מחקר זה מבצע אופטימיזציה לשיטת מיצוי RNA המבוססת על פנול חם עבור Mycobacterium, המניבה RNA באיכות גבוהה המתאים לניתוחים טרנסקריפטומיים. בהשוואה ל-TRIzol ו-RNeasy תחת תנאים זהים, השיטה הניבה תפוקה גבוהה יותר, שלמות דומה ויעילות כלכלית משופרת, ובכך היא מהווה חלופה מעשית למחקרי ביטוי גנים בקנה מידה רחב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיצוי RNA מותאם על בסיס פנול חם ממיקובקטריות: גישה חסונה לניתוח מהימן של ביטוי גנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) נותר איום בריאותי גלובלי מרכזי, מה שמדגיש את הצורך במחקרי טרנסקריפטומיקה מהימנים להבנת הביולוגיה שלו ומנגנוני העמידות לתרופות. ניתוחים אלו תלויים בהשגת RNA באיכות גבוהה ובשyield גבוה. למרות שקיימות מספר שיטות להפקת RNA, רבות מהן דורשות ריאגנטים יקרים, נפחי תרבית גדולים או ציוד מיוחד, מה שמגביל את התאמתן למחקרי רחבי היקף, במיוחד במסגרות עם משאבים מוגבלים. כאן מוצגת שיטה מותאמת לאופטימיזציה של הפקת RNA המבוססת על פנול חם (Hot Phenol), המותאמת במיוחד למייקובקטריית. השיטה משתמשת בנפח תרבית מינימלי ובריאגנטים נפוצים כדי להפיק בעקביות RNA באיכות גבוהה המתאים ליישומים טרנסקריפטומיים בעדי throughput גבוה. כמות ה-RNA ושלמותו הוערכו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וניתוח שלמות RNA (RIN), והתאמתו ליישומים המשכיים אוששה באמצעות qPCR ו-Qubit 4. כדי להשוות את ביצועי השיטה המותאמת, בוצעה הפקת RNA מקבילה באמצעות TRIzol ו-RNeasy תחת תנאים ניסיוניים זהים, כולל אותם מיני Mycobacterium, נפח תרבית, שלבי צמיחה (לוגריתמי וסטציונרי) ותנאי ליזיס. הדבר אפשר השוואה ישירה של הyield, האיכות, ההיתכנות והעלות. שיטת הפנול החם המותאמת הראתה yield ואיכות RNA דומים או משופרים, תוך הפחתה משמעותית בעלות הריאגנטים ובתלות בציוד מיוחד. בשל יעילותה, השחזרתיות שלה ומחיריה הנגישים, פרוטוקול זה מספק חלופה מעשית למחקרי ביטוי גנים וטרנסקריפטומיקה רחבי היקף ב-Mtb ובמיני מייקובקטריית אחרים.
מבוא
M. tuberculosis (Mtb), הגורם למחלת השחפת (TB), נותר הגורם המוביל למשם מפתוגן זיהומי יחיד, ועוקף את HIV/AIDS. בשנת 2024, השחבת הייתה אחראית לכ-1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. נטל זה מוחמר בשל השכיחות הגוברת של זנים העמידים לתרופות מרובות (MDR) ועמידים לתרופות רחבות (XDR). לפיכך, קיים צורך דחוף להבין את הבסיס המולקולרי של הפתוגנזה של השחבת ולזהות מטרות טיפוליות חדשות2.
פרופיל תעתוק של Mtb הפך לכלי חשוב להבנת מרכיבים פונקציונליים המעורבים באינטראקציות בין מאחס לפתוגן3, הסתגלות לעקה סביבתית4, ומנגנונים העומדים בבסיס עמידות לתרופות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. גידול של Mycobacterium
- בצעו אינוקולציה של 1mL ממלאי הגליצרין של Msmeg או Mtb לתוך 10 mL של מצע Middlebrook 7H9 מועשר ב-0.2% גליצרין, 0.05% Tween 80 ו-10% ADC, בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור ב-150 rpm עד להגעה ל-OD של 1–1.5.
