הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שילוב פרמקולוגיה רשתית לחקר ההשפעה המגנה של סינמלדהיד נגד נוירוטוקסיות הנגרמת מאוקסליפלטין

460 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69013

⸱

28 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את ההשפעות המגנות של קינמלדהיד (CA) נגד נזק שנגרם מאוקסליפלטין (OXA) בתאי גנגליון שורש גב (DRG) של חולדות. המנגנון הבסיסי כולל דיכוי מסלול האיתות JAK2/STAT3 והפעלת מסלול ה-SLC7A11-GSH-GPX4, כפי שנחשף באמצעות פרמקולוגיה רשת ואימות ניסוי.

תקציר

מחקר זה בוחן את ההשפעות המגנות של קינמלדהיד (CA) נגד נזק שנגרם מאוקסליפלטין (OXA) בתאי גנגליון שורש גב (DRG) של חולדות. הפעילויות הפרמקולוגיות של הרפואה הסינית המסורתית נותחו, והיעדים הפוטנציאליים שלה, יחד עם מטבוליטים שלה, זוהו באמצעות פלטפורמת מסד הנתונים והניתוח של מערכות פרמקולוגיה מסורתית ברפואה סינית מסורתית (TCMSP), פלטפורמת מחקר חישובית רשת מבוססת פרמקולוגיה אינטגרטיבית של רפואה סינית מסורתית (TCMIP), ופלטפורמות PharmMapper. בדיקת CCK-8 משמשת לקביעת הריכוזים האופטימליים של תרופות, בעוד שבדיקות מלונדיאלדהיד (MDA) מיושמות להערכת רמת החמצון של שומן. רמות תוך-תאי של Fe2+ ומיני חמצן תגובתי (ROS) נמדדו באמצעות גלאי פלואורסצנטי. השפעת CA על רמות ביטוי חלבונים, כולל p-STAT3, XCT ו-GPX4, בתאי DRG שטופלו ב-OXA נבדקה באמצעות אימונובלוטינג. ניתוח פרמקולוגיה רשתית זיהה 14 מטרות חופפות בין "CA-כאב נוירופתי (NP)-פרופטוזיס". תוצאות ניסוי הראו כי טיפול של 24 שעות עם 4.0 מיקרומול/ליטר CA הניב תוצאות מיטביות, והפחית משמעותית רמות MDA,Fe 2+ ו-ROS בתאי DRG (P < 0.05). יתרה מזאת, טיפול ב-CA הפחית את הביטוי של JAK2, STAT3, p-STAT3, TFRC, ErbB-1 ופקטור גרעיני-קאפה B (NF-κB) (P < 0.05) תוך הגברת ביטוי XCT, GPX4 ו-FTH1 (P < 0.05). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-CA מפחית נזק שנגרם על ידי OXA בתאי DRG על ידי עיכוב מסלול האיתות JAK2/STAT3 והפעלת ציר ה-SLC7A11-GSH-GPX4.

מבוא

בשנים האחרונות, פרופטוזיס, כמצב מוות תאי שאינו אפופטוטי, הוכח כמעורבת בנזק לרקמה הנגרם על ידי תרופות כימותרפיות שונות. המנגנון המרכזי של פרופטוזיס הוא הצטברות תוצרי פרוקסידציה ליפידיים תלויי ברזל1. מחקרים על מנגנוני נוירוטוקסיות ציספלטין מגלים כי תרופה זו גורמת לפרופטוזיס נוירוני דרך מסלולים מרובים, כאשר תהליך זה קשור ישירות להתפתחות נוירוטוקסיות. באופן ספציפי, ציספלטין מעכב את פעילות גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPX4). כ"מולקולת בלם" קריטית בפרופטוזיס, השבתה של GPX4 מונעת ניקוי הידרופרוקסידי ליפידים (L-OOH), ובכך גורמת לנזק חמצוני לממברנות התאים העצביים2. בינתיים, אוקסליפלטין יכול לקדם שחרור פרופטוזיס בתאי עצב ולהחמיר את יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) דרך תגובת פנטון, ובכך להעצים עוד יותר את מפל הפרופטוזיס3. ראיות אלו מצביעות על כך שווסות ממוקד של נוירודגנרציה עשוי להיות אסטרטגיה פוטנציאלית להקלה על הנוירוטוקסיות של אוקסליפלטין.

אוקסליפלטין (OXA), חומר כימותרפיה דור שלישי מבוסס פלטינה לסרטן המעי הגס, מציע יעילות אנטי-גידולית חזקה אך לעיתים קרובות קשור לנוירוטוקסיות משמעותית. מתן כרוני מוביל לעיתים קרובות לכאב נוירופתי המושרה על ידי OXA (OINP), עם שיעור שכיחות של 60%4, המאופיין באלודיניה מכנית, היפראלגזיה תרמית ורגישות יתר לקור5. למרות שכיחותה, אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות ל-OINP נותרות בלתי מספקות, ומפחיתות משמעותית את איכות חיי המטופל. לכן, הבהרת המנגנונים המולקולריים שמאחורי OINP וזיהוי מטרות טיפוליות חדשות נותרות תחומים קריטיים במחקר מתמשך6.

