מאמר שיטה

הקמה והערכה של מודל עכברושים סוכרתיים עם טרשת עורקים בגפה התחתונה Obliterans

DOI:

10.3791/68991

⸱

2 בינואר 2026

 ,  ,  ,  , 
1The Second Clinical Medical College of Binzhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Shandong Second Medical University, 3Department of Vascular Surgery, YanTai Yuhuangding Hospital Affiliated to Qingdao University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים אובליטרנס בגפיים התחתונות היא סיבוך נפוץ בסוכרת. כאן אנו מציגים שיטת מודל בעלי חיים חדשנית המדמה את התקדמות מחלת סגירת עורקים על ידי הזרקת אתנול לכלי דם לשיבוש מבנה כלי הדם, ובכך מספקת פלטפורמה חדשה לטיפול במחלות כלי דם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נועד לבסס ולאמת מודל עכברוש חדש של טרשת עורקים בגפיים התחתונות (ASO) בעכברים סוכרתיים. בניגוד לקשירת עורקי הירך המסורתית, הזרקנו 95% אתנול (0.1 מ"ל) לעורק האיליאק החיצוני. לאחר הניתוח, הוערכו חסימה עורקית ואיסכמיה של הגפה האחורית בימים 1, 3, 7 ו-14 באמצעות אולטרסאונד דופלר, דימות תרמי ומדידת משקל שריר רטוב. בוצע ניתוח היסטולוגי של כלי הדם ורקמות השרירים כדי להעריך את שיעור ההצלחה והיציבות של המודל. אתנול בריכוז גבוה (95%) גורם לנזק לתאי אנדותל וסקולריים, מה שמוביל לחסימת עורקי הירך. בהשוואה לקבוצת הביקורת, אולטרסאונד דופלר חשף ירידה הדרגתית בקוטר העורקים ובעלייה במהירות הזרימה בגפה הפגועה. הדמיה תרמית הראתה ירידה בטמפרטורת הגפה, בעוד שמדידת משקל השריר הראתה ירידה משמעותית במסת השריר בצד השני. הניתוח ההיסטופתולוגי אישר סתימה של הלומן העורקי, ירידה בצפיפות המיקרווסקולרית והחמרה מתקדמת של הנגע לאורך זמן. לסיכום, הזרקת עורק איליאק עם 95% אתנול משחזרת ביעילות את המאפיינים הפתופיזיולוגיים של חסימת עורקי הגפה התחתונת, ומספקת מודל חדש לחקר טרשת עורקים אובליטרנס בעכברים סוכרתיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסימת עורקים בגפיים התחתונות של סוכרת (DLEAO) היא סיבה מובילה לנכות ותמותה בקרב חולי סוכרת, הפוגעת קשות באיכות החיים ומטילה נטל סוציו-אקונומי משמעותי1. הפתוגנזה של מחלת עורקים סוכרתית כוללת אינטראקציות מורכבות בין היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, דלקת כרונית ותפקוד לקוי של כלי דם2. מודלים של בעלי חיים היו בעלי תפקיד מרכזי בהבהרת מנגנונים אלו, וסיפקו תובנות קריטיות להתפתחות טיפולית. מודלים של בעלי חיים משמשים ככלים חשובים לסימולציה של פתופיזיולוגיה של מחלת עורקים היקפית (PAD) אצל חולי סוכרת אנושיים. מודלים אלו מאפשרים מחקרים בעלי תפוקה גבוהה וניתנים לשחזור כדי לחקור התקדמות מחלה ולהבהיר מנגנונים בסיסיים. יתרה מזאת, ניסויים פרה-קליניים המשתמשים במודלים של בעלי חיים מספקים נתונים חיוניים לטיפולים חדשניים, כולל סוכנים פרמקולוגיים, טיפול גנטי ושיטות רפואה רגנרטיבית (למשל, טיפול בתאי גזע)3. מחקר יסודי כזה הוא קריטי להנחיית ניסויים קליניים עתידיים ולקידום רפואה תרגומית.

