בדיקת רעילות התפתחותית המבוססת על ניטור בזמן אמת של שיבוש אותות גורם גדילה פיברובלסטים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Koki Murayama; Kashu Mizota; Rieko Matsuura; Yusuke Okubo; Yoshihiro Nakajima; Atsushi Suzuki; Junji Fukuda

doi:10.3791/68910

מאמר שיטה

בדיקת רעילות התפתחותית המבוססת על ניטור בזמן אמת של שיבוש אותות גורם גדילה פיברובלסטים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

956 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68910

⸱

10 באוקטובר 2025

Koki Murayama¹^,² , Kashu Mizota¹^,² , Rieko Matsuura² , Yusuke Okubo² , Yoshihiro Nakajima³ , Atsushi Suzuki¹ , Junji Fukuda¹^,⁴

¹Faculty of Engineering, Yokohama National University, ²Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, ³Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), ⁴Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו מציגים בדיקת תאים במבחנה לזיהוי כימיקלים טרטוגניים. הדינמיקה של איתות גורם גדילה פיברובלסטים (FGF) / גורם תגובה בסרום (SRF) נמדדה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPS), והסיכון לטרטוגניות הוערך על ידי כימות שיבוש כימי של מסלול איתות זה.

תקציר

רעילות התפתחותית (Devtox) מוערכת בדרך כלל במודלים של בעלי חיים. עם זאת, ישנם אתגרים בהבטחת דיוק, כגון שליליות כוזבות עקב הבדלים בין מינים וחששות אתיים לגבי רווחת בעלי חיים. לכן, יש צורך במערכות בדיקה חדשות כדי להעריך Devtox אנושי ולעזור לטפל בבעיות אלו. שיערנו כי טרטוגנים משבשים מסלולי איתות הקשורים ל-Devtox החיוניים למורפוגנזה, ללא קשר ליעדים המולקולריים שלהם. כדי לבחון השערה זו, פיתחנו מערכת דיווח על גורם גדילה פיברובלסטים (FGF) המשתמשת בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPS). מערכת זו מאפשרת כימות של שיבוש אותות הנגרם על ידי כימיקלים, ומשיגה שיעור דיוק של 83% עבור תרכובות טרטוגניות ולא טרטוגניות ידועות. מכיוון שפעילות איתות Devtox משתנה עם הזמן, חשוב ללכוד את הדינמיקה שלה באופן רציף ולא למדוד בנקודת קצה אחת. השימוש במערכת מדידת זוהר בזמן אמת הוא אופציונלי, אך הוא משפר את הרזולוציה הזמנית בפחות עבודה. ניתן להשלים את הבדיקה כולה תוך שבוע, החל מזריעת תאים בצלחת תרבית ועד לרכישת נתוני זוהר.

מבוא

כימיקלים מסוימים גורמים לרעילות התפתחותית (Devtox), כולל עיכובים בגדילה, מומים, ליקויים תפקודיים ומוות¹. הערכת Devtox חיונית כדי להבטיח את בטיחותם של תרופות וחומרי הדברה². בדיקות Devtox הנוכחיות מסתמכות בדרך כלל על מודלים מרובים של בעלי חיים. עם זאת, בשל הבדלים בין מינים, למודלים של בעלי חיים יש מגבלות מובנות בעת אקסטרפולציה של תוצאות לבני אדם³. תלידומיד, תרופה רעילה התפתחותית ידועה, נרשמה לראשונה לנשים בהריון בסוף שנות ה-50 כדי להקל על בחילות בוקר. למרות שטרטוגניות לא נצפתה במכרסמים, מומים חמורים בגפיים בילודים אנושיים דווחו ברחבי העולם. טרגדיה זו הדגישה את המגבלות של בדיקות בטיחות מבוססות בעלי חיים והניעה מאמצים בינלאומיים להציג ולשנות את הנחיות בדיקות Devtox⁴. בנוסף, ישנם חששות הקשורים לרווחת בעלי חיים, כמו גם לזמן ולעלות המשמעותיים הנדרשים לניסויים בבעלי חיים. לכן, יש צורך במבחני מבחנה חלופיים שיכולים לחזות במדויק Devtox אנושי⁵.

כאן, אנו מציעים בדיקה חוץ גופית להערכת רעלים התפתחותיים על סמך שיבוש מסלולי איתות שהם קריטיים להתפתחות עוברית ^6,7,8. הבדיקה מבוצעת באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) שהונדסו גנטית כדי לבטא NanoLuc luciferase (Nluc), גן מדווח זוהר, תחת שליטת אלמנט תגובת הסרום (SRE). ה-SRE הוא אתר הקישור לגורם התגובה בסרום (SRF), גורם שעתוק במסלול האיתות של גורם הגדילה הפיברובלסטים (FGF). SRF משלב אותות מליגנדים מרובים ומווסת את הביטוי של יותר מ-200 גנים הממלאים תפקידים חיוניים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התפתחות עוברית⁹.

