הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

התפקיד המגן של קלותו בפגיעת קרדיומיוציטים הנגרמת מהיפוקסיה-חמצון מחדש באמצעות ויסות מפל האיתות של NF-κb

304 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68946

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מעריך את התפקיד המגן של ביטוי יתר של קלותו בקרדיומיוציטים H9C2 תחת ריחמצון היפוקסיה באמצעות בדיקות מולקולריות ופונקציונליות.

תקציר

מחקר זה נועד לחקור את התפקיד המגן של קלותו בקרדיומיוציטים שנחשפו להיפוקסיה/פגיעת חמצון מחדש (H/R). מודל H/R במבחנה הוקם באמצעות קרדיומיובלסטים של חולדות H9C2, שהועברו באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים יתר על המידה קלותו. התאים חולקו לשש קבוצות ניסוי: ביקורת, H/R, ביקורת שלילית (NC), ביטוי יתר קלותו, PDTC (מעכב NF-κB), וקבוצת שילוב שטופלה בקלוטו וליפופוליסכריד (LPS). רמות הביטוי של קלותו נקבעו באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ו-Western Blotting. חיוניות התאים נמדדה באמצעות בדיקת MTT, בעוד שאפופטוזיס הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. ביטוי החלבונים המעורבים במסלול האיתות של NF-κB נותח באמצעות ווסטרן בלוטינג, והביעה התאית של ציטוקינים פרו-דלקתיים הוערכה באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה. ביטוי יתר של קלותו העלה משמעותית את רמות הקלוטו בתאי H9C2 והוביל לשיפור בחיוניות התאים, הפחתת אפופטוזיס וירידה בביטוי התאים של ציטוקינים פרו-דלקתיים בהשוואה לקבוצת H/R. ניתוח ווסטרן בלוט גילה כי ביטוי יתר של קלותו, כמו גם טיפול ב-PDTC, דיכאו את הפעלת מסלול ה-NF-κB, כפי שמעיד ירידה ביחס p-P65/P65 ועלייה ברמות p-IκBα/IκBα. השפעות אלו הוחזרו חלקית לאחר טיפול משותף עם LPS. תוצאות אלו מצביעות על כך שקלוטו מעניק הגנה לבבית מפני פגיעות הנגרמות מ-H/R על ידי ויסות איתות NF-κB, הפחתת דלקת וקידום הישרדות התאים. פרוטוקול זה מספק שיטה ניתנת לשחזור לחקר המנגנונים המולקולריים שמאחורי פגיעת איסכמיה-ריפרפוזיה שריר הלב והפוטנציאל הטיפולי של קלותו בדלקת לבבית.

מבוא

אוטם שריר הלב החריף (AMI) נגרם בעיקר מאיסכמיה ואחריה רפרפוזיה, מה שהוביל למחקר נרחב על מנגנוני ההיפוקסיה/חמצון מחדש בשריר הלב (H/R) 1,2,3. היבט מרכזי בפגיעת H/R שריר הלב הוא אפופטוזיס תאי, התורם משמעותית להתפתחות הפתולוגית של AMI 4,5.

מחקרים עדכניים הצביעו על מסלול האיתות של גורם גרעיני קאפה B (NF-κB) בפגיעת H/R בשריר הלב באמצעות ויסות תגובות דלקתיות לגירויים כמו ליפופוליסכרידים (LPS)6,7,8. הפעלת NF-κB מתרחשת באמצעות שני מנגנונים מובחנים: המסלולים הקנוניים והלא קנוניים9. במסלול הקנוני, ההפעלה מתבססת על פירוק המושרה על ידי פוספורילציה של המעכב של קאפה B אלפא (IκBα)10. עם זאת, דווח גם כי פוספורילציה של תת-היחידה NF-κB p65 יכולה להניע אפופטוזיס, ייתכן ובאופן עצמאי מפירוק IκBα11. קלותו, חלבון טרנסממברנלי חד-מעבר, מווסת את חילוף החומרים של פוספט וסידן ומעכב אותות אינסולין 12,13,14. עדויות מתחדשות מצביעות על כך שקלותו מפעיל השפעות מעכבות על הפעלת NF-κB ברקמות מגוונות, כולל הכליה, ההיפוקמפוס ותאי הזדקנות, ובכך מפחית דלקת ונזק לרקמות 15,16,17. למרות ההתקדמות הזו, תפקידו של קלותו ב-AMI והאינטראקציה הפוטנציאלית שלו עם מסלול NF-κB במהלך פגיעת שריר הלב נותרו ברובם לא נחקרים.

