בדיקת פירוק ביולוגי אירובי של חומרים באמצעות חיסון מי ים טבעי ומד נשימה בלולאה סגורה

סיכום

הפרוטוקול מתאר נוהל הפעלה סטנדרטי לבדיקת חומרים מתכלים הן סינתטיים והן טבעיים בתנאים אירוביים באמצעות חיסון מי ים טבעי ומערכת רספירומטריה אוטומטית בלולאה סגורה.

תקציר

הערכה נכונה של חומרים מתכלים תלויה באימוץ רחב של שיטות בדיקה סטנדרטיות. למרות ששיטות כאלה קיימות, יכולת הבדיקה נותרה מוגבלת, מוגבלת על ידי העלות וזמן ההתחלה להקמת מעבדות חדשות. פרוטוקול סינון שונה זה מבוסס על ASTM International D6691-24a, שיטת בדיקה סטנדרטית לקביעת פירוק ביולוגי אירובי של חומרים פלסטיים בסביבה הימית על ידי קונסורציום מיקרוביאלי מוגדר או חיסון מי ים טבעיים. הוא מעריך את הפירוק הביולוגי של חומרים בסביבה ימית, משווה תוצאות לבקרות חיוביות ושליליות, ומשתמש בחיסון טבעי של מי ים בתוספת אמוניום ופוספט כדי למנוע הגבלה של חומרים מזינים. החומרים נחשפים למי ים מועשרים בחומרים מזינים אלה ומודגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. מד נשימה מיקרו-אוקסימקס מודד את ייצור הביוגז (פחמן דו חמצני, CO₂) לאורך זמן. מידת המינרליזציה (פירוק ביולוגי) נקבעת על ידי חישוב שיעור הפחמן שמקורו בחומר המומר לביוגז-פחמן. אחוז ייצור_ה-CO2 , המבוטא כשבריר מתכולת הפחמן הנמדדת או התיאורטית, מדווח כפונקציה של זמן. מערכת הרספיריומטריה בלולאה סגורה מכילה מגוון כלי כור, שהוכנו בשלושה עותקים לכל חומר, בקרה שלילית (חיסון מי ים בלבד) ובקרה חיובית (תאית כרומטוגרפיה בשכבה דקה). שיטה זו חשובה להערכת חומרים בסביבה הימית ומטפלת במניעת זיהום עולמי.

מבוא

פסולת פלסטיק מהווה איום על המערכות האקולוגיות הימיות ועל בריאות האדם¹. החשש הגובר מזיהום פלסטיק, יחד עם פסולת ימית מכל חומר באוקיינוס, מדגיש את הצורך בפתרונות ברי קיימא, כגון ניהול פסולת משופר בסוף החיים וחומרים מתכלים המתכלים בקלות בסביבה הימית. בניגוד לפלסטיק סינתטי מסורתי, שנמשך עשרות עד מאות שנים ומייצר מיקרופלסטיק המצטבר בשרשרת המזון ^2,3,4, חומרים מתכלים, רכיבים אורגניים של פחמן, עשויים לעבור חילוף חומרים ל-CO₂ ומתאן (CH₄), או להיטמע בביומסה מיקרוביאלית⁵. לכן הבנת פירוק ביולוגי של חומרים במי ים היא המפתח לכימות והפחתת ההשפעות הסביבתיות של פסולת ימית.

פירוק ביולוגי בסביבה הימית נשלט על ידי אינטראקציה של משתנים מרחביים-זמניים, כולל זמינות אור וחומרים מזינים, לחץ, טמפרטורה, הרכב מינים מיקרוביאליים ואופי ומבנה פיזיקוכימי של הפולימר, שכולם קובעים את הקצב, הדרגה ומנגנון הפירוק⁶. משתנים אלה מהווים אתגר משמעותי למחקרי פירוק ביולוגי מבוססי מעבדה המדמים סביבות ימיות. נוהל הפעלה סטנדרטי זה (SOP) משתמש במי ים טבעיים כחיסון, לוכד את הקהילה המיקרוביאלית הקיימת באתר, ומתעד משתנים רלוונטיים כולל חומרים מזינים מומסים במי ים, חלקיקי פחמן וחנקן, כלורופיל, מליחות, pH וטמפרטורה. גישה מבוקרת מבוססת מעבדה זו מייעלת את התנאים לקידום מינרליזציה ומאפשרת מדידות פירוק ביולוגיות ישירות שאינן אפשריות באתרן. ASTM International D6691-24a, שיטת בדיקה סטנדרטית לקביעת פירוק ביולוגי אירובי של חומרים פלסטיים בסביבה הימית על ידי קונסורציום מיקרוביאלי מוגדר או חיסון מי ים טבעיים (להלן ASTM D6691), ו-SOP זה פותחו ככלי סינון מהיר ואמין להערכת ההתכלות הביולוגית של חומרים 7,8,9,10.

