מאמר שיטה

הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

DOI:

10.3791/68993

⸱

7 באוקטובר 2025

 ,  , 
1Centre for Modern Interdisciplinary Technologies, Nicolaus Copernicus University in Toruń

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וחסכונית של הרכב החיידקים במוצרי חלב על ידי שילוב קולטורומיקה עם MALDI-TOF MS. הוא מספק תוצאות טקסונומיה דומות לריצוף 16S rRNA עם זמן אספקה קצר יותר משיטות תרבית מסורתיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בשיטת זיהוי של ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-TOF MS, להלן "MS") לניטור נוכחות מיקרואורגניזמים במוצרי חלב שונים (חמאה, גבינת מוצרלה, חלב, שמנת) תוך שימוש בגישה פרוטאומית, תרבות מודרנית ונהלי הכנת דגימות שונים שניתן לשלב במעבדות בקרת איכות בטיחות המזון כצום, כלי אמין וחסון לניטור בטיחות מיקרוביאלית. הוא כולל שלב בידוד מיקרוביאלי, בחירת מושבות שגדלו, הליכי הכנת דגימות (תאים שלמים, מיצוי נקודתי ובתוך הצינור), קביעת פרמטרים של ניתוח טרשת נפוצה, יצירה ואיסוף של ספקטרום טרשת נפוצה (טביעות אצבע של חלבונים), ולבסוף קבלת טקסונומיה באמצעות פלטפורמת MS, ואחריה פרשנות נתונים והדמיה. שיטה זו, שאומתה על ידי מחקרים רבים, מציעה זיהוי אמין וחסכוני יותר של מיקרואורגניזמים מחלב בהשוואה למערכות בדיקה ביוכימיות מסחריות. הוא בולט כהתקדמות מבטיחה במיקרוביולוגיה של מזון, העונה על הדרישות המגוונות של המעבדות באמצעות הפרוטוקולים הפשוטים שלו וזמן הניתוח המופחת משמעותית. הפרוטוקול המוצג נותן מענה לצרכי תעשיית המזון על ידי מתן זיהוי מיקרוביאלי אמין בזמן אספקה תקין (TAT) המותאם היטב לתהליכי הייצור.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה מקיפה לניטור הבטיחות המיקרוביאלית של מוצרי חלב שונים, כולל חמאה, גבינה, חלב ושמנת, על ידי שימוש בטרשת נפוצה לפרופיל פרוטאומי חיידקי. גישה זו, המשלבת תרבות מודרנית עם נהלי הכנת דגימות אופטימליים, נועדה להיות כלי מהיר, אמין וחזק למעבדות בטיחות מזון ובקרת איכות. הרציונל מאחורי יצירה ויישום של מתודולוגיה זו נובע מהמגבלות של שיטות זיהוי מיקרוביאליות סטנדרטיות. במשך שנים רבות, מעבדות וטרינריות ואבחון מזון הסתמכו על בדיקות ביוכימיות קונבנציונליות הבוחנות צמיחה ומטבוליזם של חיידקים על מצע תרבית דיפרנציאלי ואחריו בדיקות אנזימטיות שונות1. בעוד ששיטות אלה, המבוססות לעתים קרובות על הנחיות סטנדרטיות כמו אלה של המדריך לבקטריולוגיה דטרמיניטיבית של ברג'י, הן זולות יחסית ויכולות לייצר נתונים כמותיים ואיכותיים כאחד, הן מייגעות וגוזלות זמן, ודורשות הכנת מדיה נרחבת, דילול דגימות, ציפוי, דגירה, ספירת מושבות, בידוד ושלבי אפיון מפורטים 2,3.

