מאמר שיטה

בדיקת LIVE/DEAD אופטימלית בשילוב עם ציטומטריית זרימה לכימות הישרדות לאחר מתח בתאי שמרים

DOI:

10.3791/69005

⸱

29 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הישרדות לאחר לחץ בדגימות שמרים. הבדיקה משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים, SYTO 9 ופרופידיום יודיד (PI), כדי לכמת את שלמות קרום הפלזמה. הוא משתמש בזרימה ציטומטרית כדי לספק הערכות כמותיות וניתנות לשחזור של חלקי התאים החיים, המתים והפגומים עבור דגימות פוסט-מתח חמצוני.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות הישרדות הוא משימה נפוצה וקריטית בחקר השמרים. כתמים חיים/מתים המבוססים על שלמות קרום הפלזמה מספקים בדיקה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה להישרדות שמרים בשילוב עם ציטומטריית זרימה. עם זאת, וריאציות במאגר הצביעה, ריכוז הצבע, זמן הדגירה והגדרות ציטומטריית הזרימה יכולות להשפיע על איכות הנתונים ויכולת השחזור. פרוטוקול זה מציג מבחן LIVE/DEAD סטנדרטי לכימות הישרדות לאחר לחץ בשמרים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר טיפול בקנדידה גלברטה, פתוגן שמרים אופורטוניסטי, במינונים שונים של מי חמצן, הדגימות שלאחר הלחץ נצבעו בכתם LIVE/DEAD דו-רכיבי המורכב מ-SYTO 9 ופרופידיום יודיד (PI). ציטומטריית זרימה שימשה כדי להבחין בין אוכלוסיות תאים חיים, פגומים ומתים ולכמת את האחוזים שלהם בכל דגימה. הערכות ההישרדות המבוססות על אחוז הסטטיסטיקה של החיים הושוו לתוצאת היחידה ליצירת מושבה (CFU) באותו מדגם. שתי השיטות הניבו תוצאות עקביות עבור דגימות שטופלו במינון מדומה וקטלני (1 M H2O2). במינון תת-קטלני של 100 מ"מ H2O2, SYTO 9/PI העריך שיעור הישרדות גבוה יותר מ-CFU, מה שמשקף הבדל מרכזי בין השניים, כאשר הפרוטוקול המוצג כאן מעריך את הישרדות התאים מיד לאחר הלחץ, בעוד CFU מכמת את אחוז התאים המסוגלים להתאושש ולהתרבות. לפיכך, פרוטוקול זה מודד כדאיות בשלב מוקדם יותר של תהליך מוות תאי. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מספק חלופה מהירה וניתנת להרחבה ל-CFU לכימות הישרדות לאחר לחץ בשמרים. תוצאותיו מספקות מידע משלים ל-CFU על ידי הערכת הישרדות בשלב מוקדם יותר והבחנה בין תאים מתים לפגומים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תת-פילום השמרים הניצנים מכיל מודלים ביולוגיים וביוטכנולוגיים חשובים רבים. משימה נפוצה וקריטית בחקר שמרים היא כימות ההשפעה של הפרעות גנטיות או סביבתיות, האחרונות כוללות עקה או טיפולים תרופתיים. בתסיסה תעשייתית, למשל, על היצרנים לפקח על הכדאיות של תרביות שמרים כדי להבטיח את היעילות והאיכות של תהליך התסיסה 1,2. כאשר חוקרים מיני שמרים פתוגניים, מדידת הישרדותם לאחר עקה או טיפול אנטי פטרייתי היא קריטית להבנת הבסיס הגנטי והמכניסטי לתכונות הקשורות לזיהום כגון עמידות נגד פטריות. מדידת הישרדות על צנתרים ומשטחים היא גם משימה חשובה במסגרות קליניות3. כל התרחישים המגוונים הללו דורשים גישות כמותיות שיכולות למדוד במהירות ובדייקנות את התוצאה של טיפולים תרופתיים ולחץ.

