מאמר שיטה

הליך פשוט ויעיל להמוסטזיס בעורקי עכבר

391 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

28 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה שואף לפתח שיטה יעילה להשגת המוסטזיס בעורקי עכבר.

תקציר

במהלך ניקוב עורקי או קנולציה בעכברים, לעיתים נדרשת קשירת עורק קבועה בשל קושי בהשגת המוסטזיס לאחר משיכת המחט. דבר זה מוביל לפציעה איסכמית קבועה באזור הרקמה המסופקת. איסכמיה מקומית כזו גורמת לעיתים קרובות לסיבוכים משניים, ופוגעת בתוצאות הניסוי במודלים בעלי חיים. השיטה הנוכחית שואפת לאטום את אתר הניקוב לאחר ההליך תוך שמירה על זרימת דם תקינה, ובכך למנוע איסכמיה לאחר הניתוח. שיטה זו כוללת קצירת קטע רקמת שומן מהחיה הניסיונית, ביצוע ניקוב עורקי בטכניקות סטנדרטיות, ואז עטיפת אתר הדקירה עם כרית השומן להשגת המוסטזיס תוך שמירה על זרימת הדם. במחקר זה בוצעה ניקוב דו-צדדי בעורק קרוטיד משותף בעכברים, ואחריו בוצעה המוסטזיס בטכניקת עטיפת שומן. הלם ניגוד בלייזר עם נקודות (LSCI) לא גילה הבדלים בשינויים בזרימת הדם המוחי בין קבוצות העכברים המדומה והמנותחים, ולא נצפו שינויים משמעותיים במדידות זרימת דם מוחית לפני הניתוח לעומת אחריו בקבוצת הניתוח. הערכה היסטולוגית שבוצעה ב-7, 14 ו-28 ימים לאחר הניתוח הראתה כי: (1) שמירה על מבנה המוח (צביעת H&E), (2) מורפולוגיה עצבית שלמה ללא שינויים ניווניים (צביעת Nissl), ו-(3) היעדר שינויים פתולוגיים בחתכי המוח. טכניקת המוסטזיס עורקי זו מנצלת את אופיו הגמיש של רקמת השומן ואת מנגנוני הקרישה הפיזיולוגיים. ההליך כולל: (1) עטיפת שומן אוטולוגי סביב אתר הניקוב, (2) אבטחתו בתפרים כדי להבטיח מגע מיטבי עם האדוונטיציה העורקית, ו-(3) מתן אפשרות לדם הבורח לחדור לממשק העורק השומני שבו הוא עובר קרישה. מנגנון הפעולה המשולשת הזה משיג המוסטזיס אמין תוך שמירה על פטנטיות העורקים ומניעת סיבוכים איסכמיים לאחר הניתוח. השיטה מדגימה פשטות פרוצדורלית בולטת, יעילות קלינית ופוטנציאל תרגומי מצוין.

מבוא

במודלים של בעלי חיים, יצירת פגיעה עורקית היא גישה ניסיונית בשימוש נרחב למידול מצבים פתולוגיים שונים, כולל מודלים של איסכמיה-ריפרפוזיה מוחית, מודלים של טרשת עורקים קרוטיד (CCA) או אאורטלית (AO), ומודלים של איסכמיה של חוט השדרה.

אם ניקח לדוגמה את מודל MCAO איסכמיה מוחית של עכברים, גישת המידול הסטנדרטיתהנוכחית 1,2,3 כוללת: בידוד עורק התרדמה החיצוני (ECA), קשירת קצהו הדיסטלי, הידוק ה-ECA הפרוקסימלי עם קליפס עורקי תוך הנחת תפר קבוע, יצירת חור דקירה בין נקודות אלו, הכנסת חוט רטרוגרדית דרך ה-CCA, אבטחת כלי הדם והחוט עם תפר הסטאר, חיתוך ה-ECA בין אתר הדקירה לקשירה הדיסטלית, שחרור הקליפ העורקי, הפניית הסיב לעורק הקרוטיד הפנימי (ICA) כדי לחסום את העורק המוחי האמצעי, ובעת משיכת החוט, קשירת ה-ECA הפרוקסימלי.