הכנסת מערכות מסחריות אוטומטיות למחצה ואוטומטיות כגון אינדקס פרופיל אנליטי (API), BBL Crystal, Vitek ו-Biolog MicroPlates, ייעלו את הזיהוי המיקרוביאלי באמצעות מבחנים ביוכימיים, ובכך הפחיתו עלויות וזמני אספקה. עם זאת, למערכות אלה יש כמה חסרונות, כגון יכולת שחזור לקויה, היעדר רשומות במאגרי הנתונים שלהן, וקשיים בקביעת וריאציות פנוטיפיות בין זנים, במיוחד עבור חיידקים לא מותססים או זנים בתוך מין עם הבדלים ביוכימיים קלים, מה שעלול להוביל לתוצאות שגויות במבחנה 4. בהתחשב בכך, טרשת נפוצה התפתחה כחלופה רבת עוצמה, הנפוצה כיום במיקרוביולוגיה קלינית וזוכה לתשומת לב במעבדות אבחון וטרינריות ואיכות חלב. גישה זו הושלמה על ידי המהירות, הדיוק והעלות-תועלת שלה באיתור מספר מיקרואורגניזמים1. מחקרים רבים הוכיחו כי טרשת נפוצה מציעה זיהוי אמין יותר של מיקרואורגניזמים מחלב, ומספקת תוצאות מהירות וזולות יותר ממערכות בדיקה ביוכימיות מסחריות 5,6,7. בעוד שבדיקות ביוכימיות עשויות להספיק לזיהוי ברמת הסוג או ברמת הקבוצה, אבחון ברמת המין מחייב לעתים קרובות שיטות מתקדמות יותר כמו MS או ריצוף 16S rRNA8. ואכן, טרשת נפוצה נחשבת לפלטפורמה מבטיחה לזיהוי גמיש ואמין של מבודדים מיקרוביאליים במזון, העומדת בדרישות מגוונות של מעבדות מיקרוביולוגיה של מזון באמצעות הפרוטוקולים הפשוטים שלה וזמן הניתוח המופחת משמעותית, ובכך משפרת את בטיחות המזון 4,5. עלויות התפעול הן מינימליות עקב צריכת ריאגנטים נמוכה, וטיפול בדגימות מאפשר אוטומציה רבה יותר ותפוקה גבוהה8. עם זאת, יש לציין כי התועלת של שיטה זו תלויה מטבעה בתנאי גידול מיקרוביאליים שנבחרו (כולל סוג מדיית תרבית) ובכיסוי מינים של מאגר ייחוס, המוכרים כגורמים העיקריים המגבילים את התועלת שלה.

טרשת נפוצה ממלאת תפקיד משמעותי במיקרוביולוגיה של מזון על ידי זיהוי והבחנה בין חיידקים פתוגניים הנישאים במזון, חיידקי חומצה לקטית (LAB) וחיידקים מותססים אחרים9. התועלת שלו משתרעת על תרבות מודרנית, ומאפשרת זיהוי של כל המושבות המיקרוביאליות הגדלות על מצע תרבית ומקלה על רכישת מידע על יחידות יוצרות מושבה (CFU)7. גישה זו כבר יושמה בהצלחה לגילוי קהילות מיקרוביאליות מורכבות כמו אלה המוצגות במעיים אנושיים, מעורבות בזיהומים בכף הרגל הסוכרתית, או קשורות לדרכי השתן, ומחייה שיטות תלויות תרבית בפרקטיקות מיקרוביולוגיות10,11.

פרוטוקול זה מוצג כדי להנחות מעבדות ביישום יעיל של טרשת נפוצה להערכה שגרתית של בטיחות מיקרוביאלית במוצרי חלב, תוך מתן מענה לצורך של התעשייה בזיהוי מיקרוביאלי אמין בזמן אספקה מעשי (TAT) המתאים לתהליכי ייצור. הפרוטוקול מפרט צעדים מכריעים, כולל (1) בידוד מיקרוביאלי ממוצרי חלב נוזליים (חלב, שמנת, מי גבינה) ומוצקים (חמאה, גבינה) באמצעות מבחר מצעי תרבית מתאימים (אגר דה מאן, רוגוסה ושרפ - אגר MRS, אגר M-17, אגר טווין 80 לכל מטרה - אגר APT, אגר לקטוז כחול סין - אגר CBL, אגר ספירת צלחות חלב - MPCA, אגר סויה טריפטי - TSA) ותנאי דגירה מותאמים; (2) נהלי הכנת דגימה סטנדרטיים לניתוח טרשת נפוצה, המציעים אפשרויות כגון העברה ישירה של מושבה, מיצוי חומצה פורמית על המטרה ומיצוי חלבון אתנול/חומצה פורמית בתוך הצינור כדי להתאים לסוגי חיידקים שונים ותהליכי עבודה במעבדה; ו-(3) ניתוח MS שיטתי, כולל כיול מכשירים, הגדרת פרמטרים אופטימליים לרכישת ספקטרום והנחיות לפירוש נתונים, כולל הערכת ערך ניקוד ובדיקות עקביות להקצאה טקסונומית בטוחה. על ידי מתן גישה מובנית ומאומתת, פרוטוקול זה נועד לשפר את הדיוק והיעילות של ניטור מיקרוביאלי בתעשיית החלב, ובסופו של דבר לתרום לשיפור איכות המזון ובריאות הציבור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד חיידקים הקשורים לחלב

