הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביסוס וכימות של זיהום ליטי דה נובו על ידי וירוס הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי נטול תאים

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68959

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת חוץ גופית למודל זיהום ליטי דה נובו של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי באמצעות נגיפים שמקורם ב-BAC16. השיטה מאפשרת לחקור שכפול והפצה מוקדמים של הנגיף. ייצור הנגיף הזיהומי מכומת על ידי בדיקות יחידות זיהומיות מבוססות GFP ו-PCR בזמן אמת של גנומים נגיפיים עטופים.

תקציר

וירוס ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי (KSHV), וירוס גמאהרפס המעורב במספר ממאירויות אנושיות, יכול לעבור שכפול ליטי במהלך זיהום ראשוני, תהליך התורם להפצת ויראלי, התחמקות חיסונית ופתוגנזה של מחלות. עם זאת, היעדר מערכות מבחנה חזקות לזיהום ליטי דה נובו הגביל תובנות לגבי אירועי זיהום מוקדמים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול הניתן לביצוע המעסיק תאי HCT 116 של סרטן המעי הגס האנושי כמטרות לזיהום בנגיפים נטולי תאים שמקורם בתאי יצרן iSLK מלאכותיים חיידקיים KSHV (BAC16). מודל זה מסכם שלבים מרכזיים בזיהום ראשוני, כולל כניסה ויראלית, העברת גנום, ביטוי גנים ליטיים וייצור צאצאים. ההדבקה מסונכרנת באמצעות חיסון ומנוטרת באופן זמני. ייצור הנגיף מכומת באמצעות מערכת קריאה כפולה הכוללת בדיקות יחידה זיהומית (IU) מבוססות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו-qPCR של DNA ויראלי עטוף. גישות אלו מאפשרות ניתוח מפורט של קינטיקה של שכפול ויראלי. בעוד שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד באיתור אירועים בשלב מאוחר, המערכת ניתנת להתאמה לחקר שלבים מוקדמים של הדבקה באמצעות נקודות זמן דגימה מותאמות. על ידי הצעת פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה לזיהום דה נובו פרודוקטיבי, מערכת זו מטפלת בפער מתודולוגי במחקר KSHV ותומכת במחקרים מכניסטיים של אינטראקציה בין וירוס ההרפס למארח ואסטרטגיות אנטי-ויראליות.

מבוא

וירוס ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי (KSHV) הוא וירוס גמאהרפס אנושי הקשור אטיולוגית לסרקומה של קפוסי (KS), לימפומה תפליט ראשונית (PEL), מחלת קסלמן רב-מרכזית (MCD) ותסמונת ציטוקין דלקתית KSHV 1,2. כמו כל נגיפי ההרפס, KSHV מבסס התמדה לכל החיים במארח, לסירוגין בין שלב סמוי לשלב ליטי. בעוד שהשהיה שולטת ברוב התאים הנגועים, תת-קבוצה יכולה להיכנס למחזור הליטי במהלך זיהום ראשוני (דה נובו) או באמצעות הפעלה מחדש מחביון3. שכפול ליטי כרוך במפל מסודר של ביטוי גנים ויראלי, שמגיע לשיאו בשכפול גנום, הרכבת ויריונים ושחרור צאצאים. תהליך זה קריטי להפצת הנגיף ולהתקדמות המחלה 4,5. מחקרים מוקדמים של שכפול ליטי של KSHV הסתמכו לעתים קרובות על ביטוי חוץ רחמי של גנים נגיפיים בודדים במערכות הטרולוגיות. למרות שהיו אינפורמטיביות, גישות אלה לא לכדו את ויסות הגנים המתואם ואת האינטראקציה בין הנגיף למארח הקיימת במהלך הדבקה אותנטית. הפיתוח של BAC-16, כרומוזום מלאכותי חיידקי רקומביננטי (BAC) הנושא את גנום ה-KSHV באורך מלא, איפשר ייצור של נגיפים הניתנים למניפולציה גנטית השומרים על יכולת לשכפול וייצור ויריונים זיהומיים6. מערכת זו מאפשרת מוטגנזה ממוקדת וניתוח פונקציונלי של גנים נגיפיים בהקשר של הגנום השלם. מודלים של הפעלה מחדש המשתמשים בתאי iSLK או BCBL-1 נגועים באופן סמוי עם BAC-16 או KSHV הפכו מאז לסטנדרט לחקר שכפול ליטי של KSHV. מערכות אלו מאפשרות אינדוקציה מסונכרנת של המחזור הליטי באמצעות חומרים כגון דוקסיציקלין (Dox) ונתרן בוטיראט 7,8. עם זאת, מכיוון שמודלים של הפעלה מחדש עוקפים את שלבי ההדבקה המוקדמים - כולל כניסה ויראלית, סחר תוך תאי וההחלטה הראשונית בין חביון לשכפול ליטי - הוא אינו יכול לסכם באופן מלא את דינמיקת ההדבקה הראשונית.

מודלים של זיהום דה נובו מציעים מסגרת משלימה לטיפול בפערים אלה. מספר מודלים של תאים ראשוניים, כגון תאי אנדותל אנושיים ותאי אפיתל חניכיים, הוכחו כתומכים בשכפול ליטי לאחר זיהום KSHV de novo 3,9,10,11. עם זאת, תוחלת החיים המוגבלת שלהם, העלות הגבוהה וההתאמה הירודה למניפולציה גנטית מגבילים את יכולת השחזור והמדרגיות שלהם למחקרים מכניסטיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל ניתן למעקב וניתן להרחבה של זיהום ליטי KSHV de novo באמצעות קו תאי קרצינומה של המעי הגס האנושי HCT 116. למרות שאינם מטרה טבעית של KSHV, תאי HCT116 מפגינים מתירנות חזקה לזיהום ומספקים פלטפורמה יציבה וחסכונית המתאימה למחקרים מכניסטיים ויישומים בעלי תפוקה גבוהה. בהתחשב ביכולת המוגבלת של KSHV ליצור פלאק בתרבית, אנו משתמשים במערכת BAC16 המשלבת מדווח GFP כדי ליצור וירוס נטול תאים לזיהום. זה מאפשר הדמיה ישירה של תאים נגועים וכימות של טיטרים זיהומיים באמצעות מבחני יחידה זיהומית מבוססי GFP (IU)12. כדי להשלים זאת, DNA הקשור לוויריון נמדד על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) לאחר טיפול ב-DNase, ומציע שיטה רגישה לזיהוי גנומים נגיפיים עטופים. יחד, בדיקות אלה מאפשרות ניתוח כמותי שנפתר זמנית של דינמיקת השכפול הליטי במהלך הדבקה ראשונית.

פרוטוקול זה מספק פלטפורמה אמינה וגמישה למידול זיהום ליטי KSHV de novo במבחנה, המאפשר ניתוח של אירועים מוקדמים במחזור החיים הנגיפי, ומאפשר הערכה של תפקוד הגנים והפעילות האנטי-ויראלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

KSHV מסווג כפתוגן אנושי ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). בצע את כל ההליכים הכרוכים בחומר זיהומי בארון בטיחות ביולוגית BSL-2 מוסמך. טיהור משטחי עבודה עם 70% אתנול לפני ואחרי כל הליך. השלך את כל הפסולת בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות ולהנחיות BSL-2 של ארגון הבריאות העולמי. סקירה סכמטית של זרימת העבודה המלאה מסופקת באיור 1. ההליך כולל יצירת KSHV שמקורו ב-BAC16 ללא תאים מתאי iSLK שהופעלו מחדש, זיהום דה נובו של תאי HCT 116, כימות טיטרים של הנגיף על ידי בדיקת יחידה זיהומית (IU) וניתוח qPCR של DNA ויראלי הקשור לוויריון. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור KSHV שמקורו ב-BAC16 ללא תאים

  1. זרע חמש צלוחיות T75 של תאי iSLK הניתנים להשראת Dox המכילים סוג רחב (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) במפגש של כ-80%. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  2. לגרום להפעלה מחדש ליטית על ידי הוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל דוקס ו-1 מ"מ נתרן בוטיראט לכל בקבוק. המשך הדגירה למשך 72-96 שעות.
  3. עקוב אחר תאים מדי יום על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אסוף סופרנטנט לאחר >90% מהתאים מפגינים עיגול, ניתוק משטח הבקבוק ו/או ליזה נראית לעין, סימני היכר של אפקט ציטופתי (CPE) המעידים על תגובה ליטית חזקה. לאחר איסוף הסופרנטנטים, יש לטהר ולהשליך את תאי ה-iSLK-BAC16 המושרים ליטית באמצעות 10% אקונומיקה.
  4. צנטריפוגה את הסופרנטנטים שנאספו ב-1,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת. סנן את הסופרנטנט המובהר דרך מסנן ממברנה פוליאתרסולפון (PES) של 0.45 מיקרומטר מבלי להפריע לגלולה.
  5. העבירו את הסופרנטנטים המסוננים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה. גלולה את החלקיקים הנגיפיים על ידי צנטריפוגה ב-25,000 x גרם למשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור SW28.
  6. השליכו בזהירות את הסופרנטנט לתוך אקונומיקה של 10%. השעו מחדש את הגלולה הנגיפית ב-1 מ"ל ללא סרום Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. העבר את הנגיף המושעה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים עם מכסה הברגה של 1.5 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. קבע טיטרים זיהומיים של מלאי הנגיף באמצעות בדיקות יחידה זיהומית מבוססות GFP (IU) בתאי SLK (ראה שלב 3).

2. זיהום דה נובו של תאי HCT116

הערה: ריבוי גבוה של זיהום (MOI) הוא קריטי כדי ליזום ביעילות שכפול ליטי בתאי HCT116 לאחר זיהום דה נובו KSHV. מצב זה מאפשר ביטוי גנים ויראלי חזק ושכפול פרודוקטיבי ללא צורך בגירויים אקסוגניים. תוצאה מייצגת המדגימה את ההשפעה התלויה ב-MOI על ייצור הוויריונים מסופקת באיור משלים 1A.

  1. זרע 1 x 105 תאי HCT116 לבאר בצלחת תרבית רקמה של 12 בארות. דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO 2 .
  2. לדלל את מלאי הנגיף המרוכז ב-DMEM מחומם מראש וללא סרום לנפח סופי של 250 מיקרוליטר כדי להשיג ריבוי זיהום (MOI) של 10.
  3. שאפו מדיום תרבות מכל באר. הוסף 250 מיקרוליטר של נגיף מדולל ישירות לתאים.
  4. צנטריפוגה של הצלחת ב-1,500 x גרם למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס כדי לסנכרן זיהום (ספינוקולציה). העבירו מיד את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס והמשיכו בדגירה למשך שעה נוספת.
  5. שאפו את החיסון ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מחומם מראש כדי להסיר שאריות נגיף. הוסף 1 מ"ל של DMEM שלם לכל באר.
  6. עקוב אחר ביטוי GFP בתאים נגועים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב-36 שעות, 60 שעות ו-96 שעות לאחר ההדבקה. בכל נקודת זמן, אספו 1 מ"ל של תרבית סופרנטנט מכל באר.
    הערה: לאחר איסוף הסופרנטנטים, ניתן לשמור תאי HCT116 נגועים ב-KSHV ליישומים במורד הזרם כגון מיצוי RNA, ניתוח חלבונים, אימונופלואורסצנציה או ציטומטריית זרימה, בהתבסס על מטרות ניסוי.
  7. צנטריפוגה את הסופרנטנטים שנאספו ב-1,500 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. העבירו סופרנטנטים מובהרים לצינורות טריים. יש להקפיא חנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך ניתוח.

3. בדיקת יחידות זיהומיות (בדיקת IU)

הערה: תאי SLK מתירניים לכניסת KSHV ותומכים בביטוי גנים ליטי מוקדם. בדיקה זו מכמתת יחידות זיהומיות על סמך ביטוי GFP בתאי SLK נגועים לאחר חשיפה לסופרנטנטים המכילים נגיף מדולל סדרתי.

  1. זרע 1 x 104 תאי SLK לבאר בצלחת של 96 בארות 24 שעות לפני ההדבקה. ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה ומגיעים למפגש של ~60%-70% ביום ההדבקה.
  2. סמן תשע צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לדילול כפול סדרתי: שפופרת 1 (לא מדולל, 1:1), שפופרת 2 (1:2), שפופרת 3 (1:4), שפופרת 4 (1:8), שפופרת 5 (1:16), שפופרת 6 (1:32), שפופרת 7 (1:64), שפופרת 8 (1:128) ושפופרת 9 (1:256).
  3. הוסף 200 מיקרוליטר של סופרנטנט וירוס לצינור 1. הוסף 100 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש וללא סרום לכל אחד מהצינורות 2 עד 9. כדי להתחיל בסדרת הדילול, העבירו 100 מיקרוליטר מצינור 1 לצינור 2 וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר מצינור 2 לצינור 3 וחזרו על תהליך זה ברצף דרך צינור 9, תוך ערבוב יסודי בכל שלב.
    הערה: כל שפופרת צריכה להכיל נפח סופי של 100 מיקרוליטר.
  4. שאפו את מדיום התרבות מתאי SLK. הוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול נגיף לבארות המיועדות לכך. השתמש ב-27 בארות בסך הכל (3 בארות לדילול מ-1:1 עד 1:256).
  5. צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב-1,500 x גרם למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס כדי לקדם ספיחה בבקבוקון. העבירו את הצלחת לאינקובטור CO 2 של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת.
  6. הסר את החיסון והוסף בעדינות 100 מיקרוליטר של DMEM מלא לכל באר. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. קצור את התאים ונתח את ביטוי GFP על ידי ציטומטריית זרימה. רשום את מספר התאים החיוביים ל- GFP לבאר.
  8. חשב יחידות זיהומיות למ"ל (IU/mL) באמצעות הנוסחה הבאה13:
    IU/mL = [(מספר תאים חיוביים ל-GFP לבאר)/ נפח חיסון (מ"ל)] x גורם דילול. קבע את טיטר הנגיף הסופי באמצעות הדילול האחרון עם תאים חיוביים ל-GFP הניתנים לזיהוי

4. כימות גנומים נגיפיים עטופים על ידי qPCR

  1. הוסף DNase I לריכוז סופי של 100 U/mL עד 400 מיקרוליטר של סופרנטנט מובהר (ראה שלב 1 להבהרת סופרנטנט והסרת פסולת). יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעכל DNA נגיפי ותאי שאינו מכוסה. תוצאה מייצגת המדגימה את הספציפיות והיעילות של הטיפול ב-DNase מוצגת באיור משלים 1B.
  2. הוסף EDTA לריכוז סופי של 50 מ"מ כדי לעצור את תגובת ה-DNase. דגירה בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לנטרל את DNase I.
  3. חלץ DNA ויראלי מהסופרנטנט שטופל ב-DNase באמצעות ערכת ה-DNA Mini לפי פרוטוקול היצרן.
  4. יש לסלק את ה-DNA הנגיפי ב-30 מיקרוליטר של מאגר פליטה. השתמש ב-5 מיקרוליטר של DNA מופשט עבור כל תגובת qPCR.
  5. הגביר את מסגרת הקריאה הפתוחה KSHV 73 (ORF 73) באמצעות הפריימרים הבאים: קדימה: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; גב: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. הכן תגובות qPCR בשלוש עותקים באמצעות SYBR Green Master SuperMix. הגדר את תנאי הרכיבה באופן הבא: דנטורציה ראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; הגברה: 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; ניתוח עקומת התכה: רמפה סטנדרטית לספציפיות אמפליקון.
  7. צור עקומה סטנדרטית באמצעות דילול סדרתי פי 10 של DNA ויראלי שמקורו ב-BAC-16, הנע בין 109 ל-101 עותקים לכל תגובה. התווה ערכי Ct כנגד היומן10 של מספר עותק הקלט כדי להעריך את הליניאריות של הבדיקה. עקומה סטנדרטית מייצגת מוצגת באיור משלים 1C.
  8. קבע את מספר עותק הגנום הנגיפי על ידי השוואת ערכי Ct לעקומה הסטנדרטית. לנרמל ולדווח על תוצאות כעותקי DNA ויראלי לכל מ"ל של סופרנטנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לכמת את הטיטר של הנגיף הזיהומי, סופרנטנטים שנקטפו 72 שעות לאחר הפעלה מחדש ליטית של תאי iSLK-BAC16 היו נתונים לדילול סדרתי כפול ושימשו להדבקת תאי SLK. מספר תאי SLK חיוביים ל-GFP בכל דילול מוצג באיור 2A, ויחידות זיהומיות תואמות (IU) למ"ל חושבו והוצגו באיור 2B. כדי להעריך את היעילות של שכפול ליטי דה נובו , תאי HCT 116 נדבקו בוויריונים שמקורם ב-iSLK-BAC16 ב-MOI של 10 (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מידול הדבקה ליטית דה נובו של KSHV מעוכב זה מכבר על ידי הנטייה החזקה של הנגיף לבסס חביון ברוב סוגי התאים המתירניים. למרות שתאים ראשוניים מסוימים, כגון תאי אנדותל ותאי אפיתל אוראליים, הוכחו כתומכים בשכפול ליטי בעקבות זיהום דה נובו 9,10, תוחלת החיים המוגבלת שלהם, העלות הגבוהה והקושי הטכני בתחזוקת תרבית מפחיתים את יכולת השחזור והמדרגיות. מחקרים אחרונים הראו עוד כי התוצאה של זיהום ראשוני ב-KSHV תלויה מאוד בהקשר התאי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר ג'ה א. יונג (קליבלנד קליניק) על שיתוף קו התאים iSLK-BAC16 המייצר KSHV רקומביננטי. העיצוב הגרפי נוצר באמצעות BioRender.com, שהמחברים מחזיקים ברישיון עבורו. עבודה זו נתמכה על ידי פרסי ה-NIH R21 DE028256, R01 CA140964 ו-R01 CA262631 ל-C. Liang (PI), פרס הפוסט-דוקטורט של מאיץ המדע של Wistar ל-Q. Zhu.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 ומיקרו; מסנן מ polyethersulfome (PES) VWR76479-020
עיבוד ביולוגיעיבוד ביולוגילא ישיםעיצוב גרפי נוצר עם < br/> עם BioRender.com, שהמחברים מחזיקים ברישיון עבורו
מערכת PCR בזמן אמת CFX Opus 96ביו-ראד184-5072
DMEM מלאמדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM; Sigma-Aldrich) בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS; Gibco), 2 מ"מ L-גלוטמין (Gibco), ו-100U/ml פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep; GenClone).
דנאס אמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0303S
דוקסיציקליןסיגמא-אולדריץ'D9891
ציטומטר זרימה LSR II 18BD ביוסיינסלא ישים
PerfeCTa SYBR גרין מאסטר סופרמיקסקוואנטביוברקוד 95054-02K
ערכת QIAamp DNA מיניקיגן56304
נתרן בוטיראט (NaB)סיגמא-אולדריץ'B5887
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0תרמו פישר15575020

מקורות

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהום ליטי של KSHVזיהום דה-נובוKSHV נטול תאיםתאי HCT116נגיף BAC16ספינוקולציהבדיקת GFPציטומטריה של זרימהPCR כמותירפליקציה נגיפית
ביסוס וכימות של זיהום ליטי דה נובו על ידי וירוס הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי נטול תאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.