מאמר שיטה

הערכת התערבויות טיפוליות במודל העכבר חסר SHIP של אילייטיס ופיברוזיס דמויי מחלת קרוהן

DOI:

10.3791/68928

⸱

14 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן להשתמש במודל העכבר חסר 5'-אינוזיטול פוספטאז (SHIP) המכיל 5'-אינוזיטול פוספטאז (SHIP) של דלקת איליאלית ופיברוזיס דמויי מחלת קרוהן (CD) לבדיקת טיפולים חדשים ל-CD.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת קרוהן (CD) היא מצב דלקתי כרוני וחוזר המאופיין בדלקת סגמנטלית, טרנסמורלית, שיכולה להשפיע על כל חלק במערכת העיכול. סימן היכר של CD הוא תפקוד לקוי של מחסום המעי, ופיברוזיס במעי הוא סיבוך שכיח. עכברים חסרי SHIP (SHIP-/-) מפתחים באופן ספונטני תפקוד לקוי של מחסום המעי, דלקת איליאלית ופתולוגיה פיברוטית, ומסכמים את המאפיינים העיקריים של דלקת מעיים דמוית CD. עכברי SHIP-/- משמשים כמודל רב ערך לבדיקת טיפולים אנטי דלקתיים ואנטי פיברוטיים ב- CD.

כאן, אנו מתארים שיטות להערכת התערבויות טיפוליות במודל זה, תוך שימוש בדקסמתזון כדוגמה לטיפול יעיל. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לאפיון מחלה ותגובה לטיפול, כולל הערכה in vivo של חדירות המעיים הנמדדת על ידי FITC-dextran, כמו גם בדיקה פתולוגית גסה וניתוחים היסטולוגיים מפורטים. הערכות היסטולוגיות משלבות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) לדלקת, צביעת טריכרום של מאסון לפיברוזיס, וצביעה כחולה/חומצה מחזורית של אלצ'יאן (PAS) להיפרפלזיה של תאי גביע והיפרטרופיה. בנוסף, ציטוקינים וסמנים דלקתיים ברקמת האיליאלית מכומתים כדי להעריך את המצב הדלקתי. יחד, שיטות אלו מספקות מסגרת מקיפה להערכת יעילות הטיפול במודל SHIP-/- עכבר של דלקת דמוית CD. פרוטוקול זה ישים באופן נרחב לחוקרים החוקרים דלקת מעיים, ריפוי רירית ופיברוזיס במעי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני הסוגים העיקריים של מחלות מעי דלקתיות (IBD) הם מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC), שניהם מאופיינים בדלקת כרונית במערכת העיכול (GI) שיכולה לעקוב אחר מהלך התקפי-הפוגתי או מתקדם1. למרות שהיסטורית IBD נחשבה למחלה של מדינות מערביות, שכיחותה עולה במהירות במדינות מתפתחות ברחבי דרום אמריקה, אסיה ואפריקה2. במקביל, השכיחות ממשיכה לעלות בצפון אמריקה, אירופה ואוסטרליה, עם עלייה של כמעט 50% הן בשכיחות והן בשכיחות שדווחו בין 1990 ל-2019, מה שמדגיש את הנטל הבריאותי העולמי ההולך וגדל של IBD 2,3. למרות מאמצי מחקר משמעותיים, הגורם הבסיסי ל-IBD נותר לא ידוע. עדויות עדכניות מצביעות על יחסי גומלין מורכבים בין רגישות גנטית, תפקוד לקוי של מערכת החיסון וטריגרים סביבתיים, כולל שינויים במיקרוביום 4,5.

ישנם הבדלים עיקריים בין CD ל-UC. ב-UC, הדלקת מוגבלת למעי הגס ומאופיינת במעורבות מתמשכת המוגבלת לשכבה הרירית 6,7. לעומת זאת, CD מאופיין בדלקת לא רציפה וטרנסמורלית שיכולה להשפיע על כל חלק במערכת העיכול, לרוב באילאום הטרמינלי 6,7. סיבוך סימן היכר של CD הוא פיברוזיס במעי, התורם להיווצרות היצרות וחסימת מעיים8. פיברוזיס מוגדרת על ידי שקיעה מוגזמת של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כגון קולגן, ועיבוי שכבות שרירי המעי 9,10. כ-30% מהאנשים עם CD מפתחים מחלה היצרה תוך 10 שנים מהאבחנה11. נכון לעכשיו, אין טיפולים המכוונים ישירות לפיברוזיס, צורך קליני שלא נענה שניתן לטפל בו באמצעות מודלים פרה-קליניים מתאימים לחקר סיבוך זה 9,12.

כדי להבין טוב יותר את הפתוגנזה של IBD ולהקל על פיתוח טיפולים חדשים, הוקמו מודלים רבים של עכברים12. בעוד שקיימים מספר רב של מודלים של קוליטיס, רק מעטים מסכמים דלקת איליאלית ופיברוזיס12 הקשור ל-CD. בין אלה ניתן למנות את הומולוגיה Src 2 המכילה 5'-אינוזיטול פוספטאז חסר (SHIP-/-) המתוארים כאן, כמו גם עכברי SAMP1/YitFc ועכברי TnfΔARE. מודלים אלה משקפים באופן קולקטיבי את המורכבות של CD אנושי מכיוון שכל אחד מהם מונע על ידי מנגנונים תאיים ומולקולריים מובחנים. מחלה בעכברי SAMP1/YitFc נובעת מנטייה פוליגנית המשפיעה על תפקוד מחסום האפיתל והוויסות החיסוני13,14, בעוד שעכברי TnfΔARE נושאים מחיקה של יסודות עשירים ב-AU ב-TNF mRNA, מה שמוביל ליציבות מוגברת של mRNA וייצור יתר של TNF15,16. למרות שהם בעלי ערך, למודלים אלה יש מגבלות. מודל SAMP1/YitFc סובל מיעילות רבייה נמוכה, מה שמציב אתגרים ביצירת גדלי עוקבה מספיקים למחקרים17. בנוסף, מודל TnfΔARE דורש עד 24 שבועות לפתח פתולוגיה פיברוטית בולטת, מה שהופך את ביצוע מחקרי ההתערבות ליקר ומאתגר16.

