מאמר שיטה

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

DOI:

10.3791/68941

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Medical Faculty, Department of Pathophysiology, University of Belgrade, 2Faculty of Electronic Engineering, University of Nis

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה (Danio rerio) נמצא בשימוש נרחב כמודל של בעלי חוליות במחקר קרדיווסקולרי בשל הדמיון הגנטי שלהם לבני אדם, שקיפות אופטית במהלך ההתפתחות המוקדמת והתאמה להדמיה in vivo . כתב יד זה מציג פרוטוקול סטנדרטי ונגיש להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה ב-96 שעות לאחר ההפריה (HPF) באמצעות מיקרוסקופ אור בהיר. השיטה כוללת איסוף עוברים, סינון מורפולוגי, קיבוע באגרוז, הקלטת וידאו של הלב הפועם וניתוח מבוסס תמונה של פרמטרים לבביים כגון מידות חדר, נפח שבץ, דופק, מקטע פליטה ותפוקת לב. החישובים מבוססים על קירובים גיאומטריים של החדר באמצעות תוכנת קוד פתוח (למשל, ImageJ, Zembryo Analyzer). הפרוטוקול מאפשר הערכה כמותית של ביצועי הלב באמצעות ציוד זמין באופן נרחב, מה שהופך אותו למתאים למעבדות עם משאבים מוגבלים ובדיקות בתפוקה גבוהה. במחקר זה, 96 זחלי דג זברה hpf נותחו על ידי רישום הלב הפועם במיקרוסקופ אור. פרמטרים לבביים מרכזיים שנמדדו כללו ממדי חדרים, ששימשו לחישוב נפח השבץ וקצב הלב, שנקבעו על ידי פעימות לדקה. מאלה נגזרו מקטע פליטה ותפוקת לב כדי להעריך את ביצועי הלב הכוללים. תוצאות מייצגות מעוברים בריאים הראו התכווצות חדרים עקבית ומדדים תפקודיים חזקים, בעוד שעוברים שנחשפו לקדמיום הראו פגיעה במורפולוגיה הלבבית וירידה משמעותית בתפוקת הלב. בסך הכל, השיטה חשובה לאיתור רעילות לב התפתחותית ומספקת גישה ניתנת לשחזור ולא פולשנית להערכת תפקוד הלב in vivo במהלך התפתחות מוקדמת של דג הזברה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה (Danio rerio) התגלה כאורגניזם מודל בולט של בעלי חוליות במחקר הלב וכלי הדם בשל ההומולוגיה הגנטית שלהם עם בני אדם, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית של עוברים והתפתחות מהירה 1,2. תכונות אלו, בשילוב עם עלות-תועלת ומדרגיות, הופכות את דג הזברה למתאים במיוחד לחקר מורפוגנזה לבבית מוקדמת, מומי לב מולדים ורעילות לב התפתחותית3. הרלוונטיות שלהם מתחזקת עוד יותר על ידי השימור הגבוה של גנים ומסלולי איתות המווסתים את התפתחות הלב על פני מיני בעלי חוליות4. בפרט, מודלים של דג הזברה תרמו באופן משמעותי להבנת הבסיס הגנטי והפיזיולוגי של היווצרות, עיצוב מחדש ותפקוד של הלב בתנאים נורמליים ופתולוגיים כאחד 5,6.

מבחינה מבנית, לב דג הזברה מורכב מאטריום יחיד וחדר יחיד, המחוברים בצורה ליניארית, וחסרים את המחיצה האופיינית ללב ארבעת החדרים של היונקים. למרות זאת, לב דג הזברה מסכם היבטים מרכזיים של פיזיולוגיה של הלב האנושי, כולל נוכחות של שכבות אנדוקרדיאליות ושריר הלב, מערכת הולכה לבבית, פעילות התכווצות קצבית וויסות על ידי גורמים נוירו-הורמונליים 7,8. חשוב לציין, לב דג הזברה מציג אירועים מורפוגנטיים מרכזיים, כולל לולאה ימינה של צינור הלב והרחבה ותיחום של חדרי הלב לאחר מכן, הדומים לאלה בהתפתחות עוברית אנושית9. יתר על כן, לב דג הזברה שומר על רבות מהתכונות האלקטרופיזיולוגיות וההמודינמיות שנראות בבעלי חוליות גבוהים יותר, כולל התפשטות פוטנציאל פעולה, אפנון התכווצות ודינמיקה של מחזור סידן7.