בבדיקה זו, תאי המדווח נחשפו לכימיקל בדיקה ועוררו עם FGF כדי להפעיל איתות ולהגביר כל הפרעה של הכימיקל. מאפיין מרכזי של בדיקה זו הוא לכידת הדינמיקה של פעילות האיתות כאשר עוצמת הזוהר משתנה. מכיוון שפעילות האיתות משתנה עם הזמן, מדידות נקודות קצה בנקודת זמן אחת יכולות להיות לא מדויקות¹⁰. ואכן, מדידות בשבע נקודות זמן לאורך תקופה של 24 שעות הראו דיוק ניבוי משופר, עם ערך שטח מתחת לעקומה (AUC) של 0.837.

ניתן ליישם כימיקלים לבדיקה במגוון רחב של ריכוזים, מ-0.01 ננוגרם/מ"ל עד 1000 מיקרוגרם/מ"ל, תלוי בציטוטוקסיות ובמסיסות. נדרשים כ -1.4 × 10⁴ תאים כדי לזרוע צלחת אחת של 96 בארות. מגבלה של בדיקה זו היא שכימיקלים טרטוגניים עשויים שלא להיות ניתנים לזיהוי אם הם פועלים דרך מטרות שאינן באות לידי ביטוי בתאי iPS אנושיים לא ממויינים. בנוסף, בדיקה זו עשויה שלא ללכוד מטבוליטים טרטוגניים. יתר על כן, הוא אינו מספק מידע על המנגנונים המפורטים העומדים בבסיס רעילות טרטוגנית או תוצאותיה הספציפיות.

השימוש במערכת ניטור זוהר בזמן אמת משפר עוד יותר את רזולוציית הזמן, מפחית את העבודה הנדרשת למדידות רציפות וממזער חפצים מטיפול חוזר בלוחות תרבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בדיקת Devtox המבוססת על שיבוש אותות. ניתן להשלים את ההליך כולו תוך שבוע. גישה זו יכולה להיות אוטומטית, מה שהופך אותה למתאימה לסינון כימי ותורמת להפחתת הניסויים בבעלי חיים.

פרוטוקול

תאי iPS אנושיים (201B7) שימשו במחקר זה, כאשר הגן Nluc תחת שליטת אלמנט תגובה בסרום (SRE) הוכנס לתוך אתר שילוב הנגיף הקשור אדנו (AAVS1) באמצעות מערכת CRISPR-Cas9 (איור 1A). הפרטים של עריכת גנים עבור תאים מדווחים (תאי iPS אנושיים SRE-Nluc-knocked-in) דווחו במקום אחר⁶. הפרוטוקול מחולק בעיקר לשלושה שלבים: 1) בדיקת ציטוטוקסיות של כימיקל לקביעת ריכוז החשיפה המקסימלי שלו, 2) בדיקת שיבוש אותות ו-3) ניתוח נתונים.

כדי למזער את ההשפעה של אידוי בינוני, בצע את כל ניסויי תרבית התאים באמצעות 60 הבארות המרכזיות של צלחת של 96 בארות, והוסף מים לבארות החיצוניות ביותר ולחללים בין בארות. מכסים את הצלחת בסרט איטום חדיר גז במהלך הדגירה כדי להפחית עוד יותר את האידוי.

1. הכנת תאים

תאי דיווח תרבית לפחות שבועיים לאחר הפשרת מלאי קפוא. שמור על תאים בלוח זמנים חוזר של 7 ימים והשתמש בתאי יום 7 לבדיקה. בצע אופטימיזציה של צפיפות הזריעה למפגש ~80% ביום המעבר.
תאים בודדים של זרעים ב-2.0 ×-10⁵ תאים/באר בצלחת מצופה ECM עם 2 מ"ל של מדיום תחזוקה טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-2 מ"ל/באר של מדיום תחזוקה טרי.
לאחר 72 שעות, אסוף תאים באמצעות מגיב דיסוציאציה מבוסס אנזים כדי להשיג תרחיף של תא בודד. זרעים ב-1.0 ×-10⁵ תאים/באר בצלחת מצופה ECM עם 2 מ"ל של מדיום תחזוקה טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-4 מ"ל/באר של מדיום תחזוקה טרי.
לאחר 96 שעות, אסוף תאים כתרחיף של תא בודד באמצעות מגיב דיסוציאציה מבוסס אנזים. השתמש בתאים אלה עבור בדיקת המדווח.