כיום, שיטת קשירת עורקי הירך (FAL) משמשת באופן נרחב במעבדות לבניית מודלים של עכברים לאיסכמיה של הגפה האחורית4. גישה זו גורמת במהירות להופעות איסכמיות בגפיים התחתונות; עם זאת, הקרישה העורקית שמתקבלת שונה מההתקדמות הפתופיזיולוגית שנצפתה אצל חולי סוכרת עם מחלת עורקים בגפיים התחתונות (LEAD), הכוללת פגיעה באנדותל, הצטברות גורמי דלקת והתרבות תאי שריר חלק 2,6. בנוסף, FAL מפעיל ניאווסקולריזציה מהירה והיווצרות כלי דם צדדיים, ומחזיר את הפרפוזיה בזרימה נמוכה זמן קצר לאחר הדגם 5,7. זה מנוגד להתפתחות הכרונית של LEAD סוכרתי. לכן, יש צורך לפתח מודל של בעלי חיים שמשחזר בצורה מדויקת יותר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של טרשת עורקים אנושית.

במודלים של בעלי חיים סוכרתיים, פגיעה מכנית באינטימה של העורק הירך באמצעות קטטר בלון או השראה כימית (למשל, גירוי כלוריד ברזל) גורמת לשינויים פתולוגיים, כולל הפשטת אנדותליה, חדירת תאים דלקתיים והגירה/התרבות של תאי שריר חלק. גישה זו משחזרת טוב יותר את התכונות הפתולוגיות הבולטות של טרשת עורקים אנושית. בהשוואה למודל FAL המסורתי, היתרון המרכזי של השיטה המושרת באתנול טמון ביכולתה לדמות בצורה מדויקת יותר את התהליך הפתופיזיולוגי המורכב של LEAD סוכרתי. אתנול משבש ישירות את האנדותל הווסקולרי, מפעיל הצטברות טסיות וטרומבוזיס, ובכך מחקה את האירוע הראשוני בסוכרת LEAD9. חשוב מכך, על ידי הרס הדרגתי של המיקרו-מבנה הוסקולרי, אתנול נמנע ביעילות את פיצוי המחזור הצידי המהיר הנפוץ במודל FAL, ובכך משחזר בהצלחה את מצב היפופרפוזיה הכרוני הטיפוסי של LEAD10 עם סוכרת. לעומת זאת, למודל האיסכמיה הנגרמת על ידי קשירת עורקי הירך יש מגבלות בולטות: מכרסמים (למשל, עכברים, חולדות) מפצים במהירות על איסכמיה חריפה בשל מחזור הדם המשני המפותח שלהם, מה שמוביל לחומרת איסכמיה לא עקבית ולסיכום לקוי של איסכמיה קריטית של הגפה האנושית (CLI)11,12. יתרה מזאת, מחלת עורקים היקפיים אנושית (PAD) נובעת בעיקר מההתקדמות הכרונית של טרשת עורקים, בעוד שמודל קשירת העורק הירך מייצג אירוע איסכמי חריף - מנגנונים פתופיזיולוגיים מובחניםביסודו 13. המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לקבוע ולאפיין מודל ניסויי יציב וארוך טווח של טרשת עורקים בגפה התחתונה של סוכרת (LEAOD) המדמה במדויק את התקדמות המחלה אצל מטופלים. חסימה מונעת מאתנול היא פשוטה תפעולית, ודורשת רק הזרקה זעיר-פולשנית, מה שמפחית את המחסום הטכני ואת תמותת בעלי החיים. הפרמטרים המרכזיים שלו ניתנים לסטנדרטיזציה בקלות, מה שמבטיח שחזוריות גבוהה. יתרה מזאת, השיטה חסכונית, מבטלת את הצורך בציוד מיוחד, וניתנת להעברה בקלות בין מעבדות. נכון להיום, עדיין חסר מודלים בעלי חיים עמידים לאימות התערבויות טיפוליות חדשניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך לפי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של בית החולים ינטאי יוהואנגדינג. מחקר זה השתמש ב-40 זכרים של חולדות ספרג-דולי (משקל: 250-300 גרם, גיל: 6 שבועות) שהתגוררו במחזור אור/חושך של 12 שעות. החל מגיל 7 שבועות, הם קיבלו תזונה עתירת שומן וסוכרוז¹⁴,¹⁵ לפי החופשיות, עם גישה חופשית למים למשך 8 שבועות. לאחר 4 שבועות לתוך הדיאטה, הושרה סוכרת באמצעות הזרקת סטרפטוזוטוצין (STZ)¹⁶. לאחר 8 שבועות, אושר הקמת מודל הסוכרת בהצלחה לפני הניסויים הבאים. ניתוח חסימה עורקי גפה אחורית בוצע על חולדות בנות 14 שבועות כפי שמתואר להלן.