קינמלדהיד (CA), הרכיב הפעיל העיקרי של שמן אתרי קינמון, הוא נוזל צהוב וצמיג 7,8 עם פעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל קוטל חרקים9, אנטי-מיקרוביאלי10, אנטי-פטרייתי11, נוגד חמצון12, אנטי-סוכרתי13, אנטי-סרטן14, אפקטים נוגדי דלקת ונוירווסקולריים15,16. ראיות מתפתחות מצביעות על כך ש-CA עשוי לעכב את הפעלת מסלול האיתות JAK/STAT17. הנוסחה הכימית של CA היא C9H8O, והמבנה הכימי שלו מוצג באיור 1. כמונומר טבעי ברפואה הסינית המסורתית, CA מציגה מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות. מבחינת הגנה נוירולוגית, מספר מחקרים אישרו כי CA יכול להיכנס למערכת העצבים המרכזית דרך מחסום הדם-מוח, לקדם ביטוי של אנזימים נוגדי חמצון (כגון HO-1 ו-NQO1) על ידי הפעלת מסלול האיתות Nrf2/ARE, להפחית את הצטברות ROS בתאי העצב, וכך להקל על הנזק הנוירו-חמצוני בשבץ איסכמי. מחלת אלצהיימר ומחלות נוספות18,19. במקביל, CA יכולה לעכב היפראקטיבציה של מיקרוגליה, להפחית את שחרור גורמי דלקת (כגון TNF-α, IL-1β) ולהפחית תגובה נוירודלקתית20. עם זאת, לא דווח האם CA יכולה להקל על הנוירוטוקסיות הנגרמת על ידי אוקסליפלטין על ידי ויסות מסלול הפרופטוזיס.

מסלול האיתות JAK2/STAT3 הוא מנגנון חשוב להעברת אותות תוך-תאי שמעביר אותות שמתקבלים בממברנת התא לגרעין התא, והוא קשור קשר הדוק לתהליכים ביולוגיים מרכזיים כגון התרבות תאים, התמיינות, אפופטוזיס, לחץ חמצוני ותגובות דלקתיות21. כמסלול הקשור קשר הדוק לתגובות דלקתיות, מסלול האיתות JAK3/STAT3 יכול להפעיל תגובות דלקתיות במצב מופעל, מה שמוביל לנזק דלקתי לרקמות. מחקרים מראים כי עיכוב מסלול האיתות JAK3/STAT3 יכול להפחית את התגובה הדלקתית והנזק החמצוני בעכברים עם דמנציה וסקולרית, ובכך לשפר את התפקוד הקוגניטיבי של העכברים. בנוסף, עיכוב מסלול האיתות JAK3/STAT3 יכול גם להקל על התגובה הדלקתית בעכברים אפילפטיים, להפחית את שיעור האפופטוזיס הנוירוני ולהפחית פגיעות מוח23. למרות שלחומצה קפאית (CA) יש השפעה מגוננת מסוימת על מערכת העצבים, עדיין לא ברור אם השפעת השיפור שלה קשורה לוויסות מסלול האיתות של JAK3/STAT3.

מחקר זה נועד לאמת האם עיכוב ה-INVITRO של איתות JAK2/STAT3 והפעלת ציר LC7A11-GSH-GPX4 יכולים להפחית נזק שנגרם על ידי OXA בתאי DRG של חולדות. בנוסף, הוא בוחן את ההשפעות האנטי-פרופטוטיות האפשריות של CA ובוחן את תפקידם של מטרות מרכזיות שזוהו באמצעות פרמקולוגיית רשת בוויסות דלקת בתאי DRG.

הגישות הטיפוליות הנוכחיות לנוירוטוקסיות הנגרמת מאוקסליפלטין מתמקדות בעיקר בכילציה של יוני פלטינה חופשית כדי לצמצם נזק עצבי, כגון שימוש בקומפלקסים של סידן ומגנזיום, עם המטרה העיקרית להקל על נוירופתיות פריפריות חריפות (למשל, נימול ועקצוץ בידיים וברגליים)24. עם זאת, המנגנונים המדויקים אינם ברורים. טיפולים אלו חסרים יכולת להפוך מצבים כרוניים כמו ניוון אקסונלי והידרדרות סיבי עצב הנגרמת מאוקסליפלטין, ומראים יעילות מוגבלת במניעת נוירוטוקסיות מצטברת. בניסוי זה, האפקט הנוירו-מגן של 4 מיקרומום CA תחת טיפול ב-5 מיקרומום OXA נחקר על ידי שילוב מנגנוני אנטי-דלקתי ואנטי-פרופטוזיס. הממצאים מאשרים כי הפעלת מנגנון זה משמשת כשלב התחלתי קריטי ב-OINP. גילוי מעכבים ספציפיים עשוי להחליף את הגישות הלא-ספציפיות הקיימות, ובכך לשפר את הדיוק והיעילות של ההתערבויות הטיפוליות.

מודל ה-in vitro ששימש בניסוי זה כולל נוירונים מבודדים של חולדה (DRG) לצורך חקר OINP. עם זאת, מודל זה שונה משמעותית מתאי ראש אנושיים ברקע הגנטי, במאפיינים מטבוליים וברגישות לרעילות, מה שעשוי להקשות על יישום קליני ישיר של מסקנות מחקר. יתרה מזאת, התחזוקה התפקודית של רקמות עצביות בחיים נשענת על ויסות מדויק של קואורדינציה רב-תאית ומיקרוסביבות דינמיות – גורמים מורכבים שקשה לשחזר באופן מלא מודלים במבחנה .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: קו התאים נגזר מקווי תאי חולדות.

1. ניתוח פרמקולוגיה רשתית

הערה: הקישורים נמצאים בטבלת החומרים.

  1. מציאת מטרות אפשריות של CA
    1. לשלוף מידע מבני ממאגר PubChem ולחקור את המנגנונים הביולוגיים הפוטנציאליים של CA. לאחר מכן, לבצע את ניתוח חיזוי המטרה באמצעות SwissTargetPrediction, תוך ניצול יכולות החישוב המתקדמות שלו.
    2. כדי לשפר את הדיוק והמקיפות של הניתוח, יש להשוות בין היעדים החזויים למאגרי מידע ייחודיים לרפואה הסינית המסורתית, כולל TCMSP ו-TCMIP.
    3. בדוק את הספרות הרלוונטית כדי לזהות מטרות פוטנציאליות נוספות. שכפל את רשימת היעדים המאוחדת ליצירת מאגר נתונים מקיף, המשמש כהפניה קריטית למחקרי פעילות ביולוגית נוספים ולפיתוח תרופות הכוללים CA.
  2. זיהוי מטרות פוטנציאליות לכאב נוירופתי (NP)
    1. באמצעות מאגר GeneCards ומאגר TTD, בצע חיפוש נרחב באמצעות מילות המפתח "כאב נוירופתי" ו"פרופטוזיס". תעדף את יעדי הגנים ממסד הנתונים של GeneCards עם "ציון רלוונטיות" העולה על החציון, שכן גנים אלו מראים רלוונטיות גבוהה יותר למוקד המחקר.
    2. שלבו את מטרות הגנים שנבחרו מראש עם נתונים שנאספו מ-TTD (Therapeutic Target Database). להבטיח זיהוי מקיף של מטרות פוטנציאליות במהלך תהליך האינטגרציה על ידי הצלבה בין כל היעדים הגנטיים שנבחרו עם רשומות מסד הנתונים של TTD. הסר באופן שיטתי ערכים כפולים ממאגר הנתונים המשולב של יעדי גן. ודאו שמערך הנתונים המתקבל מכיל רשימה ייחודית של מטרות פוטנציאליות.
  3. זיהוי מטרות הצמתים של "CA-NP- פרופטוזיס"
    1. קבעו את הצטלבות המטרות ל-CA, NP ופרופטוזיס באמצעות דיאגרמת ון שנוצרה באינטרנט.
    2. יעדי החיתוך הללו הוגדרו כמועמדים פוטנציאליים ל"מסלול NP-פרופטוזיס המוסדר על ידי CA."
  4. בניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI)
    1. לצורך חקירה נוספת, יש להגיש את היעדים הנפוצים ל"CA-NP-פרופטוזיס", "CA-NP" ו"CA-פרופטוזיס" למאגר הנתונים של STRING.
    2. קבע את סף ניקוד האינטראקציה ל"ביטחון הגבוה ביותר > 0.4" והגבל את מספר האינטראקטורים המקסימלי ל-10 עבור שכבת האינטראקציה הראשונה והשנייה. החלו הגדרות ברירת מחדל לכל שאר הפרמטרים, ובנו רשת של 4.5 PPI עבור "CA-NP-ferroptosis".
  5. ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG
    1. העלה את יעדי החיתוך של "CA-NP-ferroptosis" לפלטפורמת DAVID עם הפרמטרים הבאים: "בחר מזהה: סמל גן רשמי," "סוג רשימה: גניסט," ו"מין: הומו ספיינס." ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) בוצע בשלוש קטגוריות: תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF).
    2. בצע את ניתוח העשרת מסלול KEGG, והצג את הנתונים המתקבלים באמצעות גרפים עמודים שנוצרו בפלטפורמת Hiplot.

2. עגינה מולקולרית

  1. כדי להבהיר את האינטראקציה בין תרכובות פעילות למטרות הקשורות למחלות, יש לקבל מידע מבני לחומרים פעילים ממאגר PubChem כמולקולות קטנות, תוך שליפת המבנים התלת-ממדיים של חלבוני המטרה מבנק נתוני החלבונים (PDB) כמודלים של חלבונים.
  2. השתמש ב-PyMOL לעיבוד מוקדם של מבני קולטני החלבון על ידי הסרת מולקולות מים וליגנדים לא חיוניים. לאחר מכן, הכינו את החלבונים והחומרים הפעילים לעגינה באמצעות AutoDock Tools 1.5.7, ומבצעים עגינה מולקולרית חצי-גמישה באמצעות AutoDock Vina.
  3. לנתח את אנרגיות הקישור ואתרי הקישור לחומרים פעילים בחלבוני הקולטן. עבור חלבון JAK2, המבנה שלו (מזהה PDB: 3e64) נבחר ממסד הנתונים של PDB בהתבסס על נתוני קריסטלוגרפיה מקרני רנטגן ורזולוציה אופטימלית.
  4. השתמש בתוכנת PyMOL להכנת מבנה JAK2 על ידי הסרת ליגנדים, הסרת מולקולות מים והוספת מימן. המבנים המולקולריים הקטנים של תרכובות פעילות נלקחו מ-PubChem.
  5. טען גם חלבונים וגם מבני תרכובות ל-AutoDock Tools 1.5.7, הגדר את קופסאות העגינה, ובצע עגינה מולקולרית עם AutoDock Vina.

3. תרבית תאים

הערה: השלבים הבאים ישמשו שוב ושוב בניסוי הוולידציה. הקפדו על טכניקות אספטיות קפדניות. חלק זה של הניסוי השתמש בצנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה.

  1. חיטוי את האריזה החיצונית ובקבוקי התרבית של תאים סטריליים שנרכשו עם 75% אלכוהול, ואז העבר לכלי תרבית על שולחן עבודה נקי במיוחד לתת-תרבית עד שהתאים מפזרים על פני חמישה צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ כדי להבטיח מספיק מלאי תאים.
  2. הקפיא את התאים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניסויים הבאים.
    1. הכינו DMEM, DMSO בדרגת תרבית תאים, סרום בקר עוברי (FBS), צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל, פיפטות, מקררים ואמבט קרח. מערבבים 1 מ"ל DMSO, 1 מ"ל FBS ו-8 מ"ל DMEM כדי להגיע לנפח כולל של 10 מ"ל. מקרר את ה-DMSO על הקרח למשך 15 דקות. ראשית, העבר את המדיום הבסיסי לצינור הצנטריפוגה, ואז מוסיפים לאט את ה-DMSO המקורר מראש תוך כדי סיבוב. מערבבים היטב עם פיפט, ואז מוסיפים בעדינות FBS ומערבבים שוב. אחסן את התערובת באמבט קרח לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: ריכוז של 20%-50% DMSO הביא לעלייה משמעותית בשחרור LDH, מה שמעיד שריכוזים גבוהים של DMSO הם ציטוטוקסיים, בעוד ש-10% DMSO בטוחים יחסית. זה לא השפיע על הניסוישלנו 25.
    2. קח תאים שגדלים לוגריתמיה, שטוף אותם 3 פעמים עם PBS, ואז הוסיף 0.25% טריפסין באורך 400 מיקרוליטר/10 ס"מ.
      הערה: כאשר מתרחשת התכווצות ציטופלזמית, החיבורים רופפים, או אם יש סימנים לציפה רחבת היקף, תהליך העיכול נעצר מיד.
    3. הכנת עיכול מוקדם: חימום מוקדם של תגובות מפתח (0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ו-DRG מדיום מלא) ל-37 מעלות צלזיוס. הסר את בקבוק תרבית התאים מהאינקובטור והשליך את המדיום הישן באמצעות פיפטה סטרילית כדי למנוע מהמדיום שנותר להשפיע על יעילות העיכול. שטוף בעדינות את התאים המתרבתים בשכבה אחת פעמיים עם 5 מ"ל PBS סטרילי כדי להסיר סרום שאריות תוך הימנעות מהשטיפת תאים.
    4. הוסף 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA מחוממת מראש ב-0.25% לכלי התרבית, כדי להבטיח שהוא מכסה לחלוטין את שכבת התא היחידה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 1-3 דקות. במהלך תקופה זו, התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כל 30 שניות. עצרו מיד את העיכול כאשר רוב התאים מתחילים להתכווץ, להפוך לעגולים ולהראות מרחבים בין-תאיים מובחנים (כדי למנוע עיכול יתר ונזק לתאים).
    5. הוסיפו במהירות 4 מ"ל מדיום מחומם מראש לחלוטין לכלי התרבית. יש פיפט עדין של התערובת 5 פעמים עם פיפטה סטרילית כדי לפזר את אשכול התאים לתלייה חד-תאית. העבר את כל המתלה החד-תאי לצינורות צנטריפוגה סטריליים בנפח 15 מ"ל ואיסוף כדור התא באמצעות צנטריפוגה ב-300 x g 5 דקות באמצעות צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
    6. השליך את הסופרנטנט והוסיף 5 מ"ל מדיום הקריופרפור המוכן. נשפו בעדינות עם פיפטה כדי לערבב את התאים באופן אחיד. פזר אותם באופן שווה ל-5 בקבוקונים.
    7. סמנו את הקריוביאל בשם התא, תאריך ההקפאה והאופרטור; שים אותו במיכל הקפאה ואחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C, ואז העבר לחנקן נוזלי לאחר אחסון ללילה.
  3. החייאת תאים
    1. לבש כפפות, הוצא את הבקבוקון ממיכל החנקן הנוזלי, וטבול אותו מיד במים חמים בטמפרטורה של 37°C תוך ניעור מדי פעם כדי להבטיח הפשרה מהירה (בתוך דקה).
    2. הוצא את הבקבוקון מאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס, פתח את המכסה, שאפו את מתלי התא עם פיפטה, העבר לצינור צנטריפוגה, הוסיפו פי 10 נפח מדיום התרבית, ערבבו היטב, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות (25 מעלות צלזיוס).
    3. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 5 מ"ל מדיום תרבית בתוספת 10% סרום בקר עוברי (המדיום המלא למצב תרבית תאים), חיסון את צלחת התרבית, ודוגרו סטטית בדגירה של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 .
    4. החלף את מדיום התרבית למחרת (כדי להסיר שאריות DMSO ותאים מתים), והמשך לצפות בתרבית לתנאי גדילה. אם צפיפות התא גבוהה, יש לבצע תת-תרבית במהירות לניסויים הבאים.
  4. ספירת תאים
    הערה: חלק זה של הניסוי השתמש בצנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה.
    1. הכינו 75% אלכוהול מראש לניקוי תא הספירה וכיסוי הפתיחה, ואז ייבשו לשימוש מאוחר יותר.
    2. החזירו את התאים המעכלים והצנטריפוגים ב-1 מ"ל של מדיום, ודיללו 50 מיקרוליטר של תליית התא עם 150 מיקרוליטר של מדיום בצינור EP בנפח 1.5 מ"ל ליצירת דילול בארבעה משטחים.
    3. תנודו באופן שווה, קחו 10 מיקרוליטר, והזרקו בין הכיסוי לתא הספירה כדי למלא את התא במלואו תוך הימנעות מבועות. הניחו מתחת למיקרוסקופ לתצפית וספירה. עקרונות ספירה: אין להשמיט או לספור מחדש; לספור תאים שנוגעים בגבולות העליון והשמאלי, אך לא כולל את אלו שנוגעים בגבולות התחתונים והימניים.
    4. בהתאם לדרישות הניסוי, מחשבים את נפח התאים בהתבסס על ספירת התאים הרצויה לציפוי או לזריעה בצלחות ותוצאות הספירה, ואז השלימו את נפח המדיום הכולל במדיום מלא.

4. פרוטוקול בדיקת כחיות תאים

הערה: דולוקסטין נבחר כסוכן הבקרה ברפואה המערבית משום שהוא תרופה נפוצה ומאומתת קלינית לטיפול בכאב נוירופתי פריפרי. היעילות המוכחת שלו באינדיקטציה זו (הנתמכת בהנחיות פרקטיקה קלינית וניסויים מבוקרים אקראיים) מבטיחה שקבוצת הביקורת תוכל לספק הפניה אמינה להערכת היעילות היחסית של ההתערבות בבדיקה.

  1. ראשית, השליכו את מדיום התרבית הישן מהכלי ושטפו את פני התא ב-5 מ"ל PBS כדי להסיר סרום שנותר. לאחר מכן, מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 1-3 דקות. כאשר תצפית מיקרוסקופית חושפת התכווצות, עיגול והיפרדות של התאים, הוסף מיד 4 מ"ל DRG Complete Medium לסיום העיכול ולהחזיר את התאים באמצעות פיפטינג.
  2. העבר את תליית התא לצינור צנטריפוגה ואיסוף כדור התא על ידי צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט ותלה מחדש את כדור התא בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל, ואז תלווה היטב ותערבב את המתלים.
  3. קח צינור EP של 1.5 מ"ל, ומוסיפים תחילה 150 מיקרוליטר של מדיום תרבית, ואחר כך 50 מיקרוליטר של תליית תא. ערבבו היטב כדי להגיע לדילול של 4 פעמים.
  4. אחר כך השתמש ב-75% אלכוהול כדי לנקות את תא הספירה ולכסות את הזכוכית, לייבש אותן, ולנער שוב את צינור ה-EP באופן אחיד.
  5. הוצא 10 מיקרו ליטר של תליית תא והזריק אותו בין זכוכית הכיסוי לתא הספירה, כדי להבטיח שהנוזל ממלא את תא הספירה מבלי ליצור בועות.
  6. התבונן תחת מיקרוסקופ וספר את מספר התאים לפי עקרון הספירה, תוך הימנעות מהשמטות או כפילויות.
    הערה: אם מספר התאים שנספר הוא n, אז ריכוז התאים בצינור הצנטריפוגה הוא n/mL.
  7. בהתאם לדרישות הניסוי, זרעו את התאים בלוח של 96 בארות בצפיפות של 2,000 תאים לכל באר לפי הצורך.
  8. ראשית, הזרקו 200 מיקרוליטר PBS לכל באר במעגל ההיקפי של לוח עם 96 בארות, ואז מוסיפים תווך תרבית המכיל תאים לפי הקבוצה.
  9. לאחר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, חממהשל CO2 5% למשך 24 שעות, שאיפת המדיום הישן ושוטפת פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS. לפי הניסוי, יש לדלל את ה-CA שלב בשלב (0 מיקרומ', 2 מיקרומ', 4 מיקרומ', 8 מיקרומ', 16 מיקרו-מ', 32 מיקרומ') ולהוסיף 200 מיקרו-ליטר לפלטת 96 בארות.
  10. לטפל בתאים עם OXA (5 מיקרומון) למשך 24 שעות, ואז לטפל בתאי DRG בריכוזים משתנים של CA (0 מיקרומון, 2 מיקרומון, 4 מיקרומון, 8 מיקרומון, 16 מיקרומ, 32 מיקרומון) למשך 24 שעות, בהתאמה.
    הערה: חלק זה של הניסוי נועד לקבוע את ריכוז התרופה האופטימלי ל-CA.
  11. שטפו את לוח ה-96 בארות שלוש פעמים עם בופר PBS, ואז הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 טרייה לכל באר. שלב זה מתבצע בחושך, וזמן הניסוי נשלט כך שיושלם תוך 10 דקות. דגרו את התמיסה במשך 4 שעות בתנור חממה של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 . לבסוף, מדדו את ערכי הספיגה באמצעות קורא מיקרופלט. חזור על כל הניסויים לפחות שלוש פעמים בתנאים זהים.

5. MDA

  1. זרע 10 ×10 תאי DRG 6 בצלחת בגודל 15 ס"מ ותרבית לילה בתנור של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 . הסר את מדיום הגידול, הוסף תרופות, ודגר במשך 24 שעות בתנור של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5%CO2 .
  2. הסר את מדיום הגידול ושטוף פעם אחת עם 5 מ"ל PBS. לאחר העיכול, אספו את התאים לצינור חרוטי באמצעות מדיום DMEM.
  3. הוסיפו את תאי ה-DRG המטופלים למיקרוצינורות של 5 מ"ל, בהתאמה. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות עם צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה, והסרת הסופרנטנט. לאחר מכן, מוסיפים 1 מ"ל PBS, ערבבו על ידי פיפטינג, והעבירו למיקרוצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות עם צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה, והסרת הסופרנטנט.
  4. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת PBS נוגדת חמצון, פיפטה לערבוב, והכינו את תליית התא. הכן את הפתרון הסטנדרטי של MDA.
    הערה: ראו הכנת תמיסת MDA סטנדרטית בשיטת הפלואורסצנציה; עיין בסעיף "רכיבי ערכה" של הערכה לנהלים מפורטים.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס לצינור הדגימה ולצינור הסטנדרטי, בהתאמה, ולערבב היטב באמצעות מתנד מערבולת. תן לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  6. הוסף 250 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה לכל שפופרת, וערבב היטב באמצעות מערבל מערבול. חממו את אמבט המים לטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס בסביבה אור טבעית למשך 15 דקות, ואז הכניסו אותה לאמבט קרח ל-5 דקות לקרירות. צנטריפוגה רוטור זווית במהירות גבוהה בעוצמה של 10,000 x g למשך 10 דקות (4 מעלות צלזיוס).
  7. קח 100 מיקרול של סופרנטנט והוסיף אותו ללוח שחור עם 96 בארות. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלטות פלואורסצנטי (לדוגמה: 540 ננומטר, אלמטרוגיאלוג: 590 ננומטר). חשב את ריכוז ה-MDA בדגימה בהתבסס על העקומה הסטנדרטית.

6. תכולת Fe2+ בתאים שנמדדה באמצעותערכת זיהוי Fe2+

  1. חממו מראש את אמבט המים והעלו את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. לבשו כפפות, אספו את תאי ה-DRG מחנקן נוזלי, עטפו אותם בשכבת שקית פלסטיק, ואז טבלו אותם במים חמים בטמפרטורה של 37°C תוך ניעור עדין לסירוגין כדי להבטיח הפשרה מלאה תוך דקה.
  2. לאחר הפשרה, הוצא את הבקבוקון מאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, פתח את המכסה, שאפו את מתלה התא, העבר אותו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, והוסיפו 10 מ"ל מדיום תרבית בטיפה, תוך ערבוב יסודי. צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה ב-300 x g למשך 5 דקות (25 מעלות צלזיוס).
  3. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנאנט, מוסיפים 10 מ"ל מדיום תרבית טרי, פיפטו לערבוב יסודי, וצנטריפוגה שוב. חזור על התהליך הזה 3 פעמים לפני החיסון על מנות תרבות חדשות.
  4. תרב את התאים באופן סטטי בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5%CO2 . החלף את המדיום למחרת כדי להסיר שאריות DMSO ותאים מתים, ואז להמשיך לעבד. אם צפיפות התאים גבוהה, תת-תרבית בזמן. לאחר מכן, אוספים תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי, מעכלים אותם, צנטריפוגות ומחזירים את ההשהייה. זרעו את התאים שהוחזרו ללוחות של 12 בארות בצפיפות של 70%-80%, ואז החזירו את הלוחות לתוך חממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 להמשך גידול.
  5. התבוננו במצב התא ביום הבא, ספקו טיפולים תואמים לפי הניסוי, ואז החזירו אותם לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 להמשך גידול.
  6. לאחר 24 שעות של מתן תרופה, יש להשליך את מדיום התרבית המקורי ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הוסף 300 מיקרוליטר/באר של פרוב פרואורנג' (1 מיקרומטר) מדולל ב-HBSS, ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות.
  7. לאחר מכן מוסיפים תמיסת צביעת תאים חיים Hoechst 33342 (פי 100) ללוח התא ביחס של 1:100, דגרו בטמפרטורת החדר בחושך במשך 5 דקות כדי לצבוע את גרעיני התא.
  8. התבוננו באפקט הצביעה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה וצלמו תמונות לתיעוד. לאחר מכן, השתמש ב-ImageJ לחישוב עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת, כאשר הניסוי חוזר על עצמו שלוש פעמים לניתוח סטטיסטי.

7. ערכת זיהוי ROS

  1. קחו תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי, עכלו, צנטריפוגה, ותשאו אותם מחדש, ואז זרעו את התאים בצלחת של 12 בארות בצפיפות (70%-80%). לאחר ערבוב יסודי של התאים, מניחים אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 להמשך גידול.
    הערה: לגבי שלבי העיכול, הצנטריפוגציה וההשעיה מחדש, יש לעיין בשלב 4.1.
  2. התבוננו במצב התאים ביום הבא, נתנו טיפולים תואמים לפי הניסוי, ואז החזירו את התאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 להמשך תרבית. לאחר 24 שעות של מתן תרופה, יש להשליך את מדיום התרבית המקורי ולשטוף את התאים פעמיים עם HBSS.
  3. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת צבע רגישה מאוד DCFH-DA, ואז דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% חממהCO 2 למשך 30 דקות.
  4. השליכו את הסופרנאנט, שטפו פעמיים עם HBSS, וצבועו ב-2 מיקרוליטר של תמיסת צביעה של תאי Hoechst 33342 (100x) למשך 5 דקות, ואז בדקו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. חזור על הניסוי שלוש פעמים עם ניתוח סטטיסטי.

8. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית של התאים שנצפתה באמצעות TEM

  1. להשליך את מדיום התרבית מהתאים המגודלים היטב, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת קיבוע גלוטארלדהיד בטמפרטורת החדר ב-2.5%, ומקבע את התאים בחושך בטמפרטורת החדר למשך כ-5 דקות. גרד בעדינות את התאים בכיוון אחד באמצעות מגרד תאים.
  2. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 600 x g למשך 3 דקות באמצעות צנטריפוגה רוטור אופקית במהירות נמוכה.
  3. לאחר השלכת הסופרנטנט של התמיסה הקיבועית, הוסף קיקע מיקרוסקופ אלקטרוני טרי (השתמש ב-1 מ"ל לכל באר לפלטה של 12 בארות), וקבע בטמפרטורת החדר הרחק מהאור למשך 30 דקות, ואז העבר ל-4 מעלות צלזיוס לאחסון.
  4. חדירת התייבשות: הכנס את הדגימה ללוח ההטמעה והכנס אותה לתנור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
  5. פולימר את מדיום ההטמעה בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שניות. חתוך קטעים דקים במיוחד של 60-80 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום.
  6. צבעי את החלקים בתמיסת אלכוהול רווי של 2% אורניל אצטט למשך 15 דקות, ואז עם ציטראט עופרת לעוד 15 דקות. ייבשו את האזורים המוכתמים למשך הלילה בטמפרטורת החדר. התבונן וצלם את החתכים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר.