2. בדיקת ציטוטוקסיות

מבחן מקדים
1. זרע תאים בודדים ב-2.0 ×-10⁴ תאים/באר בצלחת מצופה ECM של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר של מדיום תחזוקה טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. אטום את הצלחת בסרט חדיר גז.
2. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-200 מיקרוליטר/באר של מדיום תחזוקה טרי ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
3. לאחר 72 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
4. לאחר 96 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה.
  הערה: אם לא הושגה מפגש של 100%, הפסק את הבדיקה. מכיוון שקצב הגידול עשוי להשתנות בהתאם לקו התא, בצע אופטימיזציה של צפיפות הזריעה כדי להבטיח מפגש מלא ביום הבדיקה.
5. ממיסים את כימיקל הבדיקה במדיום בדיקה עד למסיסותו המקסימלית.
  הערה: כאשר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) משמש כממס, ריכוז ה-DMSO הסופי לא יעלה על 0.1%.
6. הכן דילול סדרתי של חמש נקודות ופי חמש של כימיקל הבדיקה במדיום הבדיקה באמצעות התמיסה משלב 2.1.5.
7. הוסף 11 מיקרוליטר לבאר של התמיסות הכימיות משלב 2.1.6. לבקרת הרכב, הוסף 11 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה המכיל את אותו ריכוז DMSO.
8. לאחר 48 שעות, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
9. הוסף 111 μL/באר של מגיב בדיקת כדאיות תא זוהר מבוסס ATP מאוזן מראש ב-25 מעלות צלזיוס. עבור הריק, הכינו באר המכילה 111 מיקרוליטר של מדיום בדיקה ו -111 מיקרוליטר של המגיב.
10. יש לנער את הצלחת ב-300 סל"ד למשך 2 דקות באמצעות שייקר מיקרו-פלטה.
11. מעבירים 200 מיקרוליטר מהתערובת לצלחת שחורה למדידת זוהר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
12. מדוד את עוצמת הזוהר כדי להעריך את ספירת התאים.
13. חשב את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה:
  כדאיות התא (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
  הערה: קבע את השלבים הבאים על סמך כדאיות התא. אם הכדאיות היא >50% בכל הריכוזים שנבדקו, המשך לשלב 2.2 עם ריכוז המסיסות המרבי. אם הכדאיות חוצה 50% בטווח שנבדק, המשך לבדיקת הקביעה באמצעות הריכוז הגבוה ביותר עם כדאיות >50%. אם הכדאיות היא <50% בכל הריכוזים, חזור על הבדיקה המקדימה החל מריכוז נמוך יותר.
מבחן נחישות
1. זרע תאים בודדים ב-2.0 ×-10⁴ תאים/באר בצלחת מצופה ECM של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר של מדיום תחזוקה טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. אטום את הצלחת בסרט חדיר גז.
2. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-200 מיקרוליטר/באר של מדיום תחזוקה טרי ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
3. לאחר 72 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
4. לאחר 96 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה.
  הערה: אם לא הושגה מפגש של 100%, הפסק את הבדיקה. מטב את צפיפות הזריעה כדי להבטיח מפגש מלא ביום 4.
5. ממיסים את כימיקל הבדיקה במדיום הבדיקה בהתאם לתוצאות הבדיקה המקדימה (שלב 2.1).
6. הכן דילול סדרתי של תשע נקודות וכפול של כימיקל הבדיקה במדיום הבדיקה באמצעות התמיסה משלב 2.2.5.
7. הוסף 11 מיקרוליטר לבאר של התמיסות הכימיות משלב 2.2.6. לבקרת הרכב, הוסף 11 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה המכיל את אותו ריכוז DMSO.
8. לאחר 48 שעות, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
9. הוסף 111 μL/באר של מגיב בדיקת כדאיות תא זוהר מבוסס ATP מאוזן מראש ב-25 מעלות צלזיוס. עבור הריק, הכינו באר המכילה 111 מיקרוליטר של מדיום בדיקה ו -111 מיקרוליטר של המגיב.
10. יש לנער את הצלחת ב-300 סל"ד למשך 2 דקות באמצעות שייקר מיקרו-פלטה.
11. מעבירים 200 מיקרוליטר מהתערובת לצלחת שחורה למדידת זוהר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
12. מדוד את עוצמת הזוהר כדי להעריך את ספירת התאים.
13. חשב את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה:
  כדאיות התא (%) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
14. צור עקומת מינון-תגובה באמצעות נתונים מתשעה ריכוזים וחשב את ה-IC₅₀ מהעקומה.

3. בדיקת מדווח בזמן אמת (איור 1B)

תאים בודדים של זרעים ב-2.0 ×-10⁴ תאים/באר בצלחת מצופה ECM של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר של מדיום תחזוקה טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. אטום את הצלחת בסרט חדיר גז.
לאחר 24 שעות, החלף את המדיום ב-200 מיקרוליטר/באר של מדיום תחזוקה טרי ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
לאחר 72 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה ואטום מחדש את הצלחת בסרט חדיר גז.
לאחר 96 שעות, החלף את המדיום ב-100 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה המכיל מצע זוהר של 1%.
הערה: אם לא הושגה מפגש של 100%, הפסק את הבדיקה. מכיוון שקצב הגידול עשוי להשתנות בהתאם לקו התא, בצע אופטימיזציה של צפיפות הזריעה כדי להבטיח מפגש מלא ביום 4.
ממיסים את כימיקל הבדיקה במדיום בדיקה בריכוז שנקבע בסעיף 2.
הכן דילול סדרתי של שמונה נקודות וכפול של כימיקל הבדיקה במדיום הבדיקה, החל מהתמיסה שהוכנה בשלב 3.5.
שעתיים לאחר חילופי המדיום בשלב 3.4, הוסף 11 מיקרוליטר לבאר של התמיסות הכימיות משלב 3.6. לבקרת הרכב, הוסף 11 מיקרוליטר/באר של מדיום בדיקה המכיל את אותו ריכוז DMSO.
שעה לאחר תחילת החשיפה לכימיקלים (שלב 3.7), הוסף 12 מיקרוליטר לבאר של מדיום בדיקה המכיל bFGF לריכוז סופי של 2 ננוגרם/מ"ל.
מדוד זוהר ברציפות במשך 48 שעות באמצעות מערכת מדידת זוהר בזמן אמת באטמוספירה לחה, 5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס.
הערה: הגדר זמן 0 בנקודת הוספת FGF (ראה איור 1B).

4. ניתוח נתונים (איור 1C)

חשב את שינוי קיפול ה-log2 (LogFC) של עוצמת הזוהר על ידי נורמליזציה של קבוצת הבדיקה לבקרת הרכב:
LogFC = יומן₂(Luc_sample / Luc_vehicle)
שלב את LogFC על פני סדרת הזמן של 48 שעות כדי להעריך את השטח בין העקומות (ABC) עבור קבוצות המבחן וקבוצת הבקרה של הרכב.
סכום ערכי ABC על פני כל הריכוזים כדי לכמת את ההיקף הכולל של שיבוש האות הנגרם על ידי כימיקל הבדיקה.
בצע ניתוח עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) כדי לקבוע את הסף לסיווג Devtox.

תוצאות

מניסיוננו, מורפולוגיה של תאים שימושית לקביעה אם בדיקה בוצעה כהלכה. איור 2A מציג תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות טיפוסיות של תאים מיד לפני ואחרי חשיפה לכימיקלים. בסוף הבדיקה, כמעט כל פני הבארות מכוסים בתאים. איור 2B מציג תמונות של צביעת תאים חיים/מתים. מספר התאים המתים המוכתמים בפרופידיום יודיד (PI) עולה לאחר חשיפה לכימיקלים; עם זאת, כדאיות התאים היא לפחות 50%, וכמעט כל התאים מוכתמים בקלצאין-AM.

טבלה 1 מפרטת את כימיקלים לבדיקה ששימשו במחקרים הקודמים שלנו ^7,8. מחקרים אלה מדגימים כי ניתן להבחין בין כימיקלים של Devtox עם דיוק משופר בהתבסס על שיבוש אות ה-FGF בתאי iPS אנושיים. ממצא מרכזי הוא שניטור רציף של פעילות האיתות הוא קריטי מכיוון שהוא משתנה באופן דינמי לאורך זמן. השימוש במערכת מדידת זוהר בזמן אמת מספק רזולוציית זמן גבוהה משמעותית עם פחות עבודת מדידה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת ניטור בזמן אמת.

איור 3A מראה שינויים בעוצמת הזוהר במשך 48 שעות בשש בארות משוכפלות באותם תנאים ללא כימיקל הבדיקה. שש העקומות כמעט מיושרות, מה שמעיד על שחזור טוב מבאר לבאר. למרות שלא זוהו בבירור במדידות ידניות של 24 שעות במחקרים הקודמים שלנו, שני שיאים נפרדים - שיא ראשוני מיד לאחר הוספת ליגנד FGF ושיא שני בערך 24 שעות - מופיעים במדידות בזמן אמת של 48 שעות. איור 3B מראה שינויים בעוצמת הזוהר עם חשיפה לחומצה ולפרואית (VPA), חומר רעיל התפתחותי ידוע. VPA הוא מעכב היסטון דאצטילאז הגורם לפגמים בצינור העצבי, בלב ובגפיים¹¹. VPA משבש את איתות ה-FGF באופן תלוי ריכוז. מערכת המדידה האוטומטית בזמן אמת לכדה דינמיקת אותות בצורה מדויקת יותר ממדידות ידניות.

figure-results-1
איור 1: בדיקת שיבוש אותות FGF/SRF. (A) הנדסה גנטית של תאי iPS אנושיים ליצירת תאי דיווח אותות FGF/SRF. נבנה פלסמיד המכיל Nluc במורד הזרם של אלמנט התגובה בסרום, זרועות הומולוגיות לדפיקות ממוקדות, וגן העמידות לפורומיצין בשליטת מקדם הפוספוגליצרט קינאז האנושי. לאחר בחירת הפורומיצין, הוקמו תאי דיווח SRE-Nluc. (ב) לוח הזמנים של הבדיקה. תאי הדיווח נזרעו בצלחת של 96 בארות וגודלו במשך 4 ימים כדי לכסות את כל פני השטח. המצע הזוהר וכימיקל הבדיקה נוספו 3 ו-1 שעות לפני תחילת המדידה, בהתאמה. זמן הוספת ליגנד FGF נקבע כ-0 שעות, ועוצמת הזוהר נמדדה ברציפות במהלך 48 השעות הבאות. דינמיקת האותות נרשמה בתאים שנחשפו ולא נחשפו לכימיקלים לבדיקה ונורמלה לבקרת הרכב כדי להעריך את השטח בין העקומות כמדד לשיבוש אות שנגרם על ידי כימיקל. ערכי ABC התקבלו עבור כל כימיקל בריכוזים שונים, וסכומם חושב. ניתוח עקומת המאפיינים התפעוליים של המקלט בוצע באמצעות כל הרעלים ההתפתחותיים הידועים שנבדקו כדי לקבוע את הסף. קיצורים: iPS = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; RLU = יחידת אור יחסית; AUC = שטח מתחת לעקומה; FGF = גורם גדילה פיברובלסטים; SRF = גורם תגובה בסרום; SRE = אלמנט תגובה בסרום; HA = זרוע הומולוגית; L = שמאל; R = ימין; PuroR = גן עמידות לפורומיצין; hPGK = פוספוגליצרט קינאז אנושי; Nluc = NanoLuc luciferase; ROC = מאפיין הפעלה של מקלט; ABC = שטח בין העקומות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מורפולוגיה של תאים וצביעה של תאים חיים/מתים. (A) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות של תאים לפני (יום 4) ואחרי (יום 6) חשיפה לכימיקל בדיקה. התאים הנותרים המכסים כמעט את כל שטח הבארות לאחר הבדיקה הם אינדיקטור לריצת בדיקה מוצלחת. כיסוי באר כמעט מלא בסוף הבדיקה מעיד על ריצה מוצלחת. (B) צביעת תאים חיים/מתים לפני ואחרי חשיפה לכימיקל בדיקה. תאים חיים נצבעו בירוק עם Calcein-AM, ותאים מתים נצבעו באדום עם propidium iodide (PI). נצבעו בקלצין-AM (ירוק), ותאים מתים בפרופידיום יודיד (PI, אדום). שיעור התאים המתים צריך להיות פחות ממה שצריך להיות < 50% מכלל התאים. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דוגמאות אופייניות לדינמיקה של עוצמת לומינסנציה. (A) זוהר במהלך הזמן משנה את מהלך הזמן של הזוהר לאחר גירוי ליגנד FGF, שנמדד באמצעות מערכת מדידת לומינסנציה בזמן אמת. עוצמת הזוהר נוטרה כל 22 דקות במשך 48 שעות. ששת הקווים הצבעוניים מייצגים אותות מבארות שונות. (B) השוואה של מדידות זוהר ידניות ובזמן אמת עם חומצה ולפרואית. שיבוש אות נצפה בשתי שיטות המדידה, בעוד שניטור בזמן אמת לכד בצורה ברורה יותר את האות המשופר בשיא השני. קיצורים: RLU = יחידת אור יחסית; VPA = חומצה ולפרואית; FGF = גורם גדילה פיברובלסטים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

בדיקה כימית	קיצור	קאס לא.	מחקר בבעלי חיים (מחקר קודם)	מחקר חוץ גופי (מחקר זה)	סכום ערכי ABC	ריכוז מקסימלי (מיקרוגרם/מ"ל)
חומצה טראנס-רטינואית	ATRA	302-79-4	P	P	65.9	0.0100
הידרוקסיאוריאה	HU	127-07-1	P	P	63.3	149
חומצה מתוקסיאצטית	MAA	625-45-6	P	P	225	683
מתילכספית כלוריד	MeHg	115-09-3	P	P	77.7	1.20
מטוטרקסט הידראט	MTX	133073-73-1	P	P	80.5	5.00
נתרן סליצילאט	SA	54-21-7	P	P	38.7	666
חומצה ולפרואית	VPA	99-66-1	P	P	63.3	100
6-אמינוניקוטינאמיד	6-אן	329-89-5	P	N	24.9	1.00
חומצה בורית	תואר ראשון	10043-35-3	P	N	24.2	250
5-ברומו-2'-דאוקסיורידין	BrdU	59-14-3	P	P	83.9	50.0
5,5-דימתיל-2,4-אוקסזולידינדיון	DMO	695-53-4	P	P	50.3	840
ליתיום קלוריד	LiCl	7447-41-8	P	N	29.8	250
5-פלואורואורציל	5-FU	51-21-8	P	P	92.4	2.65
ציקלופוספאמיד מונוהידראט	רו"ח	6055-19-2	P	N	19.1	400
אימטיניב מסילאט	הר"י	220127-57-1	P	P	42.4	12.5
לנלידומיד	לן	191732-72-6	P	P	94.7	35.0
פומלידומיד	פום	19171-19-8	P	P	50.9	2.50
תלידומיד	תה.	50-35-1	P	P	53.3	12.0
אקרילאמיד	עכו	79-06-01	N	N	37.1	454
די-קמפור	מצלמת	464-49-3	N	N	27.5	50.0
דיפנהידרמין הידרוכלוריד	DHM	147-24-0	N	P	68.2	262
דימתיל פתלט	DMP	131-11-3	N	N	24.4	100
פניצילין G מלח נתרן	פנג	69-57-8	N	N	22.1	1000
נתרן סכרין	SAC	82385-42-0	N	N	34.0	1000
פרצטמול	APAP	103-90-2	N	N	22.3	20.0
אמוקסיצילין טריהידראט	AMX	61336-70-7	N	N	28.4	25.0
סימטידין	ס מ	51481-61-9	N	N	25.3	30.0
אריתרומיצין	ארי	114-07-8	N	N	20.0	15.0
הידרוכלורותיאזיד	HCTZ	58-93-5	N	N	21.9	20.0
סולפסלזין	SSZ	599-79-1	N	N	30.8	100

כימי	האוניברסיטה האמריקאית	סף	רגישות	ספציפיות	דיוק
30 חומרים	0.819	37.9	0.778	0.917	0.833

טבלה 1: כימיקלים של Devtox ושאינם Devtox מסווגים בניסויים בבעלי חיים ותוצאות מוערכות עם ובלי הפרעה לאות FGF. קיצורים: P = חיובי (Devtox); N = שלילי (לא Devtox).