השיטות הקיימות להשגת המטרה הנ"ל מתחלקות לשלוש קטגוריות עיקריות על סמך מה שהן מודדות. הקטגוריה הראשונה מודדת קלונוגניות, או היכולת של תאי שמרים בודדים ליצור מושבה אחת בעקבות הלחץ. השיטה המייצגת בקטגוריה זו היא בדיקת היחידה ליצירת מושבה (CFU). הקטגוריה השנייה מודדת חיוניות, המסתמכת על זיהוי פעילויות אנזימטיות בתאים חיים. דוגמאות כוללות בדיקות כימיות כגון צבע FUN-14. הקטגוריה השלישית של שיטות מודדת את שלמות קרום הפלזמה - אובדן בלתי הפיך של שלמות קרום הפלזמה נחשב ל"נקודת האל-חזור "למוות תאים5. דוגמאות לקטגוריה זו כוללות צבעים פלואורסצנטיים כגון פרופידיום יודיד (PI).

עבודה זו מציגה בדיקת LIVE/DEAD אופטימלית בשילוב עם זרימה ציטומטרית כדי להשיג כימות מהיר וניתן להרחבה של הישרדות השמרים לאחר טיפול במאמץ. בדיקה זו המבוססת על חדירות הממברנה מהירה יותר מ-CFU, ולוקחת 15-30 דקות של צביעה בהשוואה ל-24-48 שעות של דגירה להיווצרות מושבות. כמו כן, דגימות מוכתמות בכתם LIVE/DEAD ניתנות לבדיקה בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה בנוסף למיקרוסקופיה, המודדת עשרות אלפי תאים תוך מספר שניות ויכולה לעבד בקלות דגימות של 96 בארות לבדיקות תפוקה גבוהות. כתוצאה מכך, בדיקה זו מהירה, כמותית וניתנת להרחבה. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בכתם LIVE/DEAD דו-רכיבי המורכב מ-SYTO 9 ו-PI להשגת כוח פתרון משופר. SYTO 9 מסמן את כל התאים, חיים או מתים, בעוד ש-PI נכנס רק לתאים עם ממברנות פלזמה שנפגעו 6,7. לכן, תאים חיים צוברים רק SYTO 9 בעוד שתאים מתים צוברים גם SYTO 9 וגם PI. מכיוון של-PI יש זיקה גבוהה יותר מ-SYTO 9 לחומצת גרעין, הוא מוציא באופן תחרותי את האחרונה בתא8. כמו כן, שני הצבעים יוצרים זוג העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET), שבו פליטת SYTO 9 נספגת על ידי PI כעירור שלה. כתוצאה מכך, תאים מתים מציגים ירוק מושתק ופלואורסצנטיות אדומה חזקה. לעומת זאת, תאים חיים מציגים פלואורסצנטיות ירוקה בהירה8. הבדל זה מאפשר בידול טוב יותר בין תאים חיים ומתים בנוכחות שינויים בעוצמת הקרינה בתוך כל קבוצה.

מאז הדיווח הראשוני על יישומו בשמרים בשנת 2004, השימוש ב- SYTO 9 / PI במחקרי שמרים היה נקודתי ומוגבל במידה רבה להערכות איכותניות באמצעות מיקרוסקופיה 7,9,10,11,12,13,14,15. מגבלה עיקרית לאימוצו כמבחן כמותי להישרדות שמרים היא היעדר אפיון שיטתי והשוואה לשיטות בשימוש נרחב כגון CFU. פרוטוקול זה מתאר בדיקה סטנדרטית הכוללת את מאגר הצביעה, ריכוז הצבע, זמן הצביעה והגדרות ציטומטריית הזרימה, שנמצאו כממזערים חפצים ומייצרים תוצאות הניתנות לשחזור כאשר הם מיושמים על C. glabrata ושני מיני שמרים אחרים16. מכיוון שצביעת SYTO 9/PI חושפת אוכלוסיית תאים "פגומה" ביניים השונה הן מהתאים החיים והן מהתאים המתים בדפוס הצביעה שלהם, היא יכולה להשלים את CFU על ידי חשיפת מידע ניואנסים יותר על השפעות הטיפול בלחץ על תאי שמרים, מה שעשוי לאפשר יישומים חדשים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. יישום מתח מי חמצן

