מאמר שיטה

יישום של אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד בניתוח חלקיקי ליפופרוטאין הרלוונטיים למחלות לב וכלי דם טרשת עורקים

DOI:

10.3791/68996

⸱

24 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לפתח שיטת ניתוח תת-פרקציה של ליפופרוטאין המבוססת על אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, המספקת בסיס אבחנתי חשוב להערכת סיכון למחלות לב וכלי דם. זה יכול לחלק LDL לשבעה תת-שברים. LDL1 ו-LDL2 מאופיינים כחלקיקים גדולים, בעוד ש-LDL3 עד LDL7 מאופיינים כחלקיקים קטנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C) הוא גורם מפתח בהתפתחות מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (ASCVD). רמות גבוהות של LDL-C קשורות קשר הדוק להיווצרות פלאק טרשת עורקים ולסיכון לאירועים קרדיווסקולריים. עם זאת, ההטרוגניות של LDL משפיעה באופן משמעותי על יכולתו לקדם טרשת עורקים. מחקרים מצביעים על כך שניתן לסווג חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) ל-LDL צפוף קטן (sdLDL) ו-LDL צף גדול (lbLDL). בין אלה, sdLDL נוטה יותר לחדור לאנדותל כלי הדם ויש לו פעילות שינוי חמצוני חזקה יותר, הקשורה במיוחד ל-ASCVD. בחולים עם תסמונת מטבולית, סוכרת והיפרטריגליצרידמיה, רמות ה-LDL-C עשויות להיות תקינות, אך שיעור ה-sdLDL גבוה, מה שמוביל להערכת חסר של הסיכון הקרדיווסקולרי. לכן, זיהוי מדויק של חלקיקי LDL הוא חיוני לריבוד הסיכון ל-ASCVD ולאופטימיזציה של אסטרטגיות התערבות.

שיטות זיהוי LDL-C מסורתיות, כגון נוסחת פרידוולד ומדידה ישירה, משקפות רק את רמות הכולסטרול הכוללות ואינן יכולות להבדיל בין תת-חלקים. שיטות לזיהוי תת-חלקיקי LDL-C כוללות אולטרה-צנטריפוגה (UC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR). עם זאת, לשיטות אלו יש דרישות טכניות גבוהות, פעולות מורכבות או ציוד יקר, מה שהופך אותן לבלתי מעשיות לשימוש קליני נרחב.

טכנולוגיית אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) מפרידה חלקיקי ליפופרוטאין באמצעות אפקט המסננת המולקולרית והבדלי המטען. טכניקה זו משתמשת במערכות ג'ל שיפוע שאינן משנות דנטורציה, בשילוב עם כתמים ספציפיים כמו שחור סודן, המציעות רזולוציה גבוהה, שחזור חזק וקלות תפעול. הקלדת ליפופרוטאין באמצעות טכנולוגיית PAGE יכולה לספק הערכה מקיפה ומדויקת יותר של רמות הליפופרוטאין של המטופלים, ולסייע בהחלטות טיפול קליניות. מאמר זה הציג חמש תוצאות מייצגות. גודל חלקיקי ה-LDL הממוצע של מדגם A, B, C, D, E הוא 275.3 Å, 266.6 Å, 258.2 Å, 257.4 Å ו-252.9 Å, מה שמצביע על סיכון נמוך, שולי, קל, בינוני וחמור למחלות לב וכלי דם עקב דיסליפידמיה, בהתאמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על פי דוח ארגון הבריאות העולמי משנת 2021, מחלות לב וכלי דם (CVD) נותרו גורם המוות המוביל בקרב מחלות אנושיות. הדו"ח מצביע על כך ש-17.9 מיליון אנשים ברחבי העולם מתו ממחלות לב וכלי דם בשנת 2019, המהווים כמעט שליש ממקרי המוות העולמיים1. ASCVD, סוג של CVD, הוא גורם המוות המוביל בקרב תושבים עירוניים וכפריים בסין, ומהווה למעלה מ-40% מכלל מקרי המוות2. טרשת עורקים היא מחלת כלי דם דלקתית כרונית המונעת על ידי גורמי סיכון מסורתיים ולא מסורתיים3. הוא מאופיין בתצהיר שומנים בדופן העורק4, התפשטות רקמות סיביות והסתיידות, מה שמוביל בסופו של דבר לעיבוי דופן כלי הדם, ירידה בגמישות והיצרות הלומן. דיסליפידמיה היא גורם הסיכון המשמעותי ביותר ל-ASCVD, כאשר LDL-C הוא גורם סיכון פתוגני ל-ASCVD, וממלא תפקיד מכריע בהתפתחות ASCVD5. מחקרים אפידמיולוגיים רבים, מחקרי אקראיות מנדליאניים וניסויים אקראיים מבוקרים הראו באופן עקבי כי רמות LDL-C בפלזמה נמצאות בקורלציה חיובית עם הסיכון ל-ASCVD. הפחתת רמות LDL-C יכולה להפחית את הסיכון ל-ASCVD6.

