מאמר שיטה

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

DOI:

10.3791/68939

⸱

21 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסימות מיקרווסקולריות במוח נפוצות יחסית אך עדיין נחקרו בחסר. קצב האירועים, ההשלכות ארוכות הטווח ומנגנוני הניקוי הפוטנציאליים אינם ידועים ברובם. המודלים הנוכחיים המשמשים לחקר אירועים אלו, כגון פוטותרומבוזה והזרקת מיקרו-אמבוליות, לכל אחד מהם יתרונות ומגבלות משלו. מחקר זה פיתח פרוטוקול מפורט המשלב הכנת חלון גולגולתי כרוני עם השראת תסחיפים מיקרווסקולריים מוחיים באמצעות הזרקה תוך-עורקית של מיקרוספירות בעכברים. מערך זה מאפשר הדמיה ארוכת טווח בתוך גוף של המיקרו-כלי דם ומיקרו-אוקלוזיות באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. מיקרוספירות מועברות דרך קטטר הממוקם בעורק הקרוטיד החיצוני (ECA), אשר קשור לצמיתות. חשוב לציין כי עורק הקרוטיד הרגיל (CCA) והעורק הקרוטידי הפנימי (ICA) נשארים שלמים לאורך ואחרי ההליך, ובכך מפחיתים הפרעה לזרימת הדם המוחית. כדי להקל על הדמיה מיידית ב-invivo ולמנוע הצטברות מיקרוספירה או הידבקות לקצות הפיפטה ולקטטר, מיקרוספירות תלויות בתערובת של FITC-Dextran ו-Tween 20 של 0.1%. טכניקת ההזרקה אושרה באמצעות הדמיה תלת-ממדית לאחר המוות במקום כדי לקבוע את התפלגות המיקרוספירות. מחקר זה מדגים עוד יותר את השימושיות שלו באמצעות דוגמת מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo . גישה זו מספקת שיטה עקבית וחזקה להשראת ולימוד תסחיפים מיקרווסקולריים, המאפשרת חקירת ההשפעה והדינמיקה שלהם באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה ב-invivo .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבץ איסכמי הנובע מתסחיף בעורק מוחי גדול הוא אירוע חריף ולעיתים הרסני1. אמבולי עשוי להופיע גם בכלי דם רחוקים יותר. כתוצאה מכך, אוטמי מוח שקטים (SBIs) עלולים להתפתח; כפי שהשם מרמז, אלה נשארים ללא תסמינים, ובדרך כלל מתגלים במקרה במהלך הדמיה מסיבות לא קשורות 2,3. SBIs נפוצים ומדורגים בין המחלות המוחיות הנפוצות ביותר בנתיחות של קשישים 4,5. מחקרים אפידמיולוגיים הראו שכיחות של 20% בקרב אנשים ללא היסטוריה של שבץ. SBI תורמים לתפקוד קוגניטיבי לקוי ודמנציה, מגדילים את התמותה הכוללת, ומהווים גורם סיכון לשבץ עתידי 6,7,8. האוטפקטים בדרך כלל בקוטר של כמה מילימטרים בלבד וקשורים לחסימת עורקים חודרים בקוטר של כ-100 מיקרון. חודרים אלו יוצרים שכבה עורקית וקפילרית נרחבת. מיקרוטרומבוס קטן העובר דרך העורקים החודרים ונתקע במיקרוסירקולציה במורד הזרם צפוי להישאר בלתי ניתן לזיהוי באנגיוגרפיה9. עם זאת, מיקרותרומבים רבים עשויים להשתחרר בפרפור פרוזדורים, פלאקים אטרוסקלרוטיים וממקורות אחרים 10,11,12,13,14. מלבד מיקרותרומבים, מיקרוחלקיקים נוספים (MPs), כולל חלקיקי שומן, אגרגטים תאיים ואפילו מיקרופלסטיקים, עלולים לגרום לתסחיפים מיקרווסקולריים. מספר מחקרים מראים נוכחות של MP פלסטי בדם ובמוח שגדול מקוטר הקפילרי של 5 מיקרון15,16.

סתימות מיקרווסקולריות עדיין נחקרו פחות יחסית בהשוואה לשבץ אקוטי ו-SBI. מעט ידוע על קצב האירועים, ההשלכות ארוכות הטווח ומנגנוני ניקוי אפשריים. עם זאת, העניין הולך וגובר במהירות לאחר ההצלחה הקלינית של טרומבקטומיה מכנית בשבץ, שבה תסחיפים מיקרווסקולריים עלולים לגרום לפגיעה ברפרפוזיה מיקרווסקולרית לאחר שנראה כי מוצלח לתקנליזציה מחדש של העורק הגדולהגורם 17. בנוסף, יש עלייה במחקר על מיקרופלסטיקים, שעשוי להשפיע חלקית דרך תסחיף מיקרווסקולרי 18,19,20.

ניתן לחקור חסימות מיקרווסקולריות בקורטקס העכבר באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית, באמצעות חלון גולגולתי. המודלים הנפוצים ביותר לחקר חסימות מיקרווסקולריות מוחיות הם מודל הפוטותרומבוטי ומודל המיקרוספירה. המודל הפוטותרומבוטי משתמש בצבעים רגישים לאור כדי לגרום לתסחיפים בכלי דם נבחרים (בדרך כלל כלי דם שאינם נימים) באמצעות פוטואקטיבציה. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר חקר תסחיפים לאורך תקופה ארוכה יותר בשל הפעלת מערכת הפיברינוליטית, שממיסה את האמבוליזם21,22. יתרה מזאת, הפעלת הצבע הרגיש לאור מייצרת מיני חמצן יחידים, הגורמים לנזק לאנדותל ולמחסום דם-מוח (BBB)23. למחקרים על תפקוד אנדותל ו-BBB במהלך תסחיפים מוחיים, וההשפעות ארוכות הטווח על מחזור הדם המוחי ותפקוד המוח, מודל מיקרוספירות מועדף לכן. מודל ההזרקה למיקרוספירה משתמש במיקרוספירות המוזרקות למחזור הדם המוחי כדי לחסום את מיקרווסקולטורה המוחית 9,24,25,26,27,28,29,30. החיסרון האפשרי של מודל זה הוא שלא ניתן לקבוע מראש את מיקום התסחיפים, בניגוד לשיטת הפוטותרומבוטיקה31,32. היתרון הוא שניתן להזריק מיקרוספירות בקטרים מוגדרים היטב, ובכך לפגוע בכלים (מיקרו-) בקטרים ספציפיים 33,34,35.

במהלך השנים פותחו גישות רבות להזרקת מיקרוספירות למחזור המוחי של מכרסמים. פרוטוקולים אלו מגיעים להסכמה בגישה למשולש הקרוטיד, הכולל את עורק הקרוטיד הרגיל (CCA), העורק הקרוטידי הפנימי (ICA) והעורק הקרוטידי החיצוני (ECA) להזרקת מיקרוספירה תוך-עורקית. שיטת הזרקת מיקרוספירה תוך-עורקית משתנה בין פרוטוקולים בכמה דרכים. ראשית, המחקרים השתמשו במזרק 9,26,27,29,33,34 או בקטטר 25,28,30,36. שנית, קיימת שונות משמעותית במספר ובגודל של מיקרוספירות מוזרקות. קוטר המיקרוספירה בדרך כלל נע בין 10 ל-50 מיקרון, כאשר הבחירה תלויה בגודל כלי המטרה. ככלל אצבע, ככל שהמיקרוספירות גדולות יותר, כך המספר הראשון צריך להזריק נמוך יותר, כי יש פחות עורקים מאשר נימים 25,26,30.

השגת הזרקת מיקרוספירה תוך-עורקית עקבית נשארת אתגר. בפועל, מספר רב של מיקרוספירות מוזרקות, אך רק חלק מהם מגיע למחזור הדם המוחי. זה בעייתי במיוחד בחקר השפעות של מיקרוספירות תקועות באמצעות הדמיית מיקרוסקופ דו-פוטוני ב-in vivo , שכן הצלחת טכניקה זו תלויה בנוכחות מיקרוספירות בשכבות החיצוניות של קליפת העכבר בתוך שדה הראייה דרך חלון הגולגולת המוכן. בחירת צבעים פלואורסצנטיים מתאימים למיקרוספירות היא קריטית, שכן שילובם עם מודלים טרנסגניים וצביעה תוך-כלי דם עלול להיות מאתגר בשל הפלואורסצנציה העזה של המיקרוספירות וספקטרום הפליטה החופף.