בהתחשב בקווי הדמיון הללו, דג הזברה התגלה כמודל מרכזי בטוקסיקולוגיה, במיוחד להערכת האופן שבו חשיפות לכימיקלים משפיעות על התפתחות הלב ותפקודו10. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות בתחום זה נותרה ההסתמכות על טכניקות הדמיה תובעניות מבחינה טכנית. שיטות קונבנציונליות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או גיליון קל, או קווים טרנסגניים המבטאים סמנים לבביים פלואורסצנטיים, למרות שהן עוצמתיות, הן יקרות ודורשות תשתית טכנית משמעותית11. אילוצים אלה מגבילים את היישום הרחב יותר של פנוטיפ לב מבוסס דג זברה, במיוחד בסביבות עם משאבים מוגבלים או עבור יישומים הדורשים סקר תפוקה גבוהה12.

יש, אם כן, צורך הולך וגובר בגישות מתודולוגיות המאפשרות הערכה אמינה של תפקוד הלב באמצעות מכשור זמין באופן נרחב. הספרות הקיימת מכילה דוגמאות לשיטות פשוטות כאלה, כולל הדמיה מבוססת שדה בהיר או מיקרוסקופ אור בשילוב עם מדידות ידניות או אוטומטיותלמחצה 13,14. עם זאת, טכניקות אלו אינן תמיד סטנדרטיות ולעתים קרובות משתנות בין קבוצות מחקר מבחינת פרוטוקול, תזמון ופרמטרים של ניתוח תמונה. שונות זו מעכבת את יכולת השחזור ומגבילה את הערך ההשוואתי בין מחקרים, במיוחד בתחומים כמו עוברטוקסיקולוגיה, פרמקולוגיה או אקוטוקסיקולוגיה, שבהם נקודות קצה קרדיווסקולריות כמותיות משמשות יותר ויותר כאינדיקטורים לבטיחות התפתחותית15.

בהקשר זה, דג הזברה מציע מודל רב ערך לבדיקת רעילות לב התפתחותית in vivo. סוכנויות רגולטוריות וקונסורציום מדעי הכירו יותר ויותר ברלוונטיות של דג הזברה בתחום זה, במיוחד בהתחשב ביכולתם לזהות שינויים עדינים בתפקוד הלב שעלולים להקדים מומים מבניים או קטלניות14. העובר השקוף מאפשר הדמיה ישירה של הלב הפועם, ומאפשר הערכה חיה של ביצועי הלב ללא צורך בפרוצדורות פולשניות. יתר על כן, הפשטות של אנטומיית הלב של דג הזברה מאפשרת כימות של דינמיקה של פרוזדורים וחדרים, כולל מידות תא ופרמטרים של שבץ, תוך שימוש בטכניקות הדמיה בסיסיות15.

מטרת העל של השיטה המתוארת במאמר זה היא לספק גישה נגישה וניתנת לשחזור להערכה מורפו-תפקודית של ביצועי לב עובריים של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי. על ידי התמקדות ברכישת וידאו פשוטה וניתוח תמונות פוסט הוק, הטכניקה שואפת למלא את הפער המתודולוגי בין הדמיה ברזולוציה גבוהה לניקוד תצפיתי איכותי. פרוטוקול זה ניתן להתאמה לסביבות מעבדה ורמות משאבים מגוונות, והוא ישים במיוחד למחקרים טוקסיקולוגיים, פרמקולוגיים או גנטיים המתמקדים בהערכת תפקודי לב.