SHIP הוא מווסת שלילי של מסלול האיתות פוספטידילינוזיטול-3-קינאז (PI3K) ומתבטא בעיקר בתאים המטופויאטיים. הוא מתפקד על ידי הסרת קבוצת הפוספט 5' מפוספטידילינוזיטול 3,4,5-טריפוספט, ובכך מחליש את איתות PI3K במורד הזרם18. עכברי SHIP-/- מציעים מספר יתרונות למחקרים פרה-קליניים. עכברים אלה קלים יחסית לגידול ומראים סימני פיברוזיס כבר בגיל 8 שבועות19. השיפוץ הפיברוטי המואץ במודל זה מונע ככל הנראה על ידי תגובות דלקתיות מוגברות עקב מסלול PI3K לא מווסת, מה שמוביל לפעילות יתר של תאי החיסון ולעיצוב מחדש מהיר של רקמות לאחר מכן. והכי חשוב, אנחנו וקבוצתו של קר הראינו באופן עצמאי שעכברי SHIP-/- מפתחים אילייטיס עם תכונות הדומות מאוד ל-CD 19,20 האנושי. תמיכה ברלוונטיות של מודל זה, תת-קבוצה של אנשים עם CD הפחיתה את פעילות ה-SHIP הן בביופסיות איליאליות והן ב-PBMCs21. יתר על כן, אלה עם פעילות SHIP נמוכה נוטים לחוות מהלך מחלה חמור יותר, לעתים קרובות דורש ניתוחים מרובים22.

עכברי SHIP-/- מתחילים לפתח דלקת מעיים ספונטנית ולא רציפה הממוקמת באילאום הדיסטלי כבר בגיל 4 שבועות, כאשר הדלקת קיימת בכל העכברים עד גיל 6 שבועות20. עד גיל 8 שבועות, עכברים ביססו פתולוגיה פיברוטית, המאופיינת בעיבוי של השרירים החיצוניים והצטברות קולגן נרחבת בתת-רירית ובין שכבות השריר19. דלקת במודל זה מונעת על ידי אינטרלוקין-1β שמקורו במקרופאגים (IL-1β)21. הן דלדול המקרופאגים באמצעות ליפוזומים המכילים קלודרונאט, והן חסימה פרמקולוגית של איתות IL-1 עם אנטגוניסט לקולטן IL-1 (אנקינרה) שיפרו את דלקת המעיים בעכברי SHIP-/-21. בנוסף לדלקת מעיים, עכברי SHIP-/- מציגים דלקת ריאות, בה השתמשנו כדי להעריך השפעות מחוץ למטרה של טיפולים המיועדים למתן מעיים מקומי23. אחרים דיווחו כי עיכוב קספאז-8 עם Z-IETD-FMK מפחית באופן משמעותי הן את דלקת הריאות והן את דלקת הריאות בעכברי SHIP-/-24, ותומך עוד יותר בפתולוגיה של הריאות כתכונה נוספת להערכת שליטה דלקתית מערכתית.

מאמר מתודולוגי זה בוחן מחדש את עבודתנו שפורסמה לאחרונה על טיפול מוצלח בדקסמתזון23 ומספק תיאור מפורט של הליכים טכניים מרכזיים, עם שיקולים נוספים לשימוש במודלים של עכברים בבדיקות פרמקולוגיות. באופן ספציפי, אנו מדגישים פרמטרים סטנדרטיים להערכת יעילות תרופות במודלים של IBD, כולל הערכת חדירות מעיים, פתולוגיה גסה, היסטופתולוגיה ומתווכים ואפקטורים פרו-דלקתיים, ודנים כיצד לשלב נתונים אלה כדי להסיק מסקנות לגבי היעילות הטיפולית הכוללת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים הכוללים בעלי חיים צריכים להתבצע בהתאם לפרוטוקולים אתיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ובהתאם להנחיות מועצות המחקר הלאומיות לטיפול בבעלי חיים. כל ההליכים בבעלי חיים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות האתיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית (פרוטוקול A21-0212).

הערה: כדי להעריך את ההשפעה הטיפולית של התרופה על פתולוגיית המעיים של עכברי SHIP-/-, כלול את SHIP+/+ כבקרות בריאות להשוואה. להתערבות טיפולית, יש להתחיל את הטיפול בגיל 6 שבועות, כאשר המחלה מבוססת במלואה במודל. כאן, גם עכברי SHIP+/+ וגם עכברי SHIP-/- קיבלו דקסמתזון יומי דרך הפה במינון של 3 מ"ג/ק"ג ב-0.5% β-ציקלודקסטרין (רכב) או ברכב בלבד במשך שבועיים, בנפח של 10 מיקרוליטר לגרם.

1. בדיקת FITC-dextran למדידת חדירות מחסום האפיתל

  1. עכברים מהירים במשך 4 שעות לפני הבדיקה.
  2. ממיסים 4 kDa FITC-dextan ב-1x PBS סטרילי לריכוז סופי של 80 מ"ג/מ"ל.
  3. הכן מספיק ל-150 מיקרוליטר לעכבר, בתוספת 50 מיקרוליטר נוספים לעקומה הסטנדרטית.
    הערה: צמצם את החשיפה לאור של תמיסת FITC-דקסטרן ודגימות פלזמה לאורך כל ההליך.
  4. לרסן בעדינות (לקשקש) כל עכבר ולתת 150 מיקרוליטר של תמיסת FITC-dextran באמצעות גבאז' דרך הפה.
    הערה: הפעל טיימר מיד לאחר מתן הגוואג' הראשון. המתן 10-15 דקות בין כל עכבר עוקב כדי לאפשר מספיק זמן לביצוע המתת חסד והליכים במורד הזרם בצורה מדורגת, תוך מזעור השונות עקב הבדלי תזמון.
  5. שמור על עכברים ללא אוכל למשך 4 שעות.
  6. המתת חסד של עכברים באמצעות 5% איזופלורן (חומר הרדמה משאף המסופק עם 1.5 ליטר חמצן לדקה) ואחריו פחמן דו חמצני בהתאם לנוהל המוסדי הסטנדרטי. אסוף דם באמצעות ניקוב לב עם מחטים של 25 גרם ומזרקים של 1 מ"ל.
  7. הוסף מיד 10 מיקרוליטר של תמיסת חומצה-ציטראט-דקסטרוז לכל 100 מיקרוליטר של דם שנאסף כנוגד קרישה. מערבבים היטב על ידי היפוך.
  8. צנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ומעבירים בזהירות פלזמה (סופרנטנט) לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים של 1.7 מ"ל. שמור דגימות על קרח ומוגן מפני אור עד לניתוח.
  9. מדללים כל דגימת פלזמה 1:2 ו-1:10 עם 1x PBS.
  10. הוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול לצלחת אטומה של 96 בארות בכפילויות.
  11. בצע דילול סדרתי של 1:2 של מלאי ה-FITC-dextran המקורי של 80 מ"ג/מ"ל באמצעות 1x PBS כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 3000, 1500, 750, 375, 187.5, 93.8, 46.9, 23.4 ו-0 ננוגרם/מ"ל. הוסף 100 מיקרוליטר מכל ריכוז לצלחת 96 הבארות בשכפול.
  12. מדוד פלואורסצנטיות בעירור של 485 ננומטר ופליטה של 535 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