  1. השגת תרביות חיידקים ממוצרי חלב נוזליים או מוצקים
    1. בחירת מדיה תרבותית
      1. לבידוד חיידקים מדגימות חלב, בחר את אמצעי התרבות בהתאם לקבוצות המיקרוביאליות הצפויות, כולל מצע גידול כללי, מדיה לחיידקים גרם שליליים, חיידקי חומצה לקטית (LAB), חיידקים יוצרי נבגים, כמו גם מיקרואורגניזמים איטיים או קפדניים.
        הערה: כדי למקסם את ההתאוששות של מינים דומיננטיים ונדירים כאחד, יש לחסן מספר מדיות במקביל. קבוצה של מדיה לדוגמה לניתוח מיקרוביום מדגימות חלב מוצגת בטבלה 1.
    2. חיסון וציפוי
      1. השג מדגם מייצג של מוצר החלב וערבב היטב.
      2. העבירו אספטית 1 מ"ל (דגימות נוזליות: חלב, שמנת, חמאה) או 1 גרם (דגימות מוצקות: גבינה, חמאה) מהדגימה לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום נוזלי סטרילי (מי פפטון / 0.85% תמיסת NaCl). עבור דגימות מוצקות, יש לחמם את המדיום הנוזלי ל-40-42 מעלות צלזיוס לפני הוספת הדגימה.
      3. הומוגניזציה של הדגימה על ידי מערבולת נמרצת במשך 30-60 שניות. עבור דגימות שומניות או קשות, המשך בהומוגניזציה עד לקבלת תרחיף אחיד.
      4. הכן סדרה של דילולים פי עשרה על ידי נטילת 1 מ"ל תרחיף והעברתו לצינורות עוקבים המכילים 9 מ"ל תמיסה סטרילית. מערבבים היטב כל דילול.
        הערה: בהתאם לסוג הדגימה ורמת הזיהום המיקרוביאלי הצפויה, הכינו דילולים הנעים בין 10-1 ל-10-6. עבור רוב הדגימות, דילולים של עד 10-3 יספיקו; עם זאת, בעת ניתוח חלב טרי או גבינה כחולה, יהיה צורך להכין דילולים נוספים. כדי להבטיח בידוד מדויק וקלות בחירת המושבה, דילול החיסון האופטימלי צריך לתת בין 30-300 מושבות לצלחת. טווח זה מאפשר בידול ברור של מושבות בודדות וממזער את הסיכון לצמיחה חופפת, מה שמקל על השגת תרביות חיידקים לא מזוהמות והומוגניות לניתוח מאוחר יותר. עבור מוצרי חלב מעובדים מסוימים (למשל, חמאה), ניתן להשתמש בדגימה טרייה לא מדוללת (למשל, 0.1 מ"ל) לציפוי ישיר.
      5. קח 0.1 מ"ל מהדגימה או מהדילול שלה והעביר על פני השטח של צלחות פטרי שהוכנו בעבר המכילות את מדיום האגר המתאים.
      6. מורחים באופן שווה את החיסון על פני האגר באמצעות מפזר סטרילי. הניחו לחיסון להיספג במדיום למשך 15 דקות, ואז הפכו את הצלחות.
    3. דגירה