מיושר עם ASTM D6691, בדיקת סינון להתכלות ביולוגית טבועה בפולימר, פרוטוקול זה מעריך פירוק ביולוגי של חומרים בתנאים אופטימליים, 30 מעלות צלזיוס, שטח פנים מרבי מהדגימה הטחונה ועודף חומרים מזינים אנאורגניים (חנקן, 130 מ"ג/ליטר; זרחן, 23 מ"ג/ליטר)⁹, כדי לקדם מינרליזציה ולמנוע מגבלות תזונתיות. בעוד שבדיקות סקר מציעות תובנות ראשוניות חשובות, בדיקות נוספות, כגון עגינות בחוף ובעומק הים, המודדות ירידה במשקל כפונקציה של זמן, עשויות להיות נחוצות להערכה מקיפה בתנאים ימיים טבעיים. מכיוון שבדיקות עגינה אלה בחוף ובעומק הים מעריכות פירוק ביולוגי על סמך ירידה במשקל כפונקציה של זמן^10,11, על החוקרים לבצע תחילה בדיקת סקר זו, המודדת ישירות את חילוף החומרים המיקרוביאלי, לפני שהם הולכים לניסוי עגינה בחוף ובעומק הים, שגם הוא יקר יותר.

שיטת הבדיקה הסטנדרטית ASTM D6691 מתארת נהלים להערכת הפירוק הביולוגי האירובי של חומרים פלסטיים שאינם צפים בסביבות ימיות. תקן זה, יחד עם תקני מפרט, כגון ASTM D7081 (מפרט סטנדרטי לפלסטיק מתכלה שאינו צף בסביבה הימית; התמקדות ביכולת מתכלה במדיום מימי, שהוסר כעת מ-ASTM ועובר הצבעה מחדש), מספק מסגרת לאישור פולימרים ניסיוניים כמתכלים ימיים ^9,12. באופן כללי, מפרט הוא תקן קונצנזוס מבית ASTM International הקובע דרישות שחומר, מוצר או מערכת חייבים לעמוד בהן. זה מבטיח שחומרים המיועדים להתפרק ביולוגית בסביבות ימיות יעשו זאת במסגרות זמן מקובלות ולא ישחררו תוספים שעלולים להיות רעילים, כגון צבעים או חומרי פלסטיק.

בהתבסס על ASTM D6691, פרוטוקול זה מכמת את קצב ומידת הפירוק הביולוגי האירובי של חומרים (מצע ניסיוני) במי ים טבעיים ומרחיב את בקרות החומרים החיוביים (כלומר, תאית, נייר קראפט, כיטין/צ'יטוזן), שהוכחו היסטורית כמתכלים בסביבה הימית ^7,9,10. המטרה של שיטה זו היא לסנן חומרים בתנאים אופטימליים כדי לראות אם החומרים מתכלים בסביבה הימית. החיסון ממנף את הקהילה המיקרוביאלית הטבעית הקיימת במי הים, שנאספה בהתאם להנחיות ספציפיות המתוארות ב-ASTM. הנחיות אלה מדגישות שימוש במי ים עם מליחות של כ-32, שנאספו ממקום נקי ממזהמים כמו ביוב, השלכת כימיקלים או דליפות נפט. הבדיקה משתמשת במד נשימה אוטומטי בלולאה סגורה עם כלי כור של 250 מ"ל המתוחזקים ב-30 מעלות צלזיוס, כל אחד מהם מכיל 75 מ"ל מי ים ו~20 מ"ג של מצע הניסוי או הבקרה⁸. מינרליזציה (פירוק ביולוגי) מתבטאת כאחוז ביוגז הפחמן נטו (CO_2-C) המיוצר ביחס למסת הפחמן הראשונית שנוספה. שיטה זו אינה מביאה בחשבון הטמעת פחמן בביומסה מיקרוביאלית.

פרוטוקול

1. איסוף ואפיון מי ים

1. זהה אתר איסוף מי ים שאינו מושפע משפכים, כימיקלים, כתמי שמן או השפעת מים מתוקים חזקה.
2. באתר האיסוף, רשום מקור (מיקום, קו רוחב ואורך, עומק איסוף, עומק כולל וטמפרטורה), תאריך איסוף הדגימה ותנאי המים שנצפו.
3. אסוף ושלב דגימות מי ים מעומקים מרובים, מיקומי אתרים ואירועי דגימה כדי לקדם הרכב קהילתי מיקרוביאלי מגוון.
4. בקרבוי שטוף חומצה בנפח 20 ליטר, אספו 10 עד 20 ליטר מי ים באמצעות בקבוק ניסקין גדול, והעבירו בחזרה למעבדה.
5. מהקרבוי, העבירו 1 ליטר של תת-דגימת מי ים שלמים לבקבוק פוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE) ענבר 1 ליטר לניתוח מעבדה של חלקיקי פחמן וחנקן לתנאי מי ים ראשוניים. מהדגימה של 1 ליטר, סנן (0.2 מיקרומטר; אצטט תאית חנקן נמוך) ואסוף תת-דגימה של 60 מ"ל בבקבוק פוליאתילן שטוף חומצה לניתוח מרכיבי חנקן אנאורגני ואורגני (N) וזרחן (P) מומסים.
6. תווית תת-דוגמאות עם שם הפרויקט, מזהה לדוגמה ותאריך. מדוד את ריכוזי NH₄⁺ בשיטת האינדופנול (4500-NH3)^13,14 ורמות PO₄^3- בשיטת התמיסה היחידה (4500-P E)^13,15. כימות חנקן חלקיקי ופחמן בשיטת ניתוח היסודות¹⁶. מדוד את ריכוזי הכלורופיל A בהתאם לפרוטוקולים המתוארים על ידי Parsons et ^al.17 (10150 A, 10150 C)¹³.
   הערה: ניתוחי איכות מים הקשורים לחומרים מזינים הם אופציונליים. פרוטוקול זה מניח שהניתוחים מבוצעים על ידי מעבדה חיצונית.
7. יש לכסות באופן רופף את פתח הקרבוי כדי לשמור על תנאים אירוביים ולאחסן מי ים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בחושך למשך עד 7 ימים.
   הערה: ניתן לאוורר מי ים גם באמצעות משאבת אוויר ומערכת בועות.