2. הערכה פתולוגית גסה

  1. לאחר איסוף הדם לבדיקת FITC-dextran, יש לכרות בזהירות את כל המעי הדק.
  2. הסר בעדינות כל שומן ורקמת חיבור מחוברים.
    הערה: היזהר בעת הטיפול ברקמה, מכיוון שאזורים חולים עלולים להיות שבירים ונוטים לקריעה.
  3. הניחו את המעי שטוח על דף נייר לבן ריק לניגודיות אופטימלית. בדוק ויזואלית את הרקמה לאיתור סימני מחלה מקרוסקופיים. הדלקת ממוקמת בדרך כלל ב-10 ס"מ הדיסטליים של המעי הדק בעכבר SHIP-/-.
    הערה: מאפיינים מקרוסקופיים עיקריים להערכה כוללים שינויי צבע, כאשר אזורים מראים אדמומיות או היפרמיה גלויה ביחס לרקמה סמוכה שנראית תקינה. בנוסף, בדוק אם יש עיבוי רקמות, מכיוון שהאזורים הפגועים עשויים להיראות נפוחים, בצקתיים או נוקשים במישוש עדין. חפש נוכחות של דם, שעשוי להופיע ככתמים דימומיים גלויים, שינוי צבע אדום כהה או דם דביק.
  4. יישר את המעי ליד סרגל לקנה מידה וצלם תמונה כדי לתעד את הממצאים הפתולוגיים הגסים.

3. הערכה היסטולוגית

  1. יש להסיר את תוכן המעיים על ידי שטיפה עדינה של הלומן עם PBS 1x באמצעות מזרק. אל תפעיל יותר מדי כוח על הרקמה, מכיוון שהדבר עלול לעוות את ארכיטקטורת הווילוס והקריפטה.
  2. זהה וקצור כ -1 ס"מ מהאילאום הדיסטלי המייצג ביותר את הפתולוגיה הגסה. כלול אזורים מושפעים גלויים, אם קיימים. לצורך השוואות (SHIP+/+ לעומת SHIP-/-), ודא שהרקמות נאספות ממיקומים אנטומיים תואמים.
    הערה: להערכה ראשונית של יעילות הטיפול, מומלץ להכין את האילאום כרול שוויצרי. שיטה זו מספקת הדמיה גלובלית של מחלות ומפחיתה את הטיית הדגימה.
  3. הניחו את הרקמה שטוחה בקלטת היסטולוגית, והניחו אותה בין ספוגים למניעת קיפול.
  4. עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה טריכרומית של מאסון, יש לקבע את הרקמה בפורמלין ניטרלי של 10% למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תוך שימוש לפחות פי 10-20 מנפח הרקמה (כ-5 מ"ל לקלטת) ולוודא שכל הקסטות שקועות במלואן. העבירו קלטות ל-70% אתנול לאחסון, ושמרו אותן שקועות לחלוטין עד לעיבוד.
    הערה: 10% פורמלין, חומר קיבוע המכיל 3.7% פורמלדהיד, הוא חומר מגרה נשימתי חזק, רגיש לעור, ומסווג כמסרטן בבני אדם. שאיפה, בליעה או מגע בעור עלולים לגרום לרעילות חריפה, בעוד שחשיפה כרונית עלולה להגביר את הסיכון לסרטן. יש לבצע את כל ההליכים הכרוכים בפורמלין במכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל חלוק מעבדה, כפפות עמידות בפני כימיקלים והגנה על העיניים. איסוף פסולת במיכלים המסומנים בבירור "פסולת פורמלין" לסילוק נכון על פי פרוטוקולי פסולת מסוכנת מוסדית. יש להתייחס לכל החומרים המזוהמים בפורמלין (למשל, קצות פיפטות, רקמות, כפפות) כפסולת מסוכנת כימית ולהשליך אותם בהתאם לנהלים המקומיים של בריאות ובטיחות סביבתית (EHS).
  5. לצביעה של Alcian blue/PAS, יש לקבע את הרקמה בתמיסה של קרנוי (60% אתנול, 30% כלורופורם ו-10% חומצה אצטית קרחון) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, תוך שימוש בכ-5 מ"ל לקלטת או פי 10-20 מנפח הרקמה. העבירו קלטות ל-100% אתנול לאחסון עד לעיבוד.
    הערה: התמיסה של קרנוי מורכבת מ-60% אתנול, 30% כלורופורם ו-10% חומצה אצטית קרחונים. תערובת זו נדיפה מאוד, דליקה ורעילה. יש לטפל בתמיסה של Carnoy אך ורק בקולט אדים ולאחסן במיכלים אטומים היטב הרחק ממקורות חום או הצתה. יש לאסוף את הפסולת של קרנוי במיכלים ייעודיים לממיסים אורגניים מעורבים ולהשליך בהתאם להנחיות הפסולת המסוכנת המוסדית. יש להתייחס לכל החומרים המזוהמים בתמיסה של קרנוי כפסולת מסוכנת מבחינה כימית.
  6. הטמיעו רקמות בפרפין וחתכו קטעים של 5 מיקרומטר לצביעה.
  7. ציין את החלקים האילאליים המוכתמים ב-H&E בסולם של 16 נקודות על פי הקריטריונים בטבלה 1. ציון הנזק ההיסטולוגי הסופי נקבע על ידי חישוב ממוצע הציונים של 2 סוקרים, העיוורים לתנאי הניסוי.
  8. הערך את חתכי הרוחב המוכתמים בטריכרום של מאסון באמצעות סולם של 6 נקודות בהתבסס על הקריטריונים בטבלה 2. ציון הפיברוזיס הסופי מחושב כחציון הציונים שהוקצו על ידי שני סוקרים עצמאיים עיוורים לתנאי הניסוי.