      1. דגירה אירובית: עבור כל הדגימות שנחקרו, יש לחסן את לוחות האגר APT, M-17, CBL, MPCA ו-TSA, לדגור בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. טמפרטורות הדגירה נקבעו על סמך דרישות הגידול האופטימליות של קבוצות מיקרוביאליות שונות החיוניות להערכת האיכות ההיגיינית (30 מעלות צלזיוס למזופילים כלליים) ובטיחות בריאות הציבור (37 מעלות צלזיוס לפתוגנים הקשורים לבני אדם ואורגניזמים אינדיקטורים) של מוצרי חלב.
        הערה: אם צפויה צמיחה אינטנסיבית של חיידקים יוצרי נבגים, במקרה של TSA, עדיף זמן דגירה קצר יותר (~12 שעות).
      2. דגירה אנאירובית: עבור כל הדגימות שנחקרו, יש לחסן צלחות MRS Agar, לדגור בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-30 מעלות צלזיוס למשך 24-72 שעות, ולבדוק את הגידול המיקרוביאלי מדי יום. טמפרטורות הדגירה נקבעו כאמור בשלב 3.1.
        הערה: ניתן להשיג תנאי דגירה אנאירוביים על ידי הנחת צלחות במיכלים אטומים עם שקיות יוצרות אטמוספירה אנאירוביות, המסלקות חמצן ומספקות אווירה מתאימה לגידול חיידקים אנאירוביים.
    4. השגת תרבויות טהורות
      1. לאחר הדגירה, בדוק את הלוחות ובחר מושבות בודדות שגדלו על סמך המאפיינים המורפולוגיים שלהן (למשל, גודל, צורה, צבע, מרקם).
      2. טהר את המושבות שנבחרו על ידי תת-תרבות (פסים) על אותו מדיום אגר באמצעות לולאה מיקרוביאלית של 1 מיקרוליטר ואותם תנאי דגירה.
מדיום תרבותיישוםמצב תרבות
אגר סויה טריפטי (TSA)מדיום כללי לגידול מגוון רחב של חיידקים30–37 מעלות צלזיוס, 24–48 שעות, אירובי
אגר דם (BLA; עם 5% דם כבשים)מועשר, התמיינות של המוליזה, שימושית לסטרפטוקוקוס, ליסטריה, בצילוס30–37 מעלות צלזיוס, 24–48 שעות, אירובי
MRS אגר (דה מאן, רוגוסה ושארפ אגר)סלקטיבי עבור לקטובצילוס ו-LAB אחרים יש להוסיף 1% טווין-80 כדי לתמוך בצמיחה של לקטובצילוס קזאי, לקטובצילוס דלברוקי, לקטובצילוס הלבטיקוס או לקטובצילוס אצידופילוס.30 מעלות צלזיוס, 48-72 שעות, אנאירובי או מיקרואירופילי
אגר M17סלקטיבי ללקטוקוקוס, סטרפטוקוקוס תרמופילוס30 מעלות צלזיוס, 48-72 שעות, אנאירובי או מיקרואירופילי
APT אגר (טווין 80 אגר לכל מטרה)סלקטיבי עבור LAB וכמה ביפידובקטריה30 מעלות צלזיוס, 48-72 שעות, אנאירובי או מיקרואירופילי
אגר שידלרסלקטיבי ומעשיר, בידוד של אנאירובים, כולל ביפידובקטריום, קלוסטרידיום30–37 מעלות צלזיוס, 48–72 שעות, אנאירובי
אגר CBL (אגר לקטוז כחול בסין)מדיום דיפרנציאלי, עבור חיידקי קוליפורמים וחיידקים אחרים המתסיסים לקטוז37 מעלות צלזיוס, 24-48 שעות, אירובי
אגר ספירת צלחות חלב (MPCA)אוניברסלי, עבור המספר הכולל של חיידקים מזופיליים אירוביים30–37 מעלות צלזיוס, 24–48 שעות, אירובי