מבחינה מתודולוגית, מודל H/R במבחנה המשתמש בקרדיומיובלסטים של חולדות H9C2 מספק מספר יתרונות על פני מודלים בעלי חיים, כולל מתח חמצן מבוקר, שחזוריות והפחתת שונות. יתרה מזאת, ביטוי יתר קלותו המתווך על ידי לנטיבירל מאפשר ויסות יציב ויעיל של ביטוי הגנים, ומאפשר חקירה ישירה של השפעתו התפקודית. גישות אלו הופכות את הפרוטוקול לפרקטי, חסכוני ונגיש למחקרים מכניים, תוך הימנעות מהאתגרים האתיים והלוגיסטיים של ניסויים בחיים החיים .

מבחינה מעשית, תאי H9C2 נמצאים בשימוש נרחב במחקר קרדיווסקולרי, שכן הם שומרים על תכונות רבות הדמויות קרדיומיוציטים, אף על פי שאינם מחקים במלואם את הפנוטיפ של קרדיומיוציטים בוגרים. מצב H/R שנבחר (היפוקסיה של 5 שעות ואחריה חמצון חוזר של שעה אחת) נמצא בטווח הנפוץ למידול פגיעות איסכמיה-רפרוזיה במבחנה. באופן דומה, העברת לנטיווירוס עם ריבוי זיהום (MOI) סביב 100 היא גישה סטנדרטית להשגת ביטוי יתר יעיל עם ציטוטוקסיות ניתנת לניהול. בעוד תכונות אלו משפרות את היישום של הפרוטוקול, יש להכיר במגבלות כמו חזרה לא מלאה של סביבת ה-in vivo . לכן, המחקר הנוכחי נועד לבחון כיצד קלותו מגן על תאי שריר הלב מפני פגיעות H/R ולקבוע פרוטוקול שניתן לשחזור להערכת האינטראקציה שלו עם איתות NF-κB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים את קו התאים הקרדיומיובלאסטיים של חולדות H9C2 (ATCC, CRL-1446) בוצעו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית. לא היו מעורבים ישירות במחקר זה של בעלי חיים או בני אדם. איור 1 ממחיש את זרימת העבודה הגרפית של צינור העיצוב והניתוח של הניסוי. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים

קו התאים הקרדיומיובלסטי של חולדות H9C2 (ATCC, CRL-1446) הוקפא בחנקן נוזלי באמצעות מדיום הקפאה המורכב מדיום Modified Eagle Medium של דולבקו (DMEM, גלוקוז גבוה, 4.5 גרם לליטר) שהושלם ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). לצורך החזרה, הבקבוקים הקפואים הופשרו במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 2-3 דקות והועברו מיד ל-DMEM מחומם מראש. מדיום התרבית הוכן עם 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 3.7 גרם לליטר נתרן ביקרבונט, ו-1 מילימטר פירובט נתרן. התאים נשמרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לחות עם 5% CO₂. תאי H9C2 בין קטעים 6 ל-20 שימשו לכל הניסויים. מעברים מוקדמים (P20) לא שימשו כדי להימנע מהסטה פנוטיפית הקשורה למעבר.

