Method Article

השגת איסוף נתוני טומוגרפיה איכותי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בהספק 200 קילו-וולט עם מערכת עדשות קונדנסר כפולה

DOI:

10.3791/68965

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Peking University Third Hospital, 2Medical and Health Analysis Center, Peking University Health Science Center, 3Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality, 4Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיית אלקטרונים מאפשרת הדמיה כמעט אטומית של אברונים, תאים ומקרומולקולות בתוך רקמות בדגימות קריוביולוגיות. השגת רזולוציה כזו דורשת תנאי הדמיה מבוקרים בקפדנות. כאן, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בהספק 200 קילו-וולט עם מערכת עדשות מעבה דו-שלבית, אנו מתארים כיצד לבצע איסוף נתוני טומוגרפיית אלקטרונים באיכות גבוהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיית קריואלקטרונים (קריו-ET) הפכה לטכניקה עוצמתית להבהרת המבנים של אברונים תאיים ומתחמי חלבונים גדולים בסביבתם הטבעית. בניגוד למיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונלי בטמפרטורת החדר, קריו-ET ממזער נזק שנגרם מקרינה והכנה למבנים פנימיים. יתרה מזאת, בניגוד לניתוח חלקיקים בודדים (SPA), קריו-ET מפחית את הצורך בטיהור חוזר, ובכך שומר על המידע המבני האותנטי ביותר של הדגימות. כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה, קריו-ET מטיל גם דרישות מחמירות על תנאי ההדמיה של ה-TEM. למרות השיפור המתמיד ביעילות רכישת נתוני קריו-ET והופעתן של פלטפורמות תוכנה רבות, רוב הפתרונות הם קנייניים, ספציפיים לספק, ומחוברים באופן הדוק למודלים מסוימים של מיקרוסקופ אלקטרונים, מה שמוביל לעלויות יישום גבוהות. במחקר זה התקנו את תוכנת הקוד הפתוח SerialEM על מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 קילו-וולט (Glacios 2 cryo-TEM) עם מערכת עדשות קונדנסר כפולה וביצענו כיולים מקיפים לאפשר איסוף נתוני טומוגרפיה באיכות גבוהה. באמצעות אפופריטין כדגם מודל, אנו מתארים את כל תהליך העבודה – מהכנת דגימות קריוגרפיות ועד איסוף אוטומטי של נתוני קריו-ET, ולאחר מכן שחזור טומוגרפיה וניתוח תת-טומוגרפי. שיטה זו מציעה פתרון חסכוני ונגיש לאיסוף נתוני קריו-ET, במיוחד למעבדות המשתמשות במיקרוסקופים של גלסיוס ללא גישה לתוכנה קניינית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טומוגרפיית קריואלקטרונים (קריו-ET) הפכה לטכניקה עוצמתית לחקר המבנים הטבעיים של קומפלקסים מקרומולקולריים ואברונים תאיים במקום. יתרון מרכזי של קריו-ET על פני ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) הוא יכולתו להימנע משלבים מופרזים של טיהור, ובכך לשמור על המצב הטבעי של הביומולקולות המטרה בהקשר הביולוגי שלהן. נכון להיום, ניתן לחקור מגוון רחב של דגימות – כולל אברונים מטוהרים 1,2,3,4, יריעות ממברנת תא, קומפלקסים מקרומולקולריים5, וירוסים 6, למלותתאיות 7, וחתכי רקמה 8,9,10 – ניתנים לחקירה באמצעות קריו-ET. בהתחשב במגוון סוגי המדגם והמטרות הניסיוניות, אסטרטגיות איסוף הנתונים משתנות באופן משמעותי ויש להתאים אותן בקפידה הן לדגימה והן לתצורת המכשיר הספציפית.

איסוף נתונים הוא שלב קריטי בתהליך העבודה של קריו-ET, שכן גם איכות הנתונים וגם יעילות הרכישה משפיעות ישירות על העיבוד במורד הזרם ועל הצלחת הניסוי הכוללת. כדי לעמוד בדרישות הניסוי המשתנות, פותחו מספר פלטפורמות לאיסוף נתונים. בין השימושים הנפוצים ביותר נמצאים טומוגרפיה מסחרית ותוכנת הקוד הפתוח SerialEM 11,12,13. טומוגרפיה מציעה ממשק משולב וידידותי למשתמש עם עקומת למידה נמוכה, אך היא פחות גמישה ודורשת רישיון מסחרי. לעומת זאת, SerialEM היא חבילת קוד פתוח חינמית התומכת בזרימות עבודה מבוססות ממשק משתמש גרפי (GUI) ובזרימות עבודה מבוססות סקריפטים, ומספקת גמישות והרחבה רבה יותר.

איסוף נתוני טומוגרפיה מקריו-למלה מציב אתגרים ייחודיים. למלות איכותיות קשות להכנה, וחוסר היציבות המכאנית והרגישות הגבוהה שלהן לקרינת אלקטרונים מסבכים עוד יותר את איסוף הנתונים. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פביאן אייזנשטיין פיתח את תהליך העבודה PACEtomo14, שיפור של SerialEM שמציג הזזת קרן-תמונה לרכישת מספר טומוגרמות בכל סדרת הטיה, ובכך להפחית את תדירות המיקוד והתאמות המעקב. אסטרטגיה זו ממקסמת את כמות הנתונים השימושיים מכל חלק תוך מזעור חשיפה מיותרת לאלקטרונים. פונקציונליות דומה זמינה גם בתוכנת Tomography5 המסחרית.

לעומת זאת, איסוף נתונים מאברונים מקובעים בקריו או מגליונות ממברנה הוא בדרך כלל פשוט יותר, שכן דגימות אלו מוכנות בדרך כלל על רשתות פחמן עם חורים, מה שמספק שטח נרחב למיקוד ומעקב15,16. במקרים כאלה, תהליכי הרכישה המובנים של SerialEM לרכישת קריו-ET – הנגישים ישירות דרך הממשק הגרפי – מציעים אפשרות נוחה וללא סקריפטים, המתאימה במיוחד למתחילים או למעבדות קטנות יותר. עם זאת, מבחינת יעילות, אנו עדיין ממליצים על אסטרטגיות מבוססות הזזת תמונת קרן ככל האפשר.

בהינתן העלות הגבוהה של מיקרוסקופים אלקטרוניים קריו-אלקטרוניים, אופטימיזציה של אסטרטגיות איסוף נתונים למקסום ניצול המכשירים היא חיונית. מכשיר TEM של 200 קילו-וולט המצויד במערכת עדשות קונדנסר דו-שלבית מציע חדירת אלקטרונים מעט נמוכה יותר לדגימות עבות מאשר מכשיר של 300 קילו-וולט, אך הוא נשאר יעיל לחלוטין לקריו-ET כאשר הוא מכויל כראוי. עם זאת, טווח תנאי קרן מקביל הצר יחסית וגודל נקודות קבוע בהגדלות הופכים אותו לפחות מתאים לקריו-ET ברזולוציה גבוהה אלא אם כן המערכת מותאמת במדויק.

מערכת מיקרוסקופיית האלקטרונים שלנו מצוידת במצלמת Falcon 4i לזיהוי אלקטרונים ישיר, המספקת יתרונות משמעותיים ביכולת ספירת אלקטרונים בודדת ודימות רציף במהירות גבוהה. כדי לנצל את ביצועי הגלאי במלואו, יש להפעיל את ה-TEM בתנאי הדמיה מותאמים היטב. עבור TEMs המשתמשים במערכת קונדנסר דו-שלבית, כיול מדויק של תנאי התאורה לאור מקבילי הוא גורם חשוב לשיפור איכות התמונה17,18. במערכות מעבה דו-שלביות מודרניות, נקודת המוקד של עדשת המעבה בשלב השני חייבת להתאים למישור המוקד הקדמי של עדשת האובייקטיב העליון כדי להבטיח שהמסלול האופטי החוצה את מישור הדגימה מקביל. תנאי אור מקבילים שנקבעו במדויק הם קריטיים להבטחת שערכי תת-המיקוד וההגדלה נשארים עקביים במיקומים המקומיים בתמונות שנאספו.

במחקר זה התמקדנו בהקמת תהליך קריו-ET איכותי המשתמש באפופריטין כדגם לדוגמה. מכיוון שמערכת מיקרוסקופ אלקטרונים בהספק 200 קילוואט אינה מורשית לתוכנת טומוגרפיה מסחרית, התקנו וכיילנו במקום זאת את פלטפורמת SerialEM בקוד פתוח. על ידי אופטימיזציה זהירה של פרמטרי הקרן המקבילית למערכת עדשות המעבה הדו-שלבית של המיקרוסקופ, השגנו איסוף אוטומטי של נתוני טומוגרפיה דרך ממשק הגרפי SerialEM – ללא צורך בסקריפטים של פייתון או תצורה מורכבת. גישה זו מספקת פתרון ידידותי וחסכוני לרכישת נתוני קריו-ET יעילה על מכשירים של 200 קילו-וולט כמו Glacios.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה וטעינת דגימות קריו-

  1. כדי להכין את ה-Vitrobot, הפעל אותו והגדר את הטמפרטורה ל-10 מעלות צלזיוס. כוון את הלחות ל-100%. החלף את נייר הסינון.
  2. הניחו רשת פחמן עם 300 רשתות R1.2/1.3 עם חורים בצורת סרטי פחמן כמותיים במערכת פריקת הזוהר. הגדר את תנאי פריקת הזוהר ל-15 mA למשך 60 שניות עם לחץ ואקום של 0.39 mBar, מטען שלילי. בצע את פריקת הזוהר כדי להידרופיליזציה של משטח הרשת.
  3. הגדר את פרמטרי ה-Vitrobot כך: זמן כיתה: 3 שניות, זמן המתנה: 0 שניות, כוח הכתמה: 2, טמפרטורה: 8 מעלות צלזיוס, לחות: 90%.
  4. הכינו אתאן נוזלי בכוס אתאן עטופה בחנקן נוזלי על ידי קירור עם חנקן נוזלי.
  5. יש להניח 3 מיקרוליטר דגימת אפופריטין על רשת הזוהר. מיד זגג את הדגימה באתאן נוזלי
  6. העבר את הדגימה מהאתאן לתיבת אחסון מקוררת מראש בחנקן נוזלי. הכנת דגימת הקריו הושלמה כעת.
    אזהרה: יש להקפיד על פרוטוקולי הבטיחות הבאים בעת טיפול בחנקן נוזלי ואתאן: ציוד מגן אישי (כגון כפפות קריוגניות ומשקפי מגן בטיחות) נדרש למניעת כוויות קור במהלך הפעולה; לפני עיבוי אתאן, ודא שכוס הקבלה נקייה מחנקן נוזלי כדי למנוע התזות הנגרמות מהרתחת מהירה; לאחר השימוש, לסגור היטב את השסתומים הראשיים והשסתומי ויסות הלחץ של מערכת גז האתאן כדי למנוע דליפה; שאריות אתאן וחנקן נוזלי חייבות להיות מושלכות בציוד אוורור ייעודי בחדר ההכנה לאחר הכנת הדגימה.

2. קביעת תנאי האור המקבילים למיקרוסקופ אלקטרונים

  1. לפני ביצוע יישור קרן מקביל, כוונן תחילה את הפרמטרים הבאים של הטווח: שלב בגובה אאוצנטרי, עדשת אובייקטיב בפוקוס, הטיית קרן nP ppX/ppY, נקודת ציר X/Y ללא תרדמת, קומה, וסטיגמה.
  2. באמצעות רשת רוחבית, יש לוודא שהדגימה נמצאת בגובה אאוצנטרי ומיקוד נכון בהגדלה של SA 73,000× (ללא מסנן אנרגיה) במצב ננו פרוב.
  3. עברו למצב דיפרקציה (אורך מצלמה: D750 מ"מ) והכניסו את צמצם המטרה של 100 מיקרון (איור 1A, 1B).
  4. לחצו על לשונית Adjust עבור פתח המטרה והשתמשו בכפתורי X ו-Y הרב-תכליתיים כדי להזיז את צמצם המטרה מהמרכז כך שקצה הצמצם יחפה על טבעות הדיפרקציה הזהובות ויחסום חלקית את הנקודה המרכזית (איור 1C).
  5. הביאו את מישור המוקד האחורי של עדשת האובייקטיב לתמונה על ידי כוונון מיקוד הדיפרקציה באמצעות כפתור המיקוד עד שקצה הצמצם האובייקטיבי יהיה חד ככל האפשר (איור 1D).
  6. כוונן את עוצמת הקרן (עוצמת C2) עד שרוחב טבעות הדיפרקציה הזהב מצטמצם.
  7. מרכז את הצמצם המטרה. הגדל את אורך מצלמת הדיפרקציה עד שרק הנקודה המרכזית נראית (איור 1E).
  8. לחצו על לשונית הדיפרקציה בלוח הסטיגמטור והשתמשו בכפתורי X ו-Y הרב-תכליתיים כדי לכוון את צורת הנקודה המרכזית תוך כדי מחזור מעל ומתחת לנקודת החצייה כדי להפוך את הקרן למעגלית (איור 1F).
  9. כוון את עוצמת הקרן עד שהנקודה המרכזית מצטמצמת. זה ייצור תנאי תאורה מקבילים. מכיוון שתנאי תאורה מקבילה עשויים להשתנות בהתאם לגדלי נקודות שונים, יש לתעד את הגדרות ה-C2 המתאימות לכל גודל נקודה נפוץ כדי לאפשר תצורה מהירה בניסויים עתידיים.
    הערה: גודל הנקודה הספציפי המשמש במהלך איסוף הנתונים תלוי בהגדלה ובהגדרת צמצם C2; אנחנו צריכים לוודא שהדימות מתבצע בקצב המינון האופטימלי למצלמה.

3. איסוף נתוני טומוגרפיה אלקטרונית איכותית לדגימות אפופריטין

הערה: סעיף זה מפרט הליך סטנדרטי לאיסוף נתוני טומוגרפיה בקצב גבוה, המתאים הן למשתמשים מנוסים והן לחוקרים חדשים.

  1. כדי לחבר את הרשת ולטעון את דגימת הקריו המוכנה למיקרוסקופ האלקטרונים, הניחו את טבעת ה-O בכלי היישור, כאשר הרשת המוכנה ממוקמת במרכז טבעת ה-O. השתמש בעט הקפיץ כדי לחבר את טבעת ה-C לטבעת ה-O, ולמקבע את הדגימה ביניהם.
  2. הכנס את האוטוגריד אנכית לחריץ של הקסטה, העבר אותו לננו-קאפ דרך תחנת העבודה, ואז טען אותו למיקרוסקופ האלקטרונים.
  3. כדי ללכוד מונטאז' מלא של כל הרשת באמצעות SerialEM, השיק את תוכנת SerialEM. הפעל את מצב המינון הנמוך. הגדר את מצב החיפוש בהגדלה של 115×.
    הערה: ההגדלה של החיפוש משמשת בדרך כלל לרכישת מפות בשטח גדול. ההגדלה הזו מכוונת לנמוך ככל האפשר כדי להאיץ את תהליך המיפוי, תוך שמירה על דיוק התפירה בתמונה.
  4. פתח את קובץ הנווט. עבור ל-Navigator > מונטאז' ורשתות > להגדיר את המונטאז' המלא. בתיבת הדו-שיח, הגדר שימוש במצב חיפוש; שמור תמונות בפורמט bin4. לחץ על Start תחת בקרות מונטאז'.
  5. כדי לכייל את שדות החיפוש והצפייה, במצב החיפוש, אתר נקודת ציון מוכרת מאוד (איור 2A). לחץ על 'הוסף סימן' בניווט. לחץ על Go to Marker כדי לעבור למיקום הסמן.
  6. עבור למצב תצוגה (2600×) ומצא את אותו סימן דרך. לחץ על הציון ההיסטורי. עבור ל-Navigator, לחץ על Shift to Marker כדי ליישר את השדות (איור 2B). בהתאם להוראות בתיבת הדו-שיח, הזזות הקרן משני ההגדלות מוקצות לכל הסימנים במפת החיפוש, וערכי ההזזה נשמרים (איור 2C).
    הערה: הגדלת התצוגה מוגדרת בדרך כלל להגדלה הנמוכה ביותר של האזור הנבחר (SA) כדי להבטיח שגם התצוגה וגם הרשומה יהיו באותו מצב, מה שמקל על תהליך המרכז במהלך החלפת ההגדלה.
  7. לכייל את שדות התצוגה וההקלטה (איור 3). במצב תצוגה, אתר אתר ציון דרך מוכר מאוד. עבור למצב תקליט (120k×). השתמש בעכבר כדי למרכז את הסימן במצב הקלטה.
    הערה: הגדרת ההגדלה של Record תלויה ברזולוציה המשוערת של היעד (כאשר רזולוציית היעד כפולה מגודל הפיקסל) ובגודל הדגימה.
  8. חזור למצב תצוגה וצלם תמונה. גרור את אובייקט המטרה תחת הגדלת התצוגה אל הכוונת המייצגת את מרכז שדה הראייה באמצעות כפתור העכבר הימני.
  9. לחץ על Set ליד Shift בחלק של Defocus כדי ליישר את השדות.
  10. כדי לבחור את ריבוע היעד וללכוד מפה בהגדלה בינונית , 5.1 במונטאז' המלא, לחץ על Add Polygon כדי לתאר את האזור שיש ללכוד. לאחר שמתארים אזור, לחצו על עצור הוספה כדי לסיים את הבחירה.
  11. חזור על שלב 3.10 לכל האזורים הרצויים. לכל פוליגון ב-Navigator, בדוק את אפשרויות Acquire (A) ו-New File at Item.
  12. בתיבת הדו-שיח שמופיעה לאחר סימון New File at Item, בחר את הדברים הבאים: תמונות מונטאז'; מונטאז' התאמה לפוליגון; סגור את הקובץ כשיש לפתוח את הקובץ החדש הבא. לחץ אוקיי.
  13. בתיבת הדו-שיח החדשה, בחר את הדברים הבאים: הזז שלב במקום להזיז תמונה; השתמש בפרמטרי View במצב מינון נמוך. שמור את התמונה במקום שצוין.
  14. כדי ללכוד את המפה בהגדלה בינונית, בתפריט הנווט, לחץ על רכישה בפריטים. בדוק את האפשרויות הבאות: רכוש ושמור תמונה או מונטאז'; תעשה מפת נווט.
  15. בסעיף 'פעולה ראשית', בדוק 'השתמש במצב תצוגה' ללכידת תמונות. בחלק המשימות לפני או אחרי היסודי, בדוק את Eucentricity גס. לחץ על GO כדי להתחיל לצלם את מפת ההגדלה הבינוכית.
  16. כדי לבחור נקודות במפת ההגדלה הבינוני. פתח את מפת ההגדלה הבינונית בממשק של Navigator. לחץ על 'הוסף נקודה' ולחץ שמאלי על אובייקטי היעד במפה.
  17. חזור על זה לכל הנקודות הרצויות. לאחר בחירת כל הנקודות, לחץ על עצור הוסף כדי לסיים את הבחירה.
  18. ליישור הצמצם, השתמשו ביישור ישיר בממשק המיקרוסקופ כדי לכוון את נטיית הקרן nP ppX/ppY ואת נקודת הציר X/Y ללא קומה, כדי למזער את רעידת נקודות הקרן בשדה הראייה.
  19. בצע Tune Scope באמצעות סקריפט מספריית הסקריפטים SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
  20. כדי להתחיל איסוף נתוני טומוגרפיה, בממשק Navigator, אתר את ה-ROI ובדוק את סדרת הטיה. בתיבת הדו-שיח, בחר תמונות מסגרות; בחר את מיקום אחסון הנתונים.
  21. בדיאלוג ההגדרות, הגדר טווח מעלות בין -50° ל-50°. הגדר את תוספת הבסיס ל-2.5°, זווית התחלה ל-0°, והפעל סכמת דוז-סימטרית.
    הערה: הגדרות המינון לכל הטיה, טווח זווית ההטיה ושלב ההטיה בדרך כלל פועלות לפי העקרונות המפורטים להלן: המינון הכולל נשמר בכ-100 e⁻/Ų. טווח ההטיה נבחר כדי להבטיח שגם בזווית ההטיה הגבוהה ביותר, הדגימה תישאר ברובה ללא הפרעה ותאפשר העברת אלקטרונים והדמיה מספקת. אם טווח ההטיה גדול יחסית (למשל, מעבר ל-±60°), ניתן להגדיר את שלב ההטיה ל-3°. לטווח הטיה קטן יותר (למשל, סביב ±50°), ניתן להפחית את שלב ההטיה ל-2.5° או 2° כדי להבטיח שהמינון הכולל יישאר סביב 100 e⁻/Ų. זה חשוב במיוחד במיקרוסקופים של 200 קילו-וולט, שבהם נזקי הקרינה בולטים יותר בהשוואה למיקרוסקופים של 300 קילו-וולט, ולכן חשוב להימנע ממינון כולל מופרז.
  22. בחלק עוצמת הקרן או בקרת החשיפה, בדוק שמור על עוצמת הקרן. הגדר את מטרת הדפוקוס ל-3- מיקרון וקבע את תדר המיקוד האוטומטי לפעם אחת בכל הטיה.
  23. בדוק עצור אם Autoalign מזיז יותר מ-60% מגודל התמונה, הגדר Track לפני ואחרי.
  24. כדי להתחיל באיסוף נתונים, ב-Navigator, לחץ על רכישה ב-Items. בפעולה הראשית, בדוק את מחזור המטרה בפוקוס אוטומטי, המתנה לדריפט ו-TS.
  25. הגדר את טווח הדפוקוס בין -3.5 ל-4.5- מיקרון, ב-4 שלבים. תחת General, הפעל סגירת שסתומי עמודה בקצה. בחלק המשימות לפני או אחרי הראשי, הפעל Realign לפריט ו-Fine Eucentricity לפני Primary.

4. ממוצע סאבטומוגרפי של אפופריטין

  1. בצע תיקון תנועה והערכת CTF באמצעות Warp19. בצע יישור טומוגרפי בסדרת הטיה באמצעות AreTomo320.
  2. בצע שחזור טומוגרפי ודקונבולוציה באמצעות Warp. בצע בחירת חלקיקים מבוססת תבנית באמצעות PyTom21.
  3. בצע שיפור ראשוני באמצעות RELION5 22. לבצע שיפור ברזולוציה גבוהה באמצעות M23.
  4. קבעו את המבנה הסופי על ידי עיבוד שמונה סדרות הטיה, ואחריהן בחירת 5,939 חלקיקים וזיקוק איטרטיבי, ולהשיג רזולוציה סופית של 2.8 Å (איור 4).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר יישור מדויק של קרן מקבילית, ביצענו איסוף נתוני טומוגרפיה לאפופריטין באמצעות פונקציית הממשק הגרפי של SerialEM. עיבוד מאוחר יותר עם Warp, AreTomo, PyTom, RELION ותוכנות רלוונטיות נוספות הניב מבנה סופי ברזולוציה של 2.8 Å. רזולוציה זו מדגימה היטב את איכות הנתונים שלנו, ומגיעה לרמה שניתן להשיג כיום באמצעות תת-טומוגרפיה בממוצע ברזולוציה יחסית גבוהה. כפי שמוצג באיור 4, התוצאות המיושרות והמשוחזרות (איור 4A) מדגימות בבירור את הארכיטקטורה הכוללת וההתפלגות המרחבית של אפופריטין. ממוצע תת-טומוגרפי בוצע על חלקיקים שהופקו משמונה סדרות הטיה מיושרות ומשוחזרות, והניב מבנה ברזולוציה של 2.8 Å (איור 4B). עקומת הקורלציה של קליפת פורייה (FSC) המתאימה מוצגת באיור 4C.

figure-results-1
איור 1: קביעת תנאי תאורה מקבילה באמצעות מערכת עדשת המעבה השנייה. (א) דפוס דיפרקציה במצב דיפרקציה ללא צמצם. (B) דפוס דיפרקציה לאחר הכנסת צמצם אובייקטיבי של 100 מיקרון. (ג) הסטת הצמצם ממרכז הדיפרקציה כדי לדמיין טוב יותר את חדות הקצוות. (ד) קצה הצמצם הממוקד וטבעות דיפרקציה אופטימליות על ידי התאמת זרמי המטרה וזרמי העדשה C2. (ה) נקודת דיפרקציה מרכזית אליפטית הדורשת תיקון באמצעות לוח הסטיגמטור. (ו) נקודת דיפרקציה מרכזית מעגלית ומזעורית המצביעה על תאורה מקבילה אופטימלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: תהליך יישור הגדלה גבוהה לנמוכה מחיפוש (115×) ל-View (2600×). (א) תמונת מצב חיפוש עם הסמן (חץ אדום) ממוקם בקצה החור. (B) תמונת מצב צפייה עם הסמן (החץ האדום) ממוקם באותו מיקום אובייקט כמו ב-(A). אפשרות Shift to Marker נלחצת בניווט. (C) בחלון הקופץ, הזזות הקרן משני ההגדלות מוקצות לכל הסימנים במפת החיפוש, וערכי ההזזה נשמרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: תהליך יישור הגדלה גבוהה לנמוכה מ-View (2600×) ועד Record (120k×). (A) במצב Record, אובייקט המטרה ממוקם במרכז שדה הראייה (עיגול אדום מקוקו מדגיש את אובייקט המטרה). (B) תמונה שצולמה במצב תצוגה, שבו אובייקט המטרה אינו מיושר עם כוונת האדום (עיגול אדום מקוקו מדגיש את אובייקט המטרה ואת הכוונת האדומה). (ג) האובייקט המטרה נגרר למרכז הכוונת האדומה על ידי לחיצה ימנית ותזוזה, ואחר כך לחיצה על כפתור ההגדרה הממוקם ליד כפתור הזזה (התיבה המקוופסת באדום מדגישה את הכפתור). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: קביעת מבנה של אפופריטין. (א) הדמיה מבנית. מפת רזולוציה מקומית של ממוצע התת-טומוגרפיה הסופי. המרקם נראה אחיד, עם תכונות ננומטריות מסודרות וחוזרות על פני כל שדה הראייה. (B) מיפוי כמותי מפותח מרחבית. מפה מעגלית בצבע שגוי של אותו אזור ננו-מבנה או אזור ננו-מבני קשור. הצבעים נעים מכחול/ירוק לצהוב/אדום, התואמים לערכים מספריים המוצגים בסולם הצבעים למטה (בערך 2.5 עד 3.5 ביחידות שרירותיות). התפלגות הצבעים ההטרוגנית מצביעה על שונות מרחבית בתכונה הנמדדת (למשל, גובה, עובי, מקדם שבירה או תגובה מכנית/אופטית) לאורך הדגימה. (ג) אפיון ספקטרלי או פונקציונלי גלובלי. עקומת קורלציה של קליפה פורייה (FSC) משמשת להערכת רזולוציה. הרזולוציה הסופית של 2.8 Å מסומנת על ידי הקו המקווקו ב-FSC = 0.143. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש להתאים את ההליכים להכנת דגימת קריו ואיסוף נתוני טומוגרפיית אלקטרונים לסוג הדגימה הספציפי. האסטרטגיה הניסויית המתוארת כאן מתאימה היטב למקרומולקולות ביולוגיות, קומפלקסים חלבונים ואברונים קטנים. דגימות אלו ניתנות לוויטריציה ישירה לרשתות אלקטרומגנטיות, ועוביהן הקטן יחסית מבטיח העברת אלקטרונים יעילה ורכישת תמונות בעלות ניגודיות גבוהה. באופן אידיאלי, עובי הדגימה לא צריך לעלות על 200 ננומטר.

בדגימות קפואה, ממד רוחבי של פחות מ-10 מיקרון מועדף בדרך כלל כדי למזער את היווצרות הקרח הגבישי, מה שעלול לפגוע בשלמות המבנה. בדגימות גדולות יותר, הקפאה בלחץ גבוה או הכללת מגן קירור, כגון גליצרול, בבופר עלולה לעכב את יצירת גרעין הקרח23. עם זאת, כדי לעמוד בדרישות העובי של TEM, לעיתים קרובות יש צורך בדילול נוסף. מבין גישות הדילול הזמינות, כריזת קרן יונים ממוקדת (FIB)24היא הפופולרית ביותר בשל דיוק ונזק מינימלי שלה, ומייצרת למלות המתאימות לקריו-ET ברזולוציה גבוהה.

במהלך איסוף נתוני למלה, חשוב למקסם את השימוש בלמלה. יישום רכישת הזזת קרן-תמונה יכול להפחית את הצורך במיקוד חוזר ובשלבי מעקב, ובכך להגדיל את קצב איסוף הנתונים. למרות שלא תוארה כאן בפירוט, טכניקה זו תוארה בהרחבה במתודולוגיית PACEtomo.

כיום, אפשרויות תוכנה פופולריות לאיסוף נתוני טומוגרפיה כוללות את טומוגרפיה (Thermo Fisher Scientific) ו-SerialEM. טומוגרפיה היא פתרון מסחרי עם גמישות מוגבלת בהתאמה אישית, בעוד ש-SerialEM, שפותח על ידי דיוויד מסטרונרד מאוניברסיטת קולורדו בולדר, הוא תוכנה בקוד פתוח התומכת באוטומציה מבוססת סקריפטים. עם זאת, ניצול מלא של יכולות SerialEM דורש עקומת למידה משמעותית. במחקר זה, אנו מציגים תהליך עבודה יעיל שמנצל את ממשק המשתמש של SerialEM, ומבטל את הצורך בסקריפטינג או תצורות מבוססות פייתון, תוך אפשרות רכישת נתונים ללא השגחה במהלך הלילה.

אתגר נפוץ במהלך איסוף נתוני טומוגרפיה בשיטה זו הוא מעקב לא מדויק, שעלול להוביל לסדרות הטיה לא שלמות עם זוויות חסרות או לסבך את היישור הבא. כדי להקל על בעיות אלו, יש לייעל את פרמטרי המעקב בהתבסס על ניגודיות הדגימה ויציבות שלב ההטיה. אסטרטגיות יעילות כוללות התאמת זמן החשיפה במיקומי מעקב כדי להבטיח בהירות תמונה, הפרדה פיזית בין מיקומי המעקב והמיקוד להפחתת נזק קרינה מצטבר, והפחתת הגדלת המעקב כאשר יציבות השלב לקויה כדי לאפשר התאמת דפוסים אמינה. ביחד, התאמות אלו חיוניות להשגת ביצועי מעקב חזקים בתנאי ניסוי מגוונים. בעבודה זו אנו משתמשים באפופריטין כדגם לדוגמה. בהנחה של בדיקת ותיקון אור מקביל, אנו משתמשים בפונקציות המובנות של SerialEM לאיסוף נתונים איכותיים עבור קריו-ET וביצוע חישובי תת-טומוגרמה על דגימות הפריטין, ובסופו של דבר מגיעים למבנה הסופי ב-2.8 Å.

שיטה זו פותחה כדי להרחיב את היישום של מיקרוסקופים אלקטרוניים של 200 קילו-וולט עבור קריו-ET ברזולוציה גבוהה. השגת רזולוציה כזו תלויה בעיקר בקבלת נתוני הדמיה איכותיים, אשר דורשים תנאי תאורה מדויקים. לשם כך, ביצענו יישור תאורה מקבילה מדויק כשלב הכנה קריטי. הליך היישור המתואר כאן תוכנן במיוחד עבור TEMs המצוידים במערכת עדשות דו-מעבה, כמו Thermo Fisher Scientific Talos Arctica ו-Glacios. בניגוד למכשירים עם עדשת מעבה שלישית (C3), מערכות אלו מגבילות את תנאי התאורה המקבילה לערך עירור ספציפי אחד של עדשת C2. מגבלה זו מחייבת יישור מדויק במיוחד של קרן האלקטרונים כדי למקם את תמונת המקור במישור המוקד הקדמי של עדשת האובייקטיב העליון – תנאי מוקדם לביצועי דימות מיטביים. תוצאות עיבוד הנתונים שלנו לאחר מכן מראות כי, לאחר יישור זה, איכות איסוף הנתונים שהושגה עם מיקרוסקופ 200 קילו-וולט עבור הדגימות שנבדקו כמעט דומה לזו שמצופה בדרך כלל ממכשיר של 300 קילו-וולט.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקן Cryo-EM במרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת פקין על מתן המכשירים. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית הלאומית של סין (2023YFC2705902), הקרן הלאומית למדעי הטבע של רפואת סין (32470880, 32500722 ו-32500737), קרן המדע הטבעי של בייג'ינג (7262143), פרויקטים קליניים מרכזיים של בית החולים השלישי של אוניברסיטת פקין (BYSYZD2023033), פרויקט Clinical Medicine Plus X-Young Scholars, אוניברסיטת פקינג (PKU2025PKULCXQ037), והמרכז הלאומי למחקר קליני למיילדות וגינקולוגיה (Peking University Third בית חולים (BYSYSZKF2023019).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
רשת ANTCryoTM nitiנאג'ינגדינגשין M04240922Aהמשמש להכנת דגימות קריוגרפיות
אפופריטיןביורטוסBP17854-00Aהמשמש להכנת דגימות קריוגרפיות
רשת רוחביתאגר סיינטיפיקAGS106משמש לקביעת תנאי האור המקבילים
גלסיוס2תרמו פישר9959084משמש לאיסוף נתוני טומו
נייר פילטר מספר 2, 55 מ"מווטמן10311807נייר הכתמה
פלקו זוהרטד פלה91000-01020משמש לפריקת זוהר
רשת Cu קוונטי-פילקוונטיפוילN1-C14nCu30-01המשמש להכנת דגימות קריוגרפיות
ויטרובוט מארק IV תרמו פישר230101164המשמש להכנת דגימות קריוגרפיות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, W., Chai, P., Zhu, J., Zhang, K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 631 (8019), 232-239 (2024).
  2. Wang, C., et al. Structure and topography of the synaptic V-ATPase-synaptophysin complex. Nature. 631 (8022), 899-904 (2024).
  3. Mühleip, A., et al. ATP synthase hexamer assemblies shape cristae of Toxoplasma mitochondria. Nat Commun. 12 (1), 120(2021).
  4. Mühleip, A., et al. Structural basis of mitochondrial membrane bending by the I-II-III2-IV2 supercomplex. Nature. 615 (7954), 934-938 (2023).
  5. Huang, Y., Zhang, Y., Ni, T. Towards in situ high-resolution imaging of viruses and macromolecular complexes using cryo-electron tomography. J Str Biol. 215 (3), 108000(2023).
  6. Yao, H., et al. Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus. Cell. 183 (3), 730-738.e13 (2020).
  7. Schuller, A. P., et al. The cellular environment shapes the nuclear pore complex architecture. Nature. 598 (7882), 667-671 (2021).
  8. Cheng, A., et al. High-resolution single-particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. J Struct Biol. 204 (2), 270-275 (2018).
  9. Xu, J., et al. In situ structural insights into the excitation-contraction coupling mechanism of skeletal muscle. Sci Adv. 10 (12), eadl1126(2024).
  10. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma FIB milling. NatComm. 15 (1), 2660(2024).
  11. Mastronarde, D. N. SerialEM: Software for automated microscopy (Version 4.0). , University of Colorado Boulder. https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ (2020).
  12. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152, 36-51 (2005).
  13. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microsc Microanal. 9 (S2), 1182CD(2003).
  14. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Meth. 20 (1), 131-138 (2023).
  15. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  16. Li, S., et al. Acidic pH-Induced Conformations and LAMP1 Binding of the Lassa Virus Glycoprotein Spike. PLoS Pathog. 12 (2), e1005418(2016).
  17. Eyidi, D., Hebert, C., Schattschneider, P. Short note on parallel illumination in the TEM. Ultramicroscopy. 106, 1144-1149 (2006).
  18. Glaeser, R. M., Typke, D., Tiemeijer, P. C., Pulokas, J., Cheng, A. Precise beam-tilt alignment and collimation are required to minimize the phase error associated with coma in high-resolution cryo-EM. J Struct Biol. 174, 1-10 (2011).
  19. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Meth. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  20. Zheng, S., et al. AreTomo: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  21. Hrabe, T., et al. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J Struct Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
  22. Burt, A., et al. An image processing pipeline for electron cryo-tomography in RELION-5. FEBS Open Bio. 14 (11), 1788-1804 (2024).
  23. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Meth. 18 (2), 186-193 (2021).
  24. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyTomographic Data CollectionTransmission Electron MicroscopeDual Condenser LensSerialEM SoftwareCryo Sample PreparationTomogram ReconstructionSub Tomogram AnalysisApoferritin ModelHigh Resolution Imaging

Related Articles