למרות שההליך הזה משיג רפרפוזיה, הוא משיב רק את זרימת הדם בין ה-ECA ל-ICA, ומשאיר את ה-ECA מנותק לצמיתות. כריתת ECA זו גורמת לנזק איסכמי לאזורי הפנים השני-צדדיים, פציעה לא מכוונת שלא רק מסבכת את ההליך אלא גם מביאה טראומה מבלבלת לבעלי חיים ניסיוניים, ועלולה לסכן את תוצאות המחקר. מדאיג יותר, בפרוטוקולים ניסיונייםמסוימים 4,5, החוקרים מבצעים ניקוב CCA ישיר, תופר מוכנס לקביעת ה-MCAO, ואז מוסר מיד, ואחריו קשירה קבועה בשני קצות אתר הדקירה להמיסטזיס. עם זאת, שיטה זו מעלה ישירות את לחץ כלי הדם, ובכך מעלה את העומס הלחיתי של הלב ועלול להוביל לאי ספיקת לב6.

באמצעות מודל פציעת אנדותל עכבר CCA או AO עם תזונה עתירת שומן להוכחת טרשת עורקים כדוגמה, השיטה הקונבנציונלית 7,8,9,10 כוללת ביצוע ניקוב עורקי ב-CCA, אאורטה בטנית (AA) או עורק ירך (CFA), הכנסת קטטר בלון לגרימת הסרת אנדותליה, והשגת המוסטזיס על ידי קשירה קבועה של שני קצות אתר הניקוב. גישה סטנדרטית זו מציבה מספר מגבלות קריטיות: ההתחייבות ההכרחית יוצרת איסכמיה מקומית דיסטלית לאתר החסימה. באופן מזיק יותר, הצטברות שומנים מתרחשת באתרי הקשירה. תוקף מודל הפשרה משתנה על ידי השפעה על ההמודינמיקה המקומית, מה שמפריע להעברת התרופות למיקוד בנגעים ומעוות את תוצאות ההערכה הפרמקולוגית.

במודל איסכמיה של חוט השדרה בעכברים, ההליך כולל ניקוב עורקי (באמצעות גישה ל-CCA, AA או CFA) ואחריו הכנסת קטטר בלון ליצירת איסכמיה במיקומים הממוקדים11. לאחר משיכת הבלון, המוסטזיס קונבנציונלי מושג על ידי קישור דו-צדדי קבוע של אתר הניקוב.

בכל שלושת המודלים שהוזכרו, המוסטזיס לאחר הדקירה מושג באופן אחיד באמצעות קשירה דו-צדדית של אתר הניקוב. למרות ששיטה זו יעילה לשליטה בדימום, היא גורמת בהכרח לאיסכמיה מקומית, מה שמוביל לסיבוכים משניים שמפגעים בסופו של דבר בתוקף המודל. לכן, שמירה על הפטנסיות הוסקולרית במהלך הליכים המוסטטיים היא קריטית פיזיולוגית וניסיונית. לכן, מאמר זה מציג שיטה חדשנית, פשוטה ויעילה להמסטזיס עורקי לניסויים בעכברים. ההליך כולל תחילה הידוק שני קצות אתר הדקירה באמצעות קליפים כלי דם עורקיים, ואז עטיפת העורק בכרית שומן בגודל 3 מ"מ × 3 מ"מ × 1 מ"מ כדי לכסות את הנקבה. כרית השומן מאובטחת במקומה באמצעות תפר קשורה סביב העורק. הקליפים העורקיים משתחררים בהדרגה, וההידוק של הריגטורה מותאם בהתאם לדימום עד להשגת המוסטזיס מלא. גישה זו משחזרת את זרימת הדם, שומרת על המודינמיקה תקינה ומונעת נזק איסכמי לרקמות הסובבות הנגרם מקשירת כלי דם קבועים. הוא מועיל במיוחד לתצפיות ארוכות טווח לאחר המודלים של מצבי עכברים ולהערכת התערבויות פרמקולוגיות, ובכך משפר משמעותית את רמת הדיוק הניסיוני של מחקרים פרה-קליניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם בקפדנות להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (אישור פרוטוקול מס' SNLL25040501; רישיון שימוש בבעלי חיים מספר SYXK(Liao)2021 - 0010) שהוקם על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) של אוניברסיטת שניונג החקלאית. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