  1. לפחות יום לפני הניסוי, יש לחסן תרבית לילה של C. glabrata ממושבה בודדת על צלחת מפוספסת טרייה לתוך 3 מ"ל של חומר סינתטי שלם (SC) (1.7 גרם/ליטר בסיס חנקן שמרים, תערובת חומצות אמינו מלאה, 2% משקל/נפח גלוקוז, מים), ולתרבית אותו על ידי הנחת צינור הזכוכית בתוף רולר ולגדול ב-30 מעלות צלזיוס. לחלופין, ניתן להשתמש בשייקר מסלולי על ידי הצבת צינור הזכוכית בזווית מלוכסנת וניעור התרבית ב-200 סל"ד.
    1. מדוד את הצפיפות האופטית (OD600) של תרבית הלילה למחרת בבוקר ודלל אותה במדיית SC טרייה ל-OD600 ~ 0.2 בנפח כולל של 10 מ"ל. תן לו לגדול במשך שתי הכפלות, שלוקחות כ-4 שעות, כדי להגיע לשלב האמצע (OD600 ~ 1).
      דוגמה: אם לתרבית לילה יש OD600 = 10, הוסף 200 מיקרוליטר של תרבית זו למדיית SC של 9.8 מ"ל.
  2. תוך 30 דקות לפני הטיפול במאמץ, הכינו את אמצעי הלחץ של מי חמצן. לדלל באופן סדרתי מי חמצן מהמלאי של 30% (9.798 M) למדיה סינתטית שלמה (SC) לריכוז הרצוי. כלול טיפול מדומה (SC ללא תוספת מי חמצן) ומינון קטלני (1 M מתאים ל - C. glabrata).
    דוגמה: כדי ליצור מדיית מתח מי חמצן של 100 מ"מ, הוסף 10.3 מיקרוליטר ממלאי מי חמצן 9.798 M ל-1 מ"ל SC. פיפטה בעדינות לערבב. כדי ליצור מדיה של לחץ מי חמצן של 10 מ"מ, יש לדלל 500 מיקרוליטר מאמצעי הלחץ של מי חמצן של 100 מ"מ ל-4.5 מ"ל של SC.
  3. מדוד את ה-OD600 של תרבית ה-mid-log ותקן אותו, למשל, OD600 = 1, על ידי הוספת מדיית SC.
    דוגמה: תרבית אמצע היומן היא ב-OD600 = 1.2. הוסף מדיית SC של 0.2 מ"ל לכל 1 מ"ל תרבית.
  4. העבר תרבית בול עץ בינונית של 600 מיקרוליטר לכל תנאי בדיקה לצלחת באר עמוקה של 96. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיבה מבלי להפריע לכדורית התא.
  5. הוסף 600 מיקרוליטר של אמצעי מתח מדומה או מי חמצן שהוכנו בשלב 1.2 לכל באר ופיפטה בעדינות כדי להשעות מחדש את התאים.
  6. דגרו את הצלחת למשך 120 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-300 סל"ד.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בשאלה הביולוגית המעניינת.

2. יישום כתם SYTO 9/PI

  1. לפני הניסוי, הכינו לפחות 10 מ"ל מאגר מלח סטרילי של 0.85%.
    הערה: מצאנו 0.85% מאגר מי מלח כדי לייצר חפצי צביעה מינימליים, כלומר, תאים לא מוכתמים ודמויי מת בדגימות שטופלו במדמה, בהשוואה למים נטולי יונים או אמצעי גידול16.
  2. הכן תמיסת מלאי עבודה של PI ב-0.2 מ"מ באמצעות מים סטריליים ונטולי יונים.
    הערה: ניתן לאחסן מלאי עבודה זה של PI עד 6 חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. מיד לפני הניסוי, הכינו תמיסת מלאי SYTO 9 עובדת ב -33.4 מיקרומטר עם מים סטריליים ונטולי יונים.
    הערה: הכן את מלאי העבודה של SYTO 9 טרי לכל ניסוי. אין לאחסן ולעשות שימוש חוזר.
  4. פיפטה בעדינות כדי לערבב את התאים בכל באר מצלחת הטיפול. מדוד OD600 של כל מצב טיפול וחשב את כמות המאגר הדרושה כדי להשעות מחדש את התאים ל-OD600 של 1.
    הערה: ניתן להשתמש בפיפטות רב-ערוציות לערבוב יעיל ואחיד. הימנע מערבוב יתר של הדגימות.
  5. אסוף תאי שמרים לאחר הטיפול המדומה או הלחץ על ידי צנטריפוגה ב -3,000 x גרם למשך 5 דקות. יש להסיר את ה-supernatant בזהירות באמצעות שאיפה. השעו מחדש תאים במאגר מי מלח סטרילי של 0.85% ל-OD600 = 1 (מחושב בשלב 2.4).
    הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להשעות מחדש את התאים. טפל בכל התרבויות שלאחר הטיפול בזהירות והימנע מערבוב יתר.
  6. שמור 50 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לשמש כבקרות צביעת צבע לא מוכתמות ויחידות.
    הערה: אוטופלואורסצנטיות מינימלית נמצאה עבור C. glabrata מסוג בר בשני הערוצים עבור SYTO 9 ו-PI. עם זאת, בדוק תמיד דגימות לא מוכתמות עבור אוטופלואורסצנציה ובצע חיסור רקע נכון או השתמש באמצעי גידול אוטו-פלואורסצנטיים נמוכים.
  7. Aliquot 16 מיקרוליטר של דגימה לאחר הטיפול מושעה במאגר מלח של 0.85% לצינור PCR של 50 מיקרוליטר. הוסף 2 מיקרוליטר ממלאי העבודה של 0.2 מ"מ של PI לתרחיף התא. לאחר מכן הוסף 2 מיקרוליטר ממלאי העבודה של 33.4 מיקרומטר של SYTO 9 לאותו צינור לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.
    1. הריכוזים הסופיים של PI ו-SYTO 9 יהיו 20 מיקרומטר ו-3.34 מיקרומטר, בהתאמה. פיפטה בעדינות לערבב ולדגור במשך 30 דקות בחושך (ניתן להשתמש בקופסה שחורה) בטמפרטורת החדר.

3. הגדרה וכיול של ציטומטר הזרימה

הערה: יש לעשות זאת על כל מכשיר חדש וגם על יישומים חדשים של צביעת SYTO 9/PI, כולל עבור זן/זן אחר, גורם לחץ חדש או פרוטוקול גדילה וכו'. ההגדרות שלהלן פותחו על ציטומטר זרימה Attune NxT. עיין במדריך למשתמש של המכשיר בשימוש להוראות ספציפיות.

  1. בחר תעלות/מסננים פלואורסצנטיים מתאימים עבור ציטומטר הזרימה: מסנן פס פס של 530 ננומטר ± 30 ננומטר (BL1) ומסנן מעבר ארוך של 600 ננומטר (> 600 ננומטר, BL3) שימשו לאיסוף אותות בערוצים הירוקים (SYTO 9) והאדומים (PI ו- SYTO 9). שניהם התרגשו עם לייזר כחול של 488 ננומטר.
  2. הגדר את קצב הזרימה ל-200 מיקרוליטר לדקה ועצור כאשר נאספו לפחות 30,000 אירועים.
    הערה: ניתן להתאים את מספר האירועים לדגימה במטרה להשיג הערכות חזקות של האחוזים. יש לשלול דגימות עם מעט מדי אירועים (תאים). השלב הבא הוא התאמת מתחים בערוצי FSC ו-SSC במהלך ההתקנה הראשונית.
  3. יש לדלל דגימה לא מוכתמת של 16 מיקרוליטר לתוך מאגר מלח סטרילי של 200 מיקרוליטר 0.85%. יש לערבב בעדינות את הפיפטה מיד לפני ציטומטריית הזרימה. הפעל דגימה זו והתאם את המתחים של ערוצי FSC ו-SSC כך שהאוכלוסייה תהיה במרכז ה-FSC לעומת עלילת צפיפות SSC.
    הערה: מתח של 345 mV ו-399 mV שימש עבור FSC ו-SSC, בהתאמה. השלבים הבאים הם התאמת כרךtages בערוצי האיסוף (BL1 ו-BL3) במהלך ההתקנה הראשונית.
  4. מערבבים 24 מיקרוליטר דגימה מטופלת עם 24 מיקרוליטר של 1000 מ"מ דגימה שטופלה במי חמצן או נהרגה בחום.
  5. חלקו את דגימת התאים החיים והמתים המעורבת לשלוש שפופרות של 16 מיקרוליטר כל אחת. מכתים את שלושת הצינורות עם (1) 2 מיקרוליטר SYTO 9 ו-2 מיקרוליטר מים למשך 30 דקות; (2) 2 מיקרוליטר PI ו-2 מיקרוליטר מים למשך 30 דקות; (3) 2 מיקרוליטר SYTO 9 ו-2 מיקרוליטר PI למשך 30 דקות. עקוב אחר פרוטוקול הצביעה מהסעיף הקודם.
    1. לאחר הדגירה, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר מלח סטרילי של 0.85% לכל צינור. כעת הם מוכנים לזרימה ציטומטרית.
  6. הפעל את הצינור (1) כדי לכוונן את כרךtage של ערוץ הקרינה הירוקה (BL1); לאחר מכן הפעל את הצינור (2) כדי לכוונן את המתח של הקרינה האדומה (BL3). המטרה היא שמצב התפלגות העוצמה של כל ערוץ יהיה ~104-10 5 כדי לנצל את הטווח הדינמי המלא של המכשיר.
    הערה: אנא עקוב אחר ההוראות של ציטומטר הזרימה הספציפי שלך בעת התאמת כרךtage. לחלק מציטומטרי הזרימה יש מתחים קבועים, ושלב זה מושמט.
  7. הפעל שפופרת (3) כדי לבדוק אם אוכלוסיות התאים החיים והמתים מופרדות היטב. התאם את מתח ערוץ BL1 או BL3 במידת הצורך.
    הערה: כרךtage של 200 mV שימש הן עבור ערוצי BL1 והן עבור BL3 ב-Attune NxT.
  8. הפעל את הדגימה המטופלת והלא מוכתמת תחת הגדרות המתח שנקבעו כדי להבטיח שלדגימה יש אוטופלואורסצנטיות מינימלית בערוצים המעניינים (<102).

4. הפעלת דגימות על ציטומטר הזרימה

  1. החל את הגדרות ציטומטר הזרימה שנקבעו לעיל והפעל תחילה את הדגימה הלא מוכתמת כדי להבטיח שאותות האוטופלואורסצנציה יהיו מתחת ל-102 בערוצי BL1 ו-BL3 כאחד.
  2. הוסף 200 מיקרוליטר 0.85% מאגר מלח לכל דגימה מוכתמת והפעל אותו על ציטומטר הזרימה.
    הערה: אם נבדקים מספר דגימות, העבר את שלב הצביעה כך שכל דגימה תהיה מוכתמת במשך 30 דקות לפני הפעלתה על ציטומטר הזרימה.
  3. ייצא פלט ציטומטריית זרימה כקבצי .fcs (תקן FCS 3.0 או 3.1).

5. ניתוח נתונים ב-R

הערה: קובץ Script לניתוח לדוגמה מסופק כקובץ משלים 1. אסטרטגיות שער לדוגמה מסופקות בסעיף תוצאות מייצגות.

  1. התקן וטען את החבילות הנדרשות: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. ייבא קבצי .fcs לסביבת R הנוכחית.
  3. התאם את שמות הקבצים וציין תנאי טיפול.
  4. צור תרשים צפיפות דו-ממדי עבור כל האירועים ב-FSC. H נגד SSC.H. השתמש בשער מצולע כדי לא לכלול אירועים שאינם תאים. תן לשער זה את השם "תאים".
    הערה: בציטומטרים מסוימים של זרימה, פרמטר השטח מומלץ על פני גובה. בדוק המלצות ספציפיות למכשיר.
  5. עבור האוכלוסייה המגודרת "תאים", צור תרשים צפיפות דו-ממדי ב-FSC. H לעומת FSC.W. בדרך כלל, שני אשכולות נראים עם טווחים דומים של FSC. H אבל FSC.W שונה. האשכול עם FSC ממוצע נמוך יותר. רמת W מכילה את התאים הבודדים ("סינגלים"). צייר שער מצולע כדי לבחור אותם וקרא לשער "סינגלים".
  6. עבור האוכלוסייה המגודרת "סינגלטים", צור תרשים צפיפות דו-ממדי על BL1. H נגד BL3.H. צייר שערי מצולע עבור אוכלוסיות חיות, פגומות ומתות בהתבסס על בקרות תאים חיים ומתים. דוגמה ניתנת בסעיף תוצאות מייצגות.
  7. קבע הישרדות באמצעות האחוזים של כל אוכלוסייה וייצא את הסטטיסטיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבע SYTO 9/PI מבדיל בין תאי שמרים חיים לתאים מתים על סמך אותות הקרינה שלהם בתעלות הירוקות (500 ננומטר-560 ננומטר) והאדומות (>600 ננומטר). תאים חיים, שצוברים רק SYTO 9, זוהרים חזק בתעלה הירוקה, עם אותות אדומים מינימליים. תאים מתים צוברים הן SYTO 9 והן PI וצפויים להאיר חזק בתעלה האדומה, עם אותות פלואורסצנטיים ירוקים נמוכים יותר בהשוואה לתאים חיים עקב הדרה תחרותית של SYTO 9 על ידי PI ו-FRET.

פרוטוק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בדיקת LIVE/DEAD באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיים, SYTO 9 ו-PI, ושימוש בזרימה ציטומטרית כדי לכמת הישרדות לאחר מתח בשמרים. בעוד ששני כתמים אלה יושמו להערכת הישרדות במיני שמרים שונים בספרות וזמינים כערכה מסחרית, לא מדריך היצרן ולא הספרות מספקים פרטים מספקים על פרוטוקול הצביעה או הגדרות ציטומטריית זרימה7. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי הנובע מאפיון שיטתי של הבדיקה, כולל מאגר צביעה אופטימלי, ריכוזי צבע, זמן צביעה והגדרות ציטומטריית זרימה. ניסויים נוספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר מייקל דיילי ולמרכז קארבר להדמיה על הכשרתם ותמיכתם במיקרוסקופיה. ברצוננו להודות לחברים בעבר ובהווה במעבדה לרגולציה גנטית על משוב שלא יסולא בפז על הפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוח באר בעומק 96 בארותתרמו פישר278606NUNC 96
Attune NxT זרימת ציטומטר עם קורא לוחותתרמו פישר A24858A24858אוטוסמפלר (A42901)
Candida glabrataCG99, זן מעבדה שמקורו בבידוד קליני (Cormack & פאלקו, 1999)
ערכת FungaLight Yeast LIVE/DEADתרמו פישר A24858L34952מכיל SYTO 9 (3.34 מ"מ) ויודיד פרופידיום (20 מ"מ). שני הרכיבים הללו ניתנים גם לרכישה נפרדת מספקים שונים.
מי חמצןסיגמא אולדריץ'H1009
מיקרוסקופ Leica Confocal SP8לייקהTCS SP8 X
כלוריד נתרןסיגמא אולדריץ'S9888משמש לייצור תמיסה עיקרה של 0.85% NaCl
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינוסיגמא אולדריץ'Y0626שימש לייצור מדיה מלאה סינתטית עם תערובת גלוקוז וחומצות אמינו של 2%

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Candida glabrataSYTO 9

מאמרים קשורים