טבלה 1: רשימת המדיה המוצעת לניתוח מיקרוביום של דגימות חלב עם תנאי תרבית מוגדרים.

2. הכנת דגימות חיידקים לניתוח טרשת נפוצה

  1. לפני שמתחילים, הכינו את פתרון מטריצת MALDI
    הערה: תרכובת המטריצה הנפוצה ביותר היא HCCA, חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית. תרכובת זו רגישה לאור, לכן הכינו ואחסנו את המטריצה במיכלים חשוכים או הרחק מאור.
    1. הכן את תערובת הממס באמצעות הפרופורציות הבאות: 50% אצטוניטריל (בדרגת HPLC), 47.5% מים (בדרגת HPLC) ו-2.5% חומצה טריפלואורואצטית (TFA).
    2. ממיסים את המטריצה בתערובת הממס לריכוז סופי של כ-10 מ"ג/מ"ל (או עד לרוויה - עד שגבישים לא מומסים נשארים גלויים).
    3. אם התמיסה אינה צלולה (נותרו גבישים), צנטריפוגה או סנן את התמיסה (למשל, דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר) לקבלת נוזל צלול.
      הערה: אחסון במקרר מותר לתקופות קצרות, בתנאי שמספר נמוך של מחזורי הפשרה.
  2. כדי לזהות חיידקים באמצעות טרשת נפוצה, השתמש באחד משלושת הליכי הכנת הדגימה:
    1. העברה ישירה של מושבה - השתמש בשיטה הפשוטה והמהירה ביותר הזו כאשר מתמודדים עם חיידקים הגדלים היטב ואינם עמידים לליזה, כגון רוב החיידקים הגראם-שליליים.
      1. בעזרת לולאה סטרילית או קיסם, העבירו כמות קטנה (~1 מיקרוליטר) מהמושבה הגדלה לנקודה בצלחת MALDI.
      2. מרחו את החומר החיידקי ישירות על נקודה ייעודית על לוחית המטרה של MALDI ליצירת שכבה דקה ואחידה.
      3. לאחר הייבוש, יש לכסות את המקום ב-1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת HCCA ולאפשר לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר.
    2. מיצוי חומצה פורמית על מטרה - השתמש עבור חיידקים קשים לזיהוי (למשל, גרם חיובי, שמרים) שדפנות התא שלהם מקשות על שחרור חלבונים ללא עיבוד נוסף.
      1. אסוף כמות קטנה של ביומסה חיידקית ממושבת חיידקים בודדת באמצעות לולאה מיקרוביאלית חד פעמית או קיסם סטרילי.
      2. מרחו את החומר החיידקי ישירות על נקודה ייעודית על לוחית המטרה של MALDI ליצירת שכבה דקה ואחידה.
      3. שכבו את החומר החיידקי המרוח ב-1 מיקרוליטר של תמיסת חומצה פורמית של 70% וייבשו באוויר בטמפרטורת החדר.
      4. לאחר הייבוש, יש לכסות את המקום ב-1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת HCCA ולאפשר לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר.
    3. מיצוי חלבון בתוך הצינור (שיטת אתנול/חומצה פורמית) - השתמש בשיטה זו עבור מיקרואורגניזמים קשים לזיהוי, כולל כמה חיידקים גראם חיוביים, שמרים ומיקובקטריה.
      1. בעזרת לולאה או ספוגית סטרילית, העבירו 1-3 מושבות שלמות מצלחת תרבית אגר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 300 מיקרוליטר מים סטריליים.
      2. הוסף 900 מיקרוליטר של אתנול מוחלט כדי להתאים את ריכוז האתנול הסופי לכ-75%. מערבבים או מערבולת מספר שניות.
      3. צנטריפוגה את הדגימה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 15,000 x גרם (טמפרטורת החדר).
      4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.
        הערה: במקרה של זנים ריריים, מומלצת צנטריפוגה נוספת ב-4 מעלות צלזיוס.
      5. השאר את צינור הגלולה פתוח עד שכל שאריות האתנול יתאדו (5-10 דקות, טמפרטורת החדר).
      6. הוסף 20-50 מיקרוליטר 70% חומצה פורמית (FA) לגלולת התא המיובשת. מערבבים על ידי פיפטינג או מערבולת עד שהכדור מושעה במלואו.
        הערה: הנפח צריך להיות פרופורציונלי לכמות החומר הביולוגי.
      7. הוסף נפח שווה של אצטוניטריל (ACN) לתרחיף החומצה הפורמית. מערבבים בזהירות.
      8. צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך 2 דקות (טמפרטורת החדר).
      9. העבירו 1 מיקרוליטר של הסופרנטנט לנקודה ייעודית על לוחית מטרה של MALDI.
      10. הניחו למקום להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.
      11. כסו את נקודת הדגימה המיובשת ב-1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית (HCCA).
      12. אפשר למטריצה להתייבש לחלוטין באוויר בטמפרטורת החדר לפני ניתוח MS (איור 1).
        הערה: 70% חומצה פורמית: קורוזיבית; גורם לכוויות. ידית במכסה אדים. אצטוניטריל: דליק ורעיל. הרחק מלהבות והימנע משאיפה/מגע. חומצה טריפלואורואצטית (TFA): חזקה, קורוזיבית ונדיפה; יש להימנע ממגע עם העור/עיניים ומשאיפה. ללבוש תמיד מעיל מעבדה, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי מגן. טפל בכל הריאגנטים במכסה אדים כדי למנוע שאיפה. הימנע ממגע עור ועיניים; עבדו הרחק מלהבות פתוחות. אסוף פסולת ממס חומצית ואורגנית במיכלים תואמים ומסומנים בבירור לסילוק נאות.

figure-protocol-1
איור 1: עץ החלטות המציג את תהליך בחירת הליך הכנת הדגימה המתאים לזיהוי מבודדי חיידקים באמצעות טכניקת MS. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. רכישת ספקטרום וזיהוי מיקרוביאלי בטכניקת MS

  1. כיול
    הערה: לקביעת מסה מדויקת בטרשת נפוצה, לפני ניתוח דגימות לא ידועות, כייל את המכשיר באמצעות תקנים מתאימים. כיול נכון של המכשיר הוא חיוני לזיהוי אמין.
    1. הכן נקודות כיול על לוחית המטרה MALDI המכילות 1 מיקרוליטר של: (א) תקן בדיקה חיידקית (BTS), המכיל תמצית של Escherichia coli DH5 alpha, המכסה טווח מסה של 3.6-17 kDa (עבור ביוטייפר MBT); (ב) כיול מיקרוביולוגיה המכיל תמצית חלבון E. coli ATCC 25922, ריבונוקלאז ומיוגלובין, המכסה טווח מסה של 3.6-17 kDa (עבור מערכת EXS2600). הניחו לייבוש באוויר וכסו את כתמי הכיול המיובשים ב-1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת HCCA, בדומה להכנת הדגימה.
    2. טען את לוחית המטרה של MALDI המכילה את הדגימות המוכנות ונקודות הקליברנט לתוך המכשיר. הפעל ניתוח כתמים קליברנטיים באמצעות מצב כיול (אוטומטי).
    3. ודא את הכיול כדי להבטיח שדיוק המסה נמצא בגבולות מקובלים על פני (100 עמודים לדקה) טווח המסה שצוין (2-20 kDa).
  2. רכישת ספקטרה
    הערה: כאשר המכשיר מכויל, נרכש ספקטרום מסה מכל נקודת דגימה מוכנה.
    1. פרמטרים כלליים של רכישה
      1. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב יונים חיובי ליניארי.
      2. הגדר את טווח זיהוי המסה בין 2,000-20,000 m/z (2-20 kDa).
    2. השתמש בהגדרות הספציפיות למכשיר הבאות
      1. מתחי מקור יונים: מקור יונים 1 (IS1) ב-20 קילו וולט, מקור יונים 2 (IS2) ב-18 קילו וולט, מתח עדשה ב-9 קילו וולט. מתח התאוצה יכול להיות עד 25 קילוואט.
      2. גלאי כרךtage: הגדר לכ-2.65 קילו וולט.
      3. הגדרות מיצוי יונים פועמות: 100 ns, זמן מיצוי מושהה קבוע ב-230 ns.
      4. הגדרות עוצמת לייזר: התאם ידנית כדי להשיג את איכות הספקטרום הטובה ביותר (לאור מספר האותות ועוצמות האות), בדרך כלל נע בין 40%-65% מההספק המינימלי הנדרש.
      5. מספר יריות לספקטרום: רכוש מספר מספיק של יריות לייזר מאזורים שונים של כל נקודה כדי ליצור ספקטרום סכום עם יחס אות לרעש (S/N) טוב→ (א) ממוצע של 200 יריות, שצולמו בצעדים של 50 יריות מ-4 אזורים שונים של כל נקודה או (ב) רכישה ב-500 צעדי ירייה - 50 יריות מעשרה מיקומים שונים של נקודת המטרה באמצעות מצב AutoXecut.
    3. אסטרטגיית מדידה לדוגמה
      1. מדוד מספר כתמים לכל מבודד (2 נקודות לכל מבודד לפחות).
      2. רכוש ספקטרום בשכפול עבור כל נקודה כדי להבטיח עקביות ודיוק של הממצאים → למדוד בשכפול, במטרה למספר מסוים של ספקטרום כולל לדגימה (4 ספקטרום לדגימה לפחות → שכפולים טכניים).
        הערה: הכניסו דגימות ביולוגיות (לפחות 3) כדי לקבל שכפולים ביולוגיים.

4. זיהוי מיקרואורגניזמים וניתוח נתונים

הערה: זיהוי אורגניזם מתרחש על ידי השוואת פרופיל החלבון המתקבל ("טביעת אצבע" חלבון ספציפית של המיקרואורגניזם) עם מסד נתונים ייחוס, והמתאם המתקבל הן של מיקום האות והן של עוצמתו משמש ליצירת ערך תואם, המתאר את רמת הביטחון שבה הותאם האורגניזם הנחקר למיקרואורגניזם הייחוס המתאים לו. זיהוי מיקרואורגניזמים על ידי השוואת ספקטרום מעובד למאגרי מידע ייחוס.