  1. פרטי ותיעוד בעלי חיים: תעד את כל נתוני המחקר על בעלי החיים בהתאם להנחיות ARRIVE (מחקר בעלי חיים: דיווח על ניסויים בחיים החיים). השתמש בעכברי Balb/C זכרים בגיל 6-8 שבועות, במשקל 22 גרם ± 4 גרם. שמרו על תנאי מגורים בטמפרטורה של 24 ± 2 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 55% ± 5% במחזור אור/חושך של 12 שעות.
  2. הכנה לבעלי חיים
    1. הרדימו את העכברים באמצעות מכשיר אידוי איזופלוראן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). השרה הרדמה עם 4% איזופלורן, ואז לשמור על 2% איזופלורן.
    2. לאחר ההרדמה, יש לנקות את אזורי צוואר הרחם והגולגולת ולחטא את העור החשוף עם פובידון-יוד, ולאחר מכן 75% אתנול להסרת השאריות.
    3. הניחו את העכברים על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס לכל ההליכים הניסיוניים הבאים.
  3. מדידת זרימת דם מוחית בסיסית בעכברים
    1. מקם את העכברים בתנוחת שכיבה. בצע חתך באמצע הקרקפת כדי לחשוף את עצמות הפריאטל. נתח בזהירות והסר את שכבת הפאשיה העליונה מפני הגולגולת.
    2. כוונו את מערכת ה-LSCI לסרוק את עצם הפריאטל החשופה של העכבר בהגדלה פי 10, ורשמו את נתוני זרימת הדם הבסיסיים במוח.
  4. קצור את כרית השומן וביצוע דקירה בעורקים
    1. החזירו את העכברים למצב שכיבה. תעשה חתך צוואר הרחם באמצע. קצור שתל רקמת שומן תת-עורית בגודל 3 מ"מ × 3 מ"מ × 1 מ"מ לשימוש מאוחר יותר.
    2. בצע ניתוח קהה של בלוטת התת-לסת, שריר סטרנוהיואיד ושריר סטרנוקליידומסטואיד. חשפו את שני ה-CCA.
    3. שחררו את ה-CCA לחשוף את ה-ICA וה-ECA.
    4. מרח את מהדק כלי הדם 1 בקצה הדיסטלי של ה-CCA, והניח את הקלמפ הווסקולרי 2 בקצה הפרוקסימלי.
    5. נקב את ה-CCA בין שני הקליפים באמצעות מחט של 23G.
  5. מניחת כרית השמן
    1. לאחר הסרת המחט, עטוף את ה-CCA באזור הדקירה עם משטח החיתוך (צד שאינו סרוזה) של כרית השומן.
    2. יש להניח תפר 4-0 מתחת לאזור העטוף בשומן; לאחר מכן קשור זריקה אחת בעדינות על פני השטח השמן כדי להפעיל לחץ למגע בטוח בין כרית השמן לדופן הכלי; לבסוף, כוונן את הקשורה בהדרגה כדי להשיג איזון לחץ להמיסטזיס.
    3. הרימו את ה-CCA הדיסטלי עם מטוש צמר גפן לח. שחררו את המהדק הווסקולרי 1 ומשכו לאט את המטוש כדי לאפשר זרימת דם הדרגתית לכיוון אתר הנקיר.
    4. בדוק זרימת דם; אם נצפתה דימום פעיל, יש להדביק מחדש את ה-CCA הדיסטלי עם קלאמפ וסקולרי 1.