4. הערכת ציטוקינים

  1. לאחר דיסקציה והסרה של הדגימה ההיסטולוגית, יש לאסוף את החלק הנותר של 10 ס"מ הדיסטליים של האילאום.
  2. כתם את הרקמה יבשה ורשום את המשקל. הקפאת בזק בחנקן נוזלי ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.
  3. כשהוא מוכן לעיבוד, אחזר את הרקמה ושמור אותה על קרח כל הזמן.
  4. שקלו את דגימות הרקמה. הכן מאגר הומוגניזציה מספיק עבור כל הדגימות על ידי הוספת מעכבי פרוטאז ל-1x PBS (אפרוטינין ולאופפטין, כל אחד ב-10 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש ב-10 מיקרוליטר של בופר לכל מ"ג רקמה (למשל, 100 מ"ג של רקמה דורש 1 מ"ל של בופר).
    הערה: יש להכין מאגר הומוגניזציה טרי ביום ההומוגניזציה כדי להבטיח שמעכבי פרוטאז יעילים.
  5. הומוגניזציה של הרקמה האיליאלית בעובי מלא במאגר הומוגניזציה קר כקרח באמצעות הומוגנייזר ספסל. ודא שההומוגנט אחיד וללא שברי רקמה גלויים. שטפו היטב את קצה ההומוגנייזר עם PBS בין הדגימות כדי למנוע זיהום צולב.
  6. צנטריפוגה הרקמה הומוגנית ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. יש להצמיד את הסופרנטנטים המובהרים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.
  8. בצע בדיקות אימונוסורבנט מקושרות לאנזים (ELISAs) על סופרנטנטים מבהירים כדי לכמת ציטוקינים מעניינים, על פי הוראות היצרנים.
    הערה: הצפיפות האופטית ב-450 ננומטר נמדדה באמצעות קורא המיקרו-פלטות Varioskan LUX עם תוכנת Skanlt RE 7.0.2, עם אורך גל ייחוס של 570 ננומטר לתיקון. Microsoft Excel שימש לניתוח נתונים, וערכי ספיגה בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית עברו אינטרפולציה כדי לקבוע את ריכוזי הציטוקינים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- בני 6 שבועות קיבלו דרך הפה 0.5% β-ציקלודקסטרין (בקרת רכב; n = 6/גנוטיפ) או 3 מ"ג/ק"ג של דקסמתזון (n = 6/גנוטיפ) מדי יום במשך שבועיים. העיתוי ומשך הטיפול תלויים במודל וצריכים לקחת בחשבון את הופעת המחלה וקצב התקדמותה, כמו גם האם ההתערבות מיועדת להיות מונעת או טיפולית. יש להשתמש במספר שווה של עכברים זכרים ונקבות בניסויים. למרות שלא זיהינו הבדלים מבוססי מין בהיסטוריה הטבעית של מחלה בעכברי SHIP-/-, פרוטוקולי טיפול שונים עשויים להראות תגובות ספציפיות למין. במודל זה, ניתן להשתמש בטיפול מונע מגיל 4-6 שבועות כדי למנוע הופעת דלקת ופיברוזיס, בעוד שניתן להשתמש במשטרי טיפול המבוצעים מגיל 6-8, 8-10 או 6-10 שבועות כדי להעריך את יעילות הטיפול במחלה מבוססת. מינון ותזמון אופטימליים צריכים להיות מונחים על ידי מחקרי הספרות והטיטרציה. הראינו בעבר כי משטר מינון זה של דקסמתזון יעיל כאשר הוא ניתן לאחר התפתחות דלקת אילאלית.

ציר זמן מומלץ ליום הקציר מתואר באיור 1A. דקסמתזון לא גרם לפתולוגיה כלשהי של המעי בעכברי SHIP+/+ על סמך בדיקה גסה. עכברי SHIP-/- הראו אזורים גלויים של אדמומיות ועיבוי, המעידים על דלקת. מאפיינים פתולוגיים גסים אלה נעדרו בעכברי SHIP-/- שטופלו בדקסמתזון (איור 1B). כדי להעריך את תפקוד מחסום המעי, ריכוזי הפלזמה של FITC-dextán נמדדו לאחר גבאז' דרך הפה. למרות שלא היה מובהק סטטיסטית, לעכברי SHIP-/- היו ריכוזי FITC-dextan גבוהים בפלזמה בהשוואה לבקרות SHIP+/+, מה שמרמז על חדירות מעיים מוגברת. טיפול בדקסמתזון הפחית את ריכוזי ה-FITC-dextan בעכברי SHIP-/- לריכוזים דומים לאלה שנצפו בעכברי SHIP+/+ (איור 1C).

בדיקה היסטולוגית של חתכי מעיים מעכברי SHIP-/- חשפה מאפיינים פתולוגיים מובהקים, כולל חדירת תאי חיסון, ארכיטקטורת קריפטה משובשת, היפרפלזיה/היפרטרופיה של תאי גביע, ועיבוי שכבת השרירים (איור 2A). מאפיינים אלה באו לידי ביטוי בציוני נזק היסטולוגי גבוהים יותר באופן משמעותי בהשוואה לעכברי SHIP+/+ (p = 0.0005, איור 2B). נזק היסטולוגי לא נצפה בעכברי SHIP+/+ שטופלו בדקסמתזון. בהתאם לשיפורים שנראו בפתולוגיה גסה ובתפקוד המחסום, דקסמתזון הפחית את ההיסטופתולוגיה בעכברי SHIP-/-, אם כי ההשפעה לא הייתה מובהקת סטטיסטית (p = 0.0981, איור 2A ואיור 2B). צביעת הטריכרום של מאסון חשפה שקיעת קולגן משמעותית ברקמות המעי SHIP-/-, מלווה בציוני פיברוזיס גבוהים משמעותית בהשוואה לבקרות SHIP+/+ (איור 2C). דקסמתזון החליש ביעילות את המאפיינים הפיברוטיים בעכברי SHIP-/-, והוריד את ציוני הפיברוזיס לערכים דומים לאלו של בקרות SHIP+/+ (איור 2C). בנוסף, צביעה כחולה/PAS של Alcian אישרה היפרפלזיה/היפרטרופיה של תאי גביע בעכברי SHIP-/-, אשר הופחתה עם טיפול בדקסמתזון (איור 2D).