1. השראה כירורגית של טרשת עורקים בגפה האחורית בחולדות סוכרתיות

  1. הכינו את כל הכלים והחומרים הכירורגיים כפי שמפורטים בטבלת החומרים ומודגמים באיור 1.
  2. הרדמו את העכברוש באמצעות מכונת הרדמה המספקת איזופלורן (1.5-2.5%) וחמצן (חמצן2, 1-2 ליטר לדקה). שמור על נשימה ספונטנית לאורך כל הדרך. הערך את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת האצבעות כדי להבטיח מישור כירורגי של הרדמה.
  3. הנח את העכברוש על הגב על פלטפורמת ההגבלה. הסירו שיער מהבטן אל הגפיים התחתונות באמצעות קרם הסרת שיער ולהב גילוח.
  4. אבטח את הגפיים. חטא את עור הגפה האחורית באלכוהול. בצע חתך של 2-3 ס"מ בירך ימין המדיאלית באמצעות מלקחיים ומספריים מעוקלים.
    הערה: כל ההליכים הכירורגיים בוצעו על ידי מנתח מנוסה כדי להבטיח עקביות ושחזוריות של מודלי בעלי החיים.
  5. תחת מיקרוסקופ, נתח את הרקמות הסובבות כדי לחשוף את העורק/וריד האילי החיצוני ואת עצב הירך. בודד את כלי הדם והעצב. עקבו אחרי העורק האיליאק החיצוני עד להתפצלותו לעורקי הירך העמוקים והשטחיים.
  6. מהדק את העורק הירך האמצעי ואת עורק הירך העמוק עם קליפסים וסקולריים. הזריקו לאט 0.1 מ"ל של 95% אתנול לעורק האיליאק החיצוני הדיסטלי. אחרי 60 שניות, הסר את הקליפים; להשיג המוסטאזיס באמצעות דחיסה. סגור את הפצע שכבה אחר שכבה.
    הערה: במהלך ההזרקה, נצפו חיוורון מיידי של העורק ורעד חולף בכף הרגל האיפסילטרלית, מה שאישר הצלחה של מתן אתנול תוך-כלי דם.
  7. אל תשתק את הגפה הפגועה לאחר הניתוח. הזרקת פניצילין נתרן (400,000 IU) בתוך השריר למניעת זיהום.
    הערה: במודל החסימה העורקי החד-צדדי של הגפה התחתונה, הגפה הנגדית משמשת כבקרה. זמן החסימה מחושב החל מ-24 שעות לאחר ההליך.

2. קביעת טמפרטורת הגפה התחתונה

  1. הרדימו את העכברוש והניחו אותו על השכיבה על פלטפורמת הניתוח.
  2. תגלח את שתי הגפיים האחוריות ותמקם אותן בסימטריה.
  3. מדדו את הטמפרטורה של שתי הגפיים האחוריות באמצעות מערכת תרמוגרפיה אינפרא-אדומה.