דיון

התפתחות עוברית-עוברית מווסתת באופן הדוק על ידי רשתות איתות¹². בעוד שמשוב בתוך רשתות אלה מספק חוסן כנגד רעש פנימי וחיצוני, שיערנו שכימיקלים של Devtox יכולים להפעיל השפעות מעבר לחציצה כזו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת כימיקלים של Devtox המבוסס על שיבוש מוגזם של איתות FGF/SRF. גישה זו אינה מספקת מידע לגבי המנגנונים המולקולריים האחראים ל-Devtox, כגון חלבוני המטרה של כימיקל, והיא מתמקדת רק באיתות FGF/SRF. עם זאת, ניתן היה לסווג כימיקלים של Devtox ביעילות, עם דיוק של 83% ו-AUC של 0.819 (טבלה 1). הסיבה לכך היא ככל הנראה שכל מסלול איתות קשור קשר הדוק לאחרים ויוצר רשתות איתות צפופות, ושיבוש בתוך רשתות אלה גורם לשיבוש אות FGF/SRF.

יש לטפל במספר אתגרים טכניים בעת יצירת תאי דיווח. Nluc בהיר בערך פי 100 מלוציפראזות קונבנציונליות שמקורן בגחליליות או רנילה, מה שמאפשר ניטור רציף לטווח ארוך של שינויי אותות¹³. Nluc המכיל את רצף ה-PEST שימש כדי ללכוד בצורה מדויקת יותר את הדינמיקה של פעילות האיתות. רצף ה-PEST מקדם פירוק חלבונים. בעוד שחלבון ה-Nluc יציב עם זמן מחצית חיים של יותר מ-6 שעות, תג ה-PEST מאיץ את הפירוק דרך מסלול היוביקוויטין-פרוטאזום, ומפחית את זמן מחצית החיים שלו ל-10-30 דקות. יתר על כן, הגן המדווח הוכנס לתוך לוקוס AAVS1, "נמל מבטחים" גנומי, מה שמבטיח שהביטוי לא יושתק ושגנים חיוניים לא יופרעו בטעות¹⁴.

בהערכת שיטות הבדיקה, חיוני לבחור כימיקלים ייחוס עבור Devtox ולא Devtox. בחרנו כימיקלים ייחוס מרשימות במחקר האימות הבינלאומי ECVAM, הנחיות ICH S5 (כולל תלידומיד) ומחקרים בבעלי חיים⁷. רשמנו 30 כימיקלים של Devtox ושאינם Devtox, אך יש להוסיף ולבדוק כימיקלים נוספים ממקורות אמינים. לכן, סף ה-ROC (Sum ABC = 37.9) המדווח כאן צריך להיחשב ראשוני וידרוש אימות עם קבוצה גדולה יותר ובלתי תלויה של תרכובות כדי להבטיח חוסן סטטיסטי. ציקלופוספאמיד (CPA) היה אחד משלושה כימיקלים עם תוצאות שליליות כוזבות. CPA עובר הידרוקסילציה בכבד ל-4-hydroperoxycyclophosphamide, ו-CPA ותוצרי הפירוק שלו הם טרטוגניים¹⁵. בדיקות מבחנה, כולל הגישה שלנו, בדרך כלל אינן מתחשבות בחילוף החומרים ואינן יכולות לזהות כימיקלים הגורמים ל-Devtox באמצעות חילוף חומרים. זוהי מגבלה של הגישה המוצעת. בנוסף לתוצאות שליליות כוזבות התלויות בחילוף החומרים (למשל, CPA), ראינו גם תוצאה חיובית כוזבת עם דיפנהידרמין הידרוכלוריד (DHM). עדויות אפידמיולוגיות אינן תומכות בקשר סיבתי בין DHM למומים מולדים, אך מספר מחקרים במבחנה סיווגו אותו כחומר רעיל התפתחותי; סביר להניח שזה תרם לסיווג השגוי שלו בבדיקה שלנו. לעומת זאת, 6-אמינוניקוטינאמיד (6-AN) לא שיבש את איתות FGF/SRF ולכן סווג באופן שגוי, מה שמרמז על כך שמנגנון הרעילות ההתפתחותית שלו עשוי להתקדם דרך מסלולים שלא נלכדו על ידי מדווח זה. יחד, דוגמאות אלו תומכות בהרחבת פאנל הבדיקה כך שיכלול מסלולי איתות התפתחותיים נוספים כדי להפחית הן תוצאות חיוביות שגויות והן שליליות כוזבות.