- גדלו את התרבית המשנית על ידי הוספת 1% מהתרבית הראשונית ל-10 mL של מצע 7H9 עד לשלב הלוגריתמי האמצעי, OD600nm = 0.6–0.7.
- חלקו את התרבויות לאליקוויטים של 3 mL וסבבו אותן בצנטריפוגה ב-2000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (23–25 °C).
- אחסנו את המשקעים בטמפרטורה של -80 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איכות ותוצרי RNA
איכות וכמות ה-RNA הוערכו באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז (איור 2). בכל שיטות המיצוי נצפו פסים חדים ובולטים המתאימים ל-23S ו-16S rRNA, מה שמאשש בידוד מוצלח של RNA כולל. שיטות ה-Hot Phenol וה-TRIzol הראו שלושה פסים ברורים המייצגים 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) ו-5S rRNA (~120 bp), מה שמעיד על RNA שלם ובאיכות גבוהה. לעומת זאת, שיטת הערכה המבוססת על עמודה (column-based kit) הראתה רק את פסי ה-23S וה-16S, כאשר פס ה-5S.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי לפתח שיטה פשוטה ואמינה להפקת RNA מ-Mycobacterium, בוצעה אופטימיזציה לשיטת הפנול החם (Hot Phenol). לאחר מכן, ה-RNA שהופק הושווה לשתי גישות נפוצות: TRIzol ושיטה מבוססת ערכה עם עמודה12,13. טכניקות אלו הושוו על בסיס תנובת ה-RNA, טהרתו, שלמותו, העלות וזמן העיבוד, כדי להעריך את מעשיותיהן עבור יישומים מולקולריים המשכיים. הן שיטת הפנול החם והן שיטת ה-TRIzol, למרות שהן דורשות זמן רב יחסית בהשוואה לשיטה המבוססת על ערכה, הניבו RNA שלם ואיכותי. כל שלוש השיטות הנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא היו ניגודי עניינים בין המחברים. כל המחברים אישרו את הגשתו של המאמר.
תודות
ברצוני להודות על התמיכה שקיבלתי מהמחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממועצת המחקר הרפואי של הודו (ICMR) וממועצת המחקר להנדסה ומדע (SERB).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חרוזי סיליקה בגודל 0.1 מ"מ | MP Biomedicals | MP116911050 | |
| 2-פרופנול | סיגמא | 278475 | |
| Bead Ruptor 4 | revvity | ||
| כלורופורם | סיגמא | 288306 | |
| צנטריפוגה מקוררת | ThermoScientific | 42541217 | |
| DNase I | qiagen | 79254 | |
| EDTA | סיגמא | E02SS | |
| HCl | SRL | 62889 | |
| בלוק חימום | MIULAB | MU-E02-1049 | |
| ערכה לשעתוק הפוך של cDNA בקיבולת גבוהה | Thermo Fischer Scientific | 4368814 | |
| גורס רקמות מונע במנוע G10 | קורונה | G22616008 | |
| NaCl | סיגמא | S5886 | |
| ננופוטומטר N50 | יישום | T51601 | |
| פנול ששיווה עם בופר ציטראט 0.1 M, pH 4.5 | סיגמא | P4682 | |
| PowerUP SYBR | Applied Biosystems | A25742 | |
| פלואורומטר Qubit 4 | Invitrogen | 2.32262E+12 | |
| מכשיר תגבור תרמי ל-PCR בזמן אמת | Analytik Jena AG | 844-00503-2 | |
| ערכה לבידוד RNA (RNA easy Kit) | Qiagen | 74104 | |
| גיליון נתוני בטיחות | סיגמא | S9888 | |
| נתרן אצטט | סיגמא | S2889 | |
| מעגל תרמי | Biorad | 621BR29739 | |
| TRI Reagent | סיגמא | T9424 | |
| Tris base | Himedia | MB029 | |
| β-מרקפטואתנול | סיגמא | 516732 |
מקורות
- Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
- Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