    5. המתינו דקה אחת, ואז שחררו לאט את הקלמפ הווסקולרי 1; אם מתרחש דימום, יש למקם מחדש את כרית השומן או להדק מעט את הזריקה היחידה של הליגטורה כדי להעלות את הלחץ; המשך בהתאמות אלו עד להשגת המוסטזיס מלא.
    6. הרם את ה-CCA הפרוקסימלי עם מטוש כותנה לח. שחרר את הקלמפ הווסקולרי 2 ומשך בהדרגה את המטוש כדי לאפשר זרימת דם מבוקרת לכיוון אתר הניקוב.
    7. אם מתרחש דימום, לחץ מחדש את ה-CCA הדיסטלי עם מהדק וסקולרי 2.
    8. להדק מעט את הזריקה היחידה של התפר כדי להגדיל את הלחץ; המתינו דקה אחת, ואז הרימו את ה-CCA הפרוקסימלי ושחררו את הקלמפ הווסקולרי 2; גלגל לאט את מטליית הכותנה הרטובה לכיוון אתר הנקבה.
    9. אם הדימום נמשך, חזור על שני השלבים הקודמים עד להשגת המוסטזיס מלא.
    10. הניחו זריקת נוספת עם התפר ליצירת קשר כפול מעל הראשונה, ובכך מייצבים טוב יותר את כרית השומן לדופן כלי הדם ומקבלים המוסטזיס באמצעות לחצים תוך-וסקולריים וחיצוניים מאוזנים.
    11. לאשר כי העורקים הקרוטידיים המשותפים משני צידי כרית השומן היו מלאים ומציגים קוטר כלי דם עקבי; תחשבו על זה כשיקום זרימת דם מוצלח והמוסטזיס.
    12. חזור על אותו הליך לביצוע המיסטזיס דקירה בעורק הקרוטיד הנפוץ הנגדי.
    13. חשפו את העורקים הקרוטידיים הדו-צדדיים המשותפים בעכברים מזויפים ללא ביצוע דקירה או עטיפת כרית שומן, תוך שמירה על כל שאר ההליכים זהים לאלו של קבוצת הניתוח.
    14. תפרו את החתך הכירורגי בצוואר הרחם ומרחו חומר חיטוי.
  6. ביצוע הערכת זרימת דם מוחית לאחר ניתוח
    1. לאחר השלמת המוסטזיס הדוקר הדו-צדדי של CCA בעכברים, כוונן את מערכת ה-LSCI לסרוק את עצם הפריאטלית החשופה ולצלם תמונות מוגדלות פי 10; ואז לתעד את השינויים בזרימת הדם במוח.
    2. תפרו את חתך הקרקפת ומרחו חומר חיטוי, אפשרו לעכברים להתאושש על כרית חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני החזרתם לכלוב המגורים להמשך טיפול.
  7. ביצוע ניטור לאחר הניתוח ואיסוף רקמות
    1. יש לעקוב ולתעד מדי יום את מצב ההישרדות, הפעילות המוטורית וכל סימן לדימום באזור צוואר הרחם של העכברים במהלך התקופה שלאחר הניתוח.
    2. בימים שלאחר הניתוח 7, 14 ו-28, יש להמתים את העכברים עם פחמן דו-חמצני (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) ותקבע את רקמות המוח ב-4% פאראפורמלדהיד.

2. בדיקה פתולוגית

  1. לאחר קיבוע של 24 שעות, ייבשו את רקמות המוח דרך גרדיאנט אתנול, מנקים עם קסילן, והטמיעו בפרפין לחתך.
  2. לבצע צביעת H&E על קטעי ההיפוקמפוס ולבדוק את מורפולוגיית רקמת המוח תחת מיקרוסקופ.
  3. לבצע צביעת Nissl על קטעי היפוקמפוס ולבדוק את הארכיטקטורה הנוירונית תחת מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח נתוני הדמיית הניגודיות בלייזר ספקל לפני ואחרי הניתוח ומדידות הפרפוזיה היחסיות בשתי הקבוצות המדומות והניתוחות לא הראה שינויים משמעותיים, מה שהראה כי טכניקת המוסטזיס העורקי הזו הצליחה לאטום את אתר הנקבה בעורק הקרוטיד הנפוץ מבלי לפגוע בזרימת הדם המוחית (איור 1).

העכברים בקבוצת הניתוח נבדקו ברציפות במשך 28 ימים לאחר הניתוח, ללא תמותה. הפעילות המוטורית שלהן לא הראתה הבדלים בהשוואה לקבוצת השמה או לרמות הבסיס שלהם לפני הניתוח, ולא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במודלים של MCAO, שימור ה-ECA משחזר טוב יותר את הפתולוגיה הקלינית על ידי מניעת נזק איסכמי לפנים הקשור לקשירת ECA וניתוק. בעוד שהגישה המקובלת של הכנסת סיבים באמצעות ניקוב CCA מציעה פשטות טכנית, היא דורשת קשירה דו-צדדית של אתר הניקוב, מה שמוביל לפרפוזיה מוחית התלויה במחזור הדם הצידי Circle of Willis, ייצוג לא אופטימלי של פתופיזיולוגיה אמיתית של שבץ. טכניקת ההמוסטזיס של כרית השומן שהוצגה במחקר זה מאפשרת תיקון וסקולרי בו-זמני ושיקום זרימת הדם בעת הסרת התפרים, ובכך מבטיחה פרפוזיה מקבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי של מנהל המכס הכללי (מענק מס' 2005HK006) תחת הכותרת "מחקר ופיתוח ויישום טכנולוגיית זיהוי פתוגנים מרובי פלטפורמות למחלות זיהומיות מועברות וקטורים באזורים הגבוליים של צפון סין". ועבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית המו"פ המרכזית הלאומית של סין (מענק מס' 2022YFC2302700) ותוכנית שיתוף הפעולה הבינלאומית למדע וטכנולוגיה של משרד המדע והטכנולוגיה (מענק מס' KY201901014). הפיתוח המוצלח של שיטת המוסטזיס העורקי הזה חייב תודה עמוקה לפרופסור פרי (עורך ראשי של The Perry Manual of Mouse Experiments) על ההכוונה המומחית שלו ולחברת RWD Life Science Co., Ltd. (שנזן) על סיפוק מערכת הדמיית הניגודיות בלייזר. הוענקה תודה כנה לפרופסור האן שיאוהו, המנטור שלנו, ולחברת Shenyang Biohao Biotech Co., Ltd., על תמיכתם היקרה. הערכה כנה מובעת גם לכל התורמים שאפשרו מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-0 עם מחט חוט תפירהשנחאי פודונג ג'ינחואן לציוד רפואי בע"מ
עכבר Balb/Cבייג'ינג חואפוקאנג ביוטכנולוגיה בע"מ6-8 שבוע, זכר
תנור חימום וייבוש מסדרת DHGחברת Shanghai Yiheng Technology בע"מDHG-9123A
המטוקסילין ואאוסין (H&) ה) ערכת צביעה ברזולוציה גבוההסרוויסביוG1076-500ML
איזופלוראןחברת טכנולוגיית החיים של שנזן רויוודה בע"מR510-22
מנתח לייזר ספקלחברת טכנולוגיית החיים של שנזן רויוודה בע"מRFLSI ZW
תמיסת צבע NisslסרוויסביוG1036-100ML
מכונת הטמעה ארגוניתלייקהHistoCore Arcadia H
מערכת הדמיה בסריקת שקופיותשנגצ'יאנג טכנולוגיה בע"מSQS-40R
מכונת הרדמה לבעלי חיים קטניםחברת טכנולוגיית החיים של שנזן רויוודה בע"מR500
מייבש רקמותלייקהפנינת היסטוקור
מערכת מים אולטרה-טהוריםתרמו50132370
מיקרוטום חצי-אוטומטי דק במיוחדלייקהHistoCore MULTICUT

מקורות

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Laser Speckle Imaging

מאמרים קשורים