LDL הוא הליפופרוטאין העיקרי האחראי על הובלת כולסטרול אנדוגני בגוף7. LDL בפלזמה הוא הטרוגני, המורכב ממגוון חלקיקים בגדלים, צפיפויות והרכבים כימיים שונים8. לחלקיקי LbLDL יש צפיפות נמוכה יותר וגודל גדול יותר, בעוד שלחלקיקי sdLDL יש צפיפות גבוהה יותר וגודל קטן יותר. הטרוגניות LDL עומדת בבסיס ההשפעות הביולוגיות המגוונות שלו9. חלקיקי LbLDL גדולים יותר בקוטר (≥ 25.5 ננומטר), צפיפותם נמוכה יותר (קרוב ל-1.02 גרם/מ"ל) ורופפים במורפולוגיה, המורכבים מ-LDL1 ו-LDL2. חלקיקי LbLDL מכילים כמות גבוהה יותר של אסטרי כולסטרול. הם נוטים פחות להתחמצן או לחדור לאנדותל כלי הדם, מה שהופך אותם לבטוחים יותר יחסית. לעומת זאת, לחלקיקי sdLDL יש קוטר קטן יותר (< 25.5 ננומטר)10, צפיפות גבוהה יותר (קרוב ל-1.06 גרם/מ"ל) ומבנה צפוף, המורכב מ-LDL3 עד LDL7. חלקיקי SdLDL מכילים כמות נמוכה יותר של אסטר כולסטרול אך רמות גבוהות יותר של טריגליצרידים ואפוליפופרוטאין B (ApoB) בהשוואה ל-lbLDL. התכונות הפיזיקליות שלהם גורמות להם לחדור למחסום האנדותל העורקי. מתחת לתת-אנדותל, חלקיקי sdLDL מתחמצנים על ידי מיני חמצן תגובתיים (ROS) ליצירת LDL מחומצן (ox-LDL)11. Ox-LDL מעכב את פעילות סינתאז תחמוצת החנקן האנדותל (eNOS), מפחית את ייצור ה-NO וגורם לתאי אנדותל לבטא VCAM-1/MCP-1, ומקדם הידבקות ונדידה של מונוציטים12. התאים החד-גרעיניים האנדותליים הנודדים מתמיינים למקרופאגים, הקולטים את ox-LDL ללא הגבלה דרך קולטני הנבלות. הצטברות אסטר כולסטרול תוך תאי הופכת לתאי קצף, שהם מרכיבי הליבה של פסי שומנים טרשת עורקים. תאי קצף מפרישים גורמים דלקתיים כגון IL-1β ו-TNF-α, המרחיבים עוד יותר את המתח החמצוני ואת הנזק לאנדותל, ויוצרים לולאת משוב חיובית13. זה יכול להפעיל דלקת בתאי אנדותל, מקדם היווצרות תאי קצף ומאיץ את התקדמות הפלאק. שני מחקרי עוקבה גדולים הראו כי ל-sdLDL-C יש ערך ייחוס קליני גדול יותר מאשר LDL-C בחיזוי והערכת הסיכונים הפוטנציאליים של ASCVD14-15. אך שיטת זיהוי LDL-C מסורתית אינה יכולה לבדוק חלקיקי ליפופרוטאין בשל מגבלת השיטה.