למספר גורמים יש השפעה רבה על בדיקה זו. גורם אחד כזה הוא הכנת התאים לפני הבדיקה. כדי למזער זאת, התאים נשמרו בלוח זמנים חוזר של 7 ימים כדי להבטיח שהתאים ששימשו בבדיקה נאספו באותם תנאי גידול. התאים נזרעים ביום שני, עוברים ביום חמישי, וחלק משמש לבדיקה ונזרע למעבר הבא. גורם נוסף הוא צפיפות התאים בזמן החשיפה לכימיקל בדיקה. הבדיקה בוצעה רק כאשר התאים הגיעו למפגש של 100% ביום החשיפה לכימיקלים. השפעות קצה בלוחות של 96 בארות ידועות היטב. בבדיקה זו, רק 60 הבארות הפנימיות של לוח 96 הבארות שימשו כדי למנוע השפעות קצה. בנוסף לשיקולים כלליים, שונות טכנית יכולה להתרחש במהלך בדיקה. בעיה נפוצה הייתה עוצמת זוהר לא עקבית בקרב הבארות בקבוצת הביקורת של הרכב, שייתכן שנבעה מזריעת תאים לא אחידה או מאיכות תאים לא אופטימלית. אנו ממליצים לשמור על התאים במפגש של כ-80% כדי למזער את השונות הזו ולוודא צמיחה אחידה על פני בארות ביום שלאחר הזריעה. התאמת צפיפות הזריעה של iPSC יכולה גם לשפר את יכולת השחזור של הבדיקה. בנוסף, מוות מוגזם של תאים יכול להוביל לתנודות זוהר לא ספציפיות שאינן קשורות לאות הניסוי. לכן, הערך את מורפולוגיה התא בסוף הבדיקה כדי להבטיח שהתאים נמצאים במצב מתאים במהלך המדידה. בבדיקות ידניות, הוצאת הצלחת מהאינקובטור בכל נקודת זמן חושפת את התאים לשינויים קצרים בטמפרטורה וברמות ה-CO₂. כדי להגביל את התנודות הסביבתיות הללו, יש לבצע מדידות במהירות ובעקביות.

בדיקה זו יכולה להתבצע באופן ידני או באמצעות מערכת מדידה בזמן אמת. הגישה הידנית אינה דורשת ציוד מיוחד, אך מערכת מדידה בזמן-אמת מאפשרת גילוי מדויק יותר של דינמיקת האותות. למרות שלא זוהה במדידות הידניות, מערכת המדידה בזמן אמת לכדה בבירור שתי פסגות של אות הזוהר. במדידות הידניות, פער של 12 שעות ברכישת הנתונים התרחש במהלך הלילה, מה שאולי הוביל להערכת חסר או לאובדן השיא השני. שתי הפסגות הללו עשויות להיגרם על ידי משוב שלילי מאיתות FGF ונוכחות של ליגנד FGF יציב תרמית. יש לציין כי שיבוש אות FGF על ידי כימיקל נראה לפעמים גדול יותר בשיא השני מאשר בשיא הראשון (איור 3B).

פרוטוקול זה מייצג גישה מבטיחה לסריקת כימיקלים של Devtox באמצעות בדיקת מדווח מבוססת iPSC אנושית כדי להעריך כמותית את שיבוש אות FGF. מספר בדיקות אלטרנטיביות במבחנה לרעילות התפתחותית פותחו במהלך העשורים האחרונים, כולל בדיקת תאי גזע עובריים של עכבר (mEST)¹⁶, בדיקת תאי גזע עובריים מבוססת Hand1 (Hand1-EST)¹⁷ ו-ReProGlo¹⁸. בהשוואה למבחנים קונבנציונליים אלה, שיטה זו הדגימה דיוק ניבוי מעולה. בשנים האחרונות הוצגו אסטרטגיות חלופיות כמו אלה המשתמשות בתאי גזע עובריים אנושיים או עוברי דג זברה כחלק מהמאמצים הבינלאומיים להקים מערכות ניסויים שאינן בבעלי חיים. גישות אלו דיווחו גם על דיוק ניבוי גבוה להערכות רעילות התפתחותיות. כדי לשפר עוד יותר את הביצועים של בדיקה זו, שילוב מסלולי איתות נוספים המעורבים בהתפתחות עוברית עשוי להועיל. ישנם מספר מסלולי איתות עיקריים אחרים במורפוגנזה התפתחותית, כגון Wnt/β-catenin, BMP/SMAD ואיתות קיפוד/GLI¹⁹. שילובים שונים של תאי דיווח המשמשים להערכת מסלולי איתות אלה עשויים לספק הערכה מקיפה יותר של כימיקלים שונים. ההשפעה של שלב ההתמיינות של תאי iPS, למשל, השלב המוקדם ביותר שבו נוצרות שלוש שכבות הנבט - על רגישות הגילוי של בדיקה זו תהיה נושא המחקר העתידי שלנו. מחקרים עתידיים עשויים גם לחקור אימות בין מינים באמצעות מערכות תאי גזע של מכרסמים או ארנבות כדי לאפשר השוואה ישירה עם מערכי נתונים in vivo במינים אלה, בעוד שההתמקדות העיקרית שלנו נותרה בתאי iPS אנושיים כדי למקסם את הרלוונטיות האנושית.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי JSPS, יפן [מספרי מענק KAKENHI 23K25021 ו-25K03278]; MHLW, יפן [מספר מענק התוכנית 23KD1003 ו-24KD1003]; KISTEC, יפן; ו-AMED, יפן [מספרי המענק JP23mk0101252 ו-25mk0121314].

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	FastGene	FG-MCT015C	הכנה כימית לבדיקה
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	ויולמו	1-3500-21	תרבית תאים
צינור PCR עם 8 רצועות	ווטסון	137-333C	הכנה כימית לבדיקה
פלטת תחתית לבנה/שקופה 96 באר, משטח TC	תרמו פישר סיינטיפיק	165306	תרבית תאים ומדידות זוהר
96וול שטוח עם מיקרופלטה שחורה	אסונה	3-3321-04	למדידת לומינסנציה במבחני ציטוטוקסיות
תנשום בקלות	טוהו	BERM-2000	סרט איטום חדיר גז
מבחן הקיימות של תאים זוהרים CellTiter-Glo	פרומגה	G7572	בדיקת ציטוטוקסיות
צנטריפוגה 5702 R	אפנדורף		צנטריפוגציה
ClipTip 300, מסונן, סטרילי, מדף	תרמו פישר סיינטיפיק	94420513
ClipTip 50, מסונן, סטרילי, מדף	תרמו פישר סיינטיפיק	94420253
מונה תאים אוטומטי של Countess 3 FL	Invitrogen		ספירת תאים
שקופיות תא ספירת תא הרוזנת	Invitrogen	C10312	ספירת תאים
תרבות בטח DMSO	פוג'יפילם וואקו	031-24051	ממס לכימיקלים
CultureSure Y-27632	פוג'יפילם וואקו	036-24023	מעכב ROCK לזריעת iPSC
DMEM/F12 HEPES, ללא פנול אדום	תרמו פישר סיינטיפיק	11039-021	ציפוי לתרבות תאים iPS
פיפטים מרובי ערוצים F1-ClipTip, 30 עד 300 ומיקרו; L	תרמו פישר סיינטיפיק	4661180N
פיפטים מרובי ערוצים F1-ClipTip, 5 עד 50 ומיקרו; L	תרמו פישר סיינטיפיק	4661160N
שבב פילטר	ווטסון
מטריצת ממברנת בסיס מופחתת של Geltrex ללא LDEV	תרמו פישר סיינטיפיק	A1413202	ציפוי לתרבות תאים iPS
HIENAI Mat 01R	ביוגרפיה של קוסמו	HMAT01R	לשמירה על יציבות טמפרטורת הלוחות במהלך טיפול בתרביות תאים
מחמם צינורות HIENAI GX01	ביוגרפיה של קוסמו	TWGX013	לשמירה על חום בינוני במהלך טיפול ניסיוני
חלבון bFGF רקומביננטי יציב בחום אנושי	תרמו פישר סיינטיפיק	PHG0367	גירוי FGF לבדיקת כתב
תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPS) מונעים על ידי אדם	201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)	RIKEN BRC Cell Bank
שייקר מיקרופלט	TAITEC	0089532-000	ניעור לוח לבדיקת ציטוציסטיות
קורא מולטיפלט	פרקיןאלמר	ARVO X4	מדידת זוהר
תת-תאי תאי חיים של ננו-גלו אנדוראזין	פרומגה	N2571	מצע זוהר
PBS (-)	פוג'יפילם וואקו	166-23555	קולוטר תאים
פרפילים	כאחד	65-1681-93	מאוחסן לפלטת ציפוי
פיפטו		אפנדורף
WSL-1563 KronosHT	ATTO	3510140	מערכת מדידת זוהר בזמן אמת
מאגר	BMBio	BM-0850-1
STEMdif APEL2 Medium	טכנולוגיות STEMCELL	ST-05275	מדיום הבדיקה
מדיום StemFlex	תרמו פישר סיינטיפיק	A3349401	אמצעי תחזוקה
מים סטריליים, נטולי אנדוטוקסין	פוג'יפילם וואקו	196-15645	בקרת לחות בתרבית תאי iPS
לוח תרבית רקמה VTC-P6	ויולמו	2-8588-01	תרבות תאים
אנזים TrypL Select (1X), ללא פנול אדום	תרמו פישר סיינטיפיק	12563011	תרבית תאים
חומצה ולפרואית	פוג'יפילם וואקו	227-01071	כימי בדיקה

מקורות

Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדידת לומינסנציה בדיקת חיוניות תאים בדיקת רעילות כימית דילול סדרתי הדמיה בניגוד מופע

בדיקת רעילות התפתחותית המבוססת על ניטור בזמן אמת של שיבוש אותות גורם גדילה פיברובלסטים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם