מאמר שיטה

ייצור מבוסס רקומבינר של וקטורים ויראליים מהונדסים למחקר וטיפול

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקומבינרינג, שיטת הנדסה גנטית בתיווך רקומבינציה, מאפשרת שינויים מדויקים בגנום הנגיפי מבלי להסתמך על עיכול אנזימטי. גישה זו חיונית למחקר בסיסי, כגון מחיקות ממוקדות, ולפיתוח וירוסים מהונדסים המשמשים בטיפולים אונקוליטיים, ריפוי גנטי וחיסונים גנטיים, ומרחיבה את האפשרויות הן במחקר והן ביישומים קליניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביקוש הגובר לווקטורים ויראליים מהונדסים במחקר בסיסי ותרגומי כאחד הדגיש את הצורך בשיטות גמישות, מהירות וניתנות להרחבה ליצירת נגיפי DNA רקומביננטיים. אסטרטגיות המסתמכות על עיכול וקשירה של אנזימי הגבלה מוגבלות על ידי מגבלות תלויות רצף ושלבי שיבוט גוזלי זמן. כאן, אנו מתארים את שיטת ההנדסה הגנטית בתיווך רקומבינציה (רקומבינריה) העוקפת את המגבלות הללו על ידי מתן אפשרות לשינויים מדויקים וחלקים של גנומים נגיפיים בכרומוזומים מלאכותיים של חיידקים (BACs). גישה זו מאפשרת מחיקה, הוספה או החלפה יעילה של אלמנטים גנטיים מקודדים או לא מקודדים, ומספקת פלטפורמה רבת עוצמה לפיתוח וקטור ויראלי בתפוקה גבוהה. רקומבינר הוא בעל ערך מיוחד ביישומי מחקר בסיסיים, כגון מחיקה או מוטציה של גנים נגיפיים כדי לחקור את תפקודם. חשוב מכך, מתודולוגיה זו מאפשרת ליצור עשרות וירוסים רקומביננטיים המקודדים מטענים חיסוניים או טיפוליים מובחנים במקביל, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד להערכה פרה-קלינית מהירה של מבנים חדשים. בעוד שטכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת לכל מטרה מדעית, מאמר זה מתמקד ביישום של רקומבינר בשני תחומים ספציפיים: יצירת וירוסים אונקוליטיים המבוססים על נגיף הרפס סימפלקס, ופיתוח וקטורים אדנו-ויראליים שאינם משכפלים להעברת גנים. לסיכום, רקומבינר מציע גישה רב-תכליתית להנדסת גנום ויראלי, ומאיץ משמעותית את הצינור מתכנון לבדיקות פונקציונליות. הרלוונטיות שלו משתרעת מווירולוגיה בסיסית ועד לרפואה תרגומית כדי לענות על צרכים מחקריים וקליניים מתפתחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורים נגיפיים התגלו ככלים רבי עוצמה בריפוי גנטי, וירותרפיה אונקוליטית ופיתוח חיסונים גנטיים בשל יכולתם הטבעית להעביר חומר גנטי לתאים מארחים. הם ממנפים את הטרופיזם הטבעי ומנגנוני ההתמרה של הנגיפים, ומאפשרים ביטוי גנים חולף וארוך טווח. הם מסוגלים לשרוד בסביבה החוץ-תאית, להיצמד לקולטן תאי ספציפי (המגדיר את הטרופיזם הנגיפי) ולקדם את הפנמתם, לחטוף את מנגנון ביטוי הגנים של התא המארח ולהניע את ביטוי הגנים שלהם, ולהתחמק מחיישנים הקשורים לממברנה ותוך תאיים של זרוע החיסון המולדת 1,2. באופן זה, לאחר זיהום ויראלי פרודוקטיבי, וירוסים הופכים תאים למפעלי צאצאים נגיפיים המפיצים נגיפים חדשים לאורגניזם, ובסופו של דבר גורמים למחלה.

וירוסים מסוג פרא יכולים להפוך לכלי ביוטכנולוגי על ידי הנדסה גנטית: ניתן לתמרן בקלות את הגנום שלהם כדי לשמור על יכולת ההתמרה ולהשיג תוצאה קלינית. בהתבסס על היישום הקליני שלהם, ניתן להנדס וקטורים ויראליים כך שישמרו (לפחות בחלקם) או יבוטלו ביכולת השכפול שלהם כדי ליצור וקטורים בעלי יכולת שכפול או חסרי יכולת שכפול 3,4.

וירוסים בעלי יכולת שכפול מיועדים בעיקר למטרות וירוסים אונקוליטיים. תאים סרטניים, שלעתים קרובות חסרים בהגנות אנטי-ויראליות1, מאפשרים שכפול של נגיפים רקומביננטיים מוחלשים שהונדסו באמצעות מחיקת גנים אלימים. נגיפים אלה משתכפלים באופן סלקטיבי בגידולים תוך שמירה על רקמות נורמליות. ככל שהבנת הווירולוגיה התקדמה, נגיפים מוחלשים הוחלפו על ידי שינויים גנומיים מדויקים יותר שנועדו לשפר הן את הבטיחות והן את היעילות הטיפולית.

בין תחומי העניין הדורשים הנדסה מולקולרית כירורגית של גנומים נגיפיים הם: 1) וירוסים אונקוליטיים מותנים בשכפול, שבהם מקדמים נגיפיים מוחלפים במקדמים הקשורים לגידול (מקדמים תאיים מתועתקים יתר על המידה בתאי גידול), ובכך מגבילים את ביטוי הגנים הנגיפי לתאים חולים5. ii) נגיפים עם טרופיזם שונה 6,7, שבהם ניתן לשנות או להחליף גליקופרוטאינים מעטפת הקובעים זיהום בשברי נוגדנים או ליגנדים המכוונים לחלבונים המתבטאים יתר על המידה בתאי הגידול 8,9. 3) וירוסים אונקוליטיים חמושים. מוות של תאי גידול הנגרם על ידי נגיפים אונקוליטיים גורם למוות תאי אימונוגני (ICD), המאופיין בשחרור מתווכים דלקתיים 1,10 ואנטיגנים של גידול 11. אותות אלה מקדמים זיהוי יעיל של אנטיגנים של גידול על ידי מערכת החיסון, משחזרים את המעקב12ומאפשרים שילוב עם מעכבי מחסום חיסוני 13,14,15 וטיפולים חיסוניים אחרים כגון טיפולים מבוססי RNA וחיסונים 16.

כדי לתמוך באפקט אימונותרפי זה, ניתן לקודד טרנסגנים מעניינים בתוך הגנום הנגיפי, ובכך לנצל את הנגיף לא רק לפעילותו האונקוליטית אלא גם להגביר את הפוטנציאל האימונותרפי שלו באמצעות ייצור במקום של מטענים רלוונטיים 3,7,17,18,19. מטענים אלה עשויים לכלול ציטוקינים, כימוקינים, נוגדנים, גנים מתאבדים ואנטיגנים 3,20. החדרה דורשת דיוק, כאשר אזורים בין-גניים של הגנום הנגיפי מועדפים כדי למזער את ההפרעה לגנים הנגיפיים ולשמר את השכפול והעוצמה7. לכן, טכניקות המאפשרות סינון הן של אתרי החדרה אופטימליים והן של טרנסגנים מעניינים הן חיוניות.

מצד שני, בהקשר של וירוסים שאינם משוכפלים, המשמשים לטיפול גנטי או ככלי לחיסונים גנטיים, חשוב שהווקטור הנגיפי יעביר את הטרנסגן (באופן זמני או ארוך טווח) מבלי להשתכפל לתא המארח כדי למנוע רעילות21. וקטורים אדנו-ויראלים מאופיינים ביעילות התמרה גבוהה, ביטוי חזק של טרנסגנים ויכולת להדביק תאים מתחלקים ולא מתחלקים3. תכונות אלה הפכו אותם לראשונים מסוגם לפיתוח חיסונים גנטיים, כולל אלה למחלות זיהומיות מתפתחות, כגון COVID-19, כמו גם טיפולים להחלפת גנים22. הדוגמה המפורסמת ביותר לווקטור אדנו-ויראלי שהגיע לשוק היא חיסון הקורונה של אוקספורד-אסטרהזניקה, הידוע בשם המסחרי Covishield או Vaxzevria, המבוסס על אדנו-וירוס שימפנזה שונה, ChAdOx1, המקודד לחלבון הספייק של SARS-CoV-2. כאשר הוא מוזרק בנתיב התוך שרירי, Covishield מסוגל לחדור לתוך התאים ולגרום לביטוי של חלבון הספייק, ומכין את מערכת החיסון להגיב נגדו3.

יש צורך ברור לשנות את הגנום הנגיפי מבלי להיות מוגבל על ידי אתרי זיהוי אנזימי הגבלה. מבין הנגיפים האונקוליטיים, וקטורים מבוססי וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) מציעים יתרונות ייחודיים, כולל יכולת ליטית, בטיחות וגודל גנום גדול, המאפשרים החדרה של טרנסגנים גדולים או אלמנטים גנטיים מרובים23,24. מעבר ל-HSV, נגיפים רבים אחרים מראים הבטחה טיפולית, כפי שנסקר לאחרונה ב-Sasso et al.3. במקום וקטור אוניברסלי "הטוב מסוגו", פלטפורמות ויראליות שונות מתאימות לצרכים טיפוליים מובהקים3. נכון לעכשיו, מערכות רקומבינציה הומולוגיות בחיידקים או שיבוט חיידקי שמרים היברידיים נותרו החלופות הנפוצות ביותר לאנזימי הגבלה, אך אלה הן מייגעות, רב-שלביות ולא יעילות25.

חלופה מתפתחת היא השימוש ב-CRISPR/Cas9, שיושם לאחרונה להנדסת גנומים של וירוסים, כולל וירוס החיסון (VV), וירוס הרפס סימפלקס ווקטורים אדנו-ויראליים. Cas9 פונה להשבתת גנים באמצעות מוטציות אינדל אך הופך פחות מעשי כאשר נדרשים חתכים מרובים כדי למחוק מקטעי גנום או להכניס טרנסגן באמצעות DNA תורם. יתר על כן, העריכה מוגבלת על ידי תכנון gRNA, השפעות מחוץ למטרה הן בגנום הנגיפי והן בגנום המארח, ותלות ברצפי PAM באזורים מעניינים25.

עם זאת בחשבון, ובאמצעות שתי דוגמאות המבוססות על HSV ואדנו-וירוס, מאמר זה ממחיש את שיטת הקומבינרינג, שניתן ליישם באופן נרחב - מווירוסים ועד בקטריופאג'ים, פלסמידים מורכבים ומערכות ניסוי מגוונות. רקומבינרינג (באנגלית: Recombineering) היא טכניקת הנדסה גנטית in vivo , המשמשת בעיקר ב-Escherichia coli, המנצלת חלבוני רקומבינציה בקטריופאג'ים תלויי טמפרטורה כדי לזרז רקומבינציה הומולוגית בין יסודות DNA עם הומולוגיה של עד 30 bp26. גישה זו מאפשרת הכנסה, מחיקה או שינוי מדויקים של רצפים ללא תלות באתרי הגבלה או בגודל ה-DNA. בכתב יד זה, אנו מתארים גרסה המבוססת על זן E. coli SW102 המעורר חום, אם כי זמינים גם זנים חלופיים עם מערכות השראה ספציפיות27.

רקומבינר מתחיל בהכנת תאי חיידקים בעלי יכולת חשמלית באמצעות הלם טמפרטורה מבוקר להפעלת מכונות רקומבינציה של פאג'ים. לאחר מכן מולקולות DNA הנושאות את זרועות ההומולוגיה המתאימות עוברות אלקטרופורציה. אלה עשויים להיות DNA דו-גדילי (dsDNA) שנוצר על ידי עיכול הגבלה או PCR או DNA חד-גדילי (ssDNAs) כגון אוליגונוקלאוטידים. נוכחותם של רצפים הומולוגיים יחד עם חלבוני רקומבינציה פעילים מאפשרת יצירת מולקולות DNA חדשות עם השינוי הרצוי.