2. הכנת מצע ניסוי

1. הוסף 10-15 גרם של מצע ניסיוני (כלומר, פוליסכרידים טבעיים, עץ, סיבית, פולימרים) שעשויים להיות בצורת כדורים, שברים וחתיכות מעוצבות לצנצנת כרסום נירוסטה של 50 מ"ל עם כדור פלדה 20 מ"מ. טחנו את מצע הניסוי לגודל חלקיקים אחיד (0.10-0.25 מ"מ) לפני תחילת הבדיקה.
2. טבלו את צנצנת הטחינה בחנקן נוזלי וערבבו למשך 15 דקות עד שהחנקן הנוזלי מפסיק לרתוח.
   זהירות: חנקן נוזלי הוא נוזל קריוגני שעלול לגרום לכוויות, פציעה או כוויות קור. קרא ופעל לפי כל גיליונות נתוני הבטיחות לפני השימוש. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
3. אבטח את צנצנת הטחינה בחיבור טחנת הכדור והגדר את פרמטרי המכשיר ל-30 הרץ ו-2:30 דקות, ולחץ על התחל. חזור על הפעולה 4x עם קירור של 30 שניות בחנקן נוזלי בין הניסויים. אם החומר הוא פולימר עם טמפרטורת מעבר זכוכית נמוכה, בצע מחזורי כרסום נוספים לפי הצורך כדי לייצר התפלגות אחידה של גודל החלקיקים.
4. ודא את אחידות הגודל ואפיין את התפלגות גודל החלקיקים על ידי ניתוח מסננת כמתואר ב- ASTM D1921-96¹⁸. הרכיבו מסננות סטנדרטיות המשתרעות על טווח גודל החלקיקים הצפוי, עם גודל הרשת הקטן ביותר בתחתית. מניחים את הדגימה הטחונה על המסננת העליונה ומאבטחים את ערימת המסננת בשייקר מכני. מערבבים עד שחלקיקים עוברים דרך הרשת. אסוף ושקול את החומר שנשמר מכל מסננת כדי לחשב את התפלגות גודל החלקיקים. השתמש באותו סט מסננות על פני טיפולים כדי לשמור על השוואה. רשום את ההתפלגות בגיליון הנתונים.
5. קבע את תכולת הפחמן לכל תת-דגימה משקל יבש של המצע הניסיוני הטחון על ידי ניתוח יסודות¹⁶.
   הערה: פרוטוקול זה מניח שניתוח יסודות מבוצע על ידי מעבדה חיצונית.

3. הכנת החומרים המזינים הנוספים למי ים

1. מלאו בקבוק נפחי של 2 ליטר או 4 ליטר באמצע הדרך במי ים. הנפח הכולל הדרוש תלוי במספר כלי הכור שישמשו בניסוי. כל כלי כור יכיל 75 מ"ל מי ים. אם מקור מי הים מכיל ריכוזים גבוהים של חומר אורגני חלקיקי, מסננים את מי הים דרך רשת של 20 מיקרומטר כדי למנוע זיהום הטרוגני על ידי חלקיקים גדולים.
2. באמצעות איזון מדויק עם רגישות ל-0.001 גרם, יש להטיל מחבת שקילה ולשקול 0.5 גרם/ליטר אמוניום כלוריד (NH₄Cl) ולאחר מכן 0.1 גרם/ליטר אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH₂PO₄) על בסיס 2 ליטר או 4 ליטר מי ים.
   זהירות: אמוניום כלוריד עלול לגרום לנזק או גירוי בעיניים. קרא ופעל לפי כל גיליונות נתוני הבטיחות לפני השימוש ולבש ציוד מגן אישי מתאים.
   הערה: השלך פסולת מונו-בסיסית של אמוניום כלוריד ואשלגן פוספט במיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים בהתאם לנהלים המוסדיים ולתקנות המקומיות. כמויות קטנות של תמיסות מדוללות (<1%) NH₄Cl ו-KH₂PO₄ עשויות להיות זכאיות לסילוק ניקוז לאחר דילול במים בשפע, אם מותר על ידי המוסד ורשות השפכים המקומית.
3. הוסיפו את החומרים המזינים האנאורגניים לבקבוק נפחי של 2 ליטר או 4 ליטר, הביאו לנפח עם מי ים, הוסיפו מוט ערבוב וערבבו על צלחת ערבוב עד שכל המלחים נמסים. הפתרון צריך להיות ברור ללא חלקיקים נראים לעין.
4. תת-דגימה של 20-30 מ"ל של מי הים בתוספת חומרים מזינים למדידת pH ומליחות. סנן 60 מ"ל נוספים דרך מסנן אצטט תאית דל חנקן דל חנקן של 0.2 מיקרומטר לתוך בקבוק פוליאתילן שטוף חומצה לניתוח חנקן וזרחן אנאורגניים מומסים בהתאם לשיטות הסטנדרטיות בשלב 1.5.
5. מדוד את ה-pH והמליחות על גבי מד ספסל בהתאם להוראות היצרן. צפויה ירידה של כיחידה אחת במי ים בעוצמה מלאה עקב החומציות של תוסף התזונה.

4. הכנה לדגירה של כלי כור

1. שטפו חומצה את כל כלי הזכוכית, כולל כלי כור של 250 מ"ל לדגימות ופיפטה נפחית של 75 מ"ל בחומצה הידרוכלורית 10% (HCl) למשך 24 שעות ושטפו פי 3 במים נטולי יונים.
   זהירות: HCl עלול לגרום לכוויות חמורות ולנזק לעיניים. קרא ופעל לפי כל גיליונות נתוני הבטיחות לפני השימוש. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
   הערה: ניתן לנטרל 10% פסולת HCl עם נתרן ביקרבונט ליצירת תמיסה ניטרלית לפני השלכתה. לבצע נטרול בהתאם לנהלי פסולת מסוכנת מוסדית ולתקנות המקומיות החלות.
2. חיטוי כלי הכור הריקים בנפח 250 מ"ל, מכסים עם יציאות, טבעות O אטומות סיליקון ומכסי ברגים בחיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני יום הניסוי.
3. סמן בקבוקונים לדוגמה עם מספר הערוץ/מזהה המתאים לכלי שיט המקבלים דגימה או חומרי בקרה.
4. באמצעות האיזון האנליטי, יש להניח בקבוקון (עם מכסה) ולשקול 20 מ"ג (± 0.1 מ"ג) של הניסוי או הביקורת, ולרשום את משקל הקריאה המלא, ולהניח בצד. חזור על כל שכפולי הניסוי והבקרה.
   הערה: ודא שהמשקולות מדויקות. מומלץ לשקול את כל המצעים באותו יום ועל ידי אותו אדם.
5. הפעילו את החממה יום לפני הוספת הכלים והגדירו את הטמפרטורה ל-30 מעלות צלזיוס. הפעל את מד הנשימה לפחות שעתיים לפני הפעלת אבחון המערכת וכיול החיישן בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: הכנת כלי הכור יכולה להמשיך ברגע שטמפרטורת החממה מגיעה ושומרת על 30 ± 2 מעלות צלזיוס.
6. הכן את גיליון הנתונים על ידי רישום מזהים/שכפולים לדוגמה ומספר הערוץ המתאים. ארגן את כלי הכור ומכלולי הכובע (מכסה עם יציאות/טבעת O) לפי סדר מספר הערוץ/מזהה (ודא שכל כלי מסומן בבירור). בדוק את טבעות ה-O והמכסים/יציאות כדי לוודא שהם נקיים, יבשים ושלמים.

5. הקמת כלי הכור

1. השתמש בבקר פיפט נפחי של 75 מ"ל ובקר פיפט ממונע כדי להזרים 75 מ"ל של מי ים בתוספת חומרים מזינים לכל כלי כור.
2. הסר פיפטה חד פעמית אחת של מי ים (~3 מ"ל) מכל כלי והנח אותה על משטח נקי לידו. מי ים אלה ישמשו לשטיפת מצעי הניסוי והבקרה הטחונים מהבקבוקון הזפת (איור 1).
3. העבירו את המצעים לכלים מתאימים.
4. הנח טבעת O על שפת כלי הכור, ולאחר מכן הנח מכסה בעל שתי יציאות ישירות על גבי טבעת ה-O. אבטח את טבעת ה-O והמכסה במקומם בעזרת מכסה בורג.
5. התאם את כלי הכור לקווי הגז/עיבוי המתאימים לו. הכנס היטב את קווי הגז ליציאות הכניסה/יציאה המתאימות במכסה הכלי.
6. הפעל את פלטפורמת השייקר ל-0.05 x g (מצב רציף). ערכו בדיקה ויזואלית כדי לוודא שכל הכלים מאובטחים, ולאחר מכן סגרו את דלת החממה.
7. רשום את טמפרטורת החממה (קריאה ובדיקת תרמיסטור) ואת הלחץ האטמוספרי באמצעות ברומטר.

איור 1: התקנה והכנה של כלי שיט. (A) הוספת מי ים, (B) הוספת הדגימה, ו- (C) הוספת טבעת ה-O, מכסה המתכת ומכסה הבורג. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. הפעלת מערכת הרספיריומטריה

1. הפעל את התוכנה במחשב המחובר. ודא שהמערכת מזהה את החומרה דרך חיבור RS-232. אם החומרה לא נמצאה, הודעה תציין שהמכשיר אינו מחובר, ויש להפעיל מחדש את התוכנית.
2. בתפריט הראשי של התוכנה, בחר כלים > אבחון > פעולות בסיסיות. לחץ על שמור קובץ יומן רישום. לחץ על שסתומים וחיישנים. התוכנה תציין PASS או FAIL עבור כל מבחן. המשך לכיול דו-נקודתי של חיישן CO₂ רק אם שתי הבדיקות עוברות.