חסימות מיקרווסקולריות נחקרות במודלים של מכרסמים, והשפעות סינרגטיות של מיקרוספירות מרובות הוצגו בעבר במוחות מכרסמים חיצוניים 9, וכן לכאורה התפשטות חלקיקים כאלה, תהליך הנקרא אנגיופגיה 33,35,37,38. כדי לאפשר את חקירתם ב-in vivo, פותחו שיטות למיקרוסקופיה רב-פוטונית בעכברים עם חלונות גולגולתיים. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח ולדווח פרוטוקול מפורט להזרקה תוך-עורקית של מיקרוספירות בעכברים, הממקסם את חקר השפעותיהן על רקמת המוח וגורלן. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא יעילות ההולכה משופרת שלו, הממזערת אובדן מיקרוספירות ומגבירה את הסיכוי לנוכחותם בעורק המוחי האמצעי (MCA) באזור הדימות של חלון הגולגולת. פרוטוקול ההזרקה האופטימלי למיקרוספירה מוערך באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים ב-vivo ודימות תלת-ממדי לאחר המוות במקום עם מיקרוטום קריו-מיקרוטוםייעודי 39.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים בעלי חיים פעלו לפי המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. הוועד המרכזי לניסויים בבעלי חיים של הולנד העניק אישור מלא (AVD11400202316817).

הערה: נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בגילאי חודשיים עד שנה. עם ההגעה, בעלי החיים התרגלו למשך 7 ימים לפני כל הליך ניסיוני. החיות אוחסנו עם מקסימום של 4 לכל כלוב, סופקו למזון ומים לפי החופשיות, ונשמרו על מחזור של 12 שעות אור-חושך. עכברים NG2-DsRed ו-TIE2-GFP נרכשו (ראו טבלת חומרים לפרטים) וגודלו בבית.

1. שתל חלון גולגולתי

  1. הרדמה וטיפול טרום-ניתוחי
    1. הוסיפו 0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן למי השתייה יום לפני תחילת ניתוח חלון הגולגולת.
    2. שקלו את העכבר ונתנו 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן ו-2 מ"ג/ק"ג דקסמתאזון תת-עורית 30 דקות לפני הניתוח.
    3. הכינו את אזור הניתוח על ידי מיקום כרית חימום עם מערכת משוב על המסגרת הסטריוטקטית וכיסוי בבד סטרילי.
    4. פרש את כל כלי הניתוח הסטריליים על בד סטרילי נוסף.
    5. הרדמו את העכבר בתא השראה עם תערובת אוויר של 1 ליטר לדקה (30% חמצן ו-70% אוויר רפואי) ו-3-4% איזופלורן, ולאחר מכן לשמור על הרדמה עם 1.5-2% איזופלורן באמצעות מסכת פנים.
    6. אבטח את העכבר במסגרת סטריאוטקטית והכנס את גשש החום של כרית החימום לרקטית באמצעות חומר סיכה. מרחו משחת עיניים למניעת ייבוש וקבעו את כרית החימום על 37 מעלות צלזיוס.
    7. נתנו תת-עורית 1.5 מ"ג/ק"ג רופיבאקאין בקו החתך 5 דקות לפני הניתוח.
    8. נקה את העור מעל הגולגולת מהצוואר ועד קצת מעבר לעיניים עם בטדין עם קצה כותנה.
  2. הכנה כירורגית לקיבוע ראש וחלון
    1. באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים כירורגיים, יש לבצע חתך ראשוני בעור מעל הגולגולת האחורית. הארכי את החתך מתפר הלמדה קדימה לאורך קו האמצע לתפרים המצחיים ממש לפני הברגמה (איור 1A). משך בזהירות והסר את העור כדי לחשוף במלואו את שרירי הטמפורליס משני הצדדים.
    2. מרחו כ-0.1 מ"ל לידוקאין 1% על הגולגולת כדי למזער דימום.
    3. הסר את הפריוסטאום ושרוט את כל האזורים בגולגולת שבהם מוט הראש יתוקן באמצעות להב ניתוח. הפוך את השריטות בניצב לרוחב הגולגולת כדי להבטיח הידבקות יציבה של מוט הראש.
    4. נקה כל דם שנותר עם קצה כותנה וייבש את הגולגולת באמצעות אוויר דחוס.
  3. קיבוע ראש
    1. הכינו תערובת דבק שיניים במיכל קרמי קר (4 מעלות צלזיוס) על ידי הוספת 100 מיקרוליטר מונומר ל-0.1 גרם פולימר וערבוב. הוסף טיפה אחת של קטליזטור לתערובת כדי להתחיל את ההתגבשות המהירה של הדבק.
    2. מרח את הדבק על תחתית מוט הראש. הטה מעט את מוט הראש לכיוון הצד השמאלי מהסינוס הסגיטלי ולחץ על הגולגולת. מרח דבק נוסף על קצוות מוט הראש כדי לאטום את כל הפתחים. זה מבטיח הידבקות יציבה.
    3. הכינו תערובת מלט דנטלי על ידי ערבוב 100 מיקרוליטר נוזל מלט דנטלי עם 0.1 גרם אבקה. הניחו את המלט על כל צידי מוט הראש תוך מניעת זרימת המלט אל הגולגולת באזור הקידוח. הוסיפו שכבה נוספת של מלט דנטלי מעל מוט הראש ליצירת באר, המאפשרת מריחת נוזלים על חלון הגולגולת (איור 1B).
    4. תן לדבק הדנטלי ולמלט להתייבש לפחות 10 דקות.
    5. ודאו הידבקות יציבה של מוט הראש על ידי הפעלת לחץ עדין על הגולגולת במקום בו תתבצע הקרניוטומיה. מוט הראש מודבק כראוי כאשר הגולגולת אינה זזה ואינו מופיע נוזל בין המלט הדנטלי לגולגולת.
  4. קרניוטומיה
    1. חבר את העכבר למחזיק ההדמיה באמצעות מוט הראש או שמור אותו במסגרת הסטריאוטקטית כדי לקבע היטב את ראש החיה במהלך הקרניוטומיה.
    2. סמן את מטרת הקידוח של הקרניוטומיה (קוטר 4 מ"מ) על הגולגולת באמצעות סימון דק. מצאו את ה-MCA הנראה דרך הגולגולת כדי לוודא שחלון הגולגולת ממוקם בצורה מיטבית, ומכסה כמה שיותר מה-MCA. כדי לאשר את הגודל והמיקום הנכונים של מטרת הקידוח, החזק את זכוכית הכיסוי מעל האזור המסומן והתאם את גודל מטרת הקידוח לפי הצורך.
    3. התחל לקדוח במעגלים על הסימנים בלי להפעיל לחץ על הגולגולת, כדי למנוע יצירת חום (איור 1C). קרר את הגולגולת על ידי מריחת מלח כל 30 שניות. בזמן הקירור, נקו וקררו את ראש המקדחה על ידי טבילה במים, ואז ייבוש עם מגבת נייר. הסר את כל אבק העצם באופן קבוע באמצעות אוויר דחוס. אשר את גודל הקרניוטומיה על ידי הנחת זכוכית הכיסוי על הגולגולת וכיוון הקידוח במידת הצורך.
    4. המשך לקדוח במעגלים עד שהעצם מדוללת כראוי. סדקים יופיעו באזור הקידוח ברגע שהגולגולת כמעט מתנקבת. ודאו שהעצם מדוללת מספיק על ידי הוספת מי מלח לריכוך הגולגולת הדלילה ולחיצה עדינה על מרכז עצם הגולגולת בתוך אזור הקידוח. אזור הקידוח דק מספיק כאשר הגולגולת נעה באופן אחיד מכל צדדי אזור הקידוח תחת לחץ עדין. המשך בקידוח עד שנגיע לנקודה זו. אל תקדח דרך הגולגולת; זה עלול לגרום נזק לדורה מאטר ולרקמת המוח. שמור על אזור הקידוח ספוג ב-aCSF אם הדורה מטר ניזוק או מתרחש דימום.
      הערה: לפני הסרת הגולגולת, ודא שכל אבק העצם מסוקה מאזור הקידוח. חלקיקי עצם שנותרו על הדורה עלולים להתחיל צמיחת עצם מחדש מתחת לחלון.
    5. נקה היטב את כל אבק העצמות באמצעות aCSF ואוויר דחוס. מרח aCSF על האזור המקדח עד שהגולגולת טובלת לחלוטין. באמצעות מחט בקוטר 27 (0.4 מ"מ x 16 מ"מ) או 30 גייג' (0.3 מ"מ x 13 מ"מ), נקב בזהירות את הגולגולת הדלילה אופקית (~180°), כדי למנוע נזק לדורה מטר ולמוח. דחפו בעדינות את העצם כלפי מעלה עד שהיא מתנתקת, תוך הפעלת כוח מינימלי. אם העצם לא מתנתקת בקלות, המשך לקדוח. הסר את הגולגולת המנותקת עם מלקחיים, תוך שמירה על המוח שקוע ב-aCSF (איור 1D).
    6. שטוף את המוח עם aCSF, ואז מניח ספוג סטרילי וסופג ג'לטין חזיר, ספוג ב-aCSF על המוח כדי לשלוט בדימום מקומי למשך 2 דקות. הסר בזהירות את הספוג, תוך שמירה על המוח שקוע ב-aCSF. המשך בשטיפה עם aCSF כדי לוודא שלא נשאר אבק עצם או דם במוח. אם הדימום נמשך, הניחו ספוג הדמוסטטי סטרילי וסופג ספוג ב-aCSF על המוח.
      הערה: דימום קל נפוץ במהלך הסרת עצם. ודא שהדימום נעצר לפני שמניחים את הזכוכית, שכן דימום שאריתי עלול להפחית את בהירות החלון.
  5. מיקום זכוכית כיסוי
    1. ספוג את ה-aCSF שמכסה את המוח עם קצה כותנה, והשאיר רק שכבה דקה שנותרה. מניחים את הכיסוי על המוח ולוחצים אותה בעדינות אל פתח הגולגולת באמצעות מיקרו-מלקחיים מעוקמים. ודא שזכוכית הכיסוי יושבת מעט מתחת לגובה הגולגולת וממוקמת במקביל למוט הראש.
      הערה: יש ללחוץ את הזכוכית היטב אל המוח כדי למנוע היווצרות חללים ולשמור על איכות החלונות. שמירה על זכוכית הכיסוי במקביל למוט הראש מבטיחה שהיא ניצבת לאובייקטיב המיקרוסקופ, מה שמשפר את איכות התמונה.
    2. חבר את זכוכית הכיסוי לגולגולת ולמוט הראש עם דבק אפוקסי, ומרח אותו על הצדדים תוך החזקת הזכוכית במקומה ובמקביל לראש הראש.
    3. אטום את כל קצוות זכוכית הכיסוי בדבק כדי למנוע חשיפה למוח. השאירו טיפה אחת של aCSF על המוח במהלך היישום כדי למנוע מהדבק לחדור מתחת לחלון או לגעת בדורה מטר (איור 1E).
    4. תן לדבק להתגבש במשך 5 דקות.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה של פרוטוקול הקרניוטומיה. דוגמאות מפורטות לתמונות ושרטוטים סכמטיים של שלבים קריטיים במהלך ניתוח הקרניוטומיה והנחת ראש. (א) הסרת העור (שלב 2.2). (ב) חיבור מוט הראש (שלב 2.3). (ג) קידוח הקרניוטומיה של 4 מ"מ (שלב 2.4.3). (ד) הסרת הגולגולת (שלב 1.4.5). (ה) מיקום זכוכית הכיסוי (שלב 1.4.7). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. טיפול לאחר ניתוח
    1. לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת-עורית.
    2. העבר את החיה לכלוב התאוששות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ואז להחזיר אותו לכלוב הביתי עם 0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן במי השתייה עד יומיים לאחר הניתוח.
    3. העניקו אוכל טבול ב-0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן עד שהחיה חוזרת למשקלה לפני הניתוח.
    4. אפשר לבעל החיים להחלים לפחות 7 ימים לפני ביצוע ניתוח מודל התסחיף המיקרווסקולרי.

2. מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי

  1. הרכבת קטטר
    1. הכנס את קצה המיקרו-קטטר באורך 20 ס"מ (ID 0.23114 OD 0.27432 מ"מ) לקטטר שקוף (ID 0.31 OD 0.64 מ"מ) ואטום את החיבור עם דבק אפוקסי וסרט. אשר שאורך הקטטר הכולל מספיק לאחסון לפחות 160 מיקרוליטר.
    2. הכנס מחט לואר-לוק בקוטר 27 גייג' (0.1 מ"מ x 16 מ"מ) בקצה הנגדי של הקטטר השקוף. אוטם את הקצה עם דבק אפוקסי ודבק.
    3. מלא מזרק של 1 מ״ל במי מלח ומחבר אותו לנעילת הלואר של מחט הקטטר. שטף עם 0.7 מ"ל מלח, כדי להבטיח שלא יישארו דליפות או בועות אוויר.
    4. מלאו את הקטטר ב-80 מיקרו-ליטר של מי מלח וסמנו את הרמה שהושגה בקטטר.
  2. הרדמה וטיפול טרום-ניתוחי
    1. ספק לעכבר מים לשתייה המכילים 0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן יום אחד לפני ניתוח התסחיף המיקרווסקולרי.
    2. הניחו כרית חימום עם מערכת משוב מתחת לבד סטרילי ומכוונים אותה ל-37 מעלות צלזיוס.
    3. הנח את כל כלי הניתוח הסטריליים על בד סטרילי נוסף.
    4. שקלו את העכבר ונתנו 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת-עורית 30 דקות לפני הניתוח.
    5. הרדמו את העכבר באמצעות איזופלוראן של 3-4% בתא השראה עם זרימת גז של 1 ליטר לדקה הכוללת 30% חמצן ו-70% אוויר ניתוח.
    6. העבר את העכבר לשולחן הניתוח ושמור על הרדמה באמצעות מסכת פנים שמספקת 1.5-2% איזופלורן ב-1 ליטר לדקה עם 30% חמצן ו-70% אוויר.
    7. הכנס גלאי טמפרטורה רקטלי משומן ומרח משחת עיניים למניעת ייבוש.
    8. הניחו מזרק של 2 מ"ל מתחת לצוואר העכבר השוכב כדי להקל על הגישה לאזור הניתוח.
    9. אבטח בעדינות את כפות הרגליים הקדמיות לשולחן הניתוח עם סרט דבק.
    10. תגלח את אזור הניתוח ותמרח בטדין ואחריו לידוקאין.
  3. החתך
    1. בדוק את עומק ההרדמה באמצעות צביטת אצבע.
    2. בצע חתך בקו האמצע של כ-0.5 ס"מ מעל קנה הנשימה מתחת לסת התחתונה באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים.
    3. נתח את רקמת החיבור השטחית לפאסיה הצוואר באמצעות מלקחיים מיקרו-קושרים כדי לחשוף את שרירי הסטרנוהיואיד שמתחת.
    4. הפרדו את שרירי הסטרנוהיואיד השמאלי והימני על ידי קריעה עדינה של רקמת החיבור ביניהם. משוך את שריר האומוהיואיד הימני בזנב-צדדי באמצעות וו רקמה. ודאו שמשולש התרדמה הימני, הכולל את ה-CCA, ה-ICA וה-ECA, נראה בבירור.
  4. הכנה כירורגית של CCA, ICA, ECA ועורק הפריאטל האחורי (PPA)
    הערה: הימנעו מאחיזה או צביטה של עצב הואגוס; הזיזו אותו בעדינות רק כדי למנוע השפעות שליליות על בריאות החיה. אל תיגע בקנה הנשימה, שכן הדבר עלול לגרום לבעיות נשימה. זהה את עורק העורף (OA), שמתפצל מה-ICA באמצע הדרך בין הפיצול בצורת Y של ה-ICA למקור ה-ECA, לבין עורק התריס העליון (TA), שמתפצל מהצד המדיאלי של ה-ECA. עורקים אלו עדינים ויש לטפל בהם בזהירות רבה.
    1. הסר את כל הפאשיה ורקמת השומן שנותרה סביב ה-CCA.
    2. הפרד בזהירות את ה-CCA מהעצב הוואגוס.
    3. הנח שני הברגות 4/0 1.5 סביב ה-CCA וקשור אותם ברפיון. ודא שהקשרים אינם מפריעים לזרימת הדם של ה-CCA.
    4. הסר את הפאשיה ורקמת השומן מה-ICA וה-PPA. לחבר זמנית את ה-PPA ואת כל ענפי הצד של ה-ICA, כולל ה-OA, על ידי קשירת קשר עם חוט 4/0 1.5.
    5. הסר את הפאשיה ורקמת השומן מה-ECA וה-TA. הנח שני קשרים רופפים סביב ה-ECA וה-TA באמצעות הברגות 4/0 1.5. מקם את החוט המרוחק ביותר כמה שיותר מהפיצול בצורת Y והשתמש בו לקישור קבוע של ה-ECA וה-TA. תשאיר את הקשר הפרוקסימלי פתוח.
  5. הכנת תמיסת מיקרוספירה וטעינת קטטרים
    הערה: יש להכין את תמיסת FITC-Dextran/מיקרוספירה זמן קצר לפני ההזרקה כדי למזער את ההידבקות המיקרוספירה לקטטר.
    1. הומוגניזציה וסוניקה של מיקרוספירות בגודל 10 מיקרון (7.2 x 10,6 מיקרוספירות/מ"ל) כדי לקבל תלייה אחידה של חלקיקים בודדים.
    2. הכינו 140 מיקרוליטר של 25 מ"ג/מ"ל 70 kDa FITC-Dextran המכיל 0.1% Tween20, ואז הוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרוספירות הומוגניות לקבלת 160 מיקרוליטר של תערובת FITC-Dextran/Tween20/מיקרוספירה המכילה 1.44 ×10 5 מיקרוספירות.
    3. למשוך בקצרה את המזרק שמחובר לקטטר כדי ליצור תא אוויר.
    4. טבלו את קצה הקטטר בתערובת FITC-Dextran/Tween20/microsphere המוכנה ומשכו את המזרק לאט לאחור עד שהתערובת נכנסת לקטטר.
    5. ודא שאין בועות אוויר בקטטר. אם קיים, רוקנו את התערובת למיכל של 0.5 מ"ל וחזרו על השלבים 2.5.3 ו-2.5.4.
    6. הניחו את המזרק עם הקטטר הטעון במשאבת המזרק. כוון את המשאבה ל-10 מיקרוליטר/דקה והפעל עד שמופיעה טיפה קטנה של תערובת מיקרוספירה בקצה הקטטר.
  6. הכנסת קטטר והזרקת מיקרוספירה
    הערה: הימנעו מהזרקת בועות אוויר למערכת כלי הדם, שכן הדבר עלול לגרום לתופעות לוואי חמורות או למוות. בועות אוויר עלולות להיגרם מטעינה לא נכונה של קטטר או נזילות בצינור.
    1. הניחו קליפס כלי על ה-ICA והדקו אחד מהקשרים הפרוקסימליים שהוכנו מראש סביב ה-CCA (ראו שלב 2.4.3).
    2. באמצעות מיקרו-מספריים, יש ליצור חתך אלכסוני קטן ב-ECA במרחק של כ-0.5 מ"מ רחוק מחוט הקשירה. ודאו שגודל החתך קטן מעט מקוטר הקטטר.