כדי להעריך את ריכוזי הציטוקינים הדלקתיים, ELISAs בוצעו על הומוגנטים של רקמות איליאליות בעובי מלא (איור 3A). ריכוזי IL-1β היו גבוהים משמעותית בעכברי SHIP-/- בהשוואה לבקרות SHIP+/+ (p = 0.0468), מה שעולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים המתאמים ביטוי IL-1β לחומרת המחלה במודל זה. טיפול בדקסמתזון הפחית משמעותית את ריכוזי IL-1β בעכברי SHIP-/- (p = 0.0023). בהתאם לדיווחים קודמים, ריכוזי IL-6 או TNF לא היו שונים בין ארבע קבוצות הניסוי. מדדנו גם ריכוזים של החלבונים הקשורים לנויטרופילים מיאלופרוקסידאז (MPO) וליפוקלין-2 (LCN-2) בהומוגנטים אילאליים בעובי מלא כסמנים ביוכימיים נוספים של דלקת (איור 3B). גם ריכוזי MPO וגם LCN-2 היו גבוהים משמעותית (p = 0.0031 ו- p = 0.0002 בהתאמה) בעכברי SHIP-/- בהשוואה לבקרות SHIP+/+, אם כי העלייה ב-LCN-2 נבעה בעיקר מריכוזים גבוהים שנמדדו ב-2 מתוך 6 עכברים. טיפול בדקסמתזון הפחית את MPO והפחית את LCN-2 באופן מתון, ההבדלים לא היו משמעותיים. נתונים אלה מצביעים על כך ש-MPO הוא סמן שימושי לדלקת בעכברי SHIP-/-, בעוד שריכוזי LCN-2 אינם עקביים או אמינים באותה מידה.

כדי לחקור את הקשר בין מאפיינים דלקתיים ופיברוטיים במודל העכבר SHIP-/-, ביצענו ניתוחי מתאם של ספירמן באמצעות ציוני נזק היסטולוגי, ציוני פיברוזיס וריכוזי IL-1β מרקמה איליאלית בעובי מלא (איור 4). ריכוזי IL-1β נמצאים בקורלציה חיובית עם ציוני נזק היסטולוגי (r = 0.6813), מה שמצביע על כך שדלקת מוגברת הייתה קשורה לנזק מוגבר לרקמות (איור 4A). כמו כן נצפה מתאם בינוני בין ריכוזי IL-1β לבין ציוני פיברוזיס (r = 0.4117), מה שמרמז על קשר בין ייצור ציטוקינים דלקתיים לבין שיפוץ פיברוטי (איור 4B). בנוסף, ציוני נזק היסטולוגי היו בקורלציה משמעותית עם ציוני פיברוזיס (r = 0.6241), מה שמרמז על כך שנזק מבני ופיברוזיס מתקדמים במקביל בעכברי SHIP-/- (איור 4C).

figure-results-1
איור 1: דקסמתזון מפחית פתולוגיה וחדירות מעיים גסים בעכברי SHIP-/-. עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- נבדקו דרך הפה מדי יום עם 0.5% β-ציקלודקסטרין כבקרת רכב (VC) או דקסמתזון (Dex; 3 מ"ג/ק"ג) מגיל 6 עד 8 שבועות. (A) לוח זמנים ניסיוני מומלץ. (B) הוערכה מורפולוגיה גסה של הצקום והאילאום הדיסטלי, ומוצגות תמונות מייצגות (n = 4-6 עכברים לקבוצה). כוכביות מציינות אזורים של אדמומיות ועיבוי כתמים שנצפו בבדיקה גסה. התמונות נועדו לשמש דוגמאות מייצגות לפתולוגיה כוללת ואינן מיועדות לניתוח כמותי. (C) כדי להעריך את חדירות המעי, עכברים היו בצום במשך 4 שעות וקיבלו 80 מ"ג/מ"ל FITC-דקסטרן. לאחר 4 שעות נוספות של צום, נאסף דם באמצעות ניקור לב, ונמדדו ריכוזי FITC-דקסטרן בפלזמה. הנתונים מוצגים כממוצע±SD. הפס האפור מייצג את טווח ריכוזי ה-FITC-dextan בפלזמה שנצפו בדרך כלל בעכברי C57BL/6 בריאים ארבע שעות לאחר gavage25. המובהקות הסטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דקסמתזון מפחית את ציוני הנזק ההיסטולוגי, קולגן, עובי השריר והיפרפלזיה והיפרטרופיה של תאי גביע באילאום הדיסטלי של עכברי SHIP-/-. עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- נבדקו דרך הפה מדי יום עם 0.5% β-ציקלודקסטרין כבקרת רכב (VC) או דקסמתזון (Dex; 3 מ"ג/ק"ג) מגיל 6 עד 8 שבועות. (A) חתכים איליאליים מוכתמים ב-H&E מעכברים צולמו בהגדלה של פי 10; פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ציוני נזק היסטולוגי עבור עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- מבוטאים כחציון ±-IQR. (C) חתכים אילאליים קבועים הוכתמו בטריכרום של מאסון לפיברוזיס; קולגן מוכתם בכחול. התמונות צולמו בהגדלה של פי 10; פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. ציוני פיברוזיס עבור עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- מבוטאים כחציון ±-IQR. (D) חתכים אילאליים קבועים היו מוכתמים בכחול אלציאני/PAS. התמונות צולמו בהגדלה של 10×; פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. כל החלקים מייצגים n = 6 עכברים לקבוצה (למעט SHIP+/+ Dex ו-SHIP-/- Dex, n = 5). המובהקות הסטטיסטית לציון הנזק ההיסטולוגי נקבעה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דקסמתזון מפחית את ריכוזי IL-1β בהומוגנטים אילאליים בעובי מלא מעכברי SHIP-/-. עכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- נבדקו דרך הפה מדי יום עם 0.5% β-ציקלודקסטרין כבקרת רכב (VC) או דקסמתזון (Dex; 3 מ"ג/ק"ג) מגיל 6 עד 8 שבועות. (A) ריכוזי IL-1β, TNF ו-IL-6 נמדדו בהומוגנטים אילאליים בעובי מלא. (B) ריכוזי מיאלופרוקסידאז (MPO) וליפוקלין-2 (LCN-2) נמדדו בהומוגנטים של רקמות איליאליות בעובי מלא. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ניתוחים סטטיסטיים נערכו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ריכוזי IL-1β נמצאים בקורלציה חיובית עם נזק היסטולוגי ומתאם פיברוזיס ופיברוזיס עם ציון הנזק ההיסטולוגי בעכברי SHIP-/-. ניתוח מתאם ספירמן בוצע כדי להעריך קשרים בין ציון נזק היסטולוגי, ציון פיברוזיס וריכוזי IL-1β ברקמה איליאלית בעובי מלא מעכברי SHIP-/-. נצפו מתאמים חיוביים משמעותיים בין (A) ציון נזק היסטולוגי וריכוזי IL-1β (r = 0.6813), (B) ציון פיברוזיס וריכוזי IL-1β (r = 0.4117), ו-(C) ציון נזק היסטולוגי וציון פיברוזיס (r = 0.6241). כל נקודת נתונים מייצגת עכבר בודד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

רכיב נזקהציון
אובדן ארכיטקטורת קריפטה0 = אין
1 = אובדן <25%
2 = הפסד של 25-50%
3 = הפסד של 50-75%
4 = >75% הפסד
חדירת תאי חיסון0 = אין
1 = תא חיסוני מזדמן בלמינה פרופריה
2 = תאי חיסון מוגברים בלמינה פרופריה
3 = תאי חיסון מתכנסים בלמינה פרופריה ורירית פורצת
4 = חדירת תאי חיסון לאורך כל הקטע
היפרפלזיה והיפרטרופיה של תאי גביע0 = אין
1 = עלייה של <50% במספר תאי הגביעים וגודלם
2 = עלייה של >50% במספר תאי הגביעים וגודלם
כיב0 = אין
1 = כיב ביניים
2 = כיב משמעותי
בצקת0 = אין
1 = <50% מהמקטע
2 = >50% מהמקטע
עיבוי שרירים0 = אין
1 = עיבוי ביניים
2 = עיבוי משמעותי

טבלה 1: ציוני נזק היסטולוגי. נזק היסטולוגי של חתכים איליאליים מעכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- שנצבעו ב-H&E נמדדים על סמך המאפיינים העיקריים של אילייטיס המאפיינים את מודל העכבר SHIP-/-, כולל אובדן ארכיטקטורה (0-4), חדירת תאי חיסון (0-4), היפרפלזיה והיפרטרופיה של תאי גביע (0-2), כיב (0-2), בצקת (0-2) ועיבוי שרירים (0-2).

רכיב פיברוזיסהציון
עודף קולגן0 = ארכיטקטורה רגילה; ללא עודף קולגן
1 = עלייה קלה בקולגן; מוגבל לתת-רירית או תת-רירית
2 = התרחבות מתונה של קולגן לתת-רירית ולשרירים פרופריים חלקיים, עם צרורות לא מאורגנים
3 = קולגן נרחב וצפוף המחליף מבנה תקין, הכולל תת-רירית ושרירים (טרנסמורליים)
היפרפלזיה פיברומוסקולרית / שרירים / מחיקה שרירית של התת-רירית0 = אין, תכולת תת-רירית שריר תקינה
1 = עלייה קלה בתכולת השרירים
2 = כמות גדולה של שריר בתת-רירית, משפיעה על המורפולוגיה אך על המבנה התקין
3= השריר מחק את כל החלל התת-רירי

טבלה 2: ניקוד פיברוזיס. פיברוזיס בחתכים איליאליים מעכברי SHIP+/+ ו-SHIP-/- שנצבעו בטריכרום של מאסון דורגו על סמך מאפיינים עיקריים של פיברוזיס במעי שנצפו במודל SHIP-/-, כולל שקיעת קולגן מוגזמת (0-3) והיפרפלזיה פיברומוסקולרית או מחיקה שרירית של תת-הרירית (0-3). קולגן מוערך מבחינת היקף והפרעה ארכיטקטונית, ואילו שינויים בשרירים מוערכים על סמך מידת חדירת השרירים ועיוות המבנה התת-רירי.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר נהלים להערכת דלקת מעיים ופיברוזיס במעי בעכברי SHIP-/-, מודל עכברי של דלקת מעיים דמוית CD עם פתולוגיה פיברוטית נלווית. מודל העכבר SHIP-/- מסכם מאפיינים של CD שאינם נראים בדרך כלל במודלים אחרים של דלקת מעיים בעכברים, במיוחד הלוקליזציה האילאלית, דלקת טלאית וטרנסמורלית ופתולוגיה פיברוטית19,26. בשילוב עם קלות הרבייה והזמן הקצר לביטוי המחלה, מודל SHIP-/- ממוקם היטב ככלי רב עוצמה למחקר תרגומי ב-CD19.

במחקר זה, מובהקות סטטיסטית עבור מבחן FITC-dextan והניקוד ההיסטולוגי הוערכה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, מכיוון שמערכי נתונים אלה לא עמדו בהנחות הנורמליות הנדרשות עבור ANOVA חד כיווני, וציונים היסטולוגיים מייצגים משתנים לא רציפים ולא פרמטריים. בעוד שהניתוחים שלנו לא הניבו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות שטופלו בדקסמתזון לקבוצות שטופלו ברכב, הבחנו במגמות ברורות. דקסמתזון הפחית את חדירות המעיים והיסטופתולוגיה של עכברי SHIP-/-, וייתכן שהשפעות אלה הגיעו למשמעות עם גדלי מדגם גדולים יותר.

מספר אתגרים טכניים עשויים להתעורר בעת ביצוע פרוטוקול זה. ביחס לטיפול ברקמות, SHIP-/- ilea דורש מניפולציה עדינה במהלך דיסקציה מכיוון שהם נוטים להיקרע. זה חשוב במיוחד בעת הכנת רקמות להדמיה גסה. קיבוע רקמות הוא גורם קריטי נוסף לניתוח היסטולוגי. רקמה קבועה פורמלין מתאימה הן לצביעה הטריכרומית של H&E והן לצביעה של מאסון, אך אינה תואמת לצביעה של Alcian Blue/PAS. לעומת זאת, הרקמה הקבועה של קרנוי מתאימה לצביעה של H&E ו-Alcian Blue/PAS אך לא לטריכרום של מאסון. הקיבעון של קרנוי מוביל לכתמים עזים ומפוזרים בכחול כהה, המסתירים את הדמיית הקולגן ושכבת השרירים. לניתוח ציטוקינים, חיוני לעבד דגימות על קרח מכיוון שציטוקינים רגישים מאוד לפירוק. זה קריטי להבהיר רקמות הומוגנטיות מיד לאחר העיבוד. מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים עלולים לפגוע באופן משמעותי בשלמות הציטוקינים ולערער את כל ההבדלים הפוטנציאליים בין גנוטיפים ו/או קבוצות טיפול. לבסוף, כדי להבטיח כימות מדויק, אנו ממליצים לבצע דילולים מרובים של כל דגימה כדי לאשר שהקריאות נופלות בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית של הבדיקה וכדי למזער הפרעות פוטנציאליות ממטריצת הרקמות המורכבת. התייחסות לשיקולים טכניים אלה חיונית כדי ליצור תוצאות הניתנות לשחזור ולפירוש, אך יש לנהל בזהירות גם את השונות הביולוגית הטבועה בעכברי SHIP-/-.

ישנם מספר היבטים קריטיים של עכברי SHIP-/- שיש לקחת בחשבון ולשלוט בהם בקפידה כדי להבטיח שחזור ולמזער משתנים מבלבלים. למיקרוביום המעי יש השפעה עמוקה על התפתחות מחלות ותגובות טיפוליות במודלים של IBD של עכברים27,28. עבודתנו הקודמת הראתה כי דלקת מעיים בעכברי SHIP-/- תלויה במיקרוביוטה וניתן לשפר אותה באמצעות אנטיביוטיקה29. לכן, יש להשתמש בבקרות המלטה כדי להפחית את השונות המונעת על ידי מיקרוביום, ויש לאזן את קבוצות הטיפול למקור כלוב30. בנוסף, התאמת מין זהירה היא חיונית. למרות שלא נצפו הבדלים מבוססי מין בחדירה או בחומרת המחלה בעכברי SHIP-/-, מודלים אחרים של אילייטיס כגון SAMP1/YitFc, מציגים הופעה מוקדמת יותר וחומרת מחלה מוגברת בנקבות14,31. מכיוון שהורמוני מין יכולים גם לווסת את הרכב החיידקים32, התאמה למין היא קריטית כדי למזער מבלבלים פוטנציאליים במחקרי טיפול. יתר על כן, טיפולים פרטניים המוערכים עשויים להיות בעלי יעילות דיפרנציאלית בעכברים זכרים ונקבות. למרות שהממצאים הנוכחיים שלנו אינם חושפים הבדלים הקשורים למין במחלה או בתגובה טיפולית לדקסמתזון, יש לבצע התאמת מין בכל מחקרי הטיפול.

בנוסף לשיקולי המיקרוביום והמין שתוארו לעיל, חשוב לכלול עכברי SHIP+/+ במחקרי טיפול כדי להעריך את ההשפעות של הרכב והחומרים הטיפוליים בהיעדר דלקת מעיים. זה מבטיח שהתרופה ושיטת האספקה שלה לא גורמים או תורמים לפתולוגיה במעי הבריא, ובכך משפרים את הפרשנות של היעילות והבטיחות הטיפולית.

תזמון ההתערבות הטיפולית חיוני גם הוא ויש לשנות אותו בהתאם למטרות הניסוי, שכן ישנם הבדלים משמעותיים הן בדלקת והן בפיברוזיס בעכברים בגיל 4, 8 ו-12 שבועות19,26. עכברי SHIP-/- מפתחים דלקת מעיים כבר בגיל 4 שבועות, כאשר כל העכברים מציגים דלקת עד גיל 6 שבועות, וניתן למדוד סמנים של פתולוגיה פיברוטית כבר בגיל 6 שבועות והם מבוססים היטב עד גיל 8 שבועות19,26. לפיכך, טיפולים המכוונים לדלקת איליאלית צריכים להתחיל בגיל 6 שבועות. ניתן להתחיל התערבויות אנטי-פיברוטיות באופן מניעתי לאחר 6 שבועות או באופן טיפולי בין 8-10 שבועות. עם זאת, הופעת המחלה וחומרתה עשויים להשתנות בהתאם לסביבה המיקרוביאלית, השונה בין המתקנים. על החוקרים לקבוע תחילה את קינטיקה של המחלה במושבה שלהם לפני יישום פרוטוקולי טיפול. בנוסף, עכברי SHIP-/- יכולים להציג ירידה של עד 17% במשקל עד 4-5 שבועות, עם 5% נוספים עד 8-10 שבועות33. יש להוציא ממחקרים בעלי חיים המציגים ירידה עמוקה במשקל, מכיוון שהדבר משקף ביטוי חמור של מחלה ועלול לפגוע בתוצאות הטיפול הקשורות לפתולוגיה של המעי.

שיקול חשוב בעת ניתוח התקדמות המחלה במודל SHIP-/- הוא בחירת סמנים דלקתיים מתאימים. בהתבסס על הניסיון הרב שלנו עם עכבר SHIP-/-, פרופיל ציטוקינים מתמקד בדרך כלל במתווכים ספציפיים, כגון IL-1β, הידוע כמווסת במהלך התקדמות המחלה. עם זאת, לאפיון ראשוני של תגובות דלקתיות או בעת הערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות, מומלץ לבצע ניתוח ציטוקינים מרובים. גישה בלתי משוחדת זו מאפשרת פרופיל רחב יותר של הסביבה הדלקתית ועשויה לחשוף מטרות בלתי צפויות הרלוונטיות לפתוגנזה של מחלה או לתגובה לטיפול.

דגם העכבר SHIP-/- מציע יתרונות מעשיים המאפשרים שחזור ויעילות. עכברי SHIP-/- מפתחים דלקת איליאלית ספונטנית ועקבית ופיברוזיס ללא צורך בטריגרים אקסוגניים. זה מבטל את השונות הקשורה להכנת ריאגנטים ופרוטוקולי מינון לא סטנדרטיים בעת גרימת דלקת במעי. הופעת המחלה מהירה, כאשר הדלקת ניכרת בגיל 4-6 שבועות ופיברוזיס בגיל 8 שבועות, מה שהופך את המודל לחסכוני בזמן ובעלות. בנוסף, קל לגדל ולתחזק עכברי SHIP-/- , הגנוטיפ הוא פשוט, ואין צורך באסטרטגיות רבייה מיוחדות. זה מפשט את ניהול המושבה, מפחית את עומס העבודה הטכני ומפחית את הסיכון להכנסת שונות גנטית לא מכוונת 19,21,26. ניתן להעריך מחלה באופן מהימן באמצעות טכניקות זמינות ברוב מסגרות המחקר, כולל בדיקת FITC-dextran, צביעת הטריכרום של H&E ומאסון ו-ELISA. תכונות משולבות אלה תומכות בתכנון מחקר יעיל, מחסומים פיננסיים וטכניים נמוכים יותר ומקדמות יצירת נתונים עקבית בין מעבדות.

בעוד שמודל SHIP-/- מציג יתרונות ייחודיים, למודל יש גם מגבלות. כמו בכל המודלים הפרה-קליניים, הוא אינו יכול לשכפל באופן מלא את האופי המורכב והרב-גורמי של IBD אנושי, המושפע מגורמים גנטיים, חיסוניים וסביבתיים34. דגמי DSS ו-TNBS נותרו פופולריים מאוד בשל פשטותם וחסכוניותם. בשילוב עם שינויים גנטיים, מודלים כימיים אלה יכולים לשמש כלים יעילים להבנת תרומות ספציפיות לגן לתפקוד המחסום35. עם זאת, התועלת העיקרית שלהם טמונה במידול פגיעה אפיתלית חריפה; הם אינם מצליחים ללכוד את הפתולוגיה הכרונית המתווכת על ידי מערכת החיסון המאפיינת את CD, ואת מנגנון הנזק לאפיתל שלהם הנגרם על ידי חומרים כימיים חסרי רלוונטיות קלינית ישירה36. הסתמכות בלעדית על מודל אחד עלולה לגרום להערכה חלקית ו/או מטעה של הפוטנציאל הטיפולי, ומומלץ להשתמש במספר מודלים כדי להיות בטוחים ביעילות הטיפול.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי המתקן לטיפול בבעלי חיים במכון המחקר של בית החולים לילדים בקולומביה הבריטית ומימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה באמצעות רשת הגליקומיקס הקנדית (GlycoNet, רשת של מרכז מצוינות) והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (MOP-133607 ל-LS). ק.ס. ו-ו.מ. הם מקבלי מלגות הדוקטורט של TRIANGLE (TRaIning a New generation of Researchs in Gastroenterology and LivEr program).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.7 מ"ל מיקרוטיוב עם כיסוי סנאפ דיומדSPE155-N
1x DPBS (בלי סידן כלוריד, בלי מגנזיום כלורי)גיבקוהפניה 14190-144
25G x figure-materials-1” Needles BD305122 מקורלניקוב לב
26G x figure-materials-2” מחטיםBDרפרנס 305110הדחת מעיים
חומצה אצטיתסיגמא-אלדריץ'A6283היסטולוגיה
תמיסת דקסטרוז חומצי ציטראט (38 מ"מ חומצה ציטרית, 107 מ"מ ציטראט נתרן ציטרוט, 136 מ"מ דקסטרוז)מיליפור סיגמאC3821
מחט האכלה לבעלי חיים, לא סטרילית, רב-פעמית, סוג 304SSמיליפור סיגמא CAD7900 ל-gavage
ישר
מידה: 24G,
Lxdiam. 1 אינץ'. x 1.25 מ"מ,
כדור
אפרוטיניןקיימן כימיקל9087-70-1בופר הומוגניזציה
BD Luer-Lok מזרק סטרילי, לשימוש חד-פעמי, 5 מ"לBDהפניה 309646הדחת מעיים
ערכת עכבר BD OptEIA IL-6 ELISABD ביוסיינסס555240
BD OptEIA עכבר TNF ELISA Set IIBD ביוסיינסס558534
BD® מזרק Luer Slip Tip סטרילי, לשימוש חד-פעמי, 1 מ"לBDהפניה 309659
רפידות קצף ביופסיה מרובעות, 30.2 x 25.4 x 2 מ"מ H.Simport Scientificמקור M476-1היסטולוגיה
פורמלדה-טרי עם בופר (ריח נמוך 10% פורמלין)פישר כימיקלSF93-4היסטולוגיה
לוחות חיסון שקופים עם תחתית שטוחה ולא-סטריליים מסוג 96 בארותתרמו-סיינטיפיק439454
Eppendorf 5415R צנטריפוגה מקוררת  מרשל סיינטיפיקEP-5415R
אלכוהול אתילי אנהידרוסגרינפילד גלובלP016EAANהיסטולוגיה
קלטת רקמות פישרברנד TRU-FLOWפישר סיינטיפיק15-200-403היסטולוגיה
FITC-dextran, 3-5kDa (1g)מיליפור סיגמאFD4-1G
מספר CAS: 60842-46-8
לופטיןמיליפור סיגמא103476-89-7בופר הומוגניזציה
עכבר IL-1 בטא/IL-1F2 DuoSet ELISA R& D SystemsDY401
פלטת 96 בארות רב-מסכים, תחתית מוצקהמיליפור סיגמאMSSWNFX40לבן, לא סטרילי, לא מטופל
כלורופורם אומניפורמיליפור סיגמא3150היסטולוגיה
הומוגנייזר פוליטרון PT-MR2100קינמטיקה AG632081
קורא מיקרופלט רב-מצבי Varioskan Luxתרמו-סיינטיפיקVL0L00D0

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SHIPFITC DextranMasson s Trichrome

מאמרים קשורים