3. קוטר העורקים ומהירות זרימת הדם

  1. הרדימו את העכברוש.
  2. הכינו את מערכת האולטרסאונד והפרוב.
    1. הפעל את מכשיר האולטרסאונד על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה בלוח הקדמי.
    2. בחר את גלאי המערך הליניארי בתדר גבוה (למשל, 40 MHz) וחבר אותו למערכת.
    3. מרחו כמות נדיבה של ג'ל קישור אקוסטי על פני השטח.
  3. אתר את העורק הירך השטחי.
    1. הניחו את העכבר בשכיבה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
    2. גלח את הפרווה מאזור הירך המדיאלי דו-צדדית, כ-1-2 ס"מ מעל מפרק הברך, באמצעות קוצץ חשמלי.
    3. הנח בעדינות את הגשוש בניצב לפני העור מעל האזור המגולח.
    4. כוונן את מיקום הגשוש במצב B כדי לדמיין את עורק הירך כמבנה צינורי פועם ואנאקואי.
  4. מדוד את קוטר העורק.
    1. הקפיאו את תמונת מצב B על ידי לחיצה על כפתור הקפאה בממשק המחשב או התוכנה.
    2. בחר את כלי המדידה מהתפריט שעל המסך.
    3. השתמש בפונקציית הקליפר כדי למדוד את הקוטר הפנימי מהדופן הקרובה לרחוקה של העורק.
    4. חזור על המדידה שלוש פעמים באותו מיקום ורשם את הערך הממוצע.
  5. מדדו את מהירות זרימת הדם.
    1. עבור למצב דופלר בגל פולס על ידי לחיצה על סמל דופלר PW .
    2. מקם את שער הדגימה מעל מרכז הלומן של העורק.
    3. כוון את זווית הדופלר ל-≤ 60° באמצעות כלי תיקון הזווית.
    4. לחץ על Update או Capture כדי לתעד את צורת הגל במהירות לאורך לפחות שלושה מחזורי לב.
    5. השתמשו בפונקציית המעקב האוטומטית של התוכנה כדי לחשב מהירות סיסטולית שיא (PSV) ומהירות קצה דיאסטולית (EDV).
    6. שמור את הנתונים על ידי לחיצה על שמור וייצא את התוצאות לקובץ גיליון אלקטרוני (למשל, CSV, Excel).

4. שקילת שרירים

  1. לאחר הרדמה עמוקה, יש להמית את העכברוש באמצעות ניתוק צוואר הרחם.
  2. נתח את שרירי הגסטרוקנמיוס משתי הגפיים האחוריות, תוך שמירה על גידי האכילס (איור 2).
  3. מניחים מיד את השרירים על איזון אלקטרוני כדי למדוד משקל רטוב.
  4. השתמש בשרירים הנגדיים כבקרה.
  5. השווה מדידות מארבע נקודות זמן והצג אותן בגרף עקומות.