טכנולוגיית שיבוט מולקולרי רקומבינרית מאפשרת הנדסה גנטית מדויקת ומיושמת בהקשרים מגוונים, כולל החדרת סמנים לבחירה או לא לבחירה בפלסמידים, DNA כרומוזומלי חיידקי וכרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BACs). BACs הם בעלי ערך מיוחד לשיבוט מקטעים גנומיים גדולים, כולל DNA אדנו-ויראלי ו-HSV, המאפשרים ייצור מהיר של וקטורים ויראליים. מעבר ליישומים תרגומיים, קומבינר תומך גם במחקר בסיסי על ידי מתן אפשרות למחיקה, שינוי או החלפה ממוקדים של גנים נגיפיים או תחומי חלבון. לרקומבינר יש כמה מגבלות: זרועות הומולוגיה קצרות מעכבות רקומבינציה באזורים שחוזרים על עצמם; מצעים מוגברים ב-PCR עשויים להציג מדי פעם מוטציות; ויש לדעת את הרצף של אזור המטרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתנאי מוקדם לשילוב מחדש, זן חיידקים מיומן (למשל, SW102) עם BAC-Genome of Interest חייב להיות זמין. אף על פי שרקומבינר הוא שיטה יעילה ביותר להעשרת מושבות שעברו את השינוי הרצוי, כאן אנו מתארים אסטרטגיית רקומבינר דו-שלבית, שנקראת השלב הראשון והשני (איור 1). בשלב הראשון, קלטת ביטוי המכילה סמני בחירה חיוביים ושליליים מוכנסת למוקד העניין. בשלב השני, קלטת זו מוחלפת בשינוי הגנטי הממשי המיועד לגנום הסופי. סמני הבחירה ששימשו במחקר זה כוללים עמידות לאמפיצילין (AmpR), פעילות בטא-גלקטוזידאז (β-gal) וגן sacB ; עם זאת, ניתן להשתמש בכל שילוב של סמני בחירה חיוביים ושליליים, בהתאם לצרכים הספציפיים של קבוצת המחקר.

1. הכנס את קלטת הבחירה באזור היעד

  1. יום 0
    1. פס תאי SW102 המכילים את ה-BAC הרצוי באנטיביוטיקה LB Agar + (שגן העמידות שלה נמצא ב-BAC (למשל, כלורמפניקול 12.5 מיקרוגרם/מ"ל). מגדלים אותם למשך הלילה בחממה בחום של 32 מעלות צלזיוס.
      הערה: הימנע מטמפרטורות > 32 מעלות צלזיוס כדי למנוע אינדוקציה של גנים משולבים בשלב זה.
  2. יום 1
    1. בצע PCR כדי להגביר את קלטת הבחירה AmpR/LacZ/SacB. השתמש בפריימרים קדימה ואחורה המכילים בקצה 3' את הרצף כדי לחשל ולהגביר את קלטת הבחירה ובקצה 5' 30-80 bp המייצגים זרועות הומולוגיה לאזור הגנומי הנגיפי שיש לשנות (טבלה 1).
      הערה: ניתן להזמין בקלות את קלטת הבחירה, כמו גם את התוספת, כמבנים סינתטיים מספקים מתמחים. עם זאת, יש לנקוט בזהירות כדי להימנע מנוכחות של מקדמים משוכפלים, טרמינטורים או אלמנטים גנטיים אחרים בתוך ה-BAC (הגנים השולטים ב-BAC) או בגנום הנגיפי כדי למנוע אירועי רקומבינציה לא רצויים.
    2. ודא זהות וטוהר של מקטע PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (מכיוון שקלטת AmpR/LacZ/SacB היא 3,400 bp, הפעל ג'ל אגרוז 1%) וכי ערכי 260/230 ו-260/280 תואמים לחומצת גרעין טהורה.
    3. אחר הצהריים, יש לחסן מושבה SW102 בודדת ל-5 מ"ל של LB ולדגור למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס.
  3. יום 2
    1. חסנו 1-2 מ"ל מתרבית הלילה ל-100 מ"ל טריים של LB. גדלו את החיידקים ל-OD600 של 0.55-0.7, מדדו את ה-OD600 באופן קבוע כדי לא לפספס את השלב האקספוננציאלי.
    2. הכינו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס לאינדוקציה וקררו ל-4 מעלות צלזיוס ~ 250 מ"ל של ddH2O סטרילי לשטיפות.
    3. לאחר שהתרבית הגיעה ל-OD הרצוי, העבירו 50 מ"ל לצינור חרוטי נקי ודגרו ב-42 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 15 דקות. כלול שליטה שלילית לא מושראת.
      הערה: שלב זה יגרום לחלבונים אדומים למבדה.
    4. השאירו את הצינורות בקרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 3,200 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס (גם 42 מעלות צלזיוס וגם לא מושרות).
    5. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 40 מ"ל של ddH2O קר כקרח, והשעו מחדש את הגלולה (גם 42 מעלות צלזיוס מושרה וגם לא מושרה).
    6. צנטריפוגה שוב למשך 8 דקות (ראה שלב 1.3.4) וחזור על שלב הכביסה (שלב 1.3.5) וצנטריפוגה. חזור על שלב הכביסה עד שהסופרנטנט צלול כמו מים (ללא עכירות ותרחיפים) (2-4 כביסות).
    7. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של ddH2O קר כקרח וסטרילי (גם 42 מעלות צלזיוס מושרה וגם לא מושרה).
    8. העבר מנה של הכדורים התלויים (50 מיקרוליטר של HSV-1 ו-25 מיקרוליטר של אדנו) לצינורות מקוררים מראש של 1.5 מ"ל (שניהם מושרים ב-42 מעלות צלזיוס וגם לא מושרים). יש להוסיף 50-400 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר (לא לחרוג מ-5 מיקרוליטר). מערבבים צינורות ודוגרים על קרח למשך 5 דקות.
    9. העבירו את התערובת מהשלב הקודם לקובט מקורר מראש ואלקטרופורט, ב-2.50 קילו וולט (2,500 וולט, קובטה 0.2 ס"מ) (גם 42 מעלות צלזיוס מושרה וגם לא מושרה).
    10. לאחר אלקטרופורציה, אפשר לחיידקים להתאושש ב-1 מ"ל של LB למשך 1.5 שעות ב-32 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל LB לקובט כדי לנקות אותו ולאסוף הכל.
    11. פזרו כמויות שונות של חיידקים (10, 50, 200 מיקרוליטר) על LB אגר + אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל), X-Gal (20 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IPTG (0.5 מ"מ) ותנו להם לגדול בן לילה (ON) ב-32 מעלות צלזיוס.
    12. הכן צלחות עם AMP/X-Gal (אותו ריכוז כמו בשלב 1.3.11) וצלחות עם סוכרוז5.
  4. יום 3
    הערה: בשלב זה, צפוי שהמושבות גדלו וייראו כחולות, אך רק על הצלחות שבהן הושרו חיידקים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס וצופו עם התוספת המכילה את קלטת הבחירה. לאחר קביעת זה, יש צורך לוודא את תקינות קלטת הבחירה בחלק מהמושבות.
    1. זהה צלחות מ-ON שבהן המושבות הן <50 כדי למנוע קטיף של שתי מושבות או יותר. בחרו מספר מושבות (בדרך כלל 8-10 מספיקות כדי לזהות לפחות מושבה מתאימה אחת) ודללו אותן בכ-50 מיקרוליטר של H2O. חסנו מושבות כחולות בודדות ב-50 מיקרוליטר של H2O ופסקו אותן על לוחות סלקטיביים שליליים (LB Agar/Sucrose/Chloramphenicol) וחיוביים (LB Agar/Ampicillin/Chloramphenicol/X-Gal/IPTG) (אותו ריכוז כמו בשלבים 1.1.2 ו-1.3.11) (איור 2).
      הערה: צפוי למצוא 20-100 מושבות על הצלחת, בהן התפשטו 50 מיקרוליטר. עם זאת, אם מספר המושבות נמוך יותר, זה לא בהכרח אומר שרקומבינציה נפגעת.
    2. לחסן את המים משלב 1.4.1 ב-5 מ"ל של LB ולדגור את הצלחות ותרבית LB למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס (איור 2).
  5. יום 4
    1. בחרו רק מושבות כחולות שגדלו על לוחות Amp/X-Gal ולא גדלו על לוחות סוכרוז (איור 3). עבור שיבוטים חיוביים אלה (טבלה 2), העבירו 500 מיקרוליטר של תרבית הלילה ל-50 מ"ל של LB טרי.
  6. יום 5
    1. עבור כל שיבוט חיובי, הכינו דקירה של גליצרול וחלצו ובודדו את הפלסמיד BAC (midiprep).
    2. לאחר מיצוי BAC, בצע בקרת איכות כדי לבדוק אם הרקומבינציה התרחשה כהלכה. בצע ריצוף Sanger של אתר ההכנסה. אם הכל נראה תקין, המשך עם החלק השני.

2. החלף את קלטת הבחירה בשינוי הרצוי

  1. יום 0
    1. פס את השיבוט החיובי על LB אגר. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.
  2. יום 1
    1. בצע PCR כדי להגביר את ההכנסה/שינוי. השתמש בפריימרים קדימה ואחורה המכילים בקצה 3' את הרצף כדי לחשל ולהגביר את קלטת הבחירה ובקצה 5' את אותן זרועות הומולוגיה של 30-80 bp המשמשות בשלב 1.3.1 (טבלה 1).
    2. ודא זהות וטוהר של שבר ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכי ערכי 260/230 ו-260/280 תואמים לחומצת גרעין טהורה.
    3. לחסן מושבה בודדת ל-5 מ"ל של LB ולדגור למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס.
  3. יום 2
    1. מעבירים 2 מ"ל מתרבית הלילה ל-100 מ"ל LB וגדלים ב-32 מעלות צלזיוס עד ש-OD600 מגיע ל-0.55-0.7 (ב~2.5-3 שעות). הכינו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס לאינדוקציה וקררו ל-4 מעלות צלזיוס ~ 250 מ"ל של ddH2O סטרילי לשטיפות.
    2. לאחר הגעה ל-OD הרצוי, העבירו 50 מ"ל תרבית לצינור חרוטי ודגרו באמבט המים של 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לגרום לחלבוני רקומבינציה של λ-פאג'. שמור על צינור נוסף של 50 מ"ל ב-32 מעלות צלזיוס כבקרה בלתי מושרית.
    3. לאחר השראת חום, הניחו את הצינורות על קרח למשך 10 דקות.
    4. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-3,200 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס (גם 42 מעלות צלזיוס וגם לא מושרה).
      הערה: מנקודה זו ואילך, עבדו על קרח כדי לשמור על כשירות תאי SW102.
    5. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדור עם 40 מ"ל מים צוננים מראש על ידי סיבוב עדין.
    6. צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 3,200 × גרם בטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס.
    7. חזור על שלב הכביסה (שלב 2.3.5) פעם אחת.
    8. הסר את הסופרנטנט והשהה בעדינות את הכדור ב-100 מיקרוליטר מים.
    9. העבר מנה של הכדורים התלויים (50 מיקרוליטר של HSV-1 ו-25 מיקרוליטר של אדנו) לצינורות מקוררים מראש של 1.5 מ"ל (שניהם מושרים ב-42 מעלות צלזיוס וגם הבלתי מושרים). יש להוסיף 50-400 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר (לא לחרוג מ-5 מיקרוליטר). מערבבים את הצינורות ודוגרים על קרח למשך 5 דקות.
    10. העבירו את התערובת מהשלב הקודם לקובטה מקוררת מראש ואלקטרופורט, ב-2.50 קילו וולט (גם 42 מעלות צלזיוס וגם לא מושרא).
    11. אפשר לתאים להתאושש ב -5 מ"ל של מדיום LB למשך 4-5 שעות ב -32 מעלות צלזיוס עם טלטול.
      הערה: זמן ההחלמה ארוך יותר מאשר בשלב הקומבינר הראשון כדי לאפשר פירוק של שאריות חלבון SacB לאחר החלפת קלטת.
    12. צלחת כמויות שונות (50, 200, 500 מיקרוליטר) של תרבית על צלחות פטרי אגר LB המכילות סוכרוז, X-Gal ו-IPTG (ריכוז זהה לשלבים 1.1.2 ו-1.3.11). יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.
  4. יום 3
    1. סנן מספר ניכר של מושבות (20-100) כדי להגדיל את הסבירות לזיהוי שיבוטים חיוביים שעברו בהצלחה רקומבינציה עם המקטע הנושא את השינוי הרצוי וקלטת הבחירה. בצע בדיקה ברמה ראשונה באמצעות PCR מושבה. השתמש בצלחת פטרי עם רשת; בחר מושבות מרביע נתון ותייג אותן (איור 4).
      הערה: גישה יעילה במיוחד כוללת שימוש בזוג פריימרים שבהם פריימר אחד מחסל מחוץ לאזור המטרה (על הגנום הנגיפי) והשני בתוך המקטע המשולב מחדש (איור 5).
    2. בדוק את הנוכחות והגודל של אמפליקון ה-PCR על ידי ג'ל אגרוז (1.5%).
    3. בחר מהרביע הנכון את השיבוטים החיוביים וחסן ב-100 מ"ל של LB. דגירה למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס.
  5. יום 4:
    1. בצע midiprep כדי לחלץ את הפלסמיד מתרביות חיידקים.
    2. עכל את הפלסמיד עם אנזימי הגבלה והפעל ג'ל אגרוז כדי לנתח את דפוס העיכול.
    3. אם דפוס העיכול נכון, המשך ברצף האזור השונה של הגנום הנגיפי.
    4. לאחר הבטחת הזהות המולקולרית של שיבוטים רקומביננטיים, המשך בטרנספקציה והצלה של חלקיקים נגיפיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת וירוס הרפס אונקוליטי מקודד IL12
כפי שמתואר בחלק המבוא של עבודה זו, יישום פוטנציאלי אחד של רקומבינר הוא החדרת טרנסגנים חיסוניים לגנום של נגיפים אונקוליטיים, במטרה לשפר את הפוטנציאל האימונותרפי שלהם. להלן, אנו מציגים דוגמה ליישום כזה באמצעות וקטור אונקוליטי המבוסס על HSV-1. באופן ספציפי, מחקר זה חוקר את ההשפעה של החדרת טרנסגן ללוקוס בין-גני באזור Us1-Us2 של גנום HSV-1. ואכן, החדרות בתוך גנומים נגיפיים עלולות להזיק לפונקציונליות הוויראלית, מה שעלול להוביל לפגמים בשכפול שעלולים לפגוע הן ביעילות האנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול "RECOMBINEERING" זה משתמש באסטרטגיה דו-שלבית: ראשית, שילוב של קלטת בחירה במיקום הגנומי המבוקש, ושנית, החלפת קלטת זו בשינוי הרצוי (איור 1).

סמני הבחירה המשמשים כוללים עמידות לאמפיצילין (AmpR), בטא-גלקטוזידאז (β-גל) ו-sacB. AmpR מאפשר ברירה מבוססת עמידות לאנטיביוטיקה, β-gal מאפשר סינון כחול/לבן ו-sacB מעניק רגישות לסוכרוז עבור ברירה נגדית. מושבות המשלבות את הקסטה נראות כחולות על לוחות מושרים; גידול בבקרות לא מושרות מרמז על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים רלוונטיים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי: PRIN 2022-MUR איטליה, מענק 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 המרכז הלאומי לטיפול גנטי ותרופות המבוססות על טכנולוגיית RNA. PNRR PE13 One Health פעולות מחקר בסיסיות ותרגומיות הנותנות מענה לצרכים שלא נענו במחלות זיהומיות מתעוררות. המחברים מודים לשירות הסינתזה של Geneart על אספקת DNA מותאם אישית. המחברים גם מביעים הכרת תודה כנה למיקלה ונרוסו, שתרמה להשלמתו המוצלחת של מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמפיציליןכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית
כדי ש-oligo יגביר Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		כלשהוכלשהוHPLC מטוהר
עבור אוליגו לאמפלופי AmpR/LacZ/SacB  קלטת: CTGGCTAGCGTTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTTTTTTTC		כלשהוכלשהוHPLC מטוהר
IPTGכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית
LB אגר
LB בינוני
Phusion Hot Start II פולימראז DNA בנאמנות גבוהה תרמו סיינטיפיקF549S
Rev oligo כדי להגביר את Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		כלשהוכלשהוHPLC מטוהר
Rev oligo ל-Amplofy AmpR/LacZ/SacB  קלטת: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTATTG 		כלשהוכלשהוHPLC מטוהר
קלטת בחירה SacB/AmpR/LacZכתב יד זה--
סוכרוזכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית
SW102 עם BAC-HSV-1 או BAC-Advכתב יד זה--
טריפטוןכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית
אשף SV ג'לפרומגהא9281
אקס-גלכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית
תמצית שמריםכלשהוכלשהוכיתה מולקולרית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים