מאמר שיטה

מיצוי RNA מותאם על בסיס פנול חם ממיקובקטריות: גישה חסונה לניתוח מהימן של ביטוי גנים

176 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מבצע אופטימיזציה לשיטת מיצוי RNA המבוססת על פנול חם עבור Mycobacterium, המניבה RNA באיכות גבוהה המתאים לניתוחים טרנסקריפטומיים. בהשוואה ל-TRIzol ו-RNeasy תחת תנאים זהים, השיטה הניבה תפוקה גבוהה יותר, שלמות דומה ויעילות כלכלית משופרת, ובכך היא מהווה חלופה מעשית למחקרי ביטוי גנים בקנה מידה רחב.

תקציר

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) נותר איום בריאותי גלובלי מרכזי, מה שמדגיש את הצורך במחקרי טרנסקריפטומיקה מהימנים להבנת הביולוגיה שלו ומנגנוני העמידות לתרופות. ניתוחים אלו תלויים בהשגת RNA באיכות גבוהה ובשyield גבוה. למרות שקיימות מספר שיטות להפקת RNA, רבות מהן דורשות ריאגנטים יקרים, נפחי תרבית גדולים או ציוד מיוחד, מה שמגביל את התאמתן למחקרי רחבי היקף, במיוחד במסגרות עם משאבים מוגבלים. כאן מוצגת שיטה מותאמת לאופטימיזציה של הפקת RNA המבוססת על פנול חם (Hot Phenol), המותאמת במיוחד למייקובקטריית. השיטה משתמשת בנפח תרבית מינימלי ובריאגנטים נפוצים כדי להפיק בעקביות RNA באיכות גבוהה המתאים ליישומים טרנסקריפטומיים בעדי throughput גבוה. כמות ה-RNA ושלמותו הוערכו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וניתוח שלמות RNA (RIN), והתאמתו ליישומים המשכיים אוששה באמצעות qPCR ו-Qubit 4. כדי להשוות את ביצועי השיטה המותאמת, בוצעה הפקת RNA מקבילה באמצעות TRIzol ו-RNeasy תחת תנאים ניסיוניים זהים, כולל אותם מיני Mycobacterium, נפח תרבית, שלבי צמיחה (לוגריתמי וסטציונרי) ותנאי ליזיס. הדבר אפשר השוואה ישירה של הyield, האיכות, ההיתכנות והעלות. שיטת הפנול החם המותאמת הראתה yield ואיכות RNA דומים או משופרים, תוך הפחתה משמעותית בעלות הריאגנטים ובתלות בציוד מיוחד. בשל יעילותה, השחזרתיות שלה ומחיריה הנגישים, פרוטוקול זה מספק חלופה מעשית למחקרי ביטוי גנים וטרנסקריפטומיקה רחבי היקף ב-Mtb ובמיני מייקובקטריית אחרים.

מבוא

M. tuberculosis (Mtb), הגורם למחלת השחפת (TB), נותר הגורם המוביל למשם מפתוגן זיהומי יחיד, ועוקף את HIV/AIDS. בשנת 2024, השחבת הייתה אחראית לכ-1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. נטל זה מוחמר בשל השכיחות הגוברת של זנים העמידים לתרופות מרובות (MDR) ועמידים לתרופות רחבות (XDR). לפיכך, קיים צורך דחוף להבין את הבסיס המולקולרי של הפתוגנזה של השחבת ולזהות מטרות טיפוליות חדשות2.

פרופיל תעתוק של Mtb הפך לכלי חשוב להבנת מרכיבים פונקציונליים המעורבים באינטראקציות בין מאחס לפתוגן3, הסתגלות לעקה סביבתית4, ומנגנונים העומדים בבסיס עמידות לתרופות5. מתודולוגיות מתקדמות כגון real-time PCR, מערכי מיקרו (microarrays) וריצוף RNA‏ (RNA-seq) שיפרו משמעותית את היכולת לנתח את הטרנסקריפטום של המיקובקטריה6. עם זאת, הצלחתן של שיטות אלו תלויה רבות בזמינות של RNA באיכות גבוהה, אשר תלויה בתורה בליזיס יעיל של התאים במהלך המיצוי. דופן התא המורכבת של Mtb, המורכבת מ-mycolyl–arabinogalactan–peptidoglycan, הופכת את מיצוי ה-RNA לקשה במיוחד7. טכניקות ליזיס קיימות, כולל הידרוליזה אנזימטית8, סוניקציה9 וטחינה בחרוזי זכוכית (bead-beating)10, דורשות לעיתים קרובות ציוד יקר ונפחי תרבית גדולים, מה שמגביל את המעשיות שלהן במעבדות BSL-3 רבות. בנוסף, קצב הצמיחה האיטי של Mtb מחייב זמני תרבית ממושכים כדי להשיג ביומסה מספקת11.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, פותחה שיטה מהירה וכלכלית ומותאמת להסתרת RNA המבוססת על פנול חם (Hot Phenol). תוך שימוש ב-3 mL בלבד של תרבית בשלב לוגיבי בינוני, השיטה מניבה 45–60 µg של RNA באיכות גבוהה המתאים לניתוחים טרנסקריפטומיים בהמשך. ליזיס של התאים משיגים באמצעות דוחס רקמות ידני קומפקטי וריאגנטים זמינים, מה שמבטל את הצורך במכשירים יקרים. למרות ששיטת הפנול החם דווחה בעבר11,12, שיטת הפנול החם המותאמת משפרת את הנוחות, את היעילות הכלכלית ואת תבואת ה-RNA. האופטימיזציה בוצעה באמצעות M. smegmatis mc2155 (Msmeg) ותוקפה בהצלחה עם Mtb H37Rv.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול של Mycobacterium

  1. יש להחדיר 1mL ממלאי הגליצרול של Msmeg או Mtb לתוך 10 mL של מצע Middlebrook 7H9 המועשר ב-0.2% גליצרול, 0.05% Tween 80 ו-10% ADC בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 150 rpm עד שה-OD מגיע ל-1–1.5.
  2. יש לגדל את התרבית המשנית על ידי הוספת 1% מהתרבית הראשונית ל-10 mL של מצע 7H9 עד לשלב הלוגריתמי המוקדם, OD600nm = 0.6–0.7.
  3. יש לחלק למנות של 3 mL ולסבב את התרביות בצנטריפוגה ב-2000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (23–25 °C).
  4. יש לאחסן את המשקעים בטמפרטורה של -80 °C עד להפקת ה-RNA.
    אזהרה: עבור תרביות Mtb, יש לפעול לפי הנחיות BSL3 המתאימות ולבצע אינאקטיבציה תרמית למשקע ב-95 ˚C למשך 20–25 דקות.
    הערה: איור 1 מציג את תרשים הזרימה של השלבים הבסיסיים שבוצעו במהלך הפקת ה-RNA בשיטת הפנול החם.

דיאגרמה של מיצוי RNA בשיטת פנול חם; זרימת העבודה מציגה סבב צנטריפוגה, הפרדה לשכבות (פאזות), וניתוח של שלמות ה-RNA.
איור 1: ייצוג סכמטי של שיטת הפנול החם (Hot-Phenol) והניתוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיצוי RNA

  1. שיטת הפנול החם (שיטת HP)
    1. הוסיפו 200 µL של באפר TES (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoethanol) למשקע התאים והשעיקו את המשקע באמצעות וורטקס.
    2. הוסיפו כ-0.1 g של חרוזי סיליקה בגודל 0.1 mm לדגימה. השתמשו במערבל רקמות ידני במשך 10–15 שניות עד שהמשקע מופשר לחלוטין על קרח. חזרו על שלב זה ב-2 מחזורים נוספים, ולאחרי כל חזרה בצעו הקפאה מהירה בחנקן נוזלי.
    3. או השתמשו במכשיר לפיסוח חרו지를 (bead ruptor) מהיר על השולחן למשך דקה אחת בהגדרת מהירות 5 (5.0 m/s) בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב זה ל-3 מחזורים והדגרו את הדגימה על קרח כדי למנוע חימום לאחר כל מחזור.
      הערה: חזרו על ליסיס תאי Mtb למשך 6–8 מחזורים (כל מחזור למשך דקה אחת) עם מערבל רקמות ידני או עם מכשיר לפיסוח חרוזים, וקררו לסירוגין על קרח לאחר כל מחזור. השתמשו במים שעובדו ב-DEPC (Diethylpyrocarbonate) להכנת כל הבאפרים והריאגנטים הדרושים להפקת RNA.
    4. הוסיפו 200 µL נוספים של באפר TES (חממו מראש ל-65 °C) לכל דגימה כדי להשלים את הנפח ל-400 µL. לכל דגימה, הוסיפו 200 µL של פנול חומצי (פנול המאוזן עם באפר ציטראט 100 mM, pH 4.5) ו-200 µL של כלורפורם (ערבבו את הפנול החומצי והכלורפורם ביחס שווה לפני ההוספה לדגימה).
    5. הדגרו את הדגימה ב-65 °C על בלוק חימום עם ניעור במהירות 900 rpm למשך 30 דקות וסבבו בצנטריפוגה ב-12000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו הפרדה תקינה של הפאזות לאחר הסבוב (ניתן יהיה להבחין בפאזה מימית עליונה צלולה המכילה RNA, פאזה ביניים מובחנת של DNA, ופאזה אורגנית תחתונה המכילה חלבונים וליפידים).
    6. הסִירו את השכבה העליונה של הפאזה המימית והעבירו אותה למבחנה חדשה של 1.5 mL במיקרוצנטריפוגה. הוסיפו שוב נפח שווה של פנול חומצי: כלורפורם. סבבו בצנטריפוגה ב-12,000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו הפרדה תקינה של הפאזות.
    7. העבירו את השכבה המימית העליונה למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה של 1.5 mL, ואז הוסיפו 30 µL של באפר סודיום אצטט 3 M, pH 5.3, ו-240 µL של איזופרופנול מקורר. הדגרו ב-−80 °C למשך 30 דקות עד שעה.
      הערה: ניתן לשמור את מבחנת המיקרוצנטריפוגה למשך הלילה ב-80 °C - בשלב זה. אטמו את מבחנת המיקרוצנטריפוגה עם מספר שכבות של פאראפילם כדי למנוע פתיחתה ב-65 °C במהלך ההדגרה.
      אזהרה: פנול וכלורפורם הם כימיקלים מסוכנים; לכן, יש להשתמש בציוד מיגון אישי (PPE) מתאים, בבקרות הנדסיות כמו מנדפות כימיות, ולפעול לפי נהלי סילוק פסולת ספציפיים.
    8. סבבו בצנטריפוגה ב-12,000 x g למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודאו היווצרות משקע והסִירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע.
    9. השעיקו את המשקע ב-1 mL של אתנול 75% וסבבו בצנטריפוגה ב-12,000 x g למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. בצעו שלב זה פעמיים וייבשו את המשקע באוויר.
    10. השעיקו את המשקע ב-50 µL של מים נטולי נוקלאז.
      ​הערה: כדי להמיס RNA, הדגרו אותו במים נטולי RNase למשך 10–30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שיטת TRIzol
    1. הוסיפו 200 µL של ריאגנט TRIzol למשקע התאים.
      אזהרה: TRIzol הוא כימיקל מסוכן; לכן, יש להשתמש בציוד מיגון אישי (PPE) מתאים, בבקרות הנדסיות כמו מנדפות כימיות, ולפעול לפי נהלי סילוק פסולת ספציפיים.
    2. בצעו את שיטת הליסיס התאי כפי שמתואר בשלבים 2.1.2 - 2.1.3.
    3. הוסיפו 200 µL נוספים של ריאגנט TRIzol, ולאחר מכן 200 µL של כלורפורם, וערבבו בוורטקס למשך דקה אחת. סבבו בצנטריפוגה ב-13,400 x g למשך 15 דקות ב-4 °C. ודאו הפרדה תקינה של הפאזות לאחר הסבוב.
    4. העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה של 1.5 mL.
    5. שקיעו את ה-RNA על ידי הוספת 500 µL של איזופרופנול לפאזה המימית והדגרה ב-−80 °C למשך 30 דקות עד שעה.
    6. שקיעו את ה-RNA לסביב בניסוב בצנטריפוגה ב-15,000 x g למשך 20 דקות ב-4 °C. התבוננו בזהירות במשקע והסִירו את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע.
    7. השעיקו את המשקע עם 1 mL של אתנול 75% וסבבו בצנטריפוגה ב-13,400 x g למשך דקה אחת ב-4 °C. חזרו על שלב זה פעמיים, ייבשו את המשקע באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, והשעיקו ב-50 µL של מים נטולי נוקלאז.
  3. שיטה באמצעות ערכה מסחרית להפקת RNA
    1. השעיקו את משקע התאים ב-200 µL של באפר השעיה (Resuspension buffer, מסופק בערכה).
    2. בצעו את שיטת הליסיס התאי כפי שמתואר בשלבים 2.1.2 - 2.1.3.
    3. בצעו את המשך הניסוי לפי הוראות היצרן.

3. טיפול ב-DNase, כימות וויזואליזציה

  1. כדי להסיר זיהום של DNA גנומי, יש להוסיף 1 µL של DNase I (10units) ו-5 µL של RDD buffer (1x) לכל דגימת RNA ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. יש לכמת את דגימת ה-RNA באופן ספקטרופוטומטרי באמצעות Nanodrop ואת שלמות ה-RNA באמצעות Qubit4. ערך RIN מקובל הוא בין 7.5 ל-10. ערכים מקובלים עבור A260/A280 ועבור A260/A230 הם בטווחים 1.8–2.0 ו-2.0–2.2, בהתאמה.
  3. יש לוויזואליזציה של ה-RNA על ג'ל agarose בריכוז 1% תוך שימוש ב-1X RNA loading dye.

4. סינתזת cDNA ו-PCR כמותי בזמן אמת (quantitative real-time PCR)

  1. הכינו תגובת 20 µL להכנת cDNA באמצעות ערכה ל-cDNA Reverse Transcription ו-1 µg RNA, בהתאם להוראות היצרן, בטרמיקלר (thermal cycler).
  2. הכינו תגובת real-time PCR בנפח של 10 µL תוך שימוש ב-50 ng של cDNA, 0.4 µM מכל פריימר ו-SYBR לפי הוראות היצרן. הריצו את הדגימה בטרמיקלר ל-Real-Time PCR.
    הערה: הפריימרים הבאים שימשו לניתוח qPCR:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. ניתוח סטטיסטי

  1. בצעו t-test של Student עבור כל החזרות הביולוגיות באמצעות Graph Pad Prism; ערך של P ≤ 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. פסי השגיאה מייצגים שגיאה תקנית של לפחות שלוש חזרות ביולוגיות.

תוצאות

איכות ותוצאת RNA

איכות וכמות ה-RNA הוערכו באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז (איור 2). פסים ברורים וחדים המתאימים ל-23S ו-16S rRNA נצפו בכל שיטות המיצוי, מה שמאשר בידוד מוצלח של RNA כולל. שיטות ה-Hot Phenol וה-TRIzol הראו שלושה פסים ברורים המייצגים את 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) ו-5S rRNA (~120 bp), מה שמעיד על RNA שלם ואיכותי. לעומת זאת, שיטת הערכה המבוססת על עמודה הראתה רק את פסי ה-23S וה-16S, כאשר פס ה-5S rRNA היה חסר או מתחת לסף הגילוי, ככל הנראה בשל אובדן מועדף של RNA קטן במהלך טיהור בעמודה. מבחינה כמותית, שיטת ה-Hot Phenol הניבה פי 1.5–2 יותר RNA מאשר TRIzol ו-RNeasy בהתאמה (איור 2A,C). התנובות הממוצעות היו ~60 µg עבור Hot Phenol, ~45 µg עבור TRIzol ו-~30 µg עבור RNeasy, האחרונה מייצגת תנובה נמוכה ב-~50% מזו של Hot Phenol. למרות ההבדלים בתנובה, שלמות וטוהר ה-RNA היו דומים בין השיטות (איור 2D,E).

כדי להעריך את יעילות גישת הליזיס, RNA חולץ גם באמצעות bead ruptor. התוצאות הראו תנובה, איכות ושלמות דומות, מה שמוכיח כי ניתן להשיג ליזיס יעיל באמצעות גריס רקמות ידני פשוט, ללא תלות בציוד ייעודי כגון bead ruptor/beater (איור 2B,F–H).

כיוון ש-Mtb עמיד יותר לליזיס מאשר Msmeg, תיקפנו באופן נוסף את שיטת הפנול החם (Hot Phenol) המותאמת באמצעות זן Mtb H37Rv. ליזיס של התאים באמצעות גריינדר לרקמות וגם באמצעות שובר חרו지를 (bead ruptor) הניב RNA בעל תנובה, איכות ושלמות גבוהים (איור 3A–D), ובכך אישש את חסונו של התהליך. על אף שמיצוי RNA באמצעות גריס רקמות ידני הניב תפוקה נמוכה יותר (~35–45 µg/3 מ"ל תרבית) בהשוואה למכשיר bead ruptor (50–60 µg(3 מ"ל/), נמצא כי ההבדל אינו מובהק סטטיסטית, וכן הכמות הייתה בטווח המקובל המספיק למחקרי ביטוי גנים רחבי היקף. כל פעולות מיצוי ה-RNA חזרו על עצמן מספר פעמים, וכל השכמי החזרים הביולוגיים העצמאיים הוצגו. ניתוח דנסיטומטריה בוצע על תמונות הג'ל, המהווה תיקוף נוסף להבדלים הסטטיסטיים ביבול ה-RNA בין השיטות השונות, כאשר שיטת הפנול החם (Hot Phenol) הניבה את היבול הגבוה ביותר (נספח איור 1A–D).

טוהר ושלמות ה-RNA

כל השיטות הניבו RNA עם יחסי A260/A280 מקובלים סביב 2.0, המעידים על זיהום חלבוני מינימלי (איור 2D). שלמות ה-RNA (מדד RIN) הייתה דומה בכל השיטות, כאשר הערכים נעים בין 7.5 ל-10 (איור 2D–H, נספח איור 2, פאנל תחתון). נתון זה מעיד על איכות טובה, שלמות ופירוק מינימלי.

ניתוח qPCR כמותי לבדיקת איכות ה-RNA

כדי להעריך את התאמת ה-RNA שחולץ בכל שיטה למחקרי ביטוי גנים המשכיים, בוצע qRT-PCR. בחנו את ביטוי הגנים של גן בית (housekeeping gene) של *M. smegmatis*, mysA ( MSMEG 2758), ושני ווסתי שעתוק, sigE (MSMEG 5072) ו- סיג-H (sigH) (MSMEG 1914), תוך שימוש בכמויות שוות של RNA קלט. ערכי ה-Ct (סף המחזור) שהתקבלו משקפים את השפע היחסי של RNA שלם הניתן להגברה בכל דגימה. כפי שמוצג ב-איור 2I), RNA שהופק באמצעות פנול חם ו-TRIzol הניב ערכי Ct דומים בטווח של כ-22–25, מה שמעיד על שלמות גבוהה יותר של ה-RNA ותאימות לשעתוק הפוך ולהגברה. בעוד ששיטת הערכה (kit) הראתה ערכי Ct גבוהים מעט יותר (~27–30), המעידים על רמות נמוכות יותר של תמלילים הניתנים לזיהוי. ניתוח עקומת המסת (Melt curve analysis) הראה הגברה ספציפית של mysA, sigE, ו- sigH גנים, המראים ספציפיות ויעילות של qPCR (איור משלים 2, פאנל עליון). ניתוח qPCR באמצעות גנים של Mtb הראה גם ערכי Ct מקובלים (~20–25), מה שמאשש את התאמתם למחקרי ביטוי גנים בהמשך (איור 3E).

השוואת מיצוי RNA; אלקטרופורזה של ג'ל (28S, 18S, 5S) ותרשימי עמודות של תפוקה, Ct וניקיון.
איור 2: השוואה של שיטות מיצוי RNA עבור Mycobacterium. (A) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז המראה RNA כולל שמוצה באמצעות שיטות Hot Phenol, TRIzol ו-RNeasy. פסי 23S ו-16S rRNA ברורים נראים בכל הדגימות, מה שמעיד על RNA שלם. (B) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז המראה RNA כולל שמוצה באמצעות Hot Phenol דרך שיטות ליזיס שונות, כלומר, Bead Ruptor וטחון רקמות ידני. (C) תפוקת RNA כולל, המראה את התפוקה הגבוהה ביותר מ-Hot Phenol, ואחריה TRIzol ושיטת הערכה (kit). (D) ניקיון ה-RNA הוערך באמצעות יחסי A260/A280, כאשר כל השיטות הניבו ערכים של ~2.0, המעידים על זיהום חלבוני מינימלי. (E) מספר שלמות ה-RNA (RIN) המראה שלמות דומה. (F–H) השוואה של תפוקת RNA, יחס 260/280 ושלמות RNA בין דגימות שעברו ליזיס באמצעות טחון רקמות ידני ו-Bead Ruptor ובודדו באמצעות שיטת Hot Phenol. (I) ערכי Ct מ-qRT-PCR המכוונים לגן בית (housekeeping gene) (למשל, mysA) וגורמים שעתקתים (sigE ו-sigH). פסי השגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית משלוש חזרות ביולוגיות (n = 3). ערך P חושב באמצעות t-test של Student. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואת הפקת RNA מ-Mycobacterium, ג'ל אלקטרופורזה ודיאגרמות עמודים המנתחות את התנובה והטוהר.
איור 3: בידוד RNA מ-Mtb באמצעות שיטת הפנול החם. (A) אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז המראה RNA כולל שהופק באמצעות bead ruptor וגריסה ידנית של רקמות בשיטת Hot Phenol מותאמת מזן Mtb H37Rv. (B–D) השוואה של ה-RNA המבודד מבחינת תנובה, יחס 260/280 והערכת שלמות ה-RNA (RIN). (E) ערכי Ct מ-qRT-PCR המכוונים לגנים sigA, 16s rRNA ו-hsp70. פסי השגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית משלוש חזרות ביולוגיות (n = 3). ערך P חושב באמצעות Student’s t-test. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

פנול חםTrizolערכת RNeasy
תפוקה60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
זמן2.5-3 שעות2-2.5 שעות30-45 דקות
עלות לתגובה$0.10 – $0.20$1.500 – $2.00$7.00 – $10.00
מגבלות חומרי דנטורציה חזקים הגוזלים זמן רב (פנול/SDS) גוזל זמן, ריאגנטים רעילים ביותר כגון Trizol, דרישה לצנטריפוגה מקוררת, יקר פי 15 משיטת הפנול החם (Hot Phenol)יקר (יקר פי 72 מפנול חם), תפוקה נמוכה, סתימה של העמודה
יתרונותשאיבה גבוהה יותר מנפח נמוך יותר, עלות נמוכה, אין צורך ב-beat beater לליסיס של תאים, אין דרישה לסבב צנטריפוגה בקירורתפוקה בינונית ועלות בינונית, דרישה לסבוב מרכזי בקירורתפוקה בינונית, יקר מאוד
גורם עלות מרכזיריאגנטים נפוצים למעבדה (מרכיבי בופר TES, פנול חומצי, כלורופורם, איזופרופנול, אתנול)ריאגנט מסחרי TRI Reagent®, כלורופורם או כלורופורם: איזואמיל אלכוהול, איזופרופנול, אתנולעמודי ספין ותמיכויות (buffers) קנייניים של Qiagen
מדד שלמות ה-RNA (RIN)8-10 RIN7.5-10 RIN9-10 RIN

טבלה 1: השוואת עלות, זמן ומגבלות בין 3 נהלי מיצוי RNA שונים (שיטות Hot Phenol, TRIzol ו-RNeasy).

איור משלים 1: אופטימיזציה של מיצוי RNA. (A) מיצוי RNA באמצעות פנול חם וליזיס באמצעות גרינדר רקמות ידני. (B) מיצוי RNA באמצעות TRIzol. (C) מיצוי RNA בשיטת RNeasy. (D) ניתוח דנסیتומטרי של תמונות ג'ל של מיצוי RNA מ-Msmeg בשיטות שונות. פסי השגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית שחושבה באמצעות GraphPad Prism (n = 8). (E) מיצוי RNA באמצעות פנול חם מזן Mtb. כל תמונות הג'ל הן שחזרים ביולוגיים עצמאיים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: (פאנל עליון) ניתוח עקומת המסה של mysA, sigE, ו- sigH מ- M. smeg, n = 3; (פאנל תחתון) ניתוח שלמות ה-RNA. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כדי לפתח שיטה פשוטה ואמינה להפקת RNA מ-Mycobacterium, בוצעה אופטימיזציה לשיטת הפנול החם (Hot Phenol). לאחר מכן, ה-RNA שהופק הושווה לשתי גישות נפוצות: TRIzol ושיטה מבוססת ערכה עם עמודה12,13. טכניקות אלו הושוו על בסיס תנובת ה-RNA, טהרתו, שלמותו, העלות וזמן העיבוד, כדי להעריך את מעשיותיהן עבור יישומים מולקולריים המשכיים. הן שיטת הפנול החם והן שיטת ה-TRIzol, למרות שהן דורשות זמן רב יחסית בהשוואה לשיטה המבוססת על ערכה, הניבו RNA שלם ואיכותי. כל שלוש השיטות הניבו RNA בעלי טהרה ושלמות דומות; עם זאת, שיטת הפנול החם סיפקה באופן עקבי תנובת RNA גבוהה יותר. בנוסף, RNA שהופק באמצעות פנול חם ו-TRIzol הניב ערכי Ct דומים. לעומת זאת, נצפתה הבדל מובהק סטטיסטית בערכי ה-Ct בין שיטת הפנול החם לשיטת ה-RNeasy. מכיוון שבניסוי נעשה שימוש בכמויות שוות של RNA, ציפו לערכי Ct דומים בכל השיטות. ניתן לייחס את ההבדלים שנצפו במקרה של שיטת ה-RNeasy להבדלים בכימיה של הפקת ה-RNA. פנול חם ו-TRIzol הן שיטות מבוססות חומרים אורגניים ולעיתים קרובות הן יעילות יותר בהמסה של תמלילים מאתגרים, כגון אלו המקודדים חלבוני ממברנה פנימיים או תמלילים בעלי תכולת GC גבוהה. לעומת זאת, RNeasy היא שיטה מבוססת עמודת סיליקה ועשויה להוביל להתאוששות נמוכה יותר של תמלילים מסוימים שאינם נקשרים ביעילות לממברנה או שאובדים במהלך שלבי השטיפה, בהשוואה לשיטות מבוססות פנול (איור 2). חשוב לציין כי תנובות RNA דומות הושגו הן באמצעות דוחס רקמות ידני והן באמצעות Bead Ruptor לליסיס תאים, ובכך התאפשרה גמישות תפעולית בביצוע ליסיס התאים. בנוסף, שיטת ההפקה עברה אופטימיזציה לעבודה עם נפחי תרבית נמוכים וללא צורך בסנטריפוגה קרה. פישוט זה משפר את הנוחות והיעילות הכללית של עיבוד הדגימות.

גורם חשוב בבחירת שיטה להפקת RNA הוא האיזון בין עלות, זמן ואיכות התוצר (Table 1). שיטת הפנול החם, למרות שהיא גוזלת מעט יותר זמן, נותרת יעילה מאוד מבחינת עלות בשל השימוש בחומרים כימיים נפוצים במעבדה ויכולתה להניב תשואות גבוהות של RNA (60–70 µg של Msmeg RNA ו-35–45 µg של Mtb RNA לכל 3 mL נפח תרבית בשלב לוגריתמי בינוני), אפילו מנפח תרבית נמוך של 3 mL ובלי שימוש בציוד bead ruptor מתקדם כפי שנעשה ברוב השיטות שפורסמו עד כה. הדבר הופך אותה ליתרון מיוחד עבור מעבדות הפועלות בתנאי משאבים מוגבלים. שיטות להפקת RNA המבוססות על פנול חם שפורסמו בעבר נבדלות בכמה היבטים מרכזיים. לדוגמה, Mangan et al. השתמשו ב-M. bovis להפקת RNA באמצעות שיטת הפנול החם, ודיווחו על תשואה של כ-20 µg של RNA ל-109 תאים. עם זאת, פרמטרים קריטיים כגון נפח התרבית וטמפרטורת ההפקה לא צוינו בבירור. בנוסף, שיטתם כוללת שטיפת דטרגנט באמצעות Divolab-1 לפני שבירה מכנית של התאים, רכיב שאינו זמין בקלות, ולאחריה הפקה עם כלורופורם ואיסואמיל אלכוהול11. בשיטת פנול חם אחרת, הופק RNA מתאי Mtb, מה שהניב כ-39 µg של total RNA, תוצאה הדומה לשיטה המיוטבת המתוארת כאן. עם זאת, שיטה זו דרשה נפח תרבית גבוה יחסית (25 mL), מה שהגדיל את זמן העיבוד והצריך שימוש בצנטריפוגות גדולות יותר. יתר על כן, ההפקה כוללת תערובת של כלורופורם-איסואמיל אלכוהול, וטמפרטורת ההפקה אינה מדווחת12,14. TRIzol נמצא בשימוש נרחב גם הוא כדי להשיג תשואת RNA ואיכות טובה בעלות מתונה15; עם זאת, התשואה הייתה נמוכה יחסית. ערכת RNeasy מציעה נוחות ומהירות עדיפות, מה שהופך אותה למתאימה למסלולי עבודה רגישים לזמן או למשתמשים פחות מנוסים, אך זאת בעלות גבוהה משמעותית משתי השיטות האחרות, והתשואה הייתה נמוכה באופן ניכר. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת גמישות תפעולית בליזיס של תאי מיקובקטריה ובהפקת RNA שלאחריה. היא מאפשרת למשתמשים לבחור את השיטה המתאימה ביותר בהתבסס על סדרי העדיפויות שלהם, בין אם מדובר בעלות ותשואה ובין אם בזמן עיבוד, תוך שמירה על איכות ושלמות RNA דומות בכל שלוש השיטות.

גילויים

לא היו ניגודי עניינים בין המחברים. כל המחברים אישרו את הגשתו של המאמר.

תודות

ברצוני להודות על התמיכה שקיבלתי מהמחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממועצת המחקר הרפואי של הודו (ICMR) וממועצת המחקר להנדסה ומדע (SERB).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חרוזי סיליקה בגודל 0.1 מ"מMP BiomedicalsMP116911050
2-פרופנולסיגמא278475
Bead Ruptor 4 revvity
כלורופורםסיגמא288306
צנטריפוגה מקוררתThermoScientific42541217
DNase I qiagen79254
EDTAסיגמאE02SS
HClSRL62889
בלוק חימוםMIULABMU-E02-1049
ערכה לשעתוק הפוך של cDNA בקיבולת גבוהה Thermo Fischer Scientific4368814
גורס רקמות מונע במנוע G10קורונהG22616008
NaClסיגמאS5886
ננופוטומטר N50 יישוםT51601
פנול ששיווה עם בופר ציטראט 0.1 M, pH 4.5סיגמאP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
פלואורומטר Qubit 4 Invitrogen2.32262E+12
מכשיר תגבור תרמי ל-PCR בזמן אמתAnalytik Jena AG844-00503-2
ערכה לבידוד RNA (RNA easy Kit)Qiagen74104
גיליון נתוני בטיחותסיגמאS9888
נתרן אצטטסיגמאS2889
מעגל תרמי Biorad621BR29739
TRI ReagentסיגמאT9424
Tris baseHimediaMB029
β-מרקפטואתנולסיגמא516732

מקורות

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mycobacterium TuberculosisRNAqPCRTRIzolRNeasy
מיצוי RNA מותאם על בסיס פנול חם ממיקובקטריות: גישה חסונה לניתוח מהימן של ביטוי גנים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.