5. ניתוח היסטופתולוגי

  1. בכל אחת מארבע נקודות הזמן, יש להמתים קבוצה אחת של חולדות במהירות.
  2. קצור מיד את העורקים השטחיים הדו-צדדיים של הפמורל.
  3. תקבע את רקמות העורקים ב-4% פאראפורמלדהיד.
  4. הטמיעו את הרקמות בפרפין וחתכו אותן בעובי 5 מיקרון.
  5. לבצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי לבדוק שינויים היסטופתולוגיים.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. ביטא את כל הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). יש לשקול הבדלים מובהקים סטטיסטית בערך p של <0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש בהזרקת אתנול תוך-עורקי כדי לקבוע מודל בעכברי SD סוכרתיים (n = 40). המודל התאפיין בשיעור הצלחה של 85% (33/40), בהתבסס על אישור אולטרסוניקי של ירידה בקוטר העורקים הנגדיים ובמהירות זרימת הדם בתוך 14 ימים לאחר ההזרקה. שיעור תמותה הקשור למודל נרשם של 8% (5/40), בעיקר בתקופה הראשונית. בעוד שהרעילות הציטוטוקסית של אתנול מהווה סיכון לנזק רקמתי לא ספציפי כגון נמק, ניטור מדוקדק אישר כי ההפחתה שנצפתה בקוטר ובזרימה היו ההשפעות העיקריות המיועדות לכך. למרות שחזוריות טובה בין קבוצות (שונות בין-קבוצתית < 15%), שונות בין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסיכום, הצלחנו לבסס מודל חולדה של חסימה עורקית מתקדמת, המדמה במידה רבה את התופעות הקליניות שנצפו אצל חולי סוכרת. הערכות עקביות של היפופרפוזיה בגפיים האחוריות הושגו באמצעות מדידות אולטרסונוגרפיות והערכות משקל רטוב של שריר לתקופות העולות על שבועיים. קשירת העורק הפמורלי גרמה לחסימה וסקולרית שטחית, תוך מתן זרימת דם דרך מערכת הוורידים העמוקה השלמה17. כאשר מתבצעת קשירה בעורק הפרוקסימלי או בענפיו, זרימת הדם הצדדית פוחתת, מה שמוביל לתופעות איסכמיות חמורות. עם זאת, גם כאשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן החדשנות של אוניברסיטת סין (מספר מענק 2024GR043).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גרסת GraphPad 8.0.1RRID:SCR_002798
מדחום אינפרא-אדום מבוסס טלפוןHIKMICROHM-TJP10B-3AMF
עכברוש ספרג-דוליחברת ג'ינאן פנגיואו ניסיונית לרבייה של בעלי חיים בע"מ.250 גרם
מכונת אולטרסאונדVevo 2100

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barnes, J. A., Eid, M. A., Creager, M. A., Goodney, P. P. Epidemiology and risk of amputation in patients with diabetes mellitus and peripheral artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (8), 1808-1817 (2020).
  2. Yang, S. L., et al. Pathophysiology of peripheral arterial disease in diabetes mellitus. J Diabetes. 9 (2), 133-140 (2017).
  3. Ko, S. H., Bandyk, D. F. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia. Semin Vasc Surg. 27 (1), 23-31 (2014).
  4. Krishna, S. M., et al. Development of a two-stage limb ischemia model to better simulate human peripheral artery disease. Sci Rep. 10 (1), 3449(2020).
  5. Wang, H., et al. Effect of miR-206 on lower limb ischemia-reperfusion injury in rat and its mechanism. Sci Rep. 13 (1), 21574(2023).
  6. Creager, M. A., Lüscher, T. F., Cosentino, F., Beckman, J. A. Diabetes and vascular disease: pathophysiology, clinical consequences, and medical therapy: part I. Circulation. 108 (12), 1527-1532 (2003).
  7. Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol. 152 (6), 1667-1679 (1998).
  8. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  9. Parsi, K. Interaction of detergent sclerosants with cell membranes. Phlebology. 30 (5), 306-315 (2015).
  10. Hellenthal, K. E. M., Brabenec, L., Gross, E. R., Wagner, N. M. TRP channels as sensors of aldehyde and oxidative stress. Biomolecules. 11 (10), 1401(2021).
  11. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  12. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. (23), e1035(2009).
  14. Rai, V., Moellmer, R., Agrawal, D. K. Clinically relevant experimental rodent models of diabetic foot ulcer. Mol Cell Biochem. 477 (4), 1239-1247 (2022).
  15. Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for type 2 diabetes mellitus. J Diabetes Res. 2016, 2902351(2016).
  16. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Curr Protoc. 1 (4), e78(2021).
  17. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. J Vasc Surg. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  18. Goto, T., et al. Search for appropriate experimental methods to create stable hind-limb ischemia in mouse. Tokai J Exp Clin Med. 31 (3), 128-132 (2006).
  19. Parikh, P. P., et al. A reliable mouse model of hind limb gangrene. Ann Vasc Surg. 48, 222-232 (2018).
  20. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (2), 205-212 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים