מאמר שיטה

הליך גמיש לביצוע טלומרים FISH ואימונופלואורסצנציה בתאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים

DOI:

10.3791/68977

⸱

5 בספטמבר 2025

 , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב טלומרים FISH (מקורי או דנטורינג) עם אימונופלואורסצנציה ו/או הדמיה של חלבון פלואורסצנטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית טלומרים באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה (TelFISH) היא כבר מזמן כלי חיוני בניסויים בביולוגיה של טלומרים. שילוב של TelFISH עם אימונופלואורסצנציה (IF) הוא גם שיטה מבוססת היטב (IF-TelFISH), למשל, בזיהוי מוקדים המושרים על ידי תפקוד לקוי של טלומרים, שבהם טלומרים מתמקמים יחד עם 53BP1. לאחרונה, טלומרים מקומיים FISH (nTelFISH) הפכו לכלי חשוב לבדיקת הארכה אלטרנטיבית של טלומרים, מנגנון תחזוקת טלומרים המשמש בחלק מתאי הגידול. ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים הוא גם כלי חיוני בביולוגיה של התא, המאפשר הדמיה של חלבונים ומבנים שעשויים להישאר בלתי ניתנים לזיהוי בשיטות אחרות. מכיוון ש-FISH חוצץ חלבונים, ביצוע הבדיקה בתאים עם חלבון פלואורסצנטי מבוטא (FP) מביא לאובדן אות FP. מתוארת כאן שיטה לשילוב IF וטלומר FISH בתאים עם חלבון פלואורסצנטי מבוטא המשמר את אות ה-FP גם לאחר FISH. ניתנות חלופות לדנטורציה ולדגי טלומר מקומיים בשילוב עם מספר תרחישי IF ו-FP. יחד, פרוטוקול זה מציע מסגרת גמישה לחקר הביולוגיה של הטלומרים בתאים נורמליים ובתאי גידול כאחד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגניזמים עם כרומוזומים ליניאריים צריכים להתמודד עם שתי בעיות. ראשית, בשל בעיית השכפול הסופי, קצות הכרומוזומים נשחקים מעט בכל פעם שה-DNA משוכפל. שנית, תאים חייבים להיות מסוגלים להבחין בין קצוות DNA טבעיים לבין שברי DNA. טלומרים התפתחו כפתרון לבעיות אלה. באמצעות פעולת הריבונוקלאופרוטאין טלומראז, הכרומוזומים מתארכים על ידי הוספת חזרות טנדם קצרות-TTAGGG בבני אדם. חזרות אלה קשורות על ידי קומפלקס המקלטין, המסתיר את קצה הכרומוזום ממנגנון תיקון נזק ל-DNA תאי1. טלומרים קצרים או לא מתפקדים מובילים להזדקנות תאית ולפנוטיפים מזדקנים2, בעוד שבריחה ממשבר הטלומרים היא אבן דרך מרכזית בגידול3. מסיבות אלה, לביולוגיה של הטלומרים יש עניין מיוחד בהבנת בריאות האדם ומחלותיו.

הכלאה פלואורסצנטית של טלומרים (FISH) היא כבר מזמן שיטה חשובה להדמיית טלומרים בתאים בין-פאזיים או בהתפשטות מטפאזה4. במשך עשרות שנים, טלומרים FISH חוברו לצביעה אימונופלואורסצנטית 53BP1 (IF) כדי לזהות מוקדים המושרים על ידי תפקוד לקוי של טלומרים (TIFs), סמן של טלומרים לא מתפקדיםולא מכוסים 5,6. באופן דומה, סימן היכר של גידולים המשתמשים בהארכה אלטרנטיבית של טלומרים (ALT) לתחזוקת טלומרים הוא הקשר של טלומרים עם גופי PML גרעיניים ליצירת גופי PML הקשורים ל-ALT או APBs7. ניתן לבחון APBs על ידי זיווג טלומר FISH עם צביעת PML IF. לפיכך, IF-FISH הוא כלי מבוסס היטב בביולוגיה של טלומרים.

כאן, השימוש ב-IF-FISH הורחב בשתי דרכים. ראשית, IF-FISH מבוצע על תאים עם חלבונים פלואורסצנטיים מבוטאים (FP). הביטוי של חלבונים המתויגים פלואורסצנטית הפך לכלי נפוץ בביולוגיה של התא. ביטוי חלבון מתויג עשוי להיות האפשרות היחידה להמחשת חלבון שאין לו נוגדנים טובים. לדוגמה, כרומוגוף האקטין הגרעיני המתויג ב-GFP (NAC-GFP) חושף דינמיקת אקטין גרעינית8. מגיב זה פתח הזדמנויות חדשות בחקר ה-f-actin הגרעיני, שנחשב בעבר לנושא שנוי במחלוקת. בעוד ש-FPs כמו GFP ו-mCherry בדרך כלל שומרים על פעילות פלואורסצנטית לאחר קיבוע, הפורממיד במאגרי הכלאה של FISH יהפוך אותם לכהים9. כדי לעקוף בעיה זו, פרוטוקול זה מציע את החידוש של "מאיץ" אנטי-FP מתויג פלואורופור בשלב המשני של צביעת IF. בהירות הפלואורופור אינה מושפעת מפורממיד, מה שמאפשר IF-FP-FISH.

שנית, IF מבוצע בשילוב עם Native Telomere FISH (nTelFISH), אבחנה חשובה לסטטוס ALT. בדנטורציה של FISH, יש להשתמש בשיטה כלשהי כדי להמיס את גדילי ה-DNA10 (למשל, חום או אלקלי), מה שמאפשר גישה לבדיקה ל-DNA שהוא בדרך כלל דו-גדילי. לעומת זאת, FISH מקומי אינו כולל שלב דנטורציה, כך שהגשושית יכולה לגשת רק ל-DNA שכבר חד-גדילי. טלומר מקומי FISH מזהה באופן ספציפי חזרות טלומרים חד-גדיליים של גדיל C, סימן היכר נוסף של ALT בתאי גידול11,12. צימוד בדיקה זו עם צביעת IF-FP מאפשר לנו לענות על שאלות חדשות בהבנת המנגנון של ALT, הנחשב כיום למועמד חזק לטיפולים ממוקדים בגידול.

ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן בסגנון "בחר את ההרפתקה שלך" כדי להכתים כל שילוב של IF, FP ו-FISH טלומר מקומי או דנטור. מכיוון שהפרוטוקול ניתן להגדרה גבוהה, התזמון יכול להשתנות באופן מהותי. באופן כללי, נדרש זמן מעשי בארבעה ימים, אך ייתכן שהימים הללו אינם רצופים. הערכות הזמן הנדרש להשלמת זרימת עבודה טיפוסית של FISH ניתנות באיור 1. אין צורך להכליא דגים מקומיים בן לילה, כך שאפשר לבטל צעד לילה (שילוב של יום 2 ויום 3) אם יום ארוך על הספסל אפשרי.

מיקרוסקופ קונפוקלי טיפוסי יכיל הדמיה של ארבעה ערוצי צבע: באופן גס, כחול, ירוק, אדום ואדום רחוק. ארבע דוגמאות לשילובים פוטנציאליים של ארבעה צבעים מודגמות, אך התמורות הפוטנציאליות הן אינסופיות. ניתן להשתמש בשני נוגדני IF או בשני FPs מבוטאים בהצלחה שווה. הפרוטוקול פשוט וחזק. כל נוגדן שמייצר תוצאות IF טובות בעצמו מתאים. בעוד שרק בדיקות טלומרים עבור FISH כלולות כאן, דנטורציה של FISH עם בדיקה צנטרומר מניבה גם תוצאות טובות. לפיכך, פרוטוקול זה מציע מידה רחבה של גמישות לענות על שאלות חשובות בביולוגיה גרעינית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני שמתחילים, שקול את המיקרוסקופ, את קו התאים המבטא FP ואת הבדיקות והנוגדנים הזמינים. כחול משמש בדרך כלל לכתם DNA כגון DAPI, מכיוון שפלואורופורים כחולים בדרך כלל אינם בהירים. ניתן להשתמש בנוגדנים משניים כחולים במידת הצורך. אם התאים מבטאים GFP, ניתן להשתמש בבדיקת FISH המתויגת בפלואורופור אדום יחד עם נוגדן משני ל-IF המתויג ב-AF-647. לחלופין, עבור הדמיית תאים המבטאים mCherry, ניתן לבחור נוגדן משני IF המתויג ב-AF-488 ובדיקת FISH המסומנת ב-AF-647. דוגמאות לארבעה שילובים אפשריים של IF-FP-FISH מוצגות באיור 2, והן נועדו לשמש כמדריך לעידוד גמישות תכנון ניסוי. חשוב לבחור בדגים מקומיים או דנטורים, מכיוון שלא ניתן לשלב שיטות אלה. שיטה אמינה לכיסויי שטיפת חומצה כדי לאפשר היצמדות לתאים, כלולה כאן. ניתן להשלים זאת בכל עת לפני השימוש, וניתן לאחסן תלושי כיסוי סטריליים ללא הגבלת זמן. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. שטיפת חומצה של כיסויים

הערה: יש לנקות כיסויי זכוכית ולשטוף אותם בחומצה כדי לאפשר לתאים מתורבתים להידבק. לגידול בלוחות 12 בארות, כיסויים עגולים בגודל 18 מ"מ הם אידיאליים. התייעץ עם מתקן ליבת המיקרוסקופיה כדי לקבוע אם עדיפים כיסויים #1 או #1.5. הזמנים המוצהרים לניקוי כיסויים אינם קריטיים, אך אינם מתעכבים על שטיפת החומצה.

  1. השתמש במלקחיים להחלקה (איור 3A) כדי למקם כיסויים במתלים כך שמשטחיהם לא ייגעו. הנח החלקות כיסוי נוספות באלכסון כדי להגדיל את הקיבולת במידת הצורך (איור 3B). הכנס מספר מתלים בנוחות לתוך כלי הצביעה (איור 3C).
  2. מלאו את כלי המכתים במים וכמות קטנה של חומר ניקוי. הורד בעדינות את המדפים עם הכיסויים לתוך הצלחת.
  3. מערבבים את הכיסויים במי הסבון למשך 30 דקות באמצעות נדנדה או נוטר.
  4. הרם את מדפי הכיסויים מהכלי המכתים. השלך את מי הסבון.
  5. שוטפים את הכלי המכתים וממלאים במים נטולי יונים. החזירו את מדפי הכיסויים למים הנקיים והניחו על נדנדה כדי לערבב בעדינות למשך 5 דקות.
  6. חזור על השטיפה עם שתי החלפות נוספות של מים נקיים נטולי יונים, בסך הכל שלוש שטיפות.
  7. הרם את מדפי הכיסויים מהכלי המכתים. מוסיפים 1 N HCl לתבשיל.
    זהירות: HCl הוא קאוסטי. טפל במכסה אדים והשתמש בציוד מגן אישי. הורד בזהירות את הכיסויים המתלים לתמיסת החומצה. ודא שה-1 N HCl מכסה במלואו את החלקות הכיסוי. הניחו את המכסה על כלי המכתים.
  8. הנח את צלחת הצביעה המכילה את הכיסויים ותמיסת החומצה למיכל של סוניקטור אמבטיה. סוניקאט למשך 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
  9. השאירו את הכיסויים באמבט החומצה למשך הלילה.
  10. הסר בזהירות את מדפי הכיסוי מכלי הצביעה למחרת. השלך את ה-1 N HCl בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים.
  11. שוטפים את כלי המכתים וממלאים אותו במים נטולי יונים. החזירו את מדפי הכיסויים למים הנקיים והניחו על נדנדה כדי לערבב בעדינות למשך 5 דקות.
  12. חזור על השטיפה עם שתי החלפות נוספות של מים נקיים נטולי יונים, בסך הכל שלוש שטיפות.
  13. הרם את מדפי הכיסויים מהכלי המכתים. רוקנו את המנה ומלאו אותה באתנול 70%. מחזירים את מדפי הכיסויים לתבשיל ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות.
  14. הרם את מדפי הכיסויים מהכלי המכתים. רוקנו את המנה ומלאו אותה באתנול 100%. מחזירים את מדפי הכיסויים לתבשיל ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות.
  15. קח את המנה עם 100% אתנול והכיסויים למכסה המנוע של תרבית רקמות. במכסה המנוע, הסר את מדפי הכיסויים מהכלי ואפשר להם להתייבש באוויר.
  16. רוקנו את המנה והחזירו אליה את מדפי הכיסויים. יש לאחסן עם מכסה פתוח כדי לשמור על סטריליות. צלחת הצביעה אינה אטומה; אם הכיסויים נשארים באתנול, הוא יתאדה בסופו של דבר. הכיסויים יישארו שמישים.

2. ציפוי תאים על כיסויים

הערה: טיפול בתלושי כיסוי דורש תרגול. קל יותר להתחיל עם צלחת 6 בארות עד לביטחון. בעת שימוש בצלחת 6 בארות, הכפילו את נפחי הכביסה הניתנים לצלחות 12 בארות.

  1. תרבית תאים בריאים וגדלים המבטאים את החלבון המעניין המתויג ב-GFP או mCherry (מספר FPs אדומים או ירוקים מתאימים; ראה הערות בטבלת החומרים). תאי אוסטאוסרקומה U2OS, המשתמשים ב-ALT לתחזוקת טלומרים, משמשים בדוגמאות המוצגות.
    1. השתמש בתאים או בשורות תאים שעברו טרנספטציה ארעית עם ביטוי FP יציב. אם הניסוי דורש טיפול תרופתי או טרנספקציה, שקול את המפגש הרצוי בקיבוע (בדרך כלל 70%-80%), משך הטיפול וקצב גדילת התאים כדי לחשב את מספר התאים המתאים לצלחת לכל כיסוי.
  2. הכן כיסויים במכסה המנוע של תרבית הרקמות כדי לשמור על סטריליות. לכל באר של צלחת 12 בארות, הוסף 1 מ"ל PBS סטרילי. בעזרת מלקחיים לכיסוי, הניחו כיסוי אחד נקי ושטוף חומצה בכל באר. מערבבים בעדינות ביד למשך מספר שניות.
  3. שאפו PBS. הוסף 1 מ"ל PBS סטרילי טרי לבאר. הניחו את הצלחת בצד.
  4. (אופציונלי) כיסויי מעיל עם פיברונקטין כדי לשפר את הידבקות התאים. קווי תאים דבקים רבים ידבקו היטב לכיסויים שטופים בחומצה כאשר הם מצופים לפחות 18 שעות לפני הקיבוע. אם התאים אינם נדבקים היטב או דורשים קיבוע זמן קצר לאחר הציפוי, כיסויי המעיל מתקבלים כדי לקדם הידבקות.
    1. הכן תמיסה של 5 מיקרוגרם/מ"ל של פיברונקטין ב-PBS סטרילי.
    2. שאפו PBS מהכיסויים. יש למרוח בעדינות כ-300 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין על כל החלקת כיסוי, וליצור טיפה המוחזקת על ידי מתח פנים.
    3. יש לדגור במשך מספר שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. יש לשטוף מספר פעמים עם PBS, להחזיק את הכיסויים בהחלפה סופית של PBS. הניחו את הצלחת בצד בזמן הכנת התאים.
    5. אם פיברונקטין אינו מתאים, שקלו חלופות לפולי-L-ליזין, קולגן או ג'לטין.
  5. טריפסיניזציה של תאים ודילול מספר מתאים ב-12 מ"ל של מדיום תרבית בהתבסס על תכנון ניסיוני וצפיפות תאים רצויה בעת הקיבוע.
  6. שאפו PBS מהחלקות הכיסוי והוסיפו 1 מ"ל של מתלה התאים לכל באר.
  7. מניחים את התאים בחממה.
  8. טפל בתאים כנדרש עם תרופות, siRNAs או ריאגנטים אחרים בהתאם לתכנון הניסוי. צמח למפגש הרצוי.

3. מכתים IF-FP

הערה: לאורך כל הפרוטוקול, אל תתנו לכיסויים להתייבש. רצוי לזרוק פיפטה ביד אחת ולשאוב תמיסות ביד השנייה כך שהכיסויים יהיו מחוץ לתמיסה כמה שפחות זמן. פתרונות פיפטה בעדינות כנגד דופן הבאר, לא ישירות על הכיסוי. כיסוי הידית מחליק בחוזקה אך בעדינות בעזרת מלקחיים. קל לשבור כיסוי על ידי אחיזה בו בכוח רב מדי. בהתחלה, תכנן תלושי כיסוי כפולים במקרה של שבירה. עם ניסיון, כיסויים שבורים הופכים לתופעה נדירה. לא ניתן להרים כיסויים מבאר יבשה. יש לכסות את הכיסויים במאגר כדי לאסוף אותם.

  1. הסר מדיה ותקן תאים באמצעות הקיבוע הנבחר. אין צורך בשטיפת תאים לפני קיבוע. השתמש ב -1 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות או 2 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות.
    1. אפשרות 1: השתמש בפורמלדהיד 4% ב-PBS.
      זהירות: פורמלדהיד רעיל. יש לטפל בכפפות ולהשליך כראוי. הכן טרי באמצעות פורמלדהיד ללא מתנול 16% ומלאי PBS פי 10. יש לתקן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. אפשרות 2: השתמש בפורמלדהיד 4% במאגר שלד תא עם סוכרוז (CBS).
      הערה: מאגר זה מועדף לשימור מבנה השלד הציטו-שלד13. ל-CBS יש ריכוז סופי של 10 מ"מ MES pH 6.1, 138 מ"מ KCl, 3 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ EGTA ו-0.32 מ' סוכרוז. להכנת קיבוע, הכינו מלאי CBS 2x עם 20 מ"מ MES pH 6.1, 276 מ"מ KCl, 6 מ"מ MgCl2, 4 מ"מ EGTA. הכינו מלאי סוכרוז נפרד של 1.28 מ '. אחסן את שני המלאי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לקיבוע עבודה טרי, מערבבים נפח אחד של פורמלדהיד ללא מתנול 16%, מלאי סוכרוז בנפח אחד ו-2 כרכים מלאי CBS פי 2. יש לתקן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. אפשרות 3: תקן עם מתנול של -20 מעלות צלזיוס. מומלץ למטרות נוגדנים של חומצות גרעין (למשל, ssDNA, G-quadruplexes, היברידיות RNA-DNA). יש לקבע למשך 5 דקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. לשאוף מקבע ולהיפטר בהתאם למדיניות המוסדית.
  3. שטפו את הכיסויים מספר פעמים עם PBS.
    1. נקודת עצירה: ניתן לאחסן תלושי כיסוי קבועים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עם אובדן אות מינימלי. לאחסון ארוך יותר, יש לייבש ל-100% אתנול (2 דקות ב-70% אתנול, 2 דקות ב-90% אתנול, לאחסן ב-100% אתנול), לאטום את הצלחת בסרט מעבדה ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן את הכיסויים בדרך זו במשך שבועות עד חודשים. כאשר מוכנים להכתים, החזירו לחות לכיסויים (2 דקות ב-90% אתנול, 2 דקות ב-70% אתנול, 15 דקות ב-PBS) והמשיכו לשלב הבא.
  4. חדירה לכיסויים ב-0.5% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בצע שלב זה בצלחת.
  5. שטפו את הכיסויים מספר פעמים עם PBS.
  6. הכן את החדר הלח (איור 3D). הניחו מגבות נייר לחות בתחתית החדר. כדי ליצור תמיכה למכתים, סמן את החלק העליון של מכסה מצלחת בת 12 בארות כך שיתאים לכיסויים.
    1. כסו את המכסה בסרט מעבדה כך שהתוויות יישארו גלויות. ודא שהתא אטום לאור עם מכסה צמוד. מכסים בנייר כסף במידת הצורך (איור 3E).
  7. טיפות של 75 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל RNase A ב-PBS על התמיכה המסומנת. הרם בעדינות כל כיסוי וטפח את הקצה על רקמת המעבדה כדי להסיר עודפי חיץ. הפוך את הכיסוי על טיפות RNase A (צד התא כלפי מטה). הנח את התמיכה בתא הלח וסגור את המכסה. יש לדגור במשך 45 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  8. הוסף PBS טרי לצלחת 12 הבארות. החזר את הכיסויים לצלחת, צד התא כלפי מעלה. שוטפים מספר פעמים עם PBS.
  9. יש לחסום למשך 30 דקות או יותר בטמפרטורת החדר. נגב את תמיסת RNase מהתמיכה המכוסה בסרט. פיפטה 75 מיקרוליטר מטפטפת 20% סרום חמור ב-PBS על הסרט. הפוך את החלקות הכיסוי על המאגר החוסם (צד התא כלפי מטה).
  10. הכן את הנוגדן הראשוני.
    1. השתמש ב-75 מיקרוליטר לכל כיסוי. הכן 10% תוספת כדי לאפשר שגיאת פיפטינג.
    2. יש לדלל את הנוגדן בסרום חמור 5%. קבע דילול נוגדנים באופן אמפירי. דילול של 1:100 הוא נקודת התחלה סבירה.
    3. בזמן החסימה, הכינו תמיכה נוספת עם תווית לדגירת נוגדנים ראשונית. מכסים את המכסה בניילון ומורחים טיפות של 75 מיקרוליטר של הנוגדן המדולל בנקודות המיועדות לכך.
  11. בסוף שלב החסימה, העבירו את הכיסויים לטיפות הנוגדנים (צד התא כלפי מטה). הנח את התמיכה בתא הלח, סגור את המכסה ודגר לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  12. הוסף PBS טרי לצלחת 12 הבארות. החזר את הכיסויים לצלחת, צד התא כלפי מעלה. יש לשטוף ב- PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
  13. במהלך הכביסה האחרונה, הכינו נוגדנים משניים.
    1. השתמש ב-75 מיקרוליטר לכל כיסוי. הכן 10% תוספת כדי לאפשר שגיאת פיפטינג.
    2. דילול של 1:400 מומלץ עבור נוגדנים משניים פלואורסצנטיים ונוגדני מאיץ GFP/RFP. התאם לפי הצורך על סמך הניסיון עם המטרה.
    3. לדלל נוגדנים משניים בסרום חמור 5%. מרחו טיפות של 75 מיקרוליטר על הנקודות המתאימות על התמיכה המסומנת בתווית.
  14. לאחר הכביסה, העבירו את הכיסויים לטיפות הנוגדנים המשניות (צד התא כלפי מטה). יש לדגור לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלח האטום.
  15. הוסף PBS טרי לצלחת 12 הבארות. החזר את הכיסויים לצלחת, צד התא כלפי מעלה. יש לשטוף ב- PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה.

4. תיקון מחדש והתייבשות

  1. הכן פורמלדהיד 4% ב- PBS בטמפרטורת החדר לקיבוע מחדש. השתמש בפורמלדהיד לשלב זה, גם אם נעשה שימוש במתנול לקיבוע הראשוני. הסר את שטיפת ה- PBS הסופית ותקן מחדש את התאים למשך 15 דקות עם נדנדה עדינה.
  2. שאפו את הקיבעון והשליכו אותו בהתאם למדיניות המוסדית.
  3. שוטפים את הכיסויים מספר פעמים עם PBS.
  4. יש לייבש את הכיסויים ולייבש באוויר כדי להתכונן להיברידיזציה:
    1. דגירה ב 70% אתנול למשך 2 דקות.
    2. דגירה באתנול 90% למשך 2 דקות.
    3. דגירה ב-100% אתנול למשך 2 דקות.
    4. לאחר 100% אתנול, הנח את הכיסויים עם צד התא כלפי מעלה על נייר סינון מסומן כדי לשמור על כיוון. הניחו להם להתייבש לחלוטין באוויר בזמן הכנת בדיקת ה-FISH.

5. דגים (אפשרות 1): דנטורציה של דגים

  1. הכן שני תומכי נייר כסף (ראה איור 3F).
    1. מקפלים חתיכת נייר אלומיניום לרבעים ליצירת ארבע שכבות. ודא שהצד העמום פונה כלפי חוץ.
    2. חתוך את נייר הכסף המקופל כך שיתאים למכסה של צלחת 12 בארות. בעזרת מגבון מעבדה, שפשפו את נייר הכסף על החלק הפנימי של המכסה כך שרכסי המכסה יבלטו תבנית על נייר הכסף. זה ייצור רכסים המונעים מהכיסויים להחליק זה לזה במהלך השלבים הבאים.
    3. הכן שני תומכים כאלה. הם עשויים להימחק ולעשות בהם שימוש חוזר בניסויים מאוחרים יותר.
  2. לדלל את הגשושית של 10 מיקרומטר 1:50 במאגר הכלאה (70% פורממיד נטול יונים, 10 מ"מ טריס, pH 7.4, 0.5% 10× תמיסת חסימת רוש). השתמש ב-75 מיקרוליטר של בדיקה מדוללת זו לכל כיסוי והכן 10% נוספים כדי לפצות על אובדן פיפטינג. ריכוז הבדיקה הסופי צריך להיות 200 ננומטר.
  3. מחממים גוש חום ל 90 מעלות צלזיוס ותרמוסייקלר ל 85 מעלות צלזיוס.
  4. דנטורציה של הכיסויים: הנח את כיסויי הכיסוי המיובשים באוויר עם צד התא כלפי מעלה על אחד מתומכי נייר הכסף המוכנים. הניחו בעדינות את נייר הכסף על גוש התרמו-סייקלר וסגרו את המכסה. דגירה למשך 5 דקות לדנטורציה.
  5. במקביל, מחממים את הגשושית המדוללת בגוש החום בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  6. פיפטה 75 מיקרוליטר טיפות של הגשושית המפורקת על תומך נייר הכסף המוכן השני. ודא שהצד העמום של נייר הכסף פונה כלפי מעלה כדי לאפשר טיפות מעוצבות היטב. אם הצד המבריק כלפי מעלה, הגשושית תתפשט ותאבד מתח פנים.
  7. הפוך את הכיסויים המפורקים על טיפות הבדיקה, והנח אותם בצד התא כלפי מטה.
  8. העבירו את תמיכת נייר הכסף עם בדיקה וכיסוי לבלוק התרמו-סייקלר המוגדר ל-85 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 5 דקות. השתמש במרית כדי לסייע בהעברה. זז בזהירות כדי למנוע התנגשות או הזזה של החלקות הכיסוי.
  9. הזיזו את נייר הכסף בעזרת כיסויים ובדקו לתא לח. מכסים במכסה ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

6. דגים (אפשרות 2): דגים מקומיים

  1. יש לדלל את הגשושית של 10 מיקרומטר 1:200 במאגר הכלאה (70% פורממיד נטול יונים, 10 מ"מ טריס, pH 7.4, 0.5% 10× תמיסת חסימת רוש). ריכוז הבדיקה הסופי הוא 50 ננומטר. השתמש ב-75 מיקרוליטר לכל כיסוי והכן 10% נוספים כדי לאפשר שגיאת פיפטינג.
  2. מרחו טיפות של 75 מיקרוליטר של בדיקה מדוללת על הנקודות המיועדות על התמיכה המכוסה בסרט.
  3. הפוך את הכיסויים המפורקים על טיפות הבדיקה של 75 מיקרוליטר, והנח אותן בצד התא כלפי מטה.
  4. הנח את התמיכה בתא לח וסגור את המכסה. דוגרים לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להאריך את הדגירה למשך הלילה אם מעדיפים.

7. כביסה והרכבה

הערה: אמצעי ההרכבה האופטימלי תלוי בצמצם המספרי של מטרת המיקרוסקופ. התייעץ עם מתקן ליבת המיקרוסקופיה המקומי לקבלת המלצות. בחירה מתאימה אחת עשויה להיות ProLong Glass עם NucBlue, בעל מקדם שבירה של 1.52. עם זאת, אמצעי הרכבה חלופי עשוי להיות מתאים יותר בהתאם למיקרוסקופ בהישג יד.

  1. החזר את הכיסויים לצלחת 12 הבארות לכביסה. הפוך אותם כך שיהיו בצד התא כלפי מעלה.
  2. יש לשטוף 3× 10 דקות ב-70% פורממיד/10 מ"מ טריס, pH 7.5.
    זהירות: פורממיד רעיל; להיפטר ממנו בהתאם למדיניות המוסדית.
  3. שטיפה 3× 5 דקות ב-TNT (0.05 מ' טריס/0.15 מ' NaCl/0.05% טווין-20, pH 7.5).
  4. שוטפים מספר פעמים ב- PBS. אם כתם DNA אינו כלול במדיום ההרכבה, שקול להוסיף DAPI בכביסה הסופית. כדי להכתים עם DAPI, הוסף 300 ננומטר DAPI ל-PBS, החל על כיסויים ודגר למשך 5 דקות. השלך את פתרון ה-DAPI בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. הרכיבו כיסויים על מגלשות זכוכית באמצעות טיפה של מדיום הרכבה. הפוך את הכיסוי על הטיפה: צד התא כלפי מטה.
  6. אפשר למדיום ההרכבה להתרפא למשך הלילה לפני ההדמיה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות אופייניות מפרוטוקול זה מוצגות באיור 4. אם מבוצע כראוי, מורפולוגיה של התא תישמר היטב, והאותות הפלואורסצנטיים יהיו בהירים. דנטורציה של טלומרים FISH אמורה לחשוף דפוס של עשרות פונקטה בכל גרעין המייצג כל טלומר (ראה איור 4, דוגמאות 1 ו-2). מוקדי טלומר אמורים להיות נוכחים כמעט אך ורק בגרעין, אם כי לפעמים מתרחשת צביעת טלומרים ציטופלזמית, במיוחד בשורות תאי ALT. אותות הטלומרים המתקבלים נוטים להיות בהירים במיוחד, עד כדי כך שיש לנקוט בזהירות כדי למנוע דימום אותות טלומרים לערוצי זיהוי אחרים. בשורות תאי ALT, טלומרים מתקבצים לעתים קרובות בגופי PML14, וכתוצאה מכך פחות מוקדים ממה שהיה צפוי בדרך כלל. ניתן לראות את ההתקבצות הזו באיור 4, דוגמה 2.

בקווי תאים המשתמשים ב-ALT לתחזוקת טלומרים, טלומר מקומי FISH מזהה את ה-ssDNA הטלומרי שהוא סימן ההיכר של ALT11,12. לא צפוי שלכל גרעין יהיה ssDNA של טלומר, וגם לא שיותר ממספר קטן של פונקטה יהיה נוכח בגרעין יחיד (ראו איור 4, דוגמאות 3 ו-4). אות FISH של טלומר מקומי לא יהיה בהיר כמו דנטורציה של טלומרים FISH. קו תאי האוסטאוסרקומה U2OS הוא בקרה חיובית טובה עבור FISH מקומי. טלומרים ssDNA לא צפוי להיצפה בשורות תאים עם טלומרים המתוחזקים על ידי טלומראז.

הן עבור דנטורציה והן עבור FISH מקומי, פלואורסצנציה גרעינית חזקה היא מלאכותית. אם נצפה אות גרעיני מוגזם, נסה להשתמש בתמיסה טרייה של RNase A, או להאריך את הטיפול ב-RNase A15 (שלב פרוטוקול 3.8). עבור ניסויי FISH טלומרים מקוריים המשתמשים בתאים עם סטטוס ALT לא ידוע, נעשה שימוש בקו תאי ALT חיובי כגון U2OS לכיול הגדרות הזיהוי.

ניתן להשוות בקלות תצפיות של FPs בניסויי IF-FP-FISH עם ניסויי הדמיה של תאים חיים לצורך אימות. אם נצפים אי התאמות, נסה תנאי קיבוע משתנים. קיבוע במאגר CSB (פרוטוקול שלב 3.1.2) עשוי להועיל לשימור מבנים תאיים, ולחשוף לוקליזציה מדויקת יותר של FP13.

צביעה אימונופלואורסצנטית משתנה מאוד בהתאם לחלבון המבוקש. יש להשוות את תוצאות IF לדגימות שהוכנו ללא FISH כדי להעריך את ההשפעה של פרוטוקול FISH על הלוקליזציה והעוצמה של החלבון המבוקש. באופן כללי, ניסויי IF-FP-FISH מתאימים לספירת מוקדים, אך העוצמות עשויות שלא להיות כמותיות6.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה לדוגמה עם משכי זמן משוערים. ייתכן שיידרש יום נוסף אם דגירה ראשונית של נוגדנים מבוצעת במהלך הלילה. במקרה של FISH מקומי, ימים 2 ו-3 משולבים לפעמים, אם כי זה מביא לזמן ספסל ממושך. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דוגמאות לשילובים ניסיוניים מוצלחים ששימשו עם הדמיה בארבעה צבעים. דוגמאות 1 ו-2 מדגימות דנטורציה של טלומרים FISH, בעוד ש-3 ו-4 משתמשות ב-FISH מקומי. שימו לב שפרוטוקול זה שימושי בין אם צביעה חיסונית של שני חלבוני מטרה (דוגמה 1), שילוב של צביעת FP אחת וצביעה אחת של IF (דוגמאות 2 ו-4), או שני FPs (דוגמה 3). תוצאות מייצגות עבור ניסויים אלה ניתנות באיור 4. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ציוד המשמש בפרוטוקול זה. (א) מלקחיים עם כיסוי. בעוד שניתן להשתמש במלקחיים ישרים לטיפול בהחלקות כיסוי, מלקחיים זוויתיים הופכים את המשימה להרבה יותר קלה. (ב) כיסויים לכביסה. שימו לב שבנוסף למתלים ישר לרוחב, החלקות כיסוי מוטות גם בזווית בין חריצים סמוכים כדי להגדיל את הקיבולת. (ג) ארבעה מדפים של כיסויים בכלי מכתים. צלחת כתמים מזכוכית מכילה עשרות כיסויים מתלים ואטומה לשטיפת חומצת HCl. (ד) תא לחות מוכן. החלק החיצוני מכוסה בנייר כסף כדי ליצור סביבה חשוכה, המשמרת את הפלואורופורים. מגבות נייר לחות בתחתית מספקות לחות. (ה) תא הלחות האטום. מכסה הדוק חיוני למניעת התייבשות. (F) הכנת תמיכת רדיד האלומיניום. הבלטת רכסים על נייר הכסף הגזום עוזרת למנוע מהכיסויים להחליק זה לתוך זה במהלך שלב הדנטורציה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תוצאות מייצגות של ניסויי הדמיה בארבעה ערוצים, כולל IF, FISH ו-FPs מבוטאים. לוחות מתארים את התוצאות האמיתיות של הניסויים המתוארים באיור 2. DAPI מכתים DNA, nAC-GFP מדגיש f-actin גרעיני, TelFISH ו-TRF2-mCherry מסמנים טלומרים מסמנים, PML מסמן צביעה חיסונית של גופי PML גרעיניים, ו-nTelFISH חושף ssDNA טלומרי. כל התאים הם תאי אוסטאוסרקומה U2OS. התמונות נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי עם יכולת סופר-רזולוציה. תמונות דוגמה 1 נרכשו במיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר; כל שאר התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנית. כל פסי הסולם מייצגים 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים המשתמשים ב-IF-FISH היו זה מכבר עמוד תווך בתחום הטלומרים כמבחן למתח טלומרים או זיהוי ALT 5,6,16. כאן, הפרוטוקול מורחב כך שיכלול חלבון פלואורסצנטי. בנוסף, האפשרות של דגי טלומר מקומיים מוצעת כבדיקת ALT אורתוגונלית11. פרוטוקול זה פשוט לביצוע ומפיק תוצאות משביעות רצון באופן מהימן.

על ידי פעולה על תלושי כיסוי עם טיפות נוגדנים או בדיקות PNA, פרוטוקול זה נועד להיות חסכן. שימוש בטיפות משמר ריאגנטים יקרי ערך. לעומת זאת, חלופות כמו מגלשות תא הן יקרות ומציעות פחות גמישות. בעוד שטיפול בתלושי כיסוי דורש תרגול כדי לפתח מיומנות, החיסכון בעלויות הופך את ההשקעה בזמן לכדאית. יש לציין כי טיפות ריאגנט גדולות מ-75 מיקרוליטר אינן מומלצות. טיפות גדולות יותר פשוט גורמות להחלקות הכיסוי ואינן משפרות את התוצאות.

הביטוי של nAC-GFP הוא כלי הכרחי להדמיה של f-actin8 גרעיני, כפי שניתן לראות באיור 4. קיימים ריאגנטים מתויגים רבים אחרים שעשויים לעזור לענות על שאלות ביולוגיות חשובות. לדוגמה, ניתן להשתמש במערכת הפלסמיד FUCCI כדי להמחיש את מחזור התא, ובאמצעות פרוטוקול זה ניתן לשלב עם טלומר FISH17. גישה אחרת לבדיקת מחזור התא עשויה להשתמש בכרומוגוף PCNA כדי לקבל מידע על מחזור התא18. בהתאם לשאלה הנשאלת, ריאגנטים רבים מתויגים-FP זמינים מסחרית.

כאן, פרוטוקול זה מודגם עם טלומר FISH, אך תוצאות מוצלחות הושגו גם עם צנטרומר FISH, תוך שימוש בבדיקת PNA באותו ריכוז. אפשר להכפיל בדיקה צנטרומרית עם תווית FAM עם בדיקת טלומר עם תווית Cy3, למשל. חשוב להדגיש כי סביר להניח שהפרוטוקול לא יעבוד עם DNA FISH עם לוקוס יחיד. לצורך בדיקת לוקוס בודד, יש צורך בעיכול פרוטאז של הדגימה, ועיכול זה אינו תואם בבירור לזיהוי IF או FP19. עם זאת, הושגה הצלחה בשילוב IF ו-mRNA FISH עם גישה דומה; ברור שיש להשמיט את שלב הטיפול ב-RNase בתרחיש זה.

לבסוף, ברור כי דגי טלומר מקומיים הופכים במהירות לבדיקה חיונית לסטטוס ALT20,21. בניגוד לבדיקת מעגל C עבור ALT, המבוססת על אוכלוסייה22, טלומרים מקומיים FISH מספקים קריאת ALT ברמה התאית, ומאפשרים זיהוי רגיש של שינויים בדינמיקת ALT. על ידי איחוד דגי טלומר מקוריים עם ביטוי IF ו-FP, ניתן לחשוף תובנות חשובות לגבי מנגנון ה-ALT. עם הזמן, אנו מקווים שתובנות אלה יובילו לטיפולים ממוקדים לגידולים המסתמכים על ALT לתחזוקת הטלומרים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, תוכנית המחקר התוך-מוראלי של המכונים הלאומיים לבריאות מספר פרויקט ZIA BC 011091. תרומותיהם של מחברי ה-NIH נעשו כחלק מחובותיהם הרשמיות כעובדים פדרליים של ה-NIH, תואמות לדרישות מדיניות הסוכנות ונחשבות ליצירות של ממשלת ארצות הברית. עם זאת, הממצאים והמסקנות המוצגים במאמר זה הם של המחברים ואינם משקפים בהכרח את העמדות של ה-NIH או של משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב. אנו מודים למעבדת Lazzerini Denchi על פרוטוקול ה-FISH המקומי של הטלומרים ועל הדיונים הפוריים. מיקרוסקופיה בוצעה בליבת המיקרוסקופיה NCI CCR.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% Tween-20ביו-ראד1610781השלך אם התמיסה מעוננת.
10x PBSג'יבקו70011044להכנת מאגרים קיבועיים ואחרים השתמש לאחר קיבוע
צלחות תרבית תאים 12 בארותנונק150628
16% פורמלדהיד ללא מתנולתרמו סיינטיפיק28908
5 M נתרן כלורימיליפור סיגמאS6546
תאים נצמדים, למשל תאי אוסטאוסרקומה U2OSATCCHTB-96
קופסה אטומה לתא לחותמפאל106415032500כל קופסה אטומה מתאימה תעבוד, אך היזהרו מקופסאות עם תחתית לא אחידה.
אלקונוקסמיליפור סיגמאZ742914
רדיד אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-100
מדיום תרבית תאים מתאים, למשל McCoy's 5Aג'יבקו16600082עבור U2OS, הוסף 15% FBS
בדיקת צנטרומר (FAM)PNA ביוF3001מספר פלואורופורים זמינים
פלסמיד אקטין-כרומוגוף גרעיני של ChromoTek (TagGFP)פרוטאינטקא.ק.ג.נ
מלקחי כיסויכלים מדעיים עדינים11251-33
מתלים לכיסוימיליפור סיגמאZ688568
DAPIInvitrogenD21490אופציונלי, למקרה שאמצעי ההרכבה אינו מכיל כתם DNA
סרום חמוריםג'קסון אימונו-מחקר017-000-121
א.ג.ט.א.ביו-וורלד40520008תמיסה 0.5 מ 'pH 8.0
אתנולוורנר-גרהאם200 הוכחה
סרום בקר עובריג'יבקוA5670801
פיברונקטיןמיליפור סיגמאF0635לציפוי אופציונלי של כיסויים
פורממידמיליפור סיגמא47671-250 מ"ל-פ
כיסויי זכוכית גרמנייםוורנר אינסומנטס64-0714CS-18R15 (עובי #1.5, ודא שזה מתאים למיקרוסקופ שלך)
מאיץ GFPפרוטאינטקgb2AF488מזהה GFP/mClover/YFP/ונוס ואחרים.  עיין במידע על המוצר לקבלת רשימה מקיפה
צלחת ויטראז' זכוכית עם מכסהמיליפור סיגמא900203
מנקה אולטראסוני מחומם עם טיימר דיגיטליברנסוןCPX-952-218Rדגם סוניקטור אמבטיה זה כולל חום אך אין לו כוח או עוצמה הניתנים להגדרה.
חומצה הידרוכלוריתמיליפור סיגמא258148HCl מרוכז הוא 12 N.  הוסף 20 מ"ל HCl מרוכז ל-220 מ"ל מים נטולי יונים עבור 1 N HCl
תמיסת מגנזיום כלורידמיליפור סיגמא63069פתרון של 1 מ'
MESמיליפור סיגמא475893
מתנולמיליפור סיגמא179337
פרפילםארה"ב סיינטיפיק3023-4526
אשלגן כלורימיליפור סיגמאעמ' 9541
נוגדן ראשוני  עכבר אנטי-PMLסנטה קרוזSC-377390
נוגדן ראשוני  ארנב אנטי-53BP1נובוסNB100-904
נוגדן ראשוני  ארנב נגד PMLאבקלונליא1184
זכוכית מאריכה עם NucBlueInvitrogenעמ' 36981
מאיץ RFPפרוטאינטקrb2AF568מזהה mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  עיין במידע על המוצר לקבלת רשימה מקיפה
RNAse אמיליפור סיגמאRNASEA-RO
פתרון חסימת רושמיליפור סיגמא11096176001
נוגדן משני למשל AF488 נגד עכברInvitrogen  א-11001או דומה
נוגדן משני למשל AF594 נגד ארנבInvitrogenא-11012או דומה
נוגדן משני למשל AF647 נגד עכברInvitrogenא-21235או דומה
מריתפישר סיינטיפיק10257402
PBS סטריליג'יבקו14190144להכנת כיסויים
סוכרוזמיליפור סיגמאS0389
בדיקת TelC (Cy3)PNA ביוF1002מספר פלואורופורים זמינים
בדיקה TelG (AF647)PNA ביוF1014מספר פלואורופורים זמינים
בסיס טריסמיליפור סיגמא648311הכן תמיסה של 1 M במים, התאם את ה-pH באמצעות HCl
טריטון X-100מיליפור סיגמאX100
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםג'יבקו25200072
מיקרוסקופ Zeiss Elyraצייסאו דומה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denchi, E. L., De Lange, T. Protection of telomeres through independent control of ATM and ATR by TRF2 and POT1. Nature. 448 (7157), 1068-1071 (2007).
  2. Rossiello, F., Jurk, D., Passos, J. F., Di Fagagna D'adda, F. Telomere dysfunction in ageing and age-related diseases. Nat Cell Biol. 24 (2), 135-147 (2022).
  3. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  4. Meyne, J., Ratliff, R. L., Moyzis, R. K. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7049-7053 (1989).
  5. Takai, H., Smogorzewska, A., De Lange, T. DNA damage foci at dysfunctional telomeres. Curr Biol. 13 (17), 1549-1556 (2003).
  6. Herbig, U., Jobling, W. A., Chen, B. P., Chen, D. J., Sedivy, J. M. Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATMp53, and p21(CIP1), but not p16(INK4a). Mol Cell. 14 (4), 501-513 (2004).
  7. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Res. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  8. Plessner, M., Melak, M., Chinchilla, P., Baarlink, C., Grosse, R. Nuclear f-actin formation and reorganization upon cell spreading. J Biol Chem. 290 (18), 11209-11216 (2015).
  9. Oliva, A. A., Swann, J. W. Fluorescence in situ hybridization method for co-localization of mRNA and GEP. Biotechniques. 31 (1), 74-81 (2001).
  10. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 64 (2), 600-604 (1969).
  11. Azeroglu, B., Ozbun, L., Pegoraro, G., Lazzerini Denchi, E. Native FISH: A low- and high-throughput assay to analyze the alternative lengthening of telomere (ALT) pathway. Methods Cell Biol. 182, 265-284 (2024).
  12. Claude, E., et al. Detection of alternative lengthening of telomeres mechanism on tumor sections. Mol Biomed. 2 (1), 32(2021).
  13. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: Influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 695-705 (1981).
  14. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (37), 15726-15731 (2009).
  15. Pardue, M. L., Gerbi, S. A., Eckhardt, R. A., Gall, J. G. Cytological localization of DNA complementary to ribosomal RNA in polytene chromosomes of diptera. Chromosoma. 29 (3), 268-290 (1970).
  16. Mender, I., Shay, J. W. Telomere dysfunction induced foci (TIF) analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
  17. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  18. Burgess, A., Lorca, T., Castro, A. Quantitative live imaging of endogenous DNA replication in mammalian cells. PLoS One. 7 (9), e45726(2012).
  19. Trask, B., Pinkel, D. Fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Methods Cell Biol. 33, 383-400 (1990).
  20. Quintanilla, I., et al. Optical pooled screening for the discovery of regulators of the alternative lengthening of telomeres pathway. Methods. 241, 1-12 (2025).
  21. Azeroglu, B., et al. Identification of novel modulators of the ALT pathway through a native FISH-based optical screen. bioRxiv. , (2024).
  22. Henson, J. D., et al. The c-circle assay for alternative-lengthening-of-telomeres activity. Methods. 114, 74-84 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FISH

מאמרים קשורים