2. ביטוי יתר לנטיוויראלי של קלותו בתאי H9C2

וקטור לנטיויראלי דור שלישי, המתבטל את עצמו, המקודד את גן העכברוש באורך מלא Klotho (Kl) תחת שליטת פרומוטר EF1α יושם כדי לקבוע ביטוי יתר יציב בתאי H9C2. המבנה כלל מדווח P2A-EGFP לצורך ויזואליזציה, אלמנט רגולטורי פוסט-שעתוק (WPRE) ואלמנטים של מסלול פוליפורין מרכזי (cPPT) ליציבות התמלול, וקסטה עמידה לפורומיצין שמונעת על ידי פרומוטר PGK לבחירה. חלקיקי לנטיויראל נוצרו בתאי HEK293T על ידי קו-טרנספקציה של הפלסמיד ההעברה עם פלסמידי psPAX2 (gag/pol/rev) ו-pMD2.G (VSV-G) ביחס של 4:3:1 באמצעות פוליאתילנאמין (PEI; DNA: PEI = 1:3, עם צבע). סופרנטנטים נאספו ב-48 שעות ו-72 שעות, הובהרו בצנטריפוגציה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות, סיננו דרך ממברנת PES של 0.45 מיקרון, וריכוזו באולטרה-צנטריפוגציה ב-25,000 × גרם למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדורי ויראליים הושעו מחדש ב-PBS המכיל 1% אלבומין סרום בקר (BSA), וטיטרים תפקודיים (TU/mL) נקבעו על ידי זיהום מגביל-דילול של תאים HEK293T עם קריאת EGFP לאחר 72 שעות. תאי H9C2 נזרעו בלוחות בעלי 6 בארות ב-2 ×-10 עד5 תאים בכל באר, מה שהוביל לכ-60% מפגש בזמן ההעברה. חלקיקי לנטיויראליים נוספו בריבוי זיהום (MOI) של 100 ב-1 מ"ל של מדיום תרבית טרי בתוספת פוליברן (8 מיקרוגרם/מ"ל) לשיפור יעילות ההדבקה. החיסון הוסר לאחר 12 שעות והוחלף ב-2 מ"ל של חומר מדיום מלא. ב-72 שעות לאחר ההדבקה, יעילות ההעברה אושרה באמצעות פלואורסצנציה של EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. להקמת קווי תאים יציבים, הוחל פורומיצין (2 מיקרוגרם/מ"ל, טיטרציה מראש) למשך 3-5 ימים החל מ-48 שעות לאחר ההדבקה, עם שינויים במדיום כל 48 שעות. ביטוי יתר של קלותו אושר על ידי RT-qPCR ואימונובלוטינג. כל הליכי הלנטי-וירוס בוצעו תחת בידוד ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), וכל הפסולת הוויראלית הושבתה עם 10% אקונומיקה למשך לפחות 30 דקות לפני ההשלכה.

3. קבוצות ניסוי

תאי H9C2 נזרעו בלוחות של 6 בארות (שטח גדילה 9.6 ס"מ²) ב-3 ×-10⁵ תאים לבאר, מה שהניב כ-70%-80% מפגש לאחר 24 שעות, הצפיפות הנדרשת לעיבוד היפוקסיה/חמצון מחדש (H/R) ולבדיקות שלאחר מכן. לאחר הצמדות לילה, התאים חולקו לשש קבוצות ניסוי: (1) קבוצת הביקורת, שלא קיבלה טיפול נוסף; (2) קבוצת H/R, שעברה היפוקסיה/חמצון מחדש (H/R) בתא היפוקסיה מודולרי אטום, ואחריה חשיפה ל-5 שעות של היפוקסיה (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) ושעה אחת של רפרוזיה (5% CO₂), כפי שתוארקודם 18; (3) קבוצת ביקורת שלילית (NC), שבה תאים עברו טרנספקט עם וקטור ריק 24 שעות לפני טיפול H/R; (4) קבוצת קלותו, שבה תאים הועברו לווקטורים לנטיויראליים המקודדים את קלותו 24 שעות לפני טיפול H/R; (5) קבוצת הטיפול בפירולידין דיתיוקרבאמט (PDTC), שטופלה ב-200 מ"ג/ל מעכב מסלול NF-κB PDTC למשך 24 שעות לפני טיפול H/R19; (6) קבוצת Klotho + LPS, שבה תאים עברו טרנספקציה עם וקטורים לנטי-ויראליים המקודדים את Klotho ולאחר מכן טופלו בליפופוליסכריד ב-1 מ"ג/ליטר במשך 24 שעות לפני טיפול H/R20.

4. qRT-PCR

תאי H9C2 נזרעו בלוחות של 6 בארות בצפיפות של 1 × 10⁶ תאים לכל באר. לאחר הטיפול, כל ה-RNA בודד באמצעות פרוטוקול הפקת פנול-כלורופורם. בקצרה, נוספו 1 מ"ל של תגובת לבאר, ולאחר מכן בוצעה חילוץ כלורופורם, השקעת איזופרופנול ושטיפה עם 75% אתנול. כדור ה-RNA יובש באוויר ונמס במים ללא RNase. ריכוז וטוהר ה-RNA נקבעו ספקטרופוטומטרית. לצורך סינתזת cDNA, 1 מיקרוגרם של RNA כולל עבר תעתיק הפוך באמצעות ערכת שעתוק הפוך מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן, כולל הסרת DNA גנומי והכנה אקראית של הקסמר. PCR כמותי בזמן אמת בוצע במערכת PCR בזמן אמת עם כימיה של SYBR Green בתנאים הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. רצפי פריימר עוצבו באמצעות Primer-BLAST (NCBI) וסונתזו על ידי ספק מסחרי: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACTTATTTATAT-3′; (2) β-אקטין (בקרה פנימית): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAAA-3′. רמות הביטוי היחסיות חושבו באמצעות שיטת 2^-ΔΔCT, וספציפיות ההגברה אושרה על ידי שיא עקומת התכה יחידה.

5. כתם מערבי

חלבונים הופקו מתאי H9C2 באמצעות מבחן רדיואימונופרציפיטציה (RIPA) (200 מיקרו-ליטר לבאר של צלחת 6 בארות) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז על קרח. ריכוזי החלבון נמדדו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA), וכמויות שוות של חלבון (20-30 מיקרוגרם) נטענו לכל נתיב על ג'ל SDS-PAGE של 10% להפרדה אלקטרופורטית. החלבונים הועברו לממברנות פוליווינילידין דיפלואוריד (PVDF) באמצעות מערכת העברה רטובה ב-100 וולט למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הממברנות נחסמו בחלב דל שומן 5% שהוכן ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד קלותו (1:500), פוספו-p65 (1:500), p65 (1:500), פוספו-IκBα (1:500), IκBα (1:500) ו-β-אקטין (1:1000). לאחר שלוש שטיפות עם TBST, הממברנות נדגרו עם נוגדנים משניים מצומדים עם פרוקסידאז חזרת (HRP) (1:1000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות מערכת זיהוי כימילומינסנציה משופרת, ועוצמות האות נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ תוך שימוש בהגדרות סף זהות.

6. בדיקת MTT

תאי H9C2 הוזרעו ללוחות של 96 בארות בצפיפות של 2 × 10³ תאים לבאר ב-100 מיקרוליטר של מדיום מלא ודגרו במהלך הלילה כדי לאפשר היצמדות. נפח של 10 מיקרוליטר של תמיסת MTT (5 מ"ג/מ"ל ב-PBS) נוסף לכל באר ודגרה במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים לחים עם 5% CO₂. לאחר הדגירה, הסופרנטנט הוסר בזהירות, והוספו 100 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להמסה של גבישי הפורמזן, ולאחר מכן דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בניעור עדין. הספיגה נמדדה לאחר מכן ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. התוצאה הוויזואלית הצפויה הייתה הופעת גבישי פורמזן סגולים בתאים ברי קיימא לפני הוספת DMSO, ותמיסה סגולה הומוגנית לאחר ההתמוססות.

7. ציטומטריית זרימה

התאים נקטפו 24 שעות לאחר הטיפול באמצעות טריפסיניזציה ונאספו בצנטריפוגציה ב-1,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדור התא הושעה מחדש ב-100 מיקרוליטר של בופר קשירה 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4). אנקסין V-APC ויודיד פרופידיום (PI) עורבבו ביחס של 1:2 להכנת תמיסת צביעה של 15 מיקרוליטר, שנוספה לתליית התא. התערובת דגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, נוספו 400 מיקרוליטר מאותו בופר קישור, והדגימות נותחו מיד באמצעות ציטומטר זרימה. בסך הכל נאספו 10,000 אירועים לכל מדגם. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo. התאים הוגדרו תחילה על בסיס פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (SSC) כדי להוציא פסולת, ולאחר מכן עברו גייטינג רבעי בין Annexin V ל-PI להבחנה בין תאים חיים (Annexin V-/PI-), תאים אפופטוטיים מוקדמים (Annexin V+/PI-), ותאי אפופטוטיים מאוחרים/נקרוטיים (Annexin V+/PI+). צביעת V-חיובי/PI שלילית באנקסין הצביעה על אפופטוזיס מוקדם, בעוד שצביעת כפולה חיובית ב-Annexin V/PI הצביעה על אפופטוזיס מאוחר או נמק.

8. אימונופלואורסצנציה

תאי H9C2 זרעו על משטחי זכוכית סטריליים בלוחות עם 6 בארות בצפיפות של 1 × 10⁵ תאים לבאר ונחשפו לטיפולים. התאים תוקעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, חודרו ב-0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, וחסמו עם 5% אלבומין סרום בקר (BSA) ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. קוברסליפים נבנו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) ו-IL-6 (1:100). לאחר שלוש שטיפות ב-PBS, תאים דוגרו בנוגדנים משניים מסומנים בפיקואריתרין (PE) (1:500) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הגרעינים צובעו ב-DAPI במשך 5 דקות. כיסויי כיסוי הותקנו על שקופיות זכוכית עם מדיום הרכבה נגד דעיכה, ואותות פלואורסצנציה הוצגו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. התמונות נותחו באמצעות ImageJ (גרסה 1.54). פלואורסצנציה אדומה סימנה ביטוי ציטוקינים, בעוד שהפלואורסצנציה הכחולה סימנה את הגרעינים.

9. ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים נותחו באמצעות תוכנת SPSS. התוצאות מבוטאות כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) לפחות משלושה ניסויים עצמאיים. בהשוואות קבוצתיות מרובות, הוחל ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. ערך P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביטוי יתר של קלותו משפר את הישרדות התאים ומפחית פגיעות דלקתיות המתווכות על ידי NF-κB

כדי לאשר את יעילות העברת הגנים, ביטוי הקלוטו נמדד הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון. תאים בעלי ביטוי יתר של קלותו הראו עלייה משמעותית בהשוואה לשתי קבוצות הביקורת השלילית (p < 0.05); איור 2A,B). פונקציונלית, ביטוי יתר של קלותו שיפר משמעותית את חיוניות התאים לאחר פגיעת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה נחקר התפקיד המגן של קלותו בקרדיומיוציטים שנחשפו להיפוקסיה/פגיעת חמצון מחדש (H/R), ונמצא כי ביטוי יתר של קלותו משפר משמעותית את חיוניות התאים, מפחית אפופטוזיס ומדכא ביטוי ציטוקינים פרו-דלקתיים. השפעות אלו לוו בפוחתת פוספורילציה של p65 ופוספורילציה מוגברת של IκBα, מה שמרמז כי עיכוב איתות NF-κB תורם לפנוטיפ המגן. עיכוב פרמקולוגי של NF-κB על ידי PDTC יצר השפעות דומות לאלו של ביטוי יתר של קלותו, בעוד שגירוי עם LPS הפך חלקית את יתרונות קלותו, ותמך בקשר מכני בין קלותו למודולציה של NF-κ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% פאראפורמלדהידביושארפXG1050
תמיסת צביעת ANNEXIN V APC/PIElabscienceE-CK-A217
ערכת סינתזת cDNAקיאגן205410
פתרון DAPIBioFroxx1155MG010
דולבקו' s Modified Eagle Medium (DMEM)הייקלוןSH30243.01B
ערכת ריאגנט לזיהוי ECLמיילונביוMA0186-1
ספק כוח אלקטרופורזה (POWER PAC 200)ביו-ראדPOWER PAC 200
סרום בקר עוברי (FBS)VivaCellC04001-500, C04002-500
ציטומטר זרימה (Gallios)בקמן קולטרגליוס
מיקרוסקופ פלואורסצנציה (BK6000)צ'ונגצ'ינג אופטקBK6000
פורמזאן ממססולרביולוגיהM1020
נוגדן IgG אנטי-ארנב של עז מצורף HRPבתילA120-101P
LPS (NF-& kappa; B Pathway Agonist)סיגמא-אלדריץ'L2630
קורא מיקרופלט (דגם K3)תרמוK3
תא אינקובטור מודולרי (תא היפוקסיה)בילופס-רותנברגMIC-101
פתרון MTTקיימן21795
PDTC (NF-& kappa; מעכב מסלולי Bסיגמא-אלדריץ'P8765
נוגדן IgG אנטי-ארנב של עז מצומדת PEביולוגיהbs-0295G-PE
פוליברן (Hexadimethrine Bromide)InvitrogenX2351
ממברנת PVDFמרקISEQ00010
Rabbit Anti-Rat IL-1β נוגדןביאורביטorb378927
נוגדן IL-6 נגד עכברוש ארנבביוגרפיה של זן384702
Rabbit Anti-Rat Iκ Bα נוגדןביאורביטorb223182
נוגדן קלותו נגד ארנבביאורביטorb333711
נוגדן Rabbit Anti-Rat p65ביאורביטorb229138
Rabbit Anti-Rat Phospho-Iκ Bα נוגדןביאורביטorb223035
Rabbit Anti-Rat Phospho-NF-κ נוגדן B p65ביאורביטorb304662
ארנב אנטי-ראט TNF-α נוגדןביאורביטorb106548
נוגדן אנטי-עכברוש ובטא-אקטין לארנבחואביוET1702
מערכת PCR כמותית בזמן אמת (LightCycler 96)רושLight Cycler96
RIPA Lysis BufferמרדהMO52447
ערכת הכנת ג'ל SDS-PAGEElabscienceE-IR-R305
ערכת ריאגנט טריזולטכנולוגיות חיים15596-018

