שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

תקציר

נוירונים מקוטבים ליצירת דנדריטים ואקסונים, המאפשרים תקשורת בין-תאית. פגיעה אקסונלית משבשת את הקשרים הללו ומעבירה אותות נזק לסומה, מה שמוביל לעתים קרובות לניוון עצבי. לפיכך, שמירה על הומאוסטזיס אקסונלי חיונית לקידום התחדשות אקסונים מקומית ולהגנה מפני ניוון עצבי. תהליך זה מסתמך על חילוף חומרים תאי כדי לספק אנרגיה וקודמנים ביוסינתטיים ונשמר על ידי מנגנונים המווסתים את האיזון המטבולי ומסלקים תוצרי לוואי. עם זאת, חילוף החומרים העצבי ממודר בין הסומה לאקסון ומושפע עוד יותר in vivo מהמיקרו-סביבה שמסביב, כגון פעילות מטבולית שמקורה באסטרוציטים (למשל, מעבורת לקטט אסטרוציטים-נוירונים). גורמים אלה מסבכים את חקירת המנגנונים המטבוליים הפנימיים של נוירונים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו כאן פלטפורמה מיקרופלואידית לטיפוח נוירונים ראשוניים בקליפת המוח במבחנה המשמרת מאפיינים מטבוליים מרכזיים שנצפו in vivo, כולל שטף גליקוליטי פיזיולוגי ונשימה מיטוכונדריאלית. מערכת זו מספקת מודל פשוט לחקירת שיפוץ מטבולי מהותי בתאי עצב לאחר פגיעה אקסונלית. שבבים מיקרופלואידיים קונבנציונליים תומכים במודלים של פגיעה אקסונלית במבחנה ותואמים להדמיית תאים חיים, צביעה אימונופלואורסצנטית וטיפול בהיפוקסיה. כדי להתאים לניתוחים טרנסקריפטומיים ומטבולומיים בקנה מידה גדול הכוללים מיליוני תאים, עיצבנו וייצרנו שבבים מיקרופלואידיים בעלי תפוקה גבוהה עם פרוטוקולים תפעוליים אופטימליים. המכשיר כולל תאי סומה ואקסון מסודרים לסירוגין המחוברים על ידי מיקרו-ערוצים, ופגיעה אקסונלית נגרמת על ידי שאיבת ואקום של נוזל מתא האקסון. פלטפורמה זו מאפשרת הערכה מהירה של דינמיקת מטבוליט ואנזימים, ומשפרת את הדיוק ויכולת השחזור של חקירות מולטי-אומיקס.

מבוא

נוירונים יוצרים שני סוגים נפרדים של בליטות עם פונקציות מיוחדות, אקסונים ודנדריטים, באמצעות קיטוב במהלך ההתפתחות ^1,2. התחדשות עצבית מתייחסת לתהליך של צמיחה אקסונלית לאחר פגיעה עצבית³, עם התמקדות מחקרית בתיקון מערכת העצבים המרכזית (CNS). בניגוד למערכת העצבים ההיקפית, למערכת העצבים המרכזית יש יכולת התחדשות מוגבלת ^4,5,6, מה שגורם לעתים קרובות לליקויים תפקודיים מתמשכים או נכויות קבועות בחולים עם פגיעות בעמוד השדרה או פגיעות מוח טראומטיות ^7,8. לפיכך, פיתוח אסטרטגיות לשיפור תיקון מערכת העצבים המרכזית והבהרת המנגנונים העומדים בבסיס התחדשות אקסונלית הם קריטיים.

מכשירים מיקרופלואידיים, המתפקדים כמערכות משולבות, חסכוניות ותפוקה גבוהה בתרבית מבחנה, הציגו יתרונות יוצאי דופן בחקר תאים ונוירונים בשנים האחרונות ^9,10. בהשוואה לשיטות מסורתיות, טכנולוגיה מיקרופלואידית מאפשרת ויסות מדויק של מתח גזירה נוזלי, שיפועי ריכוז ומבנים מרחביים, ובכך מדמה מקרוב מיקרו-סביבות פיזיולוגיות ופתולוגיות אותנטיות כדי לקדם צמיחת תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות 11,12,13,14. מודלים של פגיעה אקסונלית במבחנה מבוססי מיקרופלואידיקה מאפשרים תרבית ממודרת של גופים ותהליכים של תאים עצביים באמצעות קיטוב מרחבי, ומספקים כלי הכרחי לחקר יכולת ההתחדשות הפנימית של נוירונים וההתאמות המטבוליות שלהם לאחר פציעה^{15,1 6,17,18}. הוא מספק חלון קריטי לאופן שבו נוירונים מגיבים לפציעה, מווסתים תהליכים מטבוליים¹⁹ ומקדמים התחדשות אקסונלית²⁰. עם זאת, פלטפורמות מיקרופלואידיות קיימות לפגיעה אקסונלית ומחקר מטבולי עדיין מתמודדות עם אתגרים, כולל תפוקות נמוכות של תאים עצביים, דיוק מופחת במדידות מטבוליות והיעדר נהלים תפעוליים סטנדרטיים.

בתגובה למגבלות אלה, מחקר זה פיתח פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה בקנה מידה גדול המאפשרת אינדוקציה סטנדרטית בתפוקה גבוהה של פגיעה אקסונלית ומספקת מספיק חומר תאים לניתוחי מולטי-אומיקס ממודרים. עיצוב משולב זה מתמודד ישירות עם הצורך הקריטי שלא נענה במחקר פגיעות עצביות. באופן ספציפי, השבב המיקרופלואידי שתכננו כולל סידור מתחלף של תאים סומליים ואקסונליים המחוברים על ידי מיקרו-חריצים, עם חתך אקסונלי המושג באמצעות שאיבת ואקום מבוקרת. גישה זו אידיאלית למחקרים הדורשים מודלים של פגיעות אקסונליות הניתנות לשחזור ותפוקה גבוהה ופרופיל מטבולי מדויק, כגון חקירת המנגנונים המטבוליים העומדים בבסיס התחדשות אקסונלית. בהשוואה לשיטות מסורתיות, טכניקה זו מציעה תפוקה גבוהה יותר, דיוק מטבולי גדול יותר ויכולת לבסס מודלים סטנדרטיים של פציעות. לדוגמה, מחקרים קודמים הוכיחו את החשיבות של הובלה מיטוכונדריאלית בהתחדשות אקסונלית 20,21,22,23, בעוד שהפלטפורמה שלנו חושפת עוד יותר את תפקיד חילוף החומרים של הגלוקוז בהתחדשות אקסונלית לאחר פציעה. פרוטוקול זה מקים מערכת טכנית לאקסוטומיה בקנה מידה גדול וניתוח מטבולי הניתנת לאימות ויזואלי וסטנדרטית מבחינה תפעולית.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של אוניברסיטת בייהאנג ואושרו על ידי הוועדה (קוד אישור: BM20210060). איור 1 מתאר את ציר הזמן של הניסוי.

1. תכנון המכשיר המיקרופלואידי הקונבנציונאלי והגדול

1. תכנן את המכשיר המיקרופלואידית באמצעות AutoCAD ליצירת סכמות דו-ממדיות (2D) ומודלים מבניים תלת מימדיים (3D).
2. השתמש בעיצובים אלה כדי לייצר תבנית מאסטר על פרוסת סיליקון עם פוטוליתוגרפיה שלילית SU-8.
3. שכפל את תבנית המאסטר על ידי יציקת פולידימתילסילוקסן (PDMS), וכתוצאה מכך שבב מיקרופלואידית פונקציונלית בעלת דיוק גבוה.
4. תכנן כל מיקרו-ערוץ בגובה של 5 מיקרומטר, המאפשר רק לאקסונים לעבור תוך חסימת סומות.
5. הפוך את המיקרו-ערוצים לרוחב של 10 מיקרומטר כדי להגדיל את הקיבולת האקסונלית.
6. תכנן את התאים כך שיהיו בגובה 120 מיקרומטר וברוחב 220 מיקרומטר, ויספקו מספיק מקום לסומה עצבית.
7. השתמש בפלטפורמה מיקרופלואידית זו כדי לדמות פגיעה אקסונלית in vivo על ידי שליטה בזרימת הנוזל ובמיקום הנוירונים.
8. הכן דגימות מטבולומיות ותעתיקיות באמצעות המכשיר למניפולציה של תאים ברמת דיוק גבוהה, ואפשר עיבוד בתפוקה גבוהה כדי לשפר את דיוק הדגימה והתוקף הביולוגי.

2. ייצור מכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים ובקנה מידה גדול

1. שקלו את בסיס ה-PDMS ואת חומר הריפוי ביחס של 10:1 (w/w) והניחו אותם בצינור צנטריפוגה.
2. הנח את צינור הצנטריפוגה המכיל את תערובת ה-PDMS לתוך מערבל מערבל מערבל צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב -2000 × גרם למשך 4 דקות לערבוב, ואז צנטריפוגה שוב ב -2000 × גרם למשך 4 דקות לשחרור.
3. יוצקים 13-15 גרם מה-PDMS נטול הגז לתוך התבנית המיקרופלואידית, ומוודאים שתחתית התבנית מכוסה לחלוטין.
4. מניחים את התבנית במייבש ואקום. השתמש במשאבת ואקום כדי לפנות אוויר למשך 5-10 דקות כדי להסיר ביסודיות בועות מה-PDMS.
5. השתמש בנורת גומי כדי להקיש בעדינות על פני השטח של ה-PDMS כדי לשבור את כל בועות השטח שנותרו.
6. מכניסים את התבנית לתנור הסעה ואופים בחום של 80 מעלות למשך 100 דקות כדי לרפא את ה-PDMS.
7. לאחר שה-PDMS נרפא במלואו, החלק בעדינות את קצה האזמל מתחת לקצה ה-PDMS כדי להרים ולהפריד אותו בזהירות מהתבנית.
8. השתמש באגרוף ביופסיה בקוטר של 2.0-2.5 מ"מ כדי ליצור חורים ב-PDMS לעירוי מדיום תרבית והעמסת תאים.
9. הסר את כל זיהומי פני השטח מה-PDMS באמצעות סרט דבק, ולאחר מכן הניח אותו בכלי זכוכית נקי ועטוף אותו בנייר אלומיניום לאחסון.
10. (אופציונלי) טפל במשטח ה-PDMS עם פלזמת חמצן (30 W, 20 שניות) ולאחר מכן לחץ אותו על משטח אחר לקישור בלתי הפיך.
11. לפני הניסוי, חיטוי המכשיר המיקרופלואידי ב-121 מעלות צלזיוס ו-101 kPa למשך 5 דקות כדי להבטיח סטריליות.

3. הכנת נוירונים בקליפת המוח

1. להרדים 3 חולדות Sprague-Dawley (SD) לאחר הלידה (תוך 12 שעות לאחר הלידה) על ידי הנחתן על קרח למשך 5 דקות, ואז לערוף את ראשן במהירות.
2. נתח את האזור המוטורי של קליפת המוח והנח את הרקמה במאגר דיסקציה מקורר מראש (למשל, 2 מ"ל של HBSS ללא סידן ומגנזיום).
   הערה: בצע את כל הליכי חיתוך הרקמות על קרח באמצעות תמיסות מקוררות מראש.
3. טוחנים את הרקמה לכ -1 מ"מ³ חתיכות בעזרת מספריים סטריליים ומעבירים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
4. הניחו לעמוד למשך 5 דקות ולאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט כדי להסיר שאריות דם וחוצץ.
5. הוסף תמיסת פפאין מחוממת מראש (1 מ"ג/מ"ל) ב-5 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום שחוממו ל-37 מעלות צלזיוס.
6. דגרו בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 40 דקות, והפכו בעדינות את הצינור 3 פעמים כל 10 דקות.
7. לאחר העיכול, יש לשלש בעדינות את התרחיף 100 פעמים באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
   הערה: הימנע מהכנסת בועות אוויר כדי למנוע לחץ בתאים.
8. צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 3 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
9. הוסף תמיסת סיום המכילה מעכב פרוטאז של 1 מ"ג/מ"ל (למשל, 600 מיקרוליטר של בקבוקון ערכת מעכב מערכת דיסוציאציה פפאין ב-5 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום) כדי להשעות מחדש את התאים.
10. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר ואסוף את המסנן בצינור צנטריפוגה חדש.
11. צנטריפוגה את המסנן בחום של 200 × גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
12. יש להשעות את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של תרבית עצבית מלאה המכילה 2% B27 ו-1% GlutaMAX.
13. ספרו את התאים (כ-3 מיליון לחולדה) והתאימו את הצפיפות ל-1 ×-10⁶ תאים/מ"ל לשימוש הבא.

4. ציפוי

הערה: טפל בכיסויים או בכלי התרבית בתמיסת פולי-D-ליזין (PDL) כדי לשפר את הידבקות הנוירונים וליצור סביבה אופטימלית לצמיחה עצבית.

1. ציפוי כיסויים
   1. הנח כיסוי המיועד למכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים (Φ25 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ) בצלחת תרבית של 35 מ"מ, והוסף 2 מ"ל של תמיסת PDL של 0.1 מ"ג/מ"ל.
   2. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או למשך הלילה.
   3. לאחר הדגירה, אחזר בזהירות את תמיסת ה-PDL לשימוש חוזר או לסילוק נכון.
   4. הוסף לכלי 2 מ"ל מים סטריליים טהורים במיוחד וסובב אותו 50 פעמים בכיוון השעון, ואחריו 50 פעמים נגד כיוון השעון (עבור מספר מנות, סובב אותם בו זמנית בצלחת גדולה יותר).
   5. שאפו את המים באמצעות משאבת ואקום המחוברת לקצה פיפטה סטרילי, ואספו פסולת במיכל פסולת נוזלית.
   6. חזור על הליך הכביסה (שלבים 4.1.4-4.1.5) שלוש פעמים בסך הכל.
   7. הניחו לכיסויים להתייבש באופן טבעי בארון בטיחות ביולוגית לפני השימוש.
2. ציפוי צלחת תרבות
   1. הוסף כמות מתאימה של 0.1 מ"ג/מ"ל תמיסת PDL לצלחת התרבית או לצלחת הבאר (למשל, הוסף 2 מ"ל לצלחת 35 מ"מ למיקרופלואידיקה קונבנציונלית, ו-5 מ"ל לצלחת 10 ס"מ למיקרופלואידיקה בקנה מידה גדול).
      הערה: ודא שארון הבטיחות הביולוגית פועל כראוי עם זרימת אוויר סטרילית כדי למנוע זיהום.
   2. ודא שהתמיסה מכסה לחלוטין את התחתית, ודגר אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או לילה.
   3. לאחר שחזור תמיסת ה-PDL, שטפו את כלי התרבות שלוש פעמים בכמות מתאימה של מים אולטרה-טהורים סטריליים כמתואר בשלב 4.1.4.
   4. הסר את שאריות המים האולטרה-טהורים וייבש באוויר את צלחת התרבות בקולט אדים למינרי לשימוש מאוחר יותר.

5. הכנת מדיום עצבי

1. הכן את המדיום השלם לתרבית נוירונים שגרתית.
   1. הסר את הבוכנה ממזרק חד פעמי של 50 מ"ל. הנח את המזרק כשראש הגומי פונה כלפי מעלה על ספסל נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
   2. הוסף למזרק 500 מיקרוליטר של סטרפטומיצין פניצילין (PS), 1 מ"ל של B27, 125 מיקרוליטר של GlutaMAX ו-500 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי (FBS) ברצף. החלף את קצה הפיפטה עבור כל רכיב כדי למנוע זיהום צולב.
      הערה: הוסף כל רכיב בסדר שצוין כדי לשמור על עקביות.
   3. קח צינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל. תייגו אותו כ"נוירו-בזאלי-A (NBA) + 2% B27 + 0.25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS".
      הערה: השתמש ב-NBA אם לא בנוירונים עובריים; השתמש בנוירו-בזאלי (NB) עבור נוירונים עובריים.
   4. חבר מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לקצה המזרק.
      הערה: ודא שהמסנן מחובר היטב למזרק כדי למנוע דליפה.
   5. השתמש ב- NBA כדי למלא את המזרק בנוזל עד 50 מ"ל, כולל נפח התוספים. התקן מחדש את הבוכנה.
   6. דחוף לאט את הבוכנה בכ-2 מ"ל לשנייה כדי לסנן את הנוזל לתוך צינור הצנטריפוגה המסומן.
   7. הדק את מכסה צינור הצנטריפוגה. הפוך את הצינור 3-5 פעמים כדי לערבב את המדיום.
2. מדיום שלם המכיל [^U-13C₆]-גלוקוז (לניתוח שטף מטבולי): לניתוח שטף מטבולי של חילוף החומרים של גלוקוז בנוירונים פגומים, השתמש ב-NBA ללא סוכר להכנת מדיום שלם המכיל [^U-13C₆]-גלוקוז.
   1. השתמש ב-NBA נטול גלוקוז כתמיסת הבסיס והוסף [^U-13C₆]-גלוקוז לריכוז סופי של 25 מ"מ לפני הסינון (אם [^U-13C 6]-גלוקוז מוצק, חשב ושקול אותו מראש). עקוב אחר אותו רצף להוספת רכיבים אחרים, כמו גם את שלבי הסינון והערבוב, כמתואר בסעיף 5.1.

6. ספירת תאים

1. נגב היטב את ההמוציטומטר עם 75% אתנול. ודא שכל המשטחים יבשים לחלוטין לפני שתמשיך.
2. הוסף 90 מיקרוליטר של מאגר מלח פוספט סטרילי (PBS) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.
3. השעו בעדינות את תרחיף תאי העצב שנאספו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי.
4. בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר, העבירו 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המעורבים לתוך צינור הצנטריפוגה המכיל 90 מיקרוליטר PBS (דילול 1:10).
5. השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לערבב בעדינות את התמיסה 10 פעמים, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות.
6. החלף את קצה הפיפטה בקצה חדש של 10 מיקרוליטר. צייר 10 מיקרוליטר מהתערובת והוסף אותה לתא הדגימה של ההמוציטומטר.
7. הנח את ההמוציטומטר על שלב המיקרוסקופ והתמקד באמצעות המטרה פי 20. אתר את הרשת המרכזית 4 × 4 וספור תאים בכל 16 הריבועים בהתאם לכללי המוציטומטר הסטנדרטיים.
8. רשום את ספירת התאים הכוללת מכל 16 הריבועים. חשב את ריכוז התאים באמצעות הנוסחה: (ספירה כוללת × 10) × 10⁴ תאים/מ"ל.
   הערה: עבוד תמיד בארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.

7. תרבית חוץ גופית של נוירונים בקליפת המוח במכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים או בקנה מידה גדול

1. פרוטוקול א' (התקנים מיקרופלואידיים קונבנציונליים).
   1. ודא שמשטח הזכוכית בכלי התרבות 35 מ"מ יבש לחלוטין.
   2. בעזרת מלקחיים סטריליים בעלי קצה עדין, הנח את השבב המיקרופלואידי המאוטוקלאב במרכז משטח הזכוכית כאשר מיקרו-תעלות פונות כלפי מטה.
   3. לחץ בעדינות את השבב על משטח הזכוכית באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להבטיח הידבקות מלאה.
   4. סמן את החדר השמאלי בנקודה (·) באמצעות טוש קבוע כדי לציין את תא הסומה.
   5. שאפו 10 מיקרוליטר של תרחיף עצבי (10 מיליון תאים/מ"ל) באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר.
   6. הוצא לאט את המתלה לתוך יציאת הטעינה מעל תא הסומה המסומן.
   7. אשר זרימת נוזלים תקינה למאגר התחתון של החדר השמאלי.
   8. העבירו את צלחת התרבות לחממה לחה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) למשך 20 דקות.
   9. מוציאים את צלחת התרבות מהחממה.
   10. באמצעות מיקרוסקופ ניגוד פאזה של 20 ×, אשר את זלוף המדיה מתא הסומה לתא האקסונלי דרך המיקרו-ערוצים.
   11. הוסף 150 מיקרוליטר של תווך בסיסי עצבי ליציאה העליונה של התא האקסונלי (החדר הימני), ואפשר זרימה מונעת כבידה למאגר התחתון.
   12. באופן דומה, הוסף 15 מיקרוליטר של מדיום עצבי שלם ליציאה העליונה של תא הסומה (החדר השמאלי).
       הערה: בשלב זה, נוירונים צריכים להיצמד באופן גלוי, כאשר רוב פסולת התאים נשטפת לבאר התחתונה. אל תחליף את המדיום במהלך התרבית; השתמש בתוספת אחת של תווך עצבי שלם כמתואר בשלב 5.1.3.
   13. יוצקים 20 מ"ל מים טהורים במיוחד לתבנית תרבית של 150 מ"מ ליצירת תא לחות. מניחים את צלחת התרבות בגודל 35 מ"מ בתוך הכלי הגדול.
   14. העבירו את כל מערכת התרבית לחממה ותחזקו למשך הזמן הנדרש (למשל, 7 ימים).
       הערה: בצע את כל הליכי תרבית התאים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (מעיל מעבדה וכפפות). טיהור משטחי עבודה לפני ואחרי הליכים.
2. פרוטוקול ב' (שבבים מיקרופלואידיים בקנה מידה גדול).
   הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי של המפרטים הקונבנציונליים בוצעו בשני שינויים.
   1. השתמש בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ למיקום המכשיר.
   2. בחר זריעה בערוץ מלא או בערוץ מרווח על סמך צרכי הניסוי, מכיוון שכל שיטה דורשת פרוטוקולי פגיעה אקסונליים שונים.
   3. לאחר השלמת הזריעה, הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבית נוירונים שלם לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ כדי לשמור על צמיחת הנוירונים.
   4. הוסף 20 מ"ל מים טהורים במיוחד לכלי בגודל 150 מ"מ ליצירת תא לחות. לאחר מכן, מניחים את התבנית בגודל 10 ס"מ בתוך הכלי הגדול.
   5. זהה לשלב 7.1.14.

8. ביסוס מודל פגיעה אקסונלית במבחנה במכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים

1. סמן את הצד השמאלי של המכשיר המיקרופלואידי כתא הסומלי (כפי שמצוין בסימן "·"), ואת הצד הימני כתא המסוף האקסונלי.
2. זרע נוירונים בקליפת המוח לתוך התא הסומלי.
3. תרבית את הנוירונים במבחנה עד היום השביעי (DIV7), מה שמאפשר לאקסונים להתפשט דרך המיקרו-ערוצים לתא הקצה האקסונלי.
4. ב-DIV7, בצע הליכי פגיעה אקסונלית בתא המסוף האקסונלי כדי ליצור מודל פגיעה אקסונלית במבחנה .
5. קח כמות מתאימה של מדיום NBA והעביר אותו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל לשימוש מאוחר יותר.
6. תרבית נוירונים בקליפת המוח במכשיר המיקרופלואידי לתקופה שצוינה. לאחר מכן העבירו את המכשיר לספסל נקי.
7. השתמש בנייר נטול מוך כדי לייבש את החלק התחתון של צלחת התרבית 35 מ"מ. השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את המדיום משני החורים בצד ימין של המכשיר המיקרופלואידי.
8. חבר את צינור משאבת הוואקום לקצה פיפטה סטרילי ונטול פילטר של 200 מיקרוליטר, הפעל את משאבת הוואקום (קצב יניקה 60 ליטר/דקה), וכוון את הקצה לנקודת החיבור בין החור התחתון של תא מסוף האקסון לתא כדי לשאוב את המדיום הישן (בשלב זה, אקסונים נשברים עקב לחץ שלילי).
9. החזר את קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר ושאב 150 מיקרוליטר של NBA, והוסף אותו לאט דרך החור התחתון של החדר הימני.
   הערה: אם זרימת הנוזל איטית מדי ונוצרות בועות, הוצא במהירות את הנוזל מהקצה כדי למלא במהירות את החדר.
10. השתמש לסירוגין בשני החורים בצד ימין להוספת נוזלים: לאחר כל תוספת NBA, השתמש מיד במשאבת הוואקום כדי לשאוב נוזל מהחור השני כדי לנתק אקסונים. חזור על פעולה זו 4 פעמים, ולאחר השאיפה האחרונה, החלף במדיום עצבי שלם טרי.
11. שאפו את המדיום הישן מהחור הצדדי של גוף התא והוסיפו מדיום עצבי שלם וטרי המכיל תרופות (במידת הצורך).
12. מניחים את המכשיר המיקרופלואידי, יחד עם צלחת התרבית, בכלי תרבית של 150 מ"מ וממשיכים בתרבית למשך הזמן שצוין (למשל, 24 שעות).
    הערה: פעולת נזק האקסון דורשת מדיום NBA, שכן מדיום שלם עצבי יפיק בועות המשפיעות על אפקט הניתוק.

9. פגיעה אקסונלית במכשיר מיקרופלואידית בקנה מידה גדול

1. שיטה 1: פציעה אקסונלית ידנית.
   1. זרעו נוירונים לכל החדרים של המכשיר המיקרופלואידי.
   2. דגרו את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO₂ למשך שלושה ימים, ולאחר מכן הסירו את כל המכשיר המיקרופלואידי.
      הערה: כדי למנוע לחץ מכני או קריעה של אקסונים הגדלים לתוך המיקרו-תעלות, הסר את המכשיר המיקרופלואידי ב-DIV3 במקום DIV7. זה חשוב במיוחד אם תכנון הניסוי כולל קבוצת ביקורת שלא נפגעה.
   3. ב- DIV7, הוציאו את צלחת התרבות המכילה את המכשיר המיקרופלואידי מהחממה והניחו אותה על במה סטרילית.
   4. הכן מיקרוסקופ בהגדלה פי 20 ועיקר את אזור העבודה עם 75% אתנול.
   5. החזק קצה פיפטה סטרילי מסונן של 10 מיקרוליטר, וזהה צרורות אקסונים במיקרו-תעלות המקוריות בהנחיית מיקרוסקופ.
   6. בצע שריטות אורכיות לאורך כל צרור אקסונים באמצעות קצה הפיפטה.
   7. התבונן בשבירת האקסון מתחת למיקרוסקופ בזמן אמת לאחר השריטה.
      הערה: בעת טיפול בתאי עצב חיים, יש ללבוש כפפות ניטריל ולעבוד בסביבת מעבדה מעוקרת UV
2. שיטה 2: פגיעה אקסונלית בסיוע ואקום.
   1. זרע נוירונים בקליפת המוח לסירוגין במכשיר המיקרופלואידיקה בפורמט גדול.
   2. הפעל את משאבת הוואקום והגדר אותה על 60 ליטר לדקה.
   3. חבר את קצה צינור משאבת הוואקום ליציאת תא האקסון באמצעות קצה פיפטה סטרילי.
   4. ניתוק אקסון מלא על ידי הפעלת לחץ ואקום באמצעות פרוטוקולים מיקרופלואידיים קונבנציונליים.
   5. (אופציונלי) כדי לאסוף באופן ספציפי אקסונים פצועים, בנקודת זמן מוגדרת לאחר אקסוטומיה, שאפו במהירות את התוכן של תא גוף התא באמצעות משאבת ואקום (עם קצב יניקה של 60 ליטר לדקה) כדי להסיר את גופי התאים, ובכך להשאיר רק את האקסונים בתוך המיקרו-ערוצים.

10. טיפול היפוקסי במכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים או בקנה מידה גדול

1. זרע נוירונים ראשוניים במכשיר המיקרופלואידי ובתרבית עד DIV7 בתנאים נורמוקסיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
2. הנח את המכשיר המיקרופלואידי בתא אינקובטור היפוקסיה וספק לו תערובת גז המורכבת מ-1% O₂, 5% CO₂ ו-N₂ מאוזן.
3. השתמש במד סיבוב כדי לשלוט בקצב זרימת הגז והגדר אותו ל-25 ליטר לדקה.
4. שטוף את החדר למשך 5 דקות כדי לעקור אוויר.
5. תוך כדי הידוק כניסת החדר ההיפוקסי, סגור את שסתום הפחתת לחץ היציאה.
6. מהדק את צינור היציאה של החדר ההיפוקסי, ולבסוף, סגור היטב את שסתום בלון הגז.
7. דגרו את המכשיר המיקרופלואידי בתא ההיפוקסי בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס למשך שעה.

11. הכנת דגימות של נוירונים שגודלו במבחנה באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים בקנה מידה גדול לניתוח אומיקס

1. דוגמה לטרנסקריפטומיקה.
   1. העבר את המכשיר המיקרופלואידי עם האקסונים הפגומים למכסה זרימה למינרי 6 שעות לאחר השלמת הפגיעה האקסונלית.
   2. לאחר השלכת המדיום הישן, יש לשטוף את התאים העצביים 2-3 פעמים עם PBS סטרילי.
   3. השתמש בערכת מיצוי RNA סטנדרטית כדי לבודד ולטהר RNA בהתאם להוראות היצרן.
   4. בצע ריצוף RNA. ביצוע ניתוח ביואינפורמטי מעקב על נתוני הריצוף שנרכשו.
2. דגימה לניתוח שטף מטבולי.
   הערה: כדי לנטר שינויים בשטף המטבולי של הגלוקוז בתאי עצב לאחר פציעה באמצעות מכשיר מיקרופלואידית בקנה מידה גדול, השתמשנו בניתוח שטף מטבולי של מעקב אחר גלוקוז [^U-13C₆]²⁴. הפרוטוקול להכנת דגימות לניתוח LC-MS הוא כדלקמן:
   1. השתמש בגורי חולדות P0 SD לניסויים. לנתח נוירונים בקליפת המוח ולתרבית אותם במבחנה לטווח קצר (DIV5-DIV7) או לטווח ארוך (DIV15-DIV30).
   2. הן עבור נוירונים צעירים (DIV5-DIV7) והן עבור נוירונים בוגרים (DIV15-DIV30), יש להקים קבוצות פגיעה וקבוצות ביקורת לא פגועות.
   3. החלף את המדיום במדיום המכיל 25 מ"מ [^U-13C₆]-גלוקוז (נוירו-בזאלי-A ללא גלוקוז, 1% FBS, 2% B27, 25 מ"מ [^U-13C₆]-גלוקוז) ודגר למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי למנוע מתח עצבי ואפופטוזיס הנגרמים על ידי שינויים אוסמוטיים או pH במהלך חילופי מדיום, הכינו נוירונים נוספים שגודלו במדיום המכיל 25 מ"מ [^U-13C₆]-גלוקוז בזמן הזריעה, והשתמשו במדיום זה להחלפה.
   4. לאחר שטיפה עדינה פעמיים עם 5 מ"ל HBSS מחומם מראש (המכיל סידן ומגנזיום), הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ללבוש כפפות ניטריל וחלוק מעבדה בעת טיפול בחנקן נוזלי.

12. צביעה אימונופלואורסצנטית עצבית המבוססת על מכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים ובקנה מידה גדול

הערה: כאשר מטפחים נוירונים במבחנה באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים, יש לקחת בחשבון את הנזק הפוטנציאלי לאקסונים עצביים בתוך מיקרו-ערוצים שעלול להתרחש במהלך פירוק מכשירים אלה לקיבוע תאים חיים.

1. השתמש במשאבת ואקום מיקרו פסולת כדי להסיר את מדיום התרבות מארבע הבארות של המכשיר המיקרופלואידי.
   הערה: שמור את הנוזל בשני תאים לאורך תהליך הצביעה האימונופלואורסצנטית. פרמטרי היניקה לא צריכים להיות גבוהים מדי (2.5 ליטר לדקה הם אופטימליים) כדי למנוע נזק או שאיבת גופי תאים עצביים ואקסונים.
2. הוסף 100 מיקרוליטר של 1x PBS לכל אחת משתי הבארות העליונות של המכשיר המיקרופלואידי (PBS יזרום באופן טבעי לבארות התחתונות).
3. החזר את הקצה נטול המסנן בקצה משאבת הוואקום, שאב PBS מהבארות התחתונות וחזור על התהליך שלוש פעמים. באיטרציה האחרונה, שאפו את כל ה-PBS מארבע הבארות.
4. הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) לכל אחת משתי הבארות העליונות, וקבע בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
   הערה: הימנע מפירוק המכשיר במהלך קיבוע תאים חיים כדי לשמור על שלמות מבנית עצבית. גישה זו עוזרת להבחין בצורה ברורה יותר בין המיקומים של סומות עצביות ואקסונים.
5. שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS, ולאחר מכן דגרו על נוירונים עם חיץ חוסם המכיל 5% סרום עיזים, 0.3 M גליצין, 2% אלבומין בסרום בקר (BSA), PBS ו-0.1% (או 0.5%) Triton X-100 למשך שעה.
6. לדלל את הנוגדן הראשוני (למשל, βIII-tubulin, עכבר, 1:2000) במאגר החוסם, להוסיף 100 מיקרוליטר לבאר השמאלית העליונה, ו-50 מיקרוליטר לבאר הימנית העליונה, ולדגור עם נוירונים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
7. לאחר שאיבת הנוגדן הראשוני, יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS 1x כמתואר בשלבים 12.2-12.3. לאחר מכן הוסף את הנוגדן המשני שהוכן עם חיץ חוסם לבארות העליונות של המכשיר המיקרופלואידי, כמתואר בשלב 12.6, ודגר בחושך למשך 30 דקות (מכסים בנייר אלומיניום במידת הצורך).
8. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS אחד, יש לשטוף פעם אחת במים טהורים במיוחד. השתמש בזהירות בפינצטה מעוקלת כדי לתפוס ולהסיר את המכשיר מהפינה השמאלית העליונה של ההתקנה המיקרופלואידית.
9. הוסף 1 מ"ל PBS לצלחת התרבות כדי להפריד את הכיסוי הגדול מהצלחת.
10. השתמש בפיפטה כדי לשאוב 15 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה ושחרר אותו על משטח הכיסוי במיקום המיועד לכיסוי.
11. הורד בעדינות את צד התא על מדיום ההרכבה, הנח את הכיסוי והסר עודפי נוזלים.
12. אפשר למדיום ההרכבה להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.
13. לאחר שמדיום ההרכבה התייבש בטמפרטורת החדר, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב כדי לבצע הדמיה.
14. בחר יעד אוויר פי 20, הגדר את זמן החשיפה ל-100-200 אלפיות השנייה למסגרת, והגדר את עוצמת הלייזר ל-5-10% מהמקסימום עם עירור של 488 ננומטר עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו/או 561 ננומטר עבור חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP).

13. הדמיית תאים חיים במכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים

1. תרבית נוירונים בקליפת המוח במכשיר המיקרופלואידי עד DIV7.
2. הכן צבע תאים חיים (למשל, בדיקה לפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית) בהתאם להוראות היצרן.
3. לדלל צבע במדיום תחזוקה עצבי שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
4. טען תמיסת צבע לתא הסומטי של המכשיר המיקרופלואידי.
5. דגירה למשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ .
6. שטפו בעדינות את התאים 3 פעמים עם 3 מ"ל HBSS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) המכיל סידן ומגנזיום.
7. הוסף תמיסת הדמיית תאים חיים ללא פנול אדום לשבב המיקרופלואידי.
8. (אופציונלי) כלול GlutaMAX (0.25%) ו-B27 (2%) להדמיה ממושכת.
9. הנח את השבב המיקרופלואידי על במת המיקרוסקופ עם התא הסומטי משמאל ותא המסוף האקסונלי מימין.
10. הוסף טיפה של שמן טבילה לעדשת האובייקטיביה, וודא שהשמן יוצר מגע עם הכיסוי מתחת לשבב.
11. השתמש באובייקט של 40x עם חשיפה של 150 אלפיות השנייה ועוצמת לייזר מקסימלית של 10-15% להדמיה.
    הערה: התאם פרמטרים אלה על סמך יציבות הצבע.

14. ניתוח נתונים

1. השתמש בתוכנת ImageJ כדי לנתח תמונות מיקרוסקופיה. העריכו את איכות ה-RNA בעזרת ביו-אנלייזר. בצע ונתח RNA-seq באמצעות פלטפורמת התאמה.
2. למחקרים מטבולומיים, חלץ נתוני ספקטרומטריית מסה גולמיים באמצעות תוכנית MRMPROBS (גרסה 2.60), ואסוף מידע על מטבוליטים מזוהים, כולל פרטים איזוטופיים ואזורי שיא.
3. השתמש ב-GraphPad Prism (גרסה 8.4.3) עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים. הציגו נתונים כממוצע ± SEM. השתמשו במבחני t דו-זנביים לא מזווגים או במבחני מאן-וויטני להשוואות קבוצתיות, והשתמשו ב-ANOVA דו-כיווני להשוואות בין נקודות זמן מרובות בתוך קבוצות (מובהקות: ns, לא מובהק; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).

תוצאות

כדי לבסס פלטפורמת מחקר מקיפה לחקר מנגנוני הבקרה המטבוליים בתאי עצב בקליפת המוח, תרבית תחילה תאי עצב בקליפת המוח במכשיר מיקרופלואידי, ששולט במדויק בגדילת אקסונים לאורך מיקרו-ערוצים (איור 2A). עם תכנון מתאים, המיקרו-ערוצים נבנו בגובה נמוך (5 מיקרומטר) ורוחב גדול יותר (10 מיקרומטר), מה שמאפשר לכל תעלה לארח אקסונים נוספים מבלי לאפשר לגופי תאים להיכנס. צביעה אימונופלואורסצנטית עבור βIII-tubulin אישרה צמיחה אקסונלית דרך המיקרו-תעלות לתוך החדר הסופי האקסונלי (

דיון

הקמת מודלים מתקדמים במבחנה לחקר פגיעה אקסונלית והתחדשות חיונית לחשיפת המנגנונים המולקולריים והמטבוליים המעורבים בתיקון עצבי^16,19. במחקר זה, אנו מציגים זרימת עבודה סטנדרטית המשלבת מכשירים מיקרופלואידיים, תרביות עצביות בקנה מידה גדול ופרוטוקולי פגיעה אקסונליים מדויקים, המאפשרים ניתוח מולטי-אומיקס חזק של נוירונים בקליפת המוח הפגועים.

הצלחתה של גישה זו נשענת במידה רבה על מספר צעדים פרוצדורליים קרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוירו-בזאלי-A בינוני	ג'יבקו	10888022	מדיום תרבות
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר	Invitrogen	א-21042	אימונופלואורסצנציה
איזון אנליטי	שנחאי Shunyu Hengping מכשיר מדעי ושות', בע"מ	FA1004	שקילה מדויקת של ריאגנטים/דגימות
B27 (פי 50)	ג'יבקו	17504044	מדיום תרבות
בדיקת חלבון BCA	באסטר	AR1189	ריכוזי חלבון
ביואנלייזר	זריז	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
אלבומין סרום בקר	ג'נוויו	FA016	אימונופלואורסצנציה
מערבל בוחש צנטריפוגלי	לחשוב	ARE-310	ערבוב PDMS ודה-גז
מנתח CLARIOstarPlus-ACU	ב.מ.ג. לאבטק	קלריוסטאר פלוס	ריכוזי חלבון
אינקובטור CO2	תרמו פישר סיינטיפיק (אשוויל) LLC	3111	דגירה של תרבית תאים ב-37 מעלות; C, 5% CO?
משאבת ואקום דיאפרגמה עמידה בפני קורוזיה	שנחאי חזזית Bangxi מכשיר טכנולוגיה ושות', בע"מ	LC-85DLC	שאפו נוזל פסולת וספקו יניקה לאקסוטומיה
D-גלוקוז (U-13C6, 99%)	מעבדות איזוטופ קיימברידג'	CLM-1396	שטף מטבולי
דנאס א	רוש	11284932001	תרבית עצבית
פלטפורמת Dr.TOM2	בי.ג'י.איי גנומיקה		לבצע ולנתח RNA-seq
תנור ייבוש חשמלי באוויר חם	BIOM Huahong Bonn / Huaying Bosi	DHG-9070A	ריפוי PDMS
איזון אלקטרוני	שנחאי Huachao תעשייתי ושות', בע"מ	HC313	שקילה שגרתית של חומרים
מדיום הרכבה מימי Fluoromount	סיגמא-אולדריץ'	F4680	אימונופלואורסצנציה
גלוטמקס	ג'יבקו	35050061	מדיום תרבות
גליצין	סולארביו	G8200	אימונופלואורסצנציה
HBSS	ג'יבקו	14025092	תרבית עצבית
HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום	ג'יבקו	14175095	תרבית עצבית
מעקר קיטור בלחץ גבוה	STIK מכשיר (שנחאי) ושות', בע"מ	HMJ-54A	סטריליזציה של ציוד מעבדה ומדיה
תא היפוקסי	טכנולוגיות STEMCELL	27310	טיפול היפוקסי
תמונהJ	ה-NIH		משמש לניתוח תמונות מיקרוסקופיה
מיקרוסקופ Leica	Leica Microsystems CMS GmbH	DMIL LED פלואו	תצפית חיה ופלואורסצנטית
פתרון הדמיה של תאים חיים	Invitrogen	A14291DJ	הדמיית תאים חיים
קופסת אחסון רפואית בטמפרטורה נמוכה (-80 ° C)	צ'ינגדאו האייר ביו-רפואי ושות', בע"מ	DW-86L388J	אחסון דגימה לטווח ארוך ב-80 ו-deg; C
משאבת ואקום מיני שולחנית	היימן קילין-בל ייצור מכשירים ושות', בע"מ	גל-805	יישומי ואקום בקנה מידה קטן
MitoTracker כתום CMTMRos	Invitrogen	M7510	צביעה פוטנציאלית של הממברנה המיטוכונדריאלית
תוכנית MRMPROBS		גירסה 2.60	כדי לחלץ נתונים גולמיים של ספקטרומטריית מסה
מדיום נוירובזאלי	ג'יבקו	21103049	מדיום תרבות
נוירובזל-A ללא גלוקוז	ג'יבקו	A2477501	מדיום תרבות
פפאין	וורטינגטון	LS003127	תרבית עצבית
פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6148	קיבוע תאים
PDMS	דאו קורנינג	DC184	ייצור מכשירים
בקבוקון מעכב ערכת PDS	וורטינגטון	LK003182	תרבית עצבית
פניצילין סטרפטומיצין	ג'יבקו	15140122	מדיום תרבות
פוספט חוצץ מלח	ביושארפ	BL302א	לדלל את החומרים ולנקות את מיכלי התאים
מנקה פלזמה	האריק פלזמה	ODC-32G-2	ההפעלה
פולי-D-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6407	תרבית עצבית
פריזמה	GraphPad	גירסה 8.4.3	ניתוחים סטטיסטיים
צנטריפוגה בקירור	Eppendorf AG (גרמניה)	ברקוד 5430R	הפרדת דגימה בטמפרטורות מבוקרות
ערכת מיצוי RNA כוללת של תאים טהורים/חיידקים RNArep	טיאנגן	DP430	טרנסקריפטומיקה
רוטמטר	דווייר	RMA-23-SSV	שלוט בזרימת החמצן הנמוכה
מיקרוסקופ סטריאו	תאגיד אולימפוס	SZ2-ILST	תצפית ונתיחה לדוגמה
סטיוארט אורביטל שייקר	קיילין-בל	TS-200	ערבוב תרביות/תמיסות תאים במהירויות מתכווננות
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	X100	אימונופלואורסצנציה
משאבת ואקום שבשבת סיבובית ULVAC	ULVAC (נינגבו) ושות', בע"מ	GLD-N202	יצירת ואקום לסינון/ייבוש
&בטא; III-טובולין	פרומגה	G7121	אימונופלואורסצנציה