7. כיול חיישן CO₂

1. חבר עמוד סודה ליים ליציאת החנקן בפאנל האחורי של משאבת הדגימה כדי להסיר את ה-CO₂ הסביבתי לאפס כיול. ודא שהסודה ליים נראית לבנה גירית ולא דהויה (למשל, ורוד או סגול).
2. בחר כלים > כיול. לחץ על התחל כיול בפינה השמאלית התחתונה. כאשר תתבקש, כוונן את זרימת הדגימה ל-0.5 ליטר/דקה באמצעות הלוח הקדמי ampבקרת משאבה. לחץ על OK.
3. כאשר הטיימר מגיע לאפס, לחץ על לחצני ההיסט למעלה ולמטה בחיישן CO₂ כדי לכוונן את הקריאה על המסך ל-0.000 (או קרוב ככל האפשר). הערכים יהפכו לירוקים כאשר הם נמצאים בטווח המקובל. לחץ על הגז הבא.
4. כאשר תתבקש, חבר את בלון גז הכיול ליציאת הכיול בלוח האחורי של משאבת הדגימה. כוונן את לחץ יציאת גז הכיול ל-5 PSIG. ודא שעודפי גז זורמים דרך אביזר ה-T לפיו המשתמש יכול לשמוע ולהרגיש את הגז ליד המתקן, לפני לחיצה על אישור.
5. כאשר הטיימר מגיע לאפס, לחץ על לחצני הטווח למעלה ולמטה בחיישן CO₂ כדי לכוונן את הקריאה על המסך ל-2.700 (או קרוב ככל האפשר). הערכים יהפכו לירוקים כאשר הם נמצאים בטווח המקובל. לחץ על הגז הבא כדי להשלים את הכיול.
   הערה: ריכוזי גז הטווח נקבעים על ידי תערובת הגז הסטנדרטית הראשונית המאושרת, כפי שמתועד בתעודת הניתוח של הספק.

8. הגדרת ניסויים בתוכנה

1. בחר ניסוי > הגדרה. הזן מספרי ערוצי התחלה וסיום מהתפריטים הנפתחים בהתבסס על ערוצים תפוסים.
   1. הגדר את סף הרענון (%) ל- 0.50, את מרווח הרענון ל- NA ואת חלון הרענון (שניות) לאוטומטי.
   2. תחת הגדרות שונות, סמן את התיבה עבור חיישני טיהור; ודא שמדידת עוצמת הקול האוטומטית, O₂ צריכה חיובית ואפשר מצב זרימה פתוחה לא נבחרו.
   3. הגדר את מרווח הדגימה (שעות) ל-8.00 ואת משך הניסוי (שעות) ל-NA. הגדר יחידות גז וזמן לפי הצורך.
   4. אם אתה משתמש בבדיקת הטמפרטורה העיקרית לתיקון טמפרטורת הדגירה, ודא שלא נבחרה טמפרטורת תא כניסה ידנית. סמן את התיבה עבור מצב אוורור וודא שמצב ניקוז לא נבחר.
   5. ודא שמצב אוורור אנאירובי לא נבחר.
2. בחר הגדרת תא. הזן תוויות ערוצים תיאוריות (למשל, NegCtrl_1, PosCtrl_2, Test_PHA_3).
3. לחץ על כלי עזר. לחץ על תאים בעמודה EN עבור ערוצים תפוסים בלבד. לחץ על הגבלה. התוכנה תציין PASS או FAIL עבור כל ערוץ. המשך רק אם כל מבחני ההגבלה עוברים.
4. לחץ על עוצמת קול כדי למדוד נפחי רווח ראש.
   הערה: נפח מרווח הראש שווה לנפח האוויר בתוך כלי הכור לדוגמה וצינורות לולאה סגורה. ודא שהנפחים סבירים לגודל הכלי ואורך הצינור.
5. לחץ על דליפה. התוכנה תציין PASS או FAIL עבור כל ערוץ בהתבסס על עוצמת הקול של headspace. אם ערוץ נכשל, בצע את השלבים הבאים.
   1. ודא שטבעת ה-O נקייה וללא חלקיקים וסיבים ויושבת כהלכה בין שפת הכלי למכסה המתכת.
   2. הדק את מכסה הבורג. בדוק את החיבור והצינורות ביציאות ובאביזרי IN/OUT. חתוך קצוות צינורות שחוקים או מעוותים עם להב חד כדי להבטיח חתך נקי וישר.
   3. אם הערוץ ממשיך להיכשל, החלף את טבעת ה-O בחדשה ותואמת שצוינה על ידי היצרן.
6. לחץ על עוצמת קול כדי למדוד מחדש את אמצעי האחסון של מרווח הראש. לחץ על יציאה. ודא שעמודת עוצמת הקול של הכרטיסייה הגדרת תא מאוכלסת עבור כל הערוצים התפוסים.
7. בתפריט הראשי, בחר בתפריט כלים > שירות. ודא שבדיקת הטמפרטורה הראשונית, המודדת את טמפרטורת החממה, היא ב-30 מעלות צלזיוס ±-2 מעלות צלזיוס ויציבה.
8. לחץ על הפעל. שמור את הקובץ באמצעות שם תיאורי הכולל את התאריך (לדוגמה, 030325PositiveControlValidation). רשום את שם הקובץ בגיליון הנתונים.
9. בחר Experiment > View > Graphing כדי להציג תרשימים בזמן אמת. ייצור ביוגז מופיע כשיעורי ייצור_CO2 חיוביים. בקרות שליליות עשויות לנוע סביב אפס; עם זאת, השיעור הממוצע שלהם צריך להיות אפס או חיובי.
10. אם המערכת כוללת מייבשי אוויר מעובים, נהל יומן יומי של עיבוי גלוי בצינורות. ערבבו בעדינות את הצינורות כדי לשבש סתימות ולאפשר ניקוז, במידת הצורך.
11. עדכן קובצי נתונים (קובצי טקסט ASCII) בסוף כל מרווח דגימה. נתונים, כולל טמפרטורה, % גז (הרכב גז), קצב והצטברות, ניתנים להורדה לחבילות תוכנה שונות אחרות במהלך הניסוי או בסופו.
    1. כדי לפתוח קבצים .dat בגיליון אלקטרוני, הפעל את Excel ובחר קובץ > פתח. נווט אל התיקיה המכילה את קובץ .dat. בתפריט הנפתח של סוג הקובץ, בחר כל הקבצים ובחר את הקובץ הרצוי.
    2. כאשר תתבקש על-ידי אשף ייבוא הטקסט, בחר מופרד כסוג הקובץ ולחץ על הבא.
    3. תחת מפרידים, סמן את התיבה עבור פסיק. ודא שלא נבחרו מפרידים אחרים. חלון התצוגה המקדימה אמור להציג נתונים מופרדים לעמודות. לחץ על סיום כדי לטעון את הנתונים בגיליון האלקטרוני.
    4. שמור את הקובץ בתבנית .xlsx או .csv להמשך ניתוח ואחסון בארכיון.
12. מעת לעת, נתח נתונים כדי להבטיח שכפולי הטיפול עקביים. שגיאת התקן של שכפולי הטיפול צריכה להיות פחות מ-5% מהייצור המצטבר הממוצע של CO₂ . חזור על בדיקות שנכשלו בסף זה.
13. לחץ על עצור בסיום הדגירה.
    1. הדגירה יכולה להימשך 10-90 יום. אם חומרי הבדיקה מתכלים מאוד, יש לסיים את הדגירה כאשר ייצור CO₂ המצטבר מגיע למישור או להאריך אותה אם לא נצפתה השפלה לאחר 90 יום.
    2. סיים ניסויים כאשר לא נצפתה הפקת גז נטו במשך 5 ימים לפחות הן בספינות הבקרה והן בספינות הבדיקה. אין ייצור נטו מוגדר כשינוי של פחות מ-1% באחוז הפירוק הביולוגי במשך 5 ימים.
14. כבה את המערכת או התכונן לניסוי הבא.

9. פירוק הניסוי

1. רשום את טמפרטורת החממה (בדיקת תרמיסטור וקריאת חממה). נתק את הצינור מכלי הכור ממד הנשימה ושקול כל כלי כור דגימה באמצעות איזון מדויק. רשום משקולות כדי לקבוע אם התרחש אובדן משקל/מים במהלך תקופת הדגירה.
2. תת-דגימה של 20-30 מ"ל של מי ים מכל כלי כור כדי למדוד pH ומליחות ולהשוות ערכים אלה לאלה שתועדו בשלב 3.4 כדי לוודא יציבות במהלך הדגירה. סנן 60 מ"ל נוספים דרך מסנן אצטט תאית דל חנקן של 0.2 מיקרומטר לבקבוק פוליאתילן שטוף חומצה לניתוח חנקן וזרחן אנאורגניים מומסים בהתאם לשיטות סטנדרטיות בשלב 1.5.
   הערה: ניתן לסנן דגימות מי ים שיוריות כדי להסיר את הפלסטיק שנותר, לדלל אותן כדי להפחית את ריכוזי החומרים המזינים, ולהשליך אותן על ידי פריקת ניקוז בהתאם לתקנות המוסדיות והמקומיות.
3. שטפו כלים, טבעות O, מכסי מתכת ומכסי ברגים במי ברז. הניחו כלי זכוכית באמבט עם חומצה של 10% HCl למשך 24 שעות לפחות. חיטוי ואחסון מכוסה בנייר אלומיניום לדגירה הבאה

10. חישוב אחוז פירוק ביולוגי

1. חשב את סך הפחמן במצע הניסוי/בקרה באופן הבא:
   
   כאשר % C (תכולת פחמן) נקבע באמצעות ניתוח יסודות.
   הערה: סך הפחמן במצעי הניסוי והבקרה יכול לעבור את הטרנספורמציה הביוכימית הבאה במהלך הדגירה האירובית:
   C + O₂ → CO₂
   ניתן להמיר כל מילימול (12 מ"ג) של פחמן אורגני ממצע הניסוי/בקרה ל-1 מילימול של_CO2 גזי. מילימול אחד של גז המיוצר תופס 22.4 מ"ל בטמפרטורה ולחץ סטנדרטיים (STP).
2. חשב את אחוז הפירוק הביולוגי באופן הבא:
   
   כאשר C_g = כמות הפחמן הגזי המופק ממצע הניסוי/בקרה ובקרה שלילית (חיסון מי ים בלבד), mmoles, ו-C_i = כמות הפחמן במצע הניסוי שנוסף, mmoles.
3. חשב את שגיאת התקן, s_e, של אחוז הפירוק הביולוגי באופן הבא:
   
   כאשר n1 ו-n2 = מספר מצע ניסוי/בקרה משוכפל וכלי כור בקרה שליליים, בהתאמה, ו-s = סטיית תקן של סך הפחמן הגזי המיוצר.
4. חשב את מגבלות הביטחון (CL) של 95% באופן הבא:
   
   כאשר t = ערך התפלגות t בהסתברות של 95% עם (n1 + n2 − 2) דרגות חופש, ולכן n = 3 + 3 − 2 = 4.

11. סוף הפרוטוקול

1. לאחר השלמת החישובים וניתוח הנתונים, ריכוז התוצאות לדוח הסופי או הזנתן למסד נתונים משותף בהתאם לתוכניות ניהול הנתונים של הפרויקט או המוסד. ודא שכל החומרים מסולקים בהתאם להנחיות הפסולת המסוכנת המוסדית, וכל הציוד מנוקה ומאוחסן.

תוצאות

מוצגות תוצאות בדיקות פירוק ביולוגי ימיות. פירוק ביולוגי הוערך עבור כל דגימה על ידי מדידת שיעור הפחמן שהומר לפחמן דו חמצני. חלקות פירוק ביולוגי מצטברות, קצב ואחוז מציגות בדרך כלל שלב פיגור, ואחריו שלב צמיחה, ובסופו של דבר מישור. העיתוי והגודל של שלבים אלה תלויים בחומר הדגימה, בתנאי הניסוי ובהרכב חיסון מי הים.

מי ים שנאספו כל השנה ממפרץ ממוזג מציגים שונות במרכיבי איכות המים. לדוגמה, המגוון והשפע של קהילת החיידקים משתנים בקנה מידה של זמן יומי לעונה

דיון

ביצועי בקרה חיובית קובעים את תוקף הבדיקה. נדרש מינימום של 70% פירוק ביולוגי של מצע בקרה חיובי מתכלה ימית (למשל, תאית בדרגה אנליטית, נייר קראפט וכו'), בהתבסס על תפוקת הגז המקסימלית התיאורטית שלו. אמת מידה זו מאמתת תנאים נוחים ופעילות מיקרוביאלית מספקת במי הים הטבעיים במהלך הדגירה. אי עמידה בסף זה מצביעה על בעיה פוטנציאלית בהכנה משוכפלת, טיפול בחיסון מי ים (כלומר, קהילה מיקרוביאלית מתה), או תפקוד מערכת רספירומטריה, הדורשת פסילת בדיקה.

כדי למזער את השונות הקשורה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.2 ומיקרו; מסנן, 47 מ"מ אצטט תאית	גיאוטק גאופילטר	83100056	סינון מי ים
פיפט וולומטרי 100 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	13-650-2U	מחלקה A; חומצה נשטפה ונשטפה במים דה-יוניים
כוסות זכוכית בנפח 100-600 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	50-194-5690	מחלקה A; חומצה נשטפה ונשטפה במים דה-יוניים
כדורי מילינג בקוטר 20 מ"מ	רטש	53680062	פלדת אל-חלד. משמש עם צנצנת טחינה לטחינה קריוגנית של פולימר
צנצנות טחינה של 50 מ"ל	רטש	14620216	פלדת אל-חלד. משמש עם כדורי מיקסר מיל 400 ו-20 מ"מ לטחינה קריוגנית של פולימר
פיפט וולומטרי בנפח 75 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	13-650-2T	מחלקה A; חומצה נשטפה ונשטפה במים דה-יוניים
משאבת אוויר ומערכת בועות	טטרה	77846	אוורר מי ים במהלך שיווי משקל טרום-דגירה
נייר אלומיניום	פישרברנד	01-213-100	כיסוי לאוטוקלבינג ואחסון נקי
כלוריד אמוניום (NH4Cl)	תרמו פישר סיינטיפיק, פישר כימיקלים	A661-500	קפיצה בחומרים מזינים במי ים
איזון אנליטי	מטלר	AT201	לשקול את הסובסטרטים הניסיוניים והבקרים
אוטוקלאב	טוטנואר	MFI-TTN-3870EA	לעיקור כלים ומרכבי מכסים
ערוץ יחיד בסיסי Micro-Oxymax 120VAC	קולומבוס אינסטרומנטס	0135-8000	משמש לאחסון בקרות חיוביות ופולימר
גז כיול	איירגז	X03NI92P3000001	תערובות גז סטנדרטיות ראשוניות; 2.7% פחמן דו-חמצני, 4.5% מתאן, חנקן מאזן
מסך מחשב	דל	210-BMKK	מסך Hub של Dell Pro 24 Plus. משמש עם מחשב להפעלת תוכנת Micro-Oxymax
כפפות קריוגניות	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, כפפות קריו	11-394-306	משמש לטיפול בחנקן נוזלי
מדחום חיוג	תרמו פישר סיינטיפיק, מכשיר H-B דוראק	13-201-433	מדחום מכויל לטמפרטורת מי ים בזמן האיסוף
פיפטות חד-פעמיות	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	13-711-7M	שטוף את דפנות הכלי כדי לשחרר חומר
מארז ENC52 מבוקר טמפרטורה ואור	קולומבוס אינסטרומנטס	4740-4054	שמירה על תנאי טמפרטורה ותאורה
מלקחיים של פלאסק	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	S07387	משמש לטיפול בצנצנות טחינה בחנקן נוזלי
בקבוקים, 250 מ"ל	DWK מדעי החיים	14395-250	כלי דגימה של כורים
בקבוקי קליפות זכוכית עם סגירות בסגנון תקע	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	03-339-26D	אחסון דגימות
עומק ידני H22PX	ווסט מרין, נורקרוס מרין	6849368	קביעת עומק אתר איסוף מי הים
GPS 73 נייד	גרמין	10-01504-00	משמש לקביעת מיקום אתר איסוף מי הים
מחבת HDPE	תרמו סיינטיפיק, נלג'ין	13-359-26	משומש לחליפת כלי זכוכית בחומצה   בתמיסת HCl של 10%
חומצה הידרוכלורית (תמיסת מים חומצית)	תרמו פישר סיינטיפיק, פישר כימיקלים	A144-212	ACS Plus מוסמך, 36.5 עד 38.0%. בדיקת חיישנים CO2 וכלי זכוכית עם שטיפת חומצה
מכסה זרימה למינרי	מדעי האוויר	FLOW-48-A	מזעור מזהמים באוויר במהלך הכנת הדגימה
ניסקין גדול; בקבוק בטא פלוס בלבד - 8.2 ליטר אופקי, PVC	מדע קודם כל	3-1980-H65	לאיסוף מי ים מהמזח או הסירה
מחבת חנקן נוזלי	תרמו פישר סיינטיפיק, בל ארט מג'יק טאץ' 2	11-999-063	החזק חנקן נוזלי
כלי העברת חנקן נוזלי, 10 ליטר	תרמו-סיינטיפיק	TY509X2	אחסון וחלוקת חנקן נוזלי לקריומילינג
חנקן נוזלי, דרגה תעשייתית, 22 PSI	איירגז	NI 180LT22	משמש לשבירת ועיבוד פולימרים
מנפנת מכנית	המבולט, גריינגר	5DPL6	ניתוח מסננת להתפלגות גודל חלקיקים
מיקרו-אוקסימקס	קולומבוס אינסטרומנטס	7395-113-D64	טבעת O אטומה מסיליקון, יציאת מתכת עם 3 חיבורים, ומכסה בורג GL45;
ממשק הרחבה Micro-Oxymax 10 ערוצים	קולומבוס אינסטרומנטס	0135-8101	רכיב מערכת הספירומטריה
מיקרו-אוקסימקס רספירומטר (3% CO2)	קולומבוס אינסטרומנטס	0135-8403	אינפרא-אדום לא מפזר
מיקסר מיל 400	רטש	207450001	מיקסר מיל 400. משמש לטחינה קריוגנית של פולימר
בקר פיפטות ממונע	אפנדורף	4430000018	העברת מי ים לכלי דגימות של כורים
בקבוק איכות HDPE ענבר צר פה, 1 ליטר	תרמו סיינטיפיק, נלג'ין	02-923-5	דגימת מי ים שלמים בנפרד
רשת ניילון 20 מיקרון	חברת הסינון ELKO	41718	משמש לניפוי מי ים גולמיים להסרת חלקיקים הטרוגניים גדולים
מנענע מסלולי באוויר הפתוח	תרמו פישר סיינטיפיק	SK4000	שמירה על תנועת מסלולי כלי הכור במהלך הדגירה
מחשב OptiPlex 5090 בצורת גורם קטן	דל	C0SL03	מחשב Desktom המשמש להרצת תוכנת Micro-Oxymax
מד pH/קונד	מטלר טולדו, SevenExcellence S470-Basic	30046252	מד pH/מוליכות על שולחן למדידת חיסון מי ים ראשוני וסופי
בקבוק פוליאתילן, 60 מ"ל	קורפק	PLC-03564	דגימת מי ים מסוננת בדיסקרטית
פספט אשלגן מונובסיסי (KH2(PO4))	תרמו פישר סיינטיפיק, פישר ביו-ריאגנטים	BP362-500	קפיצה בחומרים מזינים במי ים
איזון דיוק	סארטוריוס	Practum2102-1S	כדי לשקול את המשקל הכולל של הכלים
ראונד קרבוי, 20 ליטר	תרמו פישר סיינטיפיק	02961A	נשטף בחומצה לאחסון מי ים
משקפי בטיחות	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	19-181-513
סקופולה	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד, סקופולה	01-257-567	סקופולה מעבדה מפלדת אל-חלד
מסננים	אדוואנטק, גריינג'ר	40PR18-40PR55	מסנפות מפלדת אל-חלד. מספר המסננים והגדלים תלוי בחומר הנבדק.
תאית סיגמסל, סוג 101	סיגמא-אלדריץ'	435236-250G	אבקה, מצע בקרה חיובי
נתרן ביקרבונט	תרמו פישר סיינטיפיק, פישר כימיקלים	S233-500	בדיקת חיישן CO2
נתרן סולפיט, חסר מים, 98%	תרמו פישר סיינטיפיק, תרמו סיינטי כימיקלים	AAA1793336	בדיקת חיישן CO2
מדחום/גלאי תרמיסטור	פישרברנד	15-079-700	אימות טמפרטורת האינקובטור
ברומטר דיאל מדויק שניתן למעקב	פישרברנד	14-648-51	תיעוד לחץ אטמוספרי בתחילת הניסוי
Victor Medium Duty Hydrogen, רגולטור דו-שלבי מתאן, CGA - 350	איירגז	VIC0781-3559	רגולטור גז כיול
בקבוקי וולומטרי, 2 ליטר	תרמו פישר סיינטיפיק, פישרברנד	FB4002000	מחלקה A; חומצה נשטפה ונשטפה במים דה-יוניים. משמש להכנת מי ים עם קוצים מזינים.
מחבתות שקילה	תרמו פישר סיינטיפיק	02-202-101	פוליאתילן