מקורות

  1. SupplemenDong, G., et al. Rg1 prevents myocardial hypoxia/reoxygenation injury by regulating mitochondrial dynamics imbalance via modulation of glutamate dehydrogenase and mitofusin 2. Mitochondrion. 26, 7-18 (2016).
  2. Liu, J., et al. Rhein protects the myocardiac cells against hypoxia/reoxygenation-induced injury by suppressing GSK3β activity. Phytomedicine. 51, 1-6 (2018).
  3. Yang, H., Wang, C., Zhang, L., Lv, J., Ni, H. Rutin alleviates hypoxia/reoxygenation-induced injury in myocardial cells by up-regulating SIRT1 expression. Chem Biol Interact. 297, 44-49 (2019).
  4. Liang, W., Guo, J., Li, J., Bai, C., Dong, Y. Downregulation of miR-122 attenuates hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced myocardial cell apoptosis by upregulating GATA-4. Biochem Biophys Res Commun. 478 (3), 1416-1422 (2016).
  5. Zhang, R. -Y., Qiao, Z. -Y., Liu, H. -J., Ma, J. -W. Sonic hedgehog signaling regulates hypoxia/reoxygenation-induced H9C2 myocardial cell apoptosis. Exp Ther Med. 16 (5), 4193-4200 (2018).
  6. Chen, H., Zhang, R. -Q., Wei, X. -G., Ren, X. -M., Gao, X. -Q. Mechanism of TLR-4/NF-κB pathway in myocardial ischemia reperfusion injury of mouse. Asian Pac J Trop Med. 9 (5), 503-507 (2016).
  7. Wang, R., et al. Leonurine alleviates LPS-induced myocarditis through suppressing the NF-κB signaling pathway. Toxicology. 422, 1-13 (2019).
  8. Luo, M., et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. J Cell Biochem. 121 (4), 2994-3004 (2020).
  9. Yoon, S., et al. NF-κB and STAT3 cooperatively induce IL6 in starved cancer cells. Oncogene. 31 (29), 3467-3481 (2012).
  10. Yu, H., Lin, L., Zhang, Z., Zhang, H., Hu, H. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: mechanism and clinical study. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 209(2020).
  11. Bu, Y., et al. Targeting NF-κB RelA/p65 phosphorylation overcomes RITA resistance. Cancer Lett. 383 (2), 261-271 (2016).
  12. Xu, Y., Sun, Z. Molecular basis of Klotho: from gene to function in aging. Endocr Rev. 36 (2), 174-193 (2015).
  13. Urakawa, I., et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature. 444 (7120), 770-774 (2006).
  14. Degaspari, S., et al. Altered KLOTHO and NF-κB-TNF-α signaling are correlated with nephrectomy-induced cognitive impairment in rats. PLoS One. 10 (5), e0125271(2015).
  15. Teocchi, M. A., Ferreira, A. ÉD., de Oliveira, E. P. L., Tedeschi, H., D'Souza-Li, L. Hippocampal gene expression dysregulation of Klotho, nuclear factor kappa B and tumor necrosis factor in temporal lobe epilepsy patients. J Neuroinflammation. 10 (1), 53(2013).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Feng, X., Luo, Q., Wang, H., Zhang, H., Chen, F. MicroRNA-22 suppresses cell proliferation, migration and invasion in oral squamous cell carcinoma by targeting NLRP3. J Cell Physiol. 233 (9), 6705-6713 (2018).
  18. Benoist, L., et al. Stimulation of P2Y11 receptor protects human cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and involves PKCε signaling pathway. Sci Rep. 9 (1), 11613(2019).
  19. Zhang, J. -J., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits nuclear factor-κB pathway activation, and regulates adhesion, migration, invasion and apoptosis of endometriotic stromal cells. Mol Hum Reprod. 17 (3), 175-181 (2011).
  20. Zeng, Y., et al. Klotho inhibits the activation of NLRP3 inflammasome to alleviate lipopolysaccharide-induced inflammatory injury in A549 cells and restore mitochondrial function through SIRT1/Nrf2 signaling pathway. J Physiol Investig. 66 (5), 335-344 (2023).
  21. Jin, M., et al. Klotho ameliorates cyclosporine A-induced nephropathy via PDLIM2/NF-κB p65 signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun. 486 (2), 451-457 (2017).
  22. Wu, C., et al. The function of miR-199a-5p/Klotho regulating TLR4/NF-κB p65/NGAL pathways in rat mesangial cells cultured with high glucose and the mechanism. Mol Cell Endocrinol. 417, 84-93 (2015).
  23. Kwon, H. -J., et al. Stepwise phosphorylation of p65 promotes NF-κB activation and NK cell responses during target cell recognition. Nat Commun. 7 (1), 11686(2016).
  24. Shi, H., Berger, E. A. Characterization of site-specific phosphorylation of NF-κB p65 in retinal cells in response to high glucose and cytokine polarization. Mediators Inflamm. 2018, 3020675(2018).
  25. Chen, G., et al. α-Klotho is a non-enzymatic molecular scaffold for FGF23 hormone signalling. Nature. 553 (7689), 461-466 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביטוי יתר של Klothoסיגנל NF-KappaBתאי H9C2Western Blotציטומטריה של זרימהחיוניות תאיםציטוקינים פרו-דלקתייםאיסכמיה של השריר הלבבי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.