בנוסף ליתרונותיו המעשיים, הפרוטוקול תורם לתחום בכך שהוא מציע זרימת עבודה מאוחדת, צעד-אחר-צעד, המשלבת טכניקות נפוצות לתוך צינור יחיד הניתן לשחזור. בעוד שגישות דומות קיימות בספרות, מעטות מספקות רמה זו של אינטגרציה עם תיעוד חזותי, שעשוי לתמוך באימוץ וסטנדרטיזציה רחבים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הקשורים לעוברי דג הזברה נערכו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. גידול דגי זברה ומניפולציה של עוברים בוצעו בהתאם להנחיה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. תחזוקת דג הזברה ואיסוף העוברים

  1. שמור על דג זברה בוגר (Danio rerio) במערכת אקווריום מחזורית ב-28 מעלות צלזיוס± 1 מעלות צלזיוס במחזור אור של 14 שעות / 10 שעות חושך.
  2. האכילו דגים שלוש פעמים ביום עם פתית מסחרי עתיר חלבון או הזנה גרגירית המתאימה לדגי זברה.
  3. בשעות אחר הצהריים המאוחרות, העבירו דגי זברה בוגרים למיכלי רבייה המצוידים ברשת שקופה כדי להפריד דגים מקרקעית המיכל. השתמש ביחס זכר לנקבה של 2:3, מופרד בן לילה על ידי מחיצה נשלפת.
  4. למחרת בבוקר, הסר את המחיצה והוסף 50-100 מ"ל מי אקווריום קרים כדי לעורר את ההשרצה.
  5. לאחר ההפריה (תוך 30-60 דקות), הוציאו דגים בוגרים ממיכל הרבייה כדי למנוע טריפה של עוברים.
  6. אוספים עוברים באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק ומעבירים אותם לצלחות פטרי סטריליות מלאות במדיום עוברי E3.
    הערה: מדיום עובר E3 הוא תמיסת מלח חוצצת המחקה את ההרכב היוני של הנוזל החוץ-תאי של דג הזברה. הכן מדיום E3 על ידי המסת 580 מ"ג NaCl, 27 מ"ג KCl, 97 מ"ג CaCl2·2H2O ו-163 מ"ג MgCl2·6H2O בכ-800 מ"ל מים מזוקקים טהורים במיוחד. התאם את ה-pH ל-7.2 באמצעות 1 N NaOH או HCl. לאחר שה-pH מותאם ויציב, הביאו את הנפח הכולל ל-1,000 מ"ל עם מים מזוקקים. עקר את התמיסה על ידי סינון דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר. הוסף 100 מיקרוליטר של 1% מתילן כחול לליטר כדי למנוע צמיחת פטריות. אחסן את מדיום ה-E3 המוכן ב-4 מעלות צלזיוס וחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  7. לדגור עוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס באינקובטור עם מחזור אור/חושך מבוקר (14 שעות/10 שעות).
    הערה: הגבל את מספר העוברים לכל צלחת פטרי (למשל, 50 לכל צלחת 100 מ"מ) כדי למנוע צפיפות, שעלולה לגרום להיפוקסיה ולפגמים התפתחותיים.
  8. יש להחליף את מדיום E3 מדי יום כדי לשמור על תנאי התפתחות מיטביים.

2. בחירת עוברים תקינים מבחינה מורפולוגית

  1. כ-6 שעות לאחר ההפריה (hpf; הזמן שחלף מאז ההפריה), העבירו את העוברים המופרים לצלחת פטרי נקייה המכילה מדיום E3 טרי.
  2. בדוק עוברים תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 40.
  3. השליכו את כל העוברים המראים סימנים של חריגה התפתחותית, כולל:
    1. עוברים קרושים: מזהים לפי המראה האטום או הלבן, המרקם הגרגירי והיעדר מבנים פנימיים הניתנים להבחנה. קרישה היא סימן לחוסר כדאיות ומתרחשת בדרך כלל בשעות הראשונות לאחר ההפריה.
    2. עיכוב התפתחות: לא לכלול עוברים שלא התקדמו לשלב המורפולוגי הצפוי (למשל, היעדר סידור תאים אפיבולי או לא סדיר), מה שמרמז על פגיעה בכדאיות.
    3. חריגות בשק החלמון: חפש שקי חלמון קרועים, לא סדירים או אסימטריים שעלולים להצביע על התפתחות לקויה או חוסר איזון אוסמוטי.
    4. מומים חיצוניים: אל תכלול עוברים עם צירי גוף מעוותים, פיזור מסת תאים לא סדיר או צורות חריגות של הכוריון.
    5. שלמות כוריון ירודה: הימנע משימוש בעוברים עם כוריון ממוטט, מצומק או קרוע, מכיוון שהם עלולים להיות נתונים ללחץ מכני או אוסמוטי.
  4. שמור רק עוברים העומדים בכל הקריטריונים הבאים: (1) צורת גוף שקופה וסימטרית, (2) התקדמות אפיבולית אחידה עם שכבות תאיות חלקות, (3) בלסטודרם גלוי בבירור וכוריון כדורי שלם.
    הערה: ב-6 hpf, עובר דג זברה נורמלי מבחינה מורפולוגית הוא בצורת כיפה עם בלסטודרם מוגדר בבירור העוטף את החלק העליון של החלמון. יש לחלק את הציטופלזמה באופן שווה, ללא כתמים גרגירים, וללא סימני פיצול או גוש.

3. הדמיית לב באמצעות מיקרוסקופ אור

  1. ב-96 hpf, הרכיבו עוברים בנפרד בצלחות פטרי עם תחתית זכוכית 35 מ"מ מלאות במדיום E3.
  2. מכינים 1.2% אגרוז נקודת התכה נמוכה במדיום E3 ומחממים מראש ל-37-38 מעלות צלזיוס. שמרו על הטמפרטורה באמצעות גוש חום או אמבט מים.
  3. הטמיעו כל עובר באגרוז וכוונו אותו בעדינות לרוחב באמצעות מלקחיים עדינים לפני שהאגרוז מתמצק.
    הערה: ודא שהלב נראה בבירור ופונה לרוחב, כאשר גם האטריום וגם החדר נמצאים באותו מישור מוקד.
  4. השתמש במיקרוסקופ אור הפוך המצויד במצלמה דיגיטלית כדי להקליט סרטונים ברזולוציה גבוהה של 30 שניות המתמקדים במיוחד באזור הלב של עוברי דג הזברה. צלם סרטונים בהגדלה של 40× או 100× כדי להבטיח הדמיה ברורה של מבני הלב ופעימות הלב.
    1. הקלט את הסרטונים בקצב פריימים של 30 פריימים לשנייה (fps) בפורמטים לא דחוסים או דחוסים מינימלית (למשל, AVI או MOV) כדי לשמור על איכות התמונה ולאפשר ניתוח מדויק של דינמיקת תנועת הלב. הגדרה זו מאפשרת הערכה מפורטת של פרמטרים תפקודיים כגון דופק, קצב התכווצות ומורפולוגיה של החדר.

4. ניתוח תמונה ומדידת תפקוד הלב

  1. מדידות ידניות ב-ImageJ
    1. ייבא סרטונים. פתח סרטונים ב-ImageJ באמצעות File > Import >-AVI. במידת הצורך, המירו את הווידאו לאוסף תמונות באמצעות אוספי תמונות > > המרת תמונות לאוסף.
    2. כייל את סולם המדידה. השתמש ב-Analyze > Set Scale, הזן את קוטר השדה הידוע (למשל, 4 מ"מ עבור יעד של 10×), והפעל את האפשרות Global כדי להחיל את קנה המידה על כל המדידות.
    3. הגדר אזורי עניין (ROI). השתמשו בכלי ה-ROI (קו, מצולע, מלבן) כדי לסמן את צירי החדרים הארוכים והקצרים במהלך סוף סיסטולה ודיאסטולה קצה (איור 1). נהל החזר ROI באמצעות כלי ניתוח > > ROI Manager.
  2. מדידת הקטרים והשטחים לחישוב פרמטרים פונקציונליים (קובץ משלים 1)
    1. קבע את שטח הפנים של החדר (באמצעות קירוב האליפסה) באמצעות משוואה 1:
      VA = ((D_L - D_S)/2) × π (1)
      כאשר DL = קוטר ארוך, DS = קוטר קצר.
    2. הערכת נפח החדר ב-ED ו-ES באמצעות נוסחת הנפח האליפסואיד (משוואה 2)
      VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2)
    3. חשב שינוי שטח חלקי (FAC) וקיצור שבר (FS) באמצעות משוואה 3 ומשוואה 4:
      FAC (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 (3)
      FS (%) = (D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
      כאשר VAD = אזור החדר ב-ED; VAS = אזור החדר ב-ES; DDL = ציר ארוך ב-ED; DSS = ציר קצר ב-ES.
    4. קבע את עוצמת הקול של הקו (SV) באמצעות משוואה 5:
      SV = VVD - VVS (5)
    5. חשב את שבר הפליטה (EF) באמצעות משוואה 6:
      EF (%) = (SV / VVD) × 100 (6)
  3. ניתוח אוטומטי ב-ZembryoAnalyzer
    1. הפעל וטען את הסרטון שצולם. פתח את ZembryoAnalyzer (זמין בכתובת: https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser), והשתמש בקובץ > פתח וידאו כדי לייבא את הסרטון הרצוי.
    2. בצע את הזיהוי האוטומטי של אזור הלב. לחץ על כפתור זיהוי לב כדי לאפשר לתוכנה לאתר אוטומטית את אזור העניין (ROI) על סמך תנודות הבהירות על פני מסגרות וידאו. התאם את ההחזר על ההשקעה באופן ידני במידת הצורך באמצעות כלי מלבן, אליפסה או מצולע.
    3. בצע את הערכת הדופק האוטומטית. תן לתוכנה לנתח שינויי בהירות בתוך ההחזר על ההשקעה שזוהה. הדופק מחושב על ידי זיהוי שיאים תקופתיים בעוצמה. האלגוריתם מיישם סינון סף כדי להסיר רעש ותוצאות חיוביות כוזבות, ומבטיח זיהוי פעימות מדויק.
    4. ייצא את התוצאות. ייצא את נתוני הדופק ואת תרשימי העוצמה המתאימים באמצעות ייצוא > PDF או ייצוא > Excel. לחלופין, שמור את הנתונים הגולמיים בפורמט CSV או JSON לעיבוד סטטיסטי במורד הזרם.
  4. חשב את תפוקת הלב (CO) באמצעות משוואה 7:
    CO = SV × HR (7)

5. הערכת תחולת פרוטוקול בבדיקת רעילות לב באמצעות חומרים רעילים

  1. שקלו קדמיום כלוריד והכינו תמיסת עבודה על ידי המסתו ישירות במדיום E3 לריכוז סופי של 3 מ"ג/ליטר.
  2. העבירו את העוברים לצלחות פטרי המכילות את תמיסת הקדמיום 24 שעות לאחר ההפריה (hpf).
  3. דגרו את העוברים בתמיסת הקדמיום עד 96 hpf ב-28 מעלות צלזיוס± 1 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 14 שעות / 10 שעות חושך.
  4. החלף את תמיסת הקדמיום מדי יום כדי לשמור על חשיפה עקבית.
  5. ב-96 hpf, הקלט סרטוני לב ברזולוציה גבוהה, כפי שתואר קודם לכן, של העוברים למדידה וניתוח עוקבים של פרמטרים של תפקוד הלב.
    הערה: השתמש בפרוטוקול חשיפה לקדמיום זה כדי לדמות רעילות לב התפתחותית בעוברי דג זברה, כפי שתואר במחקר קודם16.

6. ניהול נתונים ושכפולים

  1. רשום את כל המדידות בגיליונות אלקטרוניים מובנים. כלול את מזהה העובר, קבוצת הטיפול וכל הפרמטרים המחושבים.
  2. ודא שלפחות 20-30 עוברים לקבוצה מנותחים לאמינות סטטיסטית.
    הערה: ניתן לאחסן ולנתח הקלטות וידאו של אזור הלב בנקודת זמן מאוחרת יותר מבלי לפגוע בדיוק המדידות המורפומטריות או התפקודיות. בהשוואות הפנימיות שלנו, תוצאות מניתוחים מיידיים ומאוחרים היו עקביות בכל הפרמטרים הלבביים המרכזיים, ותמכו בשחזור של הערכה מבוססת וידאו מושהית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח כמותי של התפתחות הלב של דג הזברה ב-96 שעות לאחר ההפריה (hpf), כולל פרמטרים מבניים ותפקודיים כגון גודל החדר, התכווצות, נפח שבץ ושבר פליטה.

איור 2 מציג תמונות שדה בהירות מייצגות של חדר דג הזברה בקצה הדיאסטולה (ED) ובקצה הסיסטולה (ES), יחד עם גרפי עמודות תואמים המציגים מדידות שטח חדר ממוצע (VA) ונפח (VV) (n = 30 עוברים). החדר נראה אליפסואיד בצורתו ומדגים התכווצויות קצביות, עם הבדלי מימדים ברורים בין ED ל-ES המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד השלבים החשובים בפרוטוקול זה הוא זיהוי ובחירה מדויקים של עוברים תקינים מבחינה מורפולוגית 6 שעות לאחר ההפריה (hpf). עוברים המציגים סימני קרישה, עיכוב התפתחותי או חריגות מבניות עלולים לפגוע משמעותית בעקביות וביכולת הפרשנות של מדידות לב וכלי דם. הסרה מוקדמת של עוברים לא ברי קיימא או בעלי מומים מבטיחה בסיס אמין להערכת התפתחות ותפקוד הלב. התמצאות נכונה של העוברים במהלך ההדמיה, הבטחת מיקום רוחבי כשהלב נראה בבירור, חשובה לא פחות להשגת תוצאות הניתנות לשחזור ולפירוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי משרד המדע, הפיתוח הטכנולוגי והחדשנות של הרפובליקה של סרביה, באמצעות הסכם מימון מוסדי עם אוניברסיטת בלגרד, הפקולטה לרפואה, ליישום ומימון פעילויות מחקר בשנת 2025. מספר רישום החוזה למימון מוסדי בשנת 2025 הוא 451-03-137/2025-03/200110. אנו מבקשים שמספר זה ייכלל באישורים של כל הפרסומים הנובעים מתתי הפרויקטים שאושרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; מסנן ממברנה mמיליפורSLGP033RS0.22 ומיקרו; מסנן ממברנה m
תמיסה של 1 N HClסיגמא-אלדריץ'320331תמיסת חומצה כלורית לכיוון pH
תמיסה של 1 N NaOHסיגמא-אלדריץ'72068תמיסת נתרן הידרוקסיד לכיוון pH
דג זברה בוגר (Danio rerio)מתקן רבייה מקומילא זמיןאורגניזם מודל
אקווריומי רבייה עם רשת//הפרדת בוגרים להטלה
CaCl?· 2H? Oסיגמא-אלדריץ'C5670סידן כלוריד דיהידראט, דרגת מגיבה
כלוריד קדמיוםסיגמא-אלדריץ'202908חומר רעיל לשימוש בחשיפה של 3 מ"ג/ל
מזון מסחרי לדגי זברהמיני גרן, נוטרי פט, גורניי מילאנובאץ'/מזון עשיר בחלבון או מזון גרגירי מתאים לדגי זברה
מצלמה דיגיטלית (מיקרוסקופ)פוטוניקה של המאמצוORCA-Flash4.0 V3מצלמה להקלטת וידאו ב-30 fps
בלוק חוםאפנדורף5382000010מכשיר חימום מבוקר טמפרטורה
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח
מיקרוסקופ אור הפוךניקוןTi2-Eמיקרוסקופ עם מצלמה דיגיטלית, 40 פעמים; ו-100&00 פעמים; מטרות
KClסיגמא-אלדריץ'P3911כלוריד אשלגן, דרגת מגיבה
אגרוז בנקודת התכה נמוכה (1.2%)תרמו פישר סיינטיפיק16520050להטמעת עוברים
מתילן כחול (1%)סיגמא-אלדריץ'M9140חומר אנטי-פטרייתי נוסף למדיום E3
MgCl?· 6H? Oסיגמא-אלדריץ'M9272מגנזיום כלוריד הקשהידרט, דרגת מגיב
NaClסיגמא-אלדריץ'S9888כלוריד נתרן, דרגת מגיב
צלחות פטרי סטריליות (100 מ"מ)קורנינג430167צלחות פטרי מפלסטיק לתרבות עוברים
צלחות פטרי סטריליות (35 מ"מ)חברת MatTekP35G-1.5-14-Cצלחות פטרי עם תחתית זכוכית להרכבת עוברים
מים מזוקקים אולטרה-טהוריםמיליפורהפניה ל-Milli-Qמים להכנת תמיסה
תוכנת ZembryoAnalyzerGitHub (דארקו פופלוביץ')https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyserתוכנת ניתוח תפקודי לב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat RevDrug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  2. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14129(2023).
  3. Narumanchi, S., et al. Zebrafish heart failure models. Front Cell Dev Biol. 9, 662583(2021).
  4. Clément, Y., Torbey, P., Gilardi-Hebenstreit, P., Crollius, H. R. Enhancer-gene maps in the human and zebrafish genomes using evolutionary linkage conservation. Nucleic Acids Res. 48 (5), 2357-2371 (2020).
  5. Kemmler, C. L., Riemslagh, F. W., Moran, H. R., Mosimann, C. From stripes to a beating heart: Early cardiac development in zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 8 (2), 17(2021).
  6. Bowley, G., et al. Zebrafish as a tractable model of human cardiovascular disease. Br J Pharmacol. 179 (5), 900-917 (2022).
  7. Echeazarra, L., Hortigón-Vinagre, M. P., Casis, O., Gallego, M. Adult and developing zebrafish as suitable models for cardiac electrophysiology and pathology in research and industry. Front. Physiol. 11, 607860(2021).
  8. Foo, Y. Y., et al. Effects of extended pharmacological disruption of zebrafish embryonic heart biomechanical environment on cardiac function, morphology, and gene expression. Dev Dyn. 250 (12), 1759-1777 (2021).
  9. M Männer, J. The functional significance of cardiac looping: comparative embryology, anatomy, and physiology of the looped design of vertebrate hearts. J Cardiovasc Dev Dis. 11 (8), 252(2024).
  10. Park, H., Yun, B. H., Lim, W., Song, G. Dinitramine induces cardiotoxicity and morphological alterations on zebrafish embryo development. AquatToxicol. 240, 105982(2021).
  11. Schlaeppi, A., Graves, A., Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy of fast cardiac dynamics in zebrafish embryos. J Vis Exp. 174, e62741(2021).
  12. Motta, E. R. Development of microscopy strategies for rapid imaging of zebrafish heart development. Doctoral dissertation. , Université de Strasbourg. https://theses.fr/2020STRAJ043 (2020).
  13. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  14. Santoso, F., et al. An overview of methods for cardiac rhythm detection in zebrafish. Biomed. 8 (9), 329(2020).
  15. Teixidó, E., et al. Automated morphological feature assessment for zebrafish embryo developmental toxicity screens. Toxicol Sci. 167 (2), 438-449 (2019).
  16. Mitovic, N., et al. Cadmium significantly changes major morphometrical points and cardiovascular functional parameters during early development of zebrafish. Environ Toxicol. Pharmacol. 87, 103723(2021).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Spomer, W., Pfriem, A., Alshut, R., Just, S., Pylatiuk, C. High-throughput screening of zebrafish embryos using automated heart detection and imaging. J Lab Autom. 17 (6), 435-442 (2012).
  19. Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents. Front Physiol. 5, 344(2014).
  20. Liebling, M., et al. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos viapostacquisition synchronization of nongated slice sequences. J Biomed Opt. 10 (5), 054001(2005).
  21. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  22. Sargazi, S., et al. Fluorescent-based nanosensors for selective detection of a wide range of biological macromolecules: A comprehensive review. Int J Biol Macromol. 206, 115-147 (2022).
  23. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  24. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  25. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  26. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68941

תגיות

Zebrafish Cardiac ImagingCardiac Function AnalysisBrightfield MicroscopyVideo AnalysisVentricular DimensionsStroke VolumeHeart RateEjection FractionCardiac OutputEmbryonic Cardiotoxicity

מאמרים קשורים