    3. ספגו כל דם עם בד או רקמה סטרילית, כדי לוודא שדם לא ימשיך לדלוף מעבר לקשירות ולקליפס כלי הדם.
      הערה: המשולש הווסקולרי חייב להישאר נקי מדם לאחר חתך ECA. דם שנותר עלול לגרום להיווצרות קרישים, מה שעלול לגרום לאירועים איסכמיים מוחיים גדולים לאחר השבת זרימת התרדמים או לחסום את ה-ECA, מה שמונע הזרקת מיקרוספירה.
    4. הפעל לזמן קצר את משאבת המזרק כדי ליצור טיפה של תערובת מיקרוספירה בקצה הקטטר, מה שמאשר שאין אוויר בקצה הקטטר.
    5. פתח את חתך ה-ECA והכנס את הקטטר באמצעות מיקרו-מלקחיים דקים. הימנע ממגע עם משטחים אחרים במהלך ההכנסה כדי למנוע אובדן תערובת המיקרוספירה או כניסת אוויר לקטטר. אם ההחדרה נכשלת או שקצה הקטטר נוגע במשטח, חזור על שלב 2.6.4 לפני הניסיון החוזר.
    6. אבטח את הקטטר ב-ECA על ידי הידוק התפר הפרוקסימלי (ראה שלב 2.4.5.) סביב ה-ECA.
    7. ודא שאין דליפה או בועות אוויר בתוך כלי הדם על ידי הפעלת משאבת המזרק במהירות של 10 מיקרוליטר/דקה. אם יש אחד מהם, יש לנתק את הקטטר ולחזור לשלב 2.6.4.
    8. אם לא זוהו דליפה או בועות אוויר, יש להמשיך לשאוב בקצב של 10 מיקרוליטר/דקה כדי להעלות בהדרגה את הלחץ בקטטר ובכלי הדם עד לזיהוי התרחבות נראית לעין של העורק. כדי להתאים ללחץ העורקי של בעל החיים, יש לקבוע לחץ מספק בקטטר ובכלי הדם לפני פתיחת ה-ICA וה-CCA מחדש. כאשר זרימת הדם משוחזרת ב-CCA וב-ICA, חלק מהדם עשוי להיכנס לקטטר, אך לאחר מכן יוזרק מחדש ל-ICA. אשר ויזואלית את הזרקת תערובת המיקרוספירה ל-ECA וכי הצטברות הלחץ מצליחה על ידי צפייה בצבע הירוק של FITC שממלא את העורקים. אם זה לא נצפה, עצרו את משאבת המזרק, הסרו את הקטטר וחזרו על השלבים 2.6.4 עד 2.6.8.
    9. הסר את קליפס הכלי מה-ICA, ואז הגבר את קצב זרימת משאבת המזרק ל-20 מיקרוליטר לדקה. אשר הזרקת מיקרוספירה מוצלחת על ידי אימות שה-ICA הרחוק מהפיצול של PPA מלא בצבע FITC. אם מאושר, המשיכו לשלב 2.6.11; אם לא, המשיכו לשלב 2.6.10.
    10. עצור את משאבת המזרק ושחרר את קשירת ה-PPA. הזזת את קשירת ה-PPA רחוק יותר מהפיצול בין ICA-PPA, ואז הדק את הקשירה. חזור לשלב 2.6.9.
    11. הסר את החוט שקשר את ה-CCA כדי לאפשר לתערובת המיקרוספירה לזרום לתוך ה-ICA.
    12. פתרון תקלות במקרה של זרימה רטרוגרדית במהלך הזרקת תערובת המיקרוספירה:
      1. אם מתרחשת זרימה רטרוגרדית של תערובת המיקרוספירה לתוך ה-CCA, יש להוריד את זרימת משאבת המזרק ל-10 מיקרוליטר לדקה.
      2. אם הזרימה נמשכת, יש ללחוץ בעדינות על ה-ECA, ICA ו-CCA באמצעות מיקרו-מלקחיים כדי לוודא שאין חסימה בזרימה עקב קרישה.
      3. תאשר ויזואלית שאין תסחיף אוויר בתוך כלי הדם. תסחיף אוויר ניתן לזיהוי כחלק שקוף בתוך כלי הדם.
      4. אם יש תסחיף אוויר, עצור את משאבת המזרק והעבר את התסחיף ל-ECA על ידי לחיצה עדינה על העורק באמצעות מיקרו-מלקחיים. חבר את ה-CCA והניח קליפס כלי על ה-ECA. הסרת הקטטר ותסחיף האוויר וחזרה לשלב 2.6.4.
      5. אם אין מכשול, אך הזרימה נמשכת, סגרו את ה-CCA באמצעות קליפס כלי וחזרו לשלב 2.6.10.
        הערה: זרימה רטרוגרדית של תערובת המיקרוספירה לתוך ה-CCA לא אמורה להתרחש, שכן היא עשויה להעיד על פתיחה לא מספקת של ICA, תסחיף אוויר או היווצרות קרישי דם, עם השפעות מזיקות פוטנציאליות לתוצאות הניסוי.
    13. עצרו את הזרקת המיקרוספירה על ידי כיבוי משאבת המזרק כאשר התערובת בקטטר מגיעה לסימן 80 מיקרוליטר (ראו שלב 3.1.4). מוזרק סך הכל 80 מיקרוליטר FITC-Dextran/Tween20 עם 7.2 x 10מיקרוספירות 4 .
  7. השלמת ההליך
    1. חבר את ה-CCA באמצעות הקשר שנותר מוכן (ראה שלב 2.4.3) וסגור את ה-ICA עם קליפס המכלית.
    2. הסר את הקטטר מה-ECA תוך שמירה על ההברגה שמחזיקה את הקטטר ב-ECA באותו מיקום.
    3. קשירה קבועה של ה-ECA על ידי הידוק החוט שהחזיק את הקטטר.
    4. הסר את קליפס הכלי והברגים סביב ה-CCA, ICA ו-PPA כדי לשחזר את זרימת הדם. הרטיב את אזור הניתוח בכמה טיפות של מי מלח.
    5. תפר את העור עם מחט מעוקלת 3/8 הפוכה של 12 מ"מ ותפר משי 3-0 (USP) שאינו נספג.
  8. טיפול לאחר ניתוח
    1. נתנו תת-עורית 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן.
    2. העבר את החיה לכלוב ההתאוששות (~33 מעלות צלזיוס) למשך 30-60 דקות. החזירו את החיה לכלוב הבית שלה לאחר שהיא מחלימה לחלוטין.
    3. ביומיים הראשונים, השרו את האוכל במשך 10 דקות ב-0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן ומספקים אותו לבעל החיים, והוסיפו למי השתייה 0.06 מ"ג/מ"ל קרפרופן. לאחר תקופה זו, המשיכו לתת אוכל ספוג ללא קרפרופן עד שהחיה תחזור למשקלה לפני הניתוח.
    4. יש לעקוב אחרי החיה מספר פעמים ביום ביומיים הראשונים, ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע. הורד את החיה אם מגיעים לנקודת סיום אנושית.
      הערה: נקודות קצה אנושיות מוגדרות בהתאם להנחיה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי. בנוסף, יש להמתים כל בעל חיים אם הוא מראה סימני איסכמיה, כגון התנהגות מעגלית או שיתוק, שכן מודל התסחיף המיקרווסקולרי לא אמור לגרום לאירוע איסכמי משמעותי.

figure-protocol-2
איור 2: ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי. דוגמאות מפורטות לתמונות ושרטוטים סכמטיים של שלבים קריטיים במהלך ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי. (א) הכנת קשירי CCA (2x), ECA (2x), TA, OA ו-PPA (שלב 2.4). (B) קשירה (טמפורלית) של ה-CCA (1st) ו-ECA, ואחריה סגירת OA ו-PPA וסגירה זמנית של ה-ICA עם קליפס כלי דם, מה שמאפשר חתך ב-ECA ללא דימום (שלב 2.6.2). (ג) מיקום הקטטר ב-ECA המפורק, אשר קשורים יחד עם התפר השני (שלב 2.6.7). (ד) פתיחת התפר הפרוקסימלי סביב ה-CCA והסרת קליפס הכלי מה-ICA לשיקום זרימת הדם, ולאחר מכן הזרקת תערובת המיקרוספירה לתוך ה-ICA (שלב 2.6.10). CCA = עורק קרוטיד נפוץ; ECA = עורק קרוטיד חיצוני; TA = עורק בלוטת התריס; OA = עורק עורף; PPA = עורק פטריגופלטין; ICA = עורק הקרוטיד הפנימי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הדמיה ב-vivo

  1. מיקרוסקופיה דו-פוטונית
    1. הניחו את החיה במחזיק ההדמיה הדו-פוטוני של המיקרוסקופ להדמיה ב-vivo לאחר הניתוח. שמרו על הרדמה קלה עם 1.2% איזופלוראן בתערובת של 1 ליטר לדקה של 30% חמצן ו-70% אוויר, ומנטרים את תדירות הנשימה והעומק. ראו טבלה משלימה 1 לפרטי הגדרת המיקרוסקופ.
    2. אתר מיקרוספירות תקועות דרך חלון הגולגולת באמצעות תאורה של אובייקטיב 10x (10x/0.30 DRY) ומנורת כספית. לאחר מכן, עבור להדמיה בשני פוטונים עם אובייקטיב טבילה במים פי 25 (25x/0.95 מים). ראו טבלה משלימה 2 להגדרות ההדמיה.
    3. רשמו ערימות Z סביב המיקרוספירה המעניינת.

4. ניתוח לאחר המוות

  1. נקודת סיום ניסויית להדמיה במקום
    1. כאשר מגיעים לנקודת הסיום הניסיונית, יש להמתים את החיה באמצעות ניתוק צווארי תחת איזופלורן > 4% בתערובת של 1 ליטר לדקה של 30% חמצן ו-70% אוויר רפואי.
  2. הדמיית מוח במקום
    1. חלצו את המוח, הטמיעו אותו בממס נתרן קרבוקסימתילצלולוז (Sigma) 3.0% מעורבב עם דיו שחור של 0.1% (VWR), והקפאו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 24 שעות.
    2. תדמיינו את המוח באמצעות מערכת קריומיקרוטום תלת-ממדית פלואורסצנטית קטנה מותאמת אישית (small-3D-FICS) שתוארה קודם לכן על ידי Juch R.N.S. ואחרים. הגדר את המערכת לחתוך את המוח אנכית לקטעים של 16 מיקרון ותמונה ברזולוציה של 13.66 × 13.66 מיקרון. ראו טבלה משלימה 3 וטבלה משלימה 4 להגדרות ההדמיה ומפרטי המערכת. נתח את התמונות באמצעות תוכנת Articulus41.
  3. הדמיית עכבר שלם במקום
    1. הסר את העור, השיניים והזנב של החיה.
      הערה: הסרת הזנב היא אופציונלית אך מגבירה את מהירות התמונה שלה.
    2. הטמיעו את החיה בממס נתרן קרבוקסימתילצלולוז (Sigma) 3.0% מעורבב עם דיו שחור של 0.1% (VWR), והקפאו בטמפרטורה של −20°C לפחות 24 שעות.
    3. דמיינו את בעל החיים באמצעות מערכת קריומיקרוטום גדולה ותלת-ממדית פלואורסצנטית מיוחדת (large-3D-FICS) כפי שתוארה קודם 42. הגדר את המערכת לחתוך קטעים של 25.9 מיקרון ברזולוציה בתוך המישור של 26.09 מיקרון. ראו טבלה משלימה 5 וטבלה משלימה 6 להגדרות ההדמיה ומפרטי המערכת. נתח את התמונות באמצעות תוכנת Articulus41.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה לאחר המוות במקום

הצלחת ניתוח התסחיף המיקרווסקולרי אושרה על ידי הדמיה במקום לאחר המוות של כל הגוף והמוח המלא, 4 ימים לאחר ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי (איור 3A). הפרוסה הסגיטלית של עכבר מראה שייחות של מיקרוספירות במוח. איור 3B,C מציגים דוגמה למוח עכבר שהוחלץ, יום אחד לאחר תסחיף מיקרווסקולרי. מיקרוספירות היו מרוכזות בעיקר בחצי הכדור האיפסילטרלי, בשטח הזרימה של העורקים המוחיים האמצעיים והקדמיים. ספירות מיקרוספירות בפרוסות מוח עלו משמעותית כאשר Tween20 נוסף לתערובת (איור 3E). מעקב אחר המשקל במהלך ההחלמה לאחר ניתוח המיקרו-אמבוליזם מראה שעכברים איבדו פחות משקל והתאוששו מהר יותר לאחר הניתוח כאשר הוזרק להם תערובת מיקרוספירה שהכילה את Tween20 (איור 3F).

figure-results-1
איור 3: התפלגות המיקרוספירות בעכבר לאחר ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי. מיקום מקומי של מיקרוספירות בגודל 10 מיקרומטר בעכבר הוצג באמצעות תוכנת Articulus41. (א) דוגמה במישור הקשת של עכבר שלם שצולם עם תסחיף תלת-ממדי גדול לאחר ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי. (B-D) תמונות מייצגות של מוח עכבר, צירי, קורונלי וסגיטל, המצוירות באמצעות ה-3D-FICS הקטן. (ה) מספר ממוצע של מיקרוספירות שזוהו לכל חתכי קורונל מוח בגודל 50 מיקרון בעומק של כ-bregma ± 0.5 מ"מ בתנאי Control ו-Tween20. פסים מייצגים סטיית ממוצע ± תקן. מדידות בודדות מוצגות כנקודות. השוואה סטטיסטית בוצעה באמצעות מבחן t לא מזווג; ערך ה-p מצוין בגרף. יוצאי דופן זוהו והוסרו באמצעות שיטת טווח בין-רבעוני (IQR) (n = 1 לשתי הקבוצות), מה שהוביל לגודל קבוצה סופי של n = 3 עבור הביקורת ו-n = 14 עבור Tween20. (ו) שינויים נורמליים במשקל לאורך זמן לאחר ניתוח תסחיף מיקרווסקולרי בנקודה 0. המשקלים נורמל לקו הבסיס של כל בעל חיים בניתוח. הקווים מציגים ממוצע ± SD לכל קבוצה (ביקורת, n = 4; Tween20, n = 5) עם Control בכחול ו-Tween20 בכתום כהה. המשמעות הסטטיסטית בין קבוצות בכל נקודת זמן הוערכה באמצעות מבחני t דו-זנביים לא מזווגים. (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הזרקת מיקרוספירה ומיקרוסקופיה דו-פוטונית ב-in vivo

במהלך הזרקת מיקרוספירה, קטטרים מצופים ב-5% BSA הראו מיקרוספירות רבות נדבקו לפני השטח של הקטטר, ומיקרוספירות זורמות היו לעיתים מקובצות מקובץ, מה שעלול לגרום לסתימות גדולות יותר (ראו וידאו משלים 1). בנוסף, הוספת 5% BSA לתערובת המיקרוספירה למניעת הידבקות והתקבצות אינה רצויה בשל תגובה חיסונית פוטנציאלית בהזרקה43,44. כדי לעקוף זאת, נעשה שימוש בתמיסת Tween20 של 0.1% בתערובת המיקרוספירה, מה שהוביל למספר גבוה יותר של מיקרוספירות שזרמו דרך הקטטר ולמספר הרצוי (> 20) של מיקרוספירות בחלון ההדמיה (איור 4 וסרטון משלים 2). איור 4A,B מציג תמונת סקירה של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של קליפת המוח 0.5 שעות לאחר ניתוח התסחיף המיקרווסקולרי. כל נקודה לבנה מייצגת מיקרוספירה שמסתירה נימים במיקרווסקולטורה המוחית. איור 4C,D מציג את תמונות ה-z-stack עם שני פוטונים כהקרנה דו-ממדית כדוגמה. מיקרוספירות גורמות לתסחיפים מיקרווסקולריים מוחיים עם פגיעה בפרפוזיה, כפי שניתן לראות בהיעדר צבע תוך-לומי במורד המיקרוספירה (איור 4E וסרטון משלים 3). בנוסף, תסחיפים אלו גורמים להפרעה של ה-BBB באמצעות התפשטות צבע FITC-Dextran (איור 4F,G).

תוצאות אלו תואמות את מספר המיקרוספירות הנמוך שהודבקו לקטטר ואת ההצטברות המינימלית של המיקרוספירה, שנצפתה בקטטר בעת הזרקת תערובת המיקרוספירה-טווין. עם זאת, מספר רב של מיקרוספירות אכן התקבצו יחד ב-20 מיקרולטר הסופיים של תערובת המיקרוספירה בקטטר, שלא כדאי להזריק כדי למנוע התרחשות אפשרית של אוטם גדול (ראו וידאו משלים 4).

figure-results-2
איור 4: מיקרוסקופיה דו-פוטונית ב-vivo של מיקרוספירות תקועות. דוגמאות לתמונות פלואורסצנטיות ב-vivo ותמונות דו-פוטוניות של מיקרוספירות תקועות בקורטקס העכבר. (א) סקירה פלואורסצנטית דרך חלון הגולגולת של מיקרוספירות הלודג'. (B) תמונה פלואורסצנטית של ה-ROI הנבחר. (C,D) תמונות מיקרוסקופ דו-פוטוני של מיקרוספירות כלואות במיקרוסירקולציה מוחית עם ROI נבחר להדמיה מפורטת. תמונות ערימת Z מוצגות בדו-ממד על ידי חישוב סטיית התקן של עוצמות הפיקסלים לאורך ערימת ה-Z. (E-G) תמונות מיקרוסקופיות דו-פוטוניות מייצגות ב-vivo המציגות שלושה תסחיפים מיקרווסקולריים מוחיים. חצים אדומים מדגישים אזורים של אקסטרווזציה של FITC-Dextran, ומצביעים על הפרעה ב-BBB ודליפת צבע. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה משלימה 1: מפרטי מערכת מיקרוסקופ דו-פוטוני. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 2: הגדרות מיקרוסקופ דו-פוטוני להדמיית FITC-dextran ומיקרוספירה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 3: הגדרות מערכת קריומיקרוטום דימות פלואורסצנטי תלת-ממדי קטנה להדמיית מוח עכבר עם מיקרוספירות כחולות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 4: מפרטי מערכת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית קטנה להדמיית מוח עכבר עם מיקרוספירות כחולות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 5: הגדרות מערכת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית גדולה למערכת Cryomicrotome להדמיה של עכבר שלם עם מיקרוספירות אדומות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה משלימה 6: מפרטי מערכת קריומיקרוטום גדולים להדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית להדמיית עכבר שלם עם מיקרוספירות אדומות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

וידאו משלים 1: קטטר מצופה 5% ב-BSA עם הידבקות מיקרוספירה לדופן הקטטר ואשכול מיקרוספירה בתערובת מיקרוספירה של 25 מ"ג/מ"ל של FITC-Dextran במהלך ההזרקה. אנא לחצו כאן להורדת הסרטון הזה.

סרטון משלים 2: קטטר מצופה Tween20 של 0.1% עם הידבקות מיקרוספירה לדופן הקטטר אך ללא התקבצות מיקרוספירה ב-FITC-Dextran של 25 מ"ג/מ"ל עם תערובת Tween20 של 0.1% עם מיקרוספירות במהלך ההזרקה. אנא לחצו כאן להורדת הסרטון הזה.

סרטון משלים 3: סגמנטציה תלת-ממדית של סתימות מיקרווסקולריות על ידי מיקרוספירות. אנא לחצו כאן להורדת הסרטון הזה.

סרטון משלים 4: נפח סופי של הזרקת מיקרוספירה בריכוז מיקרוספירה גבוה ב-25 מ"ג/מ"ל FITC-Dextran עם תערובת Tween20 של 0.1%. אנא לחצו כאן להורדת הסרטון הזה.

קובץ משלים 1: היצמדות מיקרוספירה לאימות קצות הפיפטה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: הערכה אימונוהיסטוכימית של כיסוי CD45 בימים 1, 7 ו-28 ימים לאחר ניתוח מיקרואמבוליזם, בהשוואה בין ההמיספרות האיפסילטרליות והנגדיות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי למודל תסחיפים מיקרווסקולריים, תואר פרוטוקול להזרקת מיקרוספירות למחזור המוח של עכברים המאפשר חקר מיקרו-תסחיף באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית ב-vivo . שיטה זו אופטימיזציה את לכידת המיקרוספירה במוח, כאשר מספר מיקרוספירות נלכדו בתוך 500 מיקרון הראשונים של הקורטקס האיפסילטרלי, מה שאפשר הדמיה יעילה בשני פוטונים.

ספירת מיקרוספירה גבוהה באזור הקורטקס של המוח היא קריטית להדמיית שני פוטונים ב-invivo. אובדן המיקרוספירות צומצם במהלך הכנת תערובת המיקרוספירות על ידי ציפוי קצות הפיפטה ב-5% BSA או 0.1% Tween20, מה שהפחית את ההידבקות המיקרוספירות (ראו קובץ משלים 1). למרות שלא ניתן היה לכמת את מספר המיקרוספירות המדויקות שנדבקו, מדידות עוצמה ממוצעת הראו את השפעת הציפויים. בנוסף, Tween20 נראה כמונע התקבצות מיקרוספירות בקטטר, מה שגרם למספר גבוה יותר ויזואלית של מיקרוספירות בודדות הזורמות דרך הקטטר, אף על פי שזה לא נמדד בכמות. דבר זה מפחית את הסיכון לסתימות כלי דם גדולים ואת היווצרות אזורים איסכמיים והיפוקסיים גדולים, דבר שאינו רצוי לאור המטרה לדגם תסחיפים מיקרווסקולריים. יתרה מזאת, עכברים הפגינו ירידה פחותה במשקל והתאוששו מהר יותר למשקלים לפני הניתוח כאשר הוזרק להם תערובת מיקרוספירה המכילה ריכוזים נמוכים של Tween20. Tween20 הוא מפזר נפוץ 45,46,47, ולכן הריכוזים הנמוכים במחקר זה אינם צפויים לגרום לרעילות או השפעות שליליות על שלמות BBB. בנוסף, הנתונים שלנו מראים כי דליפת BBB מתרחשת רק בקרבת (או לאחר שיצאת) המיקרוספירה מתרחשת ולא באופן שיטתי, מבלי לגרום לעלייה משמעותית בכיסוי הלויקוציטים הכולל (ראו קובץ משלים 2), התומך בשימוש ב-Tween20 של 0.1%. בסך הכל, הוספת Tween20 תורמת להפחתת הצבצות מיקרוספירות ולהגברת העברת המיקרוספירה למחזור הדם המוחי, המאושרת על ידי ספירות מיקרוספירה בפרוסות מוח, ומביאה לכך שמיקרוספירות מספיקות נראות למיקרוסקופיה של שני פוטונים. למרות שהשימוש ב-Tween20 מגדיל את מספר המיקרוספירות השקועות במוח, השונות בהזרקת המיקרוספירה נותרה. מספר גורמים עשויים לתרום לשוני זה. ראשית, היווצרות קרישי דם בתוך הקטטר או כלי הדם עלולה לגרום למיקרוספירות להידבק לקריש. שנית, נוכחות בועות אוויר עלולה להפריע להעברה חלקה. לבסוף, שיקום לא מלא של זרימת הדם ב-CCA או ICA יכול לשנות את ההמודינמיקה, ועלול לקדם הידבקות מיקרוספירה לדופן כלי הדם או להתקבצים בתוך הלומן. למרבה הצער, לא ניתן לזהות סטיות אלו במהלך הליך ההזרקה.

מיקרוספירות פוליסטירן צפופות יותר ממים, מה שמוביל לחלוקה לא אחידה לאחר טעינת תערובת המיקרוספירה לקטטר. רוב המיקרוספירות שוקעות ליד דופן הקטטר, שם חיכוך נוזלי מאט את תנועתם ביחס לזרימה המרכזית המהירה יותר. בסופו של דבר זה מוביל להצטברות מיקרוספירות בתוך 20 מיקרו-ליטר הסופיים של הקטטר. יש להימנע מהזרקת חלק מרוכז זה, שכן היא עלולה לגרום לתסחיף גדול ולאירועים איסכמיים. כדי למנוע זאת, יש להכין את נפח תערובת המיקרוספירה בפעמיים מנפח ההזרקה המיועד.

ניתוח התסחיף המיקרווסקולרי דורש הכשרה ודיוק משמעותיים. אחד השלבים הטכניים המאתגרים ביותר כולל הנחת תפר סביב ה-PPA, ה-OA והענפים הצדדיים של ה-ICA כדי להבטיח העברה מדויקת של תערובת המיקרוספירה למעגל של וויליס ושטח ה-MCA. שלב זה מסובך בשל הקרבה של עצב הואגוס בקרבת ה-CCA, קוטר כלי הדם הקטן ומרחב הניתוח המוגבל, מה שמקשה על מיקום התפרים מבלי לגרום לנזק עצבי או פגיעה וסקולרית.

למרות שקליפס כלי דם עשוי להיחשב כחלופה לקשירת ה-PPA זמנית באמצעות תפר, הוא יוצר סיכונים נוספים. קליפים עלולים להתנתק בטעות, מה שמוביל לפתיחת כלי שיט מחדש. יתרה מזאת, שימוש בקליפס שני ב-PPA לצד הקליפס הקיים ב-ICA מעלה את הסיכוי לניתוק קליפס ה-ICA עקב מגבלת מקום. אם זה קורה, הדבר יגרום לדימום משמעותי וללא התערבות מיידית עלול לגרום להפסקת הניסוי מוקדם. לכן, אין מומלץ לסגור את ה-PPA באמצעות קליפס כלי עבודה.

הפרוטוקול הנוכחי משתמש בקטטר, במקום מזרק33, להזרקת מיקרוספירה. גישה זו מציעה שליטה טובה יותר על מהירות ונפח ההזרקה, ומאפשרת הזרקת המיקרוספירות מרחוק יותר (למשל, בתוך שיטת הדמיה כמו מיקרוסקופ או סורק MRI).

בחירת ה-ECA על פני ה-CCA כנקודת הכניסה מאפשרת ל-CCA להישאר פתוח לחלוטין במהלך הליך ההזרקה, מה שעוזר לשמור על פרפוזיה מוחית פיזיולוגית יותר לאורך כל ההליך. בנוסף, הזרקת המיקרוספירות דרך ה-ECA במקום ה-CCA מביאה יתרונות נוספים48: i) הפחתת זמן הפעולה הכולל במהלך ריפרפוזיה; ii) הפחתת הסיכון לדימום במהלך ההזרקה ולאחר סיום הניתוח; iii) בשיטת כניסת CCA, נוצר היצרות וטרומבוזה לא יציבים ב-CCA לאחר הסרת המחט49. זה יגרום להפרעה בזרימת הדם, וכן לסיכון להיווצרות מיקרוטרומבי, שיכולים להגיע למוח. בנוסף, כניסה דרך ה-CCA תכלול סיכון גבוה לסגירה קבועה של ה-CCA, מה שעלול לגרום לרפרפוזיה מוחית לא אופטימלית במהלך תקופת ההישרדות לאחר הניתוח, שמחמירה בשל השונות הגבוהה במעגל ויליס בעכברים50,51

למרות שהוא מותאם במלואו, לפרוטוקול יש מגבלות מסוימות. ראשית, התצפית שמיקרוספירות נעות לאט יותר לאורך דפנות הקטטר ואינן מתפזרות באופן שווה במהלך ההזרקה מרמזת שפחות מיקרוספירות מועברות ל-ICA מהמצופה. למרות השימוש ב-Tween-20 להפחתת ההיצמדות, חלק מהמיקרוספירות עדיין נדבקות לקצות הפיפטה, לצינור אפנדורף ולקטטר. כתוצאה מכך, מספר המיקרוספירות המוזרקות בפועל ככל הנראה נמוך מהמספר המחושב של 7.2 x 104 חלקיקים לעכבר. עם זאת, מספיק מיקרוספירות מגיעות למחזור המוחי כדי לאפשר הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. פרוטוקול ההזרקה והרכב התערובת מותאמים למיקרוספירות פוליסטירן בגודל 10 מיקרון. אם החומרים בהם השתמשו (קצות, צינורות, קטטרים) או גודל המיקרוספירות משתנים, יש להעריך מחדש הן את התמיסה והן את תהליך ההזרקה בהתאם. שנית, מחקרים שחקרו את השיטה הטובה ביותר לחסימת כלי דם גדולים באמצעות חסימה תוך-לומינלית של ה-MCA הראו כי כניסה למערכת כלי הדם באמצעות קשירת ה-ECA הקבועה גורמת לאיסכמיהשל שרירי הלעיסה והבליעה. דבר זה עלול להוביל לירידה בצריכת המזון של עכברים וכך לירידה מופרזת במשקל, לפגיעה בתפקוד המוטורי ולהגברת הגירעון הנוירולוגי. עם זאת, הצהרה זו הופרכה על ידי אחרים48. במחקר זה, ניטור המשקל הראה ירידה צפויה לאחר הניתוח אך התאוששות מהירה למשקלים שלפני הניתוח תוך מספר ימים, מה שמעיד שהעכברים מתאוששים, אוכלים ושותים כרגיל לאחר קשירת ECA קבועה. למרות שמשקל בעלי החיים נעקב, זהו רק תחליף עקיף לרווחת בעלי החיים ואינו שולל לחלוטין ליקויים תפקודיים כמו ליקויים מקומיים בלעיסה או מוטוריה. לא בוצעו הערכות ישירות על התאוששות פונקציונלית, וזהו מגבלה של מחקר זה. מחקר נוסף השווה את כניסת מערכת כלי הדם דרך ה-CCA או ECA והראה כי הכניסה דרך ה-CCA עלולה לגרום לפגיעה ברפוזיה מחדש במחזור הדם המוחי, והסיק כי שיטת הכניסה ל-ECA מועדפת53. שלישית, מיקום נכון ובטוח של קטטר ללא יצירת בועות אוויר, קרישי דם או דליפה, וללא חסימת זרימה ב-CCA וב-ICA דורש תרגול משמעותי. לבסוף, בניגוד לשיטות מיקרו-אוקלוזיה אחרות כמו פוטותרומבוזיס באמצעות הזרקת רוז-בנגל22, לא ניתן לחזות היכן המיקרוספירות יתמקמו בסופו של דבר במחזור הדם.

המחקר הנוכחי אינו כולל במכוון קבוצות ביקורת שליליות (שראשונות) או חיוביות (פוטותרומבוזיס), שכן אלו לא יספקו ערך נוסף למטרה הראשית. הצלחת מודל זה מוגדרת על ידי מספר המיקרוספירות השקועים בתוך המיקרוסירקולציה המוחית, במיוחד באזור חלון הגולגולת, כדי לאפשר מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ב-vivo . הליך מזויף, בהגדרה, לא יניב מיקרוספירות באזור היעד ולכן לא יציע השוואה רלוונטית לנקודת הקצה של הדמיה ב-in vivo . באופן דומה, הכללת מודל פוטותרומבוזיס תעסוק במנגנון פתופיזיולוגי שונה מהותית ולכן היא מעבר להיקף העבודה הזו, המתמקדת באפיון מודל התסחיף המיקרווסקולרי במקום בהשוואת מתודולוגיות. ניתוחים היסטולוגיים רחבים יותר של תסחיפים והשפעתם הפוטנציאלית על ה-BBB או רקמת העצב המקומית לא נערכו, שכן המחקר נועד להעדיף הדמיה תלת-ממדית ב-vivo על פני אימות ברמת הרקמה.

הפרוטוקול הכירורגי המפורט הן להכנת חלון הגולגולת והן למודל התסחיף המיקרווסקולרי תומך בחקירה אמינה וניתנת לשחזור של שינויים מיקרווסקולריים הקשורים לתסחיף מיקרווסקולרי והופעת אוטמי מוח שקטים בכל רחבי ההמיספרה השנייה. ההכנה וההזרקה האופטימליים של תערובת המיקרוספירה משפרים עוד יותר את העקביות והתוקף של הגישה הניסויית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להביע את תודתם הכנה לד"ר איוואן דובה על פיתוח תוכנת Articulus , ששימשה לשחזורי תמונות תלת-ממדיות במקום. אנו גם מודים לפרופ' ד"ר ניקולאוס פלסנילה על כך שסיפק בעכברי TIE2-GFP (מעבדת ג'קסון, מלאי מס' 003658) המשמשים לרבייה פנימית.

מחקר זה מומן על ידי Amsterdam Neuroscience (813294 ל-I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (קריאת ציוד 2021 ו-2023 ל-I.M.) וקרן הלב ההולנדית (03-006-2021-T019 ל-I.M.).

מחקר זה ממומן גם על ידי קרן הלב ההולנדית וקרן המוח בהולנד, ומתבצע בשיתוף פעולה ותמיכה של הברית הקרדיוווסקולרית ההולנדית, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. בנוסף, עבודה זו מומנה בחלקה באמצעות מימון בלתי מוגבל של Stryker, Medtronic ו-Penumbra. מקורות המימון לא היו מעורבים בתכנון מחקר, ניטור, איסוף נתונים, ניתוחים סטטיסטיים, פרשנות תוצאות או כתיבת מאמר יד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 27 גייג' (0.1x16 מ"מ)טרומו-מחט 27 (שלב 2.1.2.)
תוכנת Articulus--תוכנת ניתוח תלת-ממדי (שלב 4.2.2 ו-4.3.3)
בטדין 30 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל)מיילן8712207037612בטדין/יוד (שלב 1.1.8. & 2.2.10.)
C& מונומר Bסאן מדיקל7111רכיב בדבק העל (שלב 1.3.1.)
להבים ניתוחים מפלדת פחמן (מס' 15)סוואן-מורטון205להב לשריטה בגולגולת (שלב 1.2.4.)
קרפרופן (50 מ"ג/מ"ל)זואטיס-תרופות להקלה על כאבים (שלבים 1.1, 1.6, 2.2 ו-2.8)
קטלייזרסאן מדיקל7110רכיב בדבק העל (שלב 1.3.1.)
קטטר (ID 0.31 OD 0.64 מ"מ)פרוידנברג228-0661קטטר שקוף (שלב 2.1.1.)
וו רקמה שיוצר על ידי קוסטום--וו רקמה (שלב 2.3.4.)
קצות כותנה--קצה כותנה (שלבים 1.1.8, 1.2.4 ו- 1.5.1.)
זכוכית כיסויוורנר אינסטרומנטס64-0724זכוכית כיסוי החלונות הגולגולתית (שלב 1.4.2.)
ראש עכבר מותאם אישית--ראש למחזיק התמונה (שלב 1.3.2.) 
מחזיק הדמיית עכבר מותאם אישית  --מחזיק עכבר הדמיה (שלב 1.4.1. & 3.1.1.)
מסגרת סטריאוטקטית מותאמת אישית--מסגרת סטריאוטקטית (שלב 1.1.7.)
נוזל קמנט דנטליקולצר64707937רכיב במלט דנטלי (שלב 1.3.3.)
אבקת קסמנט דנטליתקולצר64707945רכיב במלט דנטלי (שלב 1.3.3.)
מקדחה דנטלית סאשין  L-206תרגיל (שלב 1.4.3.)
דקסמתאזון (4 מ"ג/מ"ל)סנטרפארם-תרופות טרום-ניתוחיות (שלב 1.1.4.)
מלקחיים ניתוחיםבראון-אסקולאפBD023Rמלקחיים (שלב 1.2.2. & 2.3.2.)
מקדח לבר PK/100.5 (0.5 מ"מ)מדעים איכותיים19007-05מקדח (שלב 1.4.3.)
דוראטארים (3.5 גרם)אלקון-משחת עיניים (שלב 1.1.8. & 2.2.7.)
דבק אפוקסי (1 גרם)פטקס9H PSMG3Xדבק אפוקסי (שלב 1.5.2. & 2.1.1.)
מלקחיים מיקרו-עדינים ישריםכלי מדע מדויקדומונט #5מלקחיים מיקרו-עדינים (שלב 2.6.6.)
FITC-דקסטרן (70 KDa)סיגמא-אלדריץ'FD70Sפתרון FITC-Dextran (שלב 2.5.2.)
איזופלוראן (1000 מ"ג/גרם)Laboratorios Karizoo S.A.118938הרדמה (שלב 1.1.6. & 2.2.5.)
קריומיקרוטום גדול עם הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית בהתאמה אישית-גדול-תלת-ממד (שלב 4.3.3)
לידוקאין (100 מ"ג/מ"ל)אספן-הרדמה מקומית (שלב 1.2.3. ו-2.2.10)
מספריים מיקרו ואנאס 3-3/8 אינץ'בראון-אסקולאפOC498Rמספריים מיקרו (שלב 2.6.2)
מלקחיים לקשירת תפרים מיקרו עם ידית עגולהבראון-אסקולאפFD280Rמיקרופורפספס (שלב 2.3.3.)
מלקחיים לקשירת תפרים מיקרו עם ידית עגולה מכופפתבראון-אסקולאפFD281Rמיקרופורפספס כפוף (שלב 1.5.1. & 2.3.3.)
קליפ מיקרווסקולריבראון-אסקולאפFD562Rקליפס כלי (שלב 2.6.1.)
קטטר מיקרו (מזהה 0.23114 מ"מ OD 0.27432 מ"מ)מיקרולומןקטטר מיקרו (שלב 2.1.1.)
כרית חימום עכבר וגשוש רקטליסטולטינג53800Rכרית חימום (שלב 1.1.2. & 2.2.2.)
עכברי NG2-DsRedמעבדת ג'קסון, בר הארבור, ארה"ב, מלאי מס' 008241
פוליאתילן גליקול סורביטן מונולאוראטסיגמא-אלדריץ'9005-64-5Tween20 (שלב 2.5.2.)
פוליסטירן פלואורספירות כחול (365/415)InvitrogenF8829מיקרוספירות כחולות (שלב 2.5.1.)
פוליסטירן פלואורספירות אדומות (580/605)InvitrogenF8834מיקרוספירה אדומה (שלב 2.5.1.)
כלוב התאוששות--כלוב התאוששות (שלבים 1.6.2. & 2.8.2.)
חיתוך הפוך במחט מעוקלת 3/8 (12 מ"מ) עם תפרבבראון0762067תפר (שלב 2.7.5)
Ropivacaï NE (2 מ"ג/מ"ל)--תרופות   (שלב 1.1.5.)
קריומיקרוטום פלואורסצנטי תלת-ממדי קטן   בהתאמה אישיתSmall-3D-FICS (שלב 4.2.2)
ספונגוסטןאתיקוןMS0005ספונגוסטן (שלב 1.4.6.)
מיקרוסקופ כירורגיEuromex Microscopen B.V.NZ.1903-Bמיקרוסקופ לניתוח (שלב 1.2. 2.1.1.)
מספריים כירורגייםבראון-אסקולאפBC303Rמספריים כירורגיים (שלב 1.2.2. & 2.3.2.)
משאבת מזרק (למזרקים של 1 מ"ל)מכשיר הווארד70-2208משאבת מזרק של 1 מ"ל (שלב 2.5.6.)
Thread, 100m,  4/0 1.5   בבראוןF11340354/0.15 שרשורים (שלב 2.4.3.)
עכברי TIE2-GFPמעבדת ג'קסון, בר הארבור, ארה"ב, מלאי מס' 003658
דאסטר טהור במיוחדThorlabsCA6-EUאוויר דחוס (שלב 1.2.5.)
Universal Polymer Clearסאן מדיקלT058Eרכיב בדבק העל (שלב 1.3.1.)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VivoFITC Dextran

מאמרים קשורים