חלקיקי LDL (LDL-P) משקפים את מספר חלקיקי ה-LDL ליחידת נפח דם ומשמשים כנשאים למולקולות LDL, שכל אחת מהן מכילה מולקולת ApoB אחת ומולקולות כולסטרול מרובות. LDL-C מייצג את המסה הכוללת של כולסטרול הנישא על ידי חלקיקים אלה. רמות LDL-C מושפעות ממספר חלקיקי ה-LDL וצפיפות הכולסטרול, שאולי לא משקפים באופן מלא את הסיכון בפועל16. לדוגמה, לחולים עם תסמונת מטבולית, סוכרת או היפרטריגליצרידמיה עשויות להיות רמות LDL-C תקינות אך LDL-P גבוהות באופן חריג (עקב חלקיקים קטנים יותר ותכולת כולסטרול נמוכה יותר). אפילו רמות LDL-C עומדות ביעד, LDL-P גבוה עדיין יכול להגביר את הסיכון הקרדיווסקולרי השיורי. מחקרים הראו כי LDL-P מנבא יותר מכל פרמטר אחר הקשור ל-LDL17. ניתוח תת-חלקיקי ליפופרוטאין הוא קריטי להבנת הפתוגנזה של ASCVD, הערכת סיכון שיורי והנחיית טיפול מדויק. בשנים האחרונות, הנחיות מקומיות המליצו גם על חלקיקי LDL כאינדיקטורים להערכת סיכון ASCVD או ניטור טיפול18.

ASCVD הוא גורם המוות המוביל בעולם. אסטרטגיות המניעה והבקרה שלו תלויות במידה רבה בניהול השומנים. נכון לעכשיו, הבדיקה של אנשים עם דיסליפידמיה בפרקטיקה הקלינית מסתמכת בעיקר על ארבע בדיקות שומנים מסורתיות, כולל טריגליצרידים (TG), כולסטרול כולל (TC), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-C) ו-LDL-C. בנוסף, סמני שומנים אחרים כגון ליפופרוטאין (a), אפוליפופרוטאין A1 (ApoA1) ו-ApoB משמשים בעיקר לאוכלוסיות בסיכון גבוה של ASCVD19, כגון חולי סוכרת, חולי יתר לחץ דם ומעשנים או כאלה שרמות ה-LDL-C שלהם נשלטו אך עדיין מהווים סיכון גבוה.

ככל שהמחקר התקדם, המגבלות של בדיקות השומנים המסורתיות הפכו ברורות יותר ויותר, במיוחד ביעילות האזהרה המוקדמת והסבר הסיכון השיורי. מספר לא מבוטל של חולי ASCVD מאובחנים בתחילה עם רמות שומנים תקינות, מה שהופך את LDL-C ללא יעיל לאזהרה ראשונית. נתונים אפידמיולוגיים מראים כי לכ-20% מהחולים עם תסמונת כלילית חריפה יש רמות LDL-C בטווח הנורמלי (<3.4 ממול/ליטר) עם קבלתם, מה שמצביע על כך שבדיקת שומנים מסורתית עלולה לפספס אנשים בסיכון גבוה. יתר על כן, גם לאחר השגת יעדי LDL-C, חולי ASCVD עדיין עשויים להתמודד עם סיכון קרדיווסקולרי שיורי גבוה. בחולים אלה, לא ניתן להסביר את רוב אירועי העורקים הכליליים הנותרים על ידי ירידה ברמות ה-LDL-C. לכן, בדיקת LDL-C פשוטה עשויה שלא לענות באופן מלא על הצרכים הקליניים לאבחון וטיפול ב-ASCVD, מכיוון שבדיקות שומנים שגרתיות אינן יכולות להבדיל בין lbLDL-C ל-sdLDL-C.

מחקרים מרובים אישרו מתאם ברור בין חלקיקי ליפופרוטאין ל-ASCVD. תוצאות חריגות מבדיקת תת-פרקציה של ליפופרוטאין יכולות לשמש אזהרה למניעה ראשונית של ASCVD אצל אנשים עם רמות שומנים תקינות, ולסייע בזיהוי קבוצות סיכון נסתרות. למניעה משנית של ASCVD, כאשר רמות ה-LDL-C כבר נמצאות בטווחי היעד, בדיקת תת-חקירה של ליפופרוטאין יכולה לעזור להעריך את הסיכון השיורי ולהנחות את המשך הטיפול20. לכן, איתור תת-חלקיקי LDL חדשים צפוי לספק יעדים חדשים למניעה וטיפול בדיסליפידמיה ו-ASCVD בהשוואה לבדיקות שומנים מסורתיות.

מערכת הזיהוי והניתוח במעבדה שלנו משתמשת בעיקר ב-PAGE כדי להפריד תת-חלקיקים של ליפופרוטאינים על סמך גודלם ומטענם. חלקיקי ליפופרוטאין מופרדים בעיקר לפי גודל עקב סינון מולקולרי במטריצת הפוליאקרילאמיד על ידי PAGE. מולקולות קטנות נודדות במהירות בעוד שמולקולות גדולות מונעות על ידי חסימה סטרית ונודדות לאט. וככל שמולקולה נושאת יותר מטען, כך היא נודדת מהר יותר. שיטה זו יכולה לחלק במהירות ליפופרוטאינים לשנים עשר תת-חלקים. LDL מחולק לשבעה תת-חלקים, המסומנים כ-LDL1 עד LDL7. לכולם גדלים, צפיפויות, תכונות פיזיקוכימיות, התנהגויות מטבוליות ופוטנציאל טרשת עורקים. LDL1 ו-LDL2 מסווגים כ-lbLDL, בעוד ש-LDL3 עד LDL7 מסווגים כ-sdLDL. טכניקות זיהוי תת-פרקציה של ליפופרוטאין כוללות UC, HPLC ו-NMR. עם זאת, בשל דרישות ציוד גבוהות, פעולה מורכבת וצריכת זמן, היישום הקליני שלהם מוגבל יחסית21. שיטת PAGE מפרידה ביעילות בין חלקי משנה שונים של LDL, מה שהופך אותה לידידותית יותר למשתמש בהשוואה לטכניקות אחרות. הציוד המשמש הוא חסכוני ונייד, מה שהופך אותו למתאים יותר לשימוש נרחב במעבדות שגרתיות קליניות. מחקר זה נועד לאמת את PAGE כשיטה מהירה וחסכונית לניתוח תת-חלקיקי LDL בדגימות סרום כדי לתמוך בקבלת החלטות קליניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הדגימות במחקר זה מוערכות ומאושרות על ידי ועדת סקירת האתיקה של בית החולים העממי המחוזי של גואנגדונג (מספר אישור: KY2025-435-01). כל המשתתפים חתמו על הסכמה מדעת בכתב לפני הניסוי.

1. הכנת ערכה

  1. הכנת מאגר הג'ל
    1. הכנת 30% אקרילאמיד (ACR): שוקלים 30 גרם אקרילאמיד, מוסיפים 80 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה ומתאימים ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש.
    2. הכנת ביסקרילאמיד 1% (BIS): שוקלים 1 גרם ביסקרילאמיד, מוסיפים 80 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה ומתאימים ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש.
    3. הכנת 25% סוכרוז: שוקלים 25 גרם סוכרוז, מוסיפים 70 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה ומתאימים ל-100 מ"ל לאחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. הכנת 10% אמוניום פרסולפט (APS): ממיסים 0.1 גרם אמוניום פרסולפט ב-1 מ"ל מים נטולי יונים ומשתמשים מיד.
    5. הכנת 1M Tris (pH = 6.8): שוקלים 121.14 גרם של trishydroxymethylaminomethane, מוסיפים 800 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה ומתאימים את ערך ה-pH ל-6.8, ואז יוצרים עד 1000 מ"ל.
    6. הכנת 1M Tris (pH = 8.6): שוקלים 121.14 גרם של trishydroxymethylaminomethane, מוסיפים 800 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה ומתאימים את ערך ה-pH ל-8.6, ואז יוצרים עד 1000 מ"ל.
      הערה: בעת טיפול באקרילאמיד, יש ללבוש כפפות גומי בוטיל, משקפי מגן, ביגוד מגן ולפעול במכסה אדים. במקרה של מגע בעור, יש לשטוף מיד במים וסבון, ולאחר מכן לפנות לטיפול רפואי. במקרה של שאיפה, עברו לאוויר צח.
  2. הכנת ג'ל הפרדה
    1. קח צינור זכוכית נקי ואטום את השכבה התחתונה בסרט איטום.
    2. הוסף 8.29 מ"ל של 30% ACR, 17.76 מ"ל של 1% BIS, 10 מ"ל של 25% סוכרוז, 1 מ"ל של 10% APS, 10 מ"ל של 1M Tris (pH = 8.6), 0.1 מ"ל של טטרמתיל-אתילנדיאמין (TEMED) ו-32.85 מ"ל של מים נטולי יונים לכוס נקייה ברצף. מערבבים היטב לקבלת 80 מ"ל ליקר אם (עם ריכוז פוליאקרילאמיד של 3.3%) ומוסיפים לצינור הזכוכית ב-1.2 מ"ל לשורש. יש לפלמר בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות ולאטום את הנוזל במים מטוהרים כדי להבטיח משטח נוזלי שטוח.
  3. הכנת דבק מרוכז
    1. הוסף 4.07 מ"ל של 30% ACR, 3.05 מ"ל של 1% BIS, 5 מ"ל של 25% סוכרוז, 0.5 מ"ל של 10% APS, 5 מ"ל של 1M Tris (pH = 6.8), 0.05 מ"ל של TEMED ו-32.33 מ"ל מים נטולי יונים לכוס נקייה ברצף, ערבב היטב כדי לקבל 50 מ"ל של משקה אם (עם ריכוז פוליאקרילאמיד של 3.05%), הוסף לצינור הזכוכית ב 0.2 מ"ל לשורש. יש לפלמר בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות ולאטום את הנוזל במים מטוהרים כדי להבטיח משטח נוזלי שטוח.
  4. הכנת תמיסת השימור
    1. שוקלים 6.4 גרם טריס, 75 גרם סוכרוז, 2.5 מ"ל גליצרין ו-0.3 מ"ל PC-300 (חומר משמר אנטיבקטריאלי) ומוסיפים 800 מ"ל מים נטולי יונים, מערבבים להמסה, מכוונים את ערך ה-PH ל-6.8 ולבסוף מדללים ל-1000 מ"ל. ריכוז Tris-HCl הוא כ-52 מ"מ.
  5. הכנת תמיסת מכתים שחורה של סודן
    1. שוקלים 0.03 גרם שחור סודני וממיסים אותו בתערובת של 2 מ"ל אתילן גליקול, 6 מ"ל אתנול נטול מים ו -2 מ"ל דימתיל סולפוקסיד. לאחר הסינון, חלקו אותו ל -1 מ"ל לכל בקבוקון.
      הערה: בעת טיפול בסודאן שחור ודימתיל סולפוקסיד, יש ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן כדי למנוע מגע ישיר. הפעולות חייבות להתבצע בסביבה מאווררת. יש לשטוף מיד את העור והעיניים במים לאחר החשיפה, ולאחר מכן לפנות לטיפול רפואי במידת הצורך.
  6. אריזה פנימית
    1. אריזה מלאה בהתאם לדרישות הרכב הערכה.

2. הרכב ערכה

  1. ודא שהמוצר מכיל עמודים טרומיים, תמיסת שימור ותמיסת כתמים שחורה סודנית. העמודים הטרומיים צריכים להכיל אקרילאמיד, ביסקרילאמיד, סוכרוז, אמוניום פרסולפט, טריס וטטרמתיל-אתילנדיאמין. אורך העמוד הטרומי הוא 75 ± 0.5 מ"מ, הקוטר הפנימי הוא 5.5 ± 0.02 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 7.0 ± 0.02 מ"מ. התמיסה המשמרת צריכה להכיל טריס, סוכרוז, גליצרין וחומרים משמרים. תמיסת הצביעה השחורה של סודאן צריכה להכיל שחור סודן, אתילן גליקול, אתנול נטול מים ודימתיל סולפוקסיד. ודא שמפרטי האריזה שונים בהתאם לכמות העמודים הטרומיים. מנה אחת של מגיב חייבת להיות בעלת עמודה טרומית אחת. אין לשלב ערכות ריאגנטים של קבוצות שונות, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על תוצאות הניסוי.

3. הכנת מדגם

  1. הכנת המטופל: ודא שהמטופל נמצא על בטן ריקה בזמן שאיבת דגימות דם.
  2. השתמש בצינורות דגימת ג'ל להפרדת סרום ובצע את איסוף הדגימות בהתאם לנוהל ההפעלה הסטנדרטי. יש להפריד את הדם בהקדם האפשרי לאחר איסוף הדם כדי למנוע המוליזה.
  3. בדוק את דגימות הסרום לאחר ההפרדה בהקדם האפשרי בטמפרטורת החדר. אם לא ניתן לבצע בדיקה מיידית, אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס עד 7 ימים או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 30 יום.
  4. החזר את הדגימות לטמפרטורת החדר וערבב היטב לפני השימוש, במיוחד עבור הדגימות הקפואות והמופשרות. הקפאה והפשרה חוזרת ונשנית אינה מותרת מכיוון שהיא עלולה לפגוע בשלמות הדגימה. גם דגימות ליפמיה וגם המוליזה עשויות להשפיע על תוצאות הבדיקה. אם מדובר בדגימת ליפמיה או המוליזה קלה, מומלץ לבצע צנטריפוגה במהירות גבוהה ב-14,462 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לדגימות ליפמיה, השתמש בפיפטה כדי לשאוב את כל השכבה השקופה מלמטה. לדגימות המוליזה, אספו את הסופרנטנט. לאחר מכן העבירו אותו לצינור צנטריפוגה חדש וכתם. עם זאת, אם הליפמיה או ההמוליזה חמורות מאוד, מומלץ לשאוב שוב דם.

4. שלבי פעולה

  1. הכנה
    1. הוצא עמודים טרומיים ודוגמאות לבדיקה. השתמש בפיפטה כדי לשאוב את נוזל השימור השיורי מיציאת הדגימה של עמודים טרומיים. איזון עמודים ודגימות טרומיים לטמפרטורת החדר והמיס 14.3 גרם אבקת חיץ אלקטרופורטית עם 800 מ"ל מים נטולי יונים.
  2. צבע
    1. קח צינורות צנטריפוגה נקיים ומספר אותם. מספר הצינורות תואם את סדר צינורות איסוף הדם. הוסף את צינורות הצנטריפוגה ביחס של 50 מיקרוליטר דגימה לתמיסת צביעה שחורה של 10 מיקרוליטר סודן, ערבב היטב ותן לו לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים.
      הערה: עקרון הצביעה של שחור סודאן מבוסס על תכונתו הליפופילית. זה יכול לגרום לתגובות כרומוגניות ספציפיות עם חומרים ליפידים כגון שומנים ניטרליים, פוספוליפידים וסטרואידים בתוך התאים, וכתוצאה מכך חלקיקים חומים-שחורים או שחורים כהים. במערכת זו, ביצענו אופטימיזציה של זמן הצביעה והמינון באמצעות תכנון ניסיוני חד-גורמי עם הפרוטוקול הבא. נבחרות שלוש דגימות סרום LDL-C (ריכוזים גבוהים, בינוניים ונמוכים), עם נפחי צביעה מתאימים של 5 מיקרוליטר, 10 מיקרוליטר, 15 מיקרוליטר ו-20 מיקרוליטר, בהתאמה. משך הצביעה נקבע על 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 25 דקות, 30 דקות, 35 דקות, 45 דקות ו-60 דקות. נערכים ניסויים אלקטרופורטיים, ואחריהם ניתוח בגווני אפור של הרצועות האלקטרופורטיות כדי לוודא את יעילות הצביעה. התנאים האופטימליים נקבעים כנפח צביעה של 10 מיקרוליטר עם משך צביעה של 30 דקות ± 5 דקות. נפח ומשך צביעה נמוכים יותר גורמים לכולסטרול ליפופרוטאין מוכתם קלוש. בעוד שהתנאים האופטימליים השיגו איזון, אין צורך בנפח ומשך צביעה גבוהים יותר.
  3. הפרדה יונופורטית
    1. הכנס עמודים מאוזנים מראש לשקע הגומי של מיכל האלקטרופורזה. יציאת הדגימה של עמוד הג'ל נמצאת במרחק של כ -2 ס"מ מפקק הגומי. ודא שהוא סגור היטב ולא מתרחשת דליפה. כאשר מספר עמודי הג'ל לדוגמה אינו מלא, מלאו את החלל הריק בפקק גומי ללא חורים.
    2. לאחר מכן שפכו מאגר אלקטרופורזה למיכל העליון והתחתון. הסר את הבועות בפתח העמודים הטרומיים. הוסף 25 מיקרוליטר של דגימות מוכתמות ליציאת הדגימה של עמודים טרומיים.
    3. כסו את המכסה, חברו את מתג ההפעלה והגדירו את הפרמטרים של מתח (U = 100 V), זרם (I = 3 mA/צינור), הספק (P = 120 W), זמן (T = 70 דקות) להפרדת אלקטרופורזה.
      הערה: כרךtagה, הספק וזמן הם פרמטרים קבועים. יש להגדיר את הזרם בהתאם למספר דגימות הבדיקה (למשל, 10 צינורות דגימה, I = 3 mA x 10 צינורות = 30 mA).
    4. לאחר השלמת האלקטרופורזה, כבה את החשמל, הסר את המכסה ושפך את מאגר האלקטרופורזה בחלקו העליון של מכשיר האלקטרופורזה. הוציאו את עמודי הג'ל בתורם והניחו אותם על מסגרת הקיבוע, שפכו את מאגר האלקטרופורזה העודף על המשטח העליון ונתחו במערכת ניתוח הסריקה.
  4. ניתוח סריקה
    הערה: סוג המנתח הוא DY-03, ותוכנת הסריקה היא KBL 3.3.9 GD.
    1. הפעל את מתג ההפעלה של מנתח הסריקה, לחץ פעמיים על תוכנת מערכת שולחן העבודה ולחץ על אוסף כדי להיכנס לממשק התוכנה. לחץ על ייצוא מגש דגימה בממשק התוכנה, הנח עמודות ג'ל על מתלה הדגימה כשקצה הדגימה פונה לכיוון החלק הפנימי של המכשיר. ודא שעמודות הג'ל ממוקמות במיקומים הממוספרים המתאימים. עמדות 25 ו-26 מיועדות לבדיקות בקרת איכות בלבד.
    2. לחץ על ייבוא מגש דגימה בממשק התוכנה כדי לייבא את מגש הדגימה להתקן. לחץ על סרוק כדי לקבל תמונות סריקה לדוגמה. למכשיר מערכת פוקוס אוטומטי מובנית. הוא מתאים אוטומטית את המיקוד בין מודול הסריקה לצינור הג'ל כדי להבטיח הדמיה ברורה. התוכנה מזהה אוטומטית את המיקום ההתחלתי (VLDL) ואת מיקום הסיום (HDL) של האלקטרופורוגרמה. כאשר מתגלים פסגות ברורות במיקומים אלה, התוכנה ננעלת על אזור הניתוח המיועד לניתוח ספקטרלי.
    3. לאחר הזנת פרטי המטופלים וסריקת הברקוד, לחץ על ניתוח ועיבוד בממשק התוכנה, המערכת תנתח ותפיק דוחות בדיקה באופן אוטומטי. לחץ על העלה LIS כדי להעביר דוחות בדיקה למערכת LIS.
    4. הוצא עמודים טרומיים לאחר סריקה וניתוח וטפל בהם בהתאם למפרט הפסולת הרפואית.

5. בקרת איכות

  1. בצע בדיקת בקרת איכות של שתי רמות לפני בדיקת דגימה יומית. שלבי הפעולה של בדיקת בקרת האיכות זהים לאלה של בדיקת מדגם. ייחוס מסוג A הוא קוטר החלקיקים הממוצע הגדול מ-268 Å. התייחסות מסוג B היא קוטר החלקיקים הממוצע הקטן מ-265 Å.
    הערה: ניתוח תוצאות: סוג A, גודל חלקיקי ה-LDL הממוצע הוא >-268 Å, LDL1 ו-LDL2 מהווים יותר, מה שמעיד על סיכון נמוך למחלות לב וכלי דם. סוג ביניים (סוג INT), גודל חלקיקי ה-LDL הממוצע הוא 265 עד 268 Å, מה שמצביע על כך שהיחס בין LDL3 ל-LDL7 הוא מעל הערך הקריטי. סוג B, גודל חלקיקי ה-LDL הממוצע הוא <-265 Å, LDL3 עד LDL7 מהווים יותר, מה שמעיד על סיכון גבוה למחלות לב וכלי דם.

6. שיפורים טכניים

  1. כדי להבטיח תוצאות אבחון מדויקות, יש ליישם את השיפורים הטכניים הבאים.
    1. בדיקה מוקדמת: ודא שהמטופלים צמים במלואם לפני איסוף הדם. השתמש בסרום או בפלזמה נוגדת קרישה EDTA במקום בפלזמה נוגדת קרישה של הפרין. ודא שהפיפטה מדויקת בקליטתה. הימנע מדגימות כילוס או המוליטיות חמורות.
    2. במהלך הבדיקה: הגדר פרמטרים של אלקטרופורזה של מתח (U = 100 V), זרם (I = 3 mA / צינור), הספק (P = 120 W), זמן (T = 70 דקות) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ללבוש כפפות סטריליות כדי למנוע זיהום של צינורות זכוכית שעלול להשפיע על היכולת לצלם ולסרוק.
    3. לאחר בדיקה: בעת הפקת דוחות, סקור כרומטוגרמות חריגות לאיתור הפרעות פוטנציאליות ובצע ניתוח חוזר כדי להימנע ממתן מסקנות אבחון שגויות.
      1. הכרומטוגרמה הנורמלית: במיקום ההתחלתי של VLDL ובמיקום הסיום של HDL, לשניהם יש שיא מובהק (ראה סעיף תוצאות מייצגות).
      2. כרומטוגרמה אנומלית: במיקום ההתחלתי של VLDL או במיקום הסיום של HDL אין או יותר משיא אחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נועד להמציא שיטה המשתמשת ב-PAGE לאיתור תת-חלקיקי ליפופרוטאין בסרום של המשתתפים. המטרה היא לקבוע אם חלקיקי ה-LDL-C הם בעיקר חלקיקים גדולים (LDL1 ו-LDL2) או חלקיקים קטנים (LDL3 עד LDL7). לאחר צביעה בשחור סודן, הדגימות מופרדות על ידי מכשיר האלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד. לאחר מכן מופרדים ליפופרוטאינים לרצועות נפרדות בתוך צינורות הג'ל, וניתוח תת-שבר מבוצע באמצעות מערכת ניתוח סריקה.

המכשיר האנליטי מחשב את צורת השיא ואת שטח השיא מאלקטרופורזה הסורקת תמונות בגווני אפור. באמצעות מרחקי נדידת שי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שתפקידו של sdLDL כגורם סיכון קרדיווסקולרי בהתפתחות טרשת עורקים אושר על ידי מחקר, אין כיום שיטה מבוססת לזיהוי תת-חלקיקי LDL. במהלך העשורים האחרונים חלה התקדמות משמעותית בפיתוח שיטות זיהוי עבור תת-חלקיקי LDL. UC נחשב לתקן הזהב. הוא יכול להפריד בין חלקי LDL על סמך הבדלי הצפיפות שלהם, ולהבחין בין sdLDL ל-lbLDL ברזולוציה גבוהה. עם זאת, שיטה זו דורשת אולטרה-צנטריפוגות יקרות וזמן צנטריפוגה ארוך, מה שעלול לפגוע ברכיבי חלקיקים לא יציבים. בנוסף לחוסר היכולת לכמת LDL-P, הדיוק של UC משתנה ממעב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מפרויקט קרן המחקר למדע וטכנולוגיה רפואית של מחוז גואנגדונג (A2024108).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת חיץ אלקטרופורטיתחברת הטכנולוגיה גואנגשי קאנגבולאי25030401להכנת תמיסות חיץ ומתן תנאי אלקטרופורזה
מוצרי בקרת איכות בעלי ערך גבוהחברת הטכנולוגיה גואנגשי קאנגבולאי25030301לניטור דיוק ודיוק
תמיסת הפרדת צפיפות דגימה של ליפופרוטאין (אלקטרופורזה של ג'ל שיפוע)חברת הטכנולוגיה גואנגשי קאנגבולאיLSS60-SB1-A1  25030301להפרדת רכיבי תת-סוג ליפופרוטאין מדגימות סרום
מוצרי בקרת איכות בעלי ערך נמוךחברת הטכנולוגיה גואנגשי קאנגבולאי25030301לניטור דיוק ודיוק
תמיסת מכתים שחורה של סודןחברת הטכנולוגיה גואנגשי קאנגבולאיLSS60-SB1-A1  25030301לצביעה לדוגמא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LDLLDLSudan BlackLDL

מאמרים קשורים