  1. עיבוד ספקטרה
    1. השתמש בתוכנה מתאימה לעיבוד ספקטרה: (א) flexAnalysis עבור מערכות MALDI Biotyper או (ב) EX-Accuspec עבור מערכות EXS2600.
    2. יש ליישם את שיטת סביצקי-גולאי כאלגוריתם החלקה (רוחב 2 מ'/ז, 10 מחזורים).
    3. בצע תיקון בסיסי להסרת רעשי רקע באמצעות אלגוריתם TopHat (סף S/N = 2, רוחב מסנן TopHat 0.2 Da).
    4. השתמש במצב צנטרואיד כאלגוריתם זיהוי שיא (סף S/N = 2).
  2. השוואת מסדי נתונים ופרשנות ציונים
    1. העלה את ספקטרום המסה המעובד של מבודדים לא ידועים לפלטפורמת MALDI לזיהוי מיקרוביאלי. לאחר מכן, הפעל את הזיהוי.
      הערה: התוכנה הבאה שימשה במחקרים אלה: Biotyper גרסה 4.1.100, Ex-Accuspec גרסה V1. במקרה של תוכנת MALDI Biotyper, מומלץ ליצור ספקטרום ראשי (MSPs) מספקטרום גולמי כדי להבטיח את אמינות ההתאמה הטובה ביותר.
    2. הערך את תוצאות הזיהוי על פי סף תקן היצרן.
      הערה: עבור MALDI Biotyper ו-EXS2600, ערכי הניקוד הם:
      2.300-3.000: זיהוי מינים בסבירות גבוהה;
      2.000-2.299: זיהוי בטוח של הסוג, זיהוי מינים סביר;
      1.700-1.999: זיהוי סוג סביר;
      0.000-1.699: זיהוי לא אמין.
      במהלך הערכת תוצאת הזיהוי הנגזרת מפלטפורמת MALDI Biotyper ממצאי תמיכה באמצעות קטגוריות עקביות: A- מינים עקביים → ההתאמה הטובה ביותר וכל שאר ההתאמות עם ערך ניקוד גבוה דומה (>1.999) מצביעות על אותו מין; B - סוג עקבי → ההתאמה הטובה ביותר והתאמות אחרות עם ערכי ניקוד דומים (1.700 - 1.999) מצביעים על אותו סוג, אך עשויים להיות שונים ברמת המין; C- לא התקיימו דרישות → עקביות לעקביות ברמת המין או הסוג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישה תרבותית
הגישה התרבותית היא אסטרטגיה שמטרתה לגוון באופן מקסימלי את תנאי גידול המיקרואורגניזמים על מנת להגדיל את הסיכוי לבידוד, בין היתר, מינים נדירים, קשים לגידול או שלא תוארו בעבר12. זה מאפשר לקבל תמונה רחבה הרבה יותר של המגוון הביולוגי של המיקרופלורה הקיימת בדגימות שונות, למשל דגימות מזון. ניתן להבחין במגוון מוגבר של מיקרואורגניזמים כבר בשלב ההערכה החזותית של מושבות, הנבדלות זו מזו במורפולוגיה, בצבע, בגודל ובקצב הצמיחה, מה שמשקף את היעילו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוקדש לזיהוי מיקרוביאלי של מוצרי חלב מציע התקדמות חשובה על פני שיטות מסורתיות על ידי הבטחת קונצנזוס אופטימלי על מהירות, אמינות וחסכוניות. עם זאת, כמה שלבים מכריעים בפרוטוקול דורשים תשומת לב קפדנית. ראשית, שלב הבידוד והטיפוח הוא בסיסי. אמצעי התרבות ותנאי הדגירה חייבים להתאים למגוון ולעומס המיקרוביאלי הצפויים. השגת תרביות טהורות היא בעלת חשיבות עליונה, ולעתים קרובות דורשת תת-תרבות כדי להימנע מפרופילים מעורבים המבלבלים את זיהוי הטרשת הנפוצה מכיוון שהפרדה לא מספקת של מושבות או זיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.S., M.Z. ו-P.P. הם חברים במרכז המצוינות של טורון "לקראת רפואה מותאמת אישית" הפועל תחת יוזמת המצוינות-אוניברסיטת המחקר. מחקר זה נתמך כספית במסגרת פרויקט LIDER שכותרתו "פיתוח שיטת הכנה לבידוד לקטופרין פעיל ביולוגית", DPWP/LIDER-XIII/6/2023, במימון המרכז הלאומי למחקר ופיתוח (ורשה, פולין).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה פורמית 70%צ'מפור115676307
אצטוניטרילמרק KGaA1.00014.1011
APT אגרמרק KGaA1.10453.0500
תקן בדיקת חיידקיםברוקר דלטוניק GmbH8255343
CBL אגר (אגר כחול לקטוז סיני)מרק KGaA1.02348.0500
קולומביה בלוד אגר אוקסואידCM0331B
אגר M17
רוזן צלחת החלב אגר (MPCA)אוקסואידcm0681
גברת אגר (דה מאן, רוגוסה ושארפ אגר)מרק KGaA1.10660.0500
MSP 96 מטרה מפלדה מלוטשת BCברוקר דלטוניק GmbH8280800
מי פפטוןסיגמא-אלדריץ'70179
אגר שידלרסיגמא-אלדריץ'91019
דם כבשיםביומקסימהSL0160-100
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אלדריץ'T6508
טריפטית סויה אגר (TSA)סיגמא-אלדריץ'22091
מיםמרק KGaA1.15333.2500
α-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמיתברוקר דלטוניק GmbH8201344

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savage, E., et al. Evaluation of three bacterial identification systems for species identification of bacteria isolated from bovine mastitis and bulk tank milk samples. Foodborne PathogDis. 14 (3), 177-187 (2017).
  2. Holt, J. G., et al. Bergey's manual of determinative bacteriology. , 9th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2000).
  3. Franco-Duarte, R., et al. Advances in chemical and biological methods to identify microorganisms-from past to present. Microorganisms. 7 (5), 130(2019).
  4. Czeszewska-Rosiak, G., et al. The usefulness of the MALDI-TOF MS technique in the determination of dairy samples' microbial composition: Comparison of the new EXS 2600 system with MALDI Biotyper platform. Arch. Microbiol. 206, 172(2024).
  5. Wilson, D. J., et al. Test agreement among biochemical methods, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, and 16S rRNA sequencing for identification of microorganisms isolated from bovine milk. J Clin Microbiol. 57 (3), e01381-e01418 (2019).
  6. Barreiro, J. R., et al. Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J Dairy Sci. 93 (12), 5661-5667 (2010).
  7. Vithanage, N. R., et al. Species-level discrimination of psychrotrophic pathogenic and spoilage gram-negative raw milk isolates using a combined MALDI-TOF MS proteomics-bioinformatics-based approach. J Proteome Res. 16 (6), 2188-2203 (2017).
  8. Ashfaq, M. Y., et al. Application of MALDI-TOF MS for identification of environmental bacteria: A review. J Environ Manage. 305, 114359(2022).
  9. Sugajski, M., et al. New sources of lactic acid bacteria with potential antibacterial properties. Arch Microbiol. 204 (349), 1-13 (2022).
  10. Lagier, J. C., et al. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev. 28 (1), 237-264 (2015).
  11. Złoch, M., et al. Culturomics approach to identify diabetic foot infection bacteria. Int J Mol Sci. 22 (17), 9574(2021).
  12. Bilen, M., et al. The contribution of culturomics to the repertoire of isolated human bacterial and archaeal species. Microbiome. 6 (94), 1-11 (2018).
  13. Bourassa, L., Butler-Wu, S. M. MALDI-TOF mass spectrometry for microorganism identification. Method Microbiol. 42, 37-85 (2015).
  14. Janiszewska, D., et al. Implications of sample preparation methods on the MALDI-TOF MS identification of spore-forming bacillus species from food samples: A closer look at Bacillus licheniformis, Peribacillus simplex, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus flexus, and Bacillus marisflavi. ACS Omega. 8 (38), 34982-34994 (2023).
  15. Valentine, N., et al. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 71 (1), 58-64 (2005).
  16. Wragg, P., et al. Comparison of Biolog GEN III MicroStation semi-automated bacterial identification system with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and 16S ribosomal RNA gene sequencing for the identification of bacteria of veterinary interest. J Microbiol Methods. 105, 16-21 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dairy ProductsMALDI TOF MSMicrobial IdentificationSample PreparationProtein ExtractionMass SpectrometryFood MicrobiologyCulturomics

מאמרים קשורים