרו את מספר התאים עם ניצן גדול וגרעין אחד (אות DAPI אחד) באוכלוסייה וחלקו במספר התאים הכולל.
6. עיין בקובץ המשלים 1 לקבלת הוראות התוכנה עם צילומי מסך מתוכנת ההדמיה.

Results

ניתוח שינויים בלוקליזציה של חלבון תלוי מחזור התא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכול להתבצע בקלות באמצעות השיטות שאנו מתארים כאן. הקבוצה שלנו מתעניינת זה מכבר בוויסות ובתפקוד הדינמי של הציר המיטוטי. בשמרים, גופי קוטב ציר (המסומנים על ידי רכיב Spc110) מתפקדים כמרכזי ארגון מיקרו-צינוריות שמהם נובעים חוטי מיקרו-צינוריות ליצירת מבנה הציר המיטוטי³⁰. חלבון קושר המיקרו-צינורות, Stu2, ממלא תפקיד ביצירת ציר על ידי פילמור מיקרו-צינורות

Discussion

שימוש בסנכרון מחזור התא בשמרים ניצנים מאפשר לחקור מנגנונים חשובים למגוון תהליכים תאיים. השימוש בשחרור מעצר G1 עם טיפול α גורמים מאפשר התקדמות סינכרונית של אוכלוסיית תאים בשלבי מחזור התא, וכפי שהראנו, יכול לחשוף דפוסי לוקליזציה דינמיים של מווסתים תאיים כמו Stu2³⁶. ניתן לבצע עצירות מחזור תא גם באמצעים גנטיים באמצעות דלדול מווסתי מחזור התא כמו Cdc20, המשמש לעצירת תאים במטאפאזה. זה מאפשר הערכה של תהליכים ספציפיים למיטוזה, כמו גיוס Bub1 לקינטוכורים בהיעדר מתח ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-גורם	מתקן הסינתזה המרכזית של אוניברסיטת יוטה		רצף: WHWLQLKPGQPMY
צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל	אקסיגן	MCT-175-C
תערובת dNTP של 10mM	תרמו-סיינטיפיק	R0193
צינורות קוניים של 50 מ"ל	גריינר ביו-וואן	227 261
5x בופר תגובת Phusion HF	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	B0518S
חומצה אצטית, קרחונית	פישר כימיקל	BP2401C-212
מלח המיסולפט אדנין	סיגמא-אלדריץ'	A9126-100G
אגר, גרגר	כימיקלים ותגובות של אפקס	20-275
אגרוזה	אפקס ביוריסרץ' פרודקטס	20-102GP
אוטוקלב Amsco Century Steam Strailizer	סטריס	SV-1262
מי DI מאוטוקליבים
אוקסין	סיגמא-אלדריץ'	קטגוריה#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
נוזל לייזר קרגיל	מעבדות קרג'יל	20130
D-סורביטול	סיגמא-אלדריץ'	S1876-500G
DAPI (40,6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)	גשושיות מולקולריות	Cat#D1306
מלח נתרן מחומצה דאוקסיריבונוקלאית מאשכי סלמון	סיגמא-אלדריץ'	D1626
דקסטרוז	פישר כימיקל	D16-10
די-סודיום אתילנדיאמין טטראצטט	פישר כימיקל	S811-10
DMSO	תרמו-סיינטיפיק	20688
FIJI/ImageJ2 לעומת 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
מערבל מערבולת במהירות קבועה	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי DV Ultra	לייקה	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	סריאל #: NV01063. לא נתמך עוד
פורמלדהיד	פישר כימיקל	Cat#F79-500
מכשיר ג'ל	תרמו-סיינטיפיק	אול איזיקאסט B1
תערובת סולם DNA של GeneRuler	פרמנטאס	SM0333
חרוזי זכוכית	פישר סיינטיפיק	11312A
שקופיות זכוכית	VWR	48300-026
מנער פלטפורמה אינובה 2300	ניו ברונסוויק	NB-2300
קימווייפס	קימטק	06-666
צנטריפוגה מעבדה לצינורות 1.5 מ"ל	אפנדורף	2525
צנטריפוגה מעבדה לצינורות 50 מ"ל	אפנדורף	5804
ליתיום אצטט דיהידרט	סיגמא-אלדריץ'	L4158-250G
מאסטר סייקלר נקסוס X2	אפנדורף	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
מיקרופיפטות p2, p20, p200 ו-p1000 והקצוות המתאימים	ריינין	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12541014
נוקודאזול	קלביוכימיה	Cat#487928; CAS: 31430-18-9; מגרש#B35705
אורנג' G	סיגמא-אלדריץ'	O7252
יתד	המפטון ריסרץ'	HR2-591
פפטון גרעיני	ביוריאגנטים של פישר	BP9725-5
פולימראז DNA של פיוזיון HF	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0530L
פיפט-X	ריינין	PX-100R
פוספט אשלגן, די-בסיסי	תרמו-סיינטיפיק	424195000
פוספט אשלגן, מונובסיסי	תרמו-סיינטיפיק	424200025
מקור כוח	ביו-ראד	23786
Start Acquire Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	השגה עם DV Ultra
בסיס טריס	ביוריאגנטים של פישר	BP152-10
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ'	9002-93-1
סיבוב צינורות	VWR	10136-084
אמבט מים	VWR	WBE10A11B
מים, אולטרה טהור	אפקס ביוריסרץ' פרודקטס	18-194
תמצית שמרים גרנולטיבית	ביוריאגנטים של פישר	BP9727-5