9. בלוט מערבי

  1. חלץ את כל החלבון מהתאים
    1. טפלו והחסנו את התאים בצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ עד שהם מגיעים לצפיפות של 70%.
      הערה: עיין בשלב 3.3 לקבלת הוראות על החייאת תאים וחיסון.
    2. בצלחת הגידול, הוסף 3 מ"ל OA (5 מיקרומון) ואחרי 4 שעות מוסיפים CA (4 מיקרומון).
    3. הכינו קופסה של קרח, PBS לפני קירור, מגרדים של תאים, בופר ליזיס מוכן, וכמה צינורות EP מסומנים מראש.
    4. לאחר טיפול תרופתי, הסר את מדיום התרבית מהתאים ושוטף אותם פעמיים עם PBS מקורר מראש. בצע את התהליך הזה על קרח, ושאוף כל PBS שנותר באמצעות צנטריפוגה בוואקום.
    5. תייגו כל צלחת פטרי, ואז מוסיפים 300 מיקרוליטר של בופר ליזיס ותנו לה לעמוד על הקרח במשך 5 דקות עם ערבוב מתמשך כדי למנוע ליזיס לא מלא והקפאה.
    6. לאחר מכן משתמשים במגרד תאים מקורר מראש כדי לנתק את התאים הדבוקים, ואוספים 300 מיקרוליטר לצינור EP לאחר כל גירוד. השתמש במגרד תאים חדש לכל גירוד ואל תשתמש בו שוב.
    7. החזק את החלק העליון של צינור ה-EP וערבב היטב במיקסר וורטקס, ואז ממשיך להניח אותו על הקרח במשך 25 דקות. בשלב זה, יש להדליק מראש את הצנטריפוגה הזוויתית במהירות 4 מעלות צלזיוס, שכן קירור מוקדם של הצנטריפוגה דורש זמן מסוים.
    8. לאחר סיום הטיימר, יש להפעיל שוב מערבולת נוספת, ואז צנטריפוגה רוטור זוויתית במהירות גבוהה ב-4500 x g למשך 15 דקות בצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס.
    9. עכשיו תדליק את תנור האמבטיה היבש ותגדיר את הטמפרטורה ל-100 מעלות צלזיוס.
    10. הוציאו את ערכת הכימות של חלבון BCA, הוסיפו דגימות וריגנטים ללוח עם 96 בארות, ערבבו היטב והגיבו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו-5%CO2 למשך 30 דקות. מדדו את תכולת החלבון המופקת באמצעות קורא מיקרופלט רב-תכליתי, ואז התאימו עם בופר הליזה הנותר בהתאם לתוצאות כדי לוודא שריכוז כל דגימה עקבי.
    11. לבסוף, בהתבסס על תכולת כל סופרנאנט, מוסיפים 1/5 נפח של 6× בופר טעינה כדי להכין את מערכת טעינת החלבון. שאפו בזהירות 150 מיקרוליטר של סופרנטנט לתוך צינור EP חדש. הוסף 30 מיקרוליטר של בופר עומס 6× לסופרנטנט וערבב היטב (בדרך כלל ביחס של 1:5). שמרו את התערובת על קרח.
    12. אחר כך חמם ב-100 מעלות צלזיוס על מחמם למשך 6 דקות, תוך שמירה על הפקק של צינור ה-EP כדי למנוע פתיחה. אחרי החימום, מקררים אותו באמבט קרח.
  2. הכינו ג'ל חלבון בריכוז 10%.
    1. שטוף את צלחת הג'ל במים טהורים, ייבש באוויר, נגב לחות עודפת והימנע מכתמי מים ואבק ככל האפשר.
    2. הוציאו את מעמד יציקת הג'ל, כאשר הלוחות הקצרים של שתי לוחות הזכוכית מלפנים והלוחות הארוכים מאחור, מיישרים את התחתית כדי להבטיח שהרווח בין לוחות הזכוכית יתאים היטב לרצועת האיטום בתחתית המעמד כדי למנוע דליפה, ואז מהדקים את הלוחות היטב כדי להתכונן ליציקת ג'ל.
    3. הכינו את הג'ל התחתון עם 6 מ"ל מים טהורים, 3.75 מ"ל של 1.5 מ' טריס-HCl (pH 8.8), 0.15 מ"ל של 10% SDS, 5 מ"ל של 30% Acry/bis, 75 מיקרוליטר של 10% APS, ו-7.5 מיקרוליטר TEMED.
    4. סובבו בעדינות כדי למנוע קצף, ואז הוסיפו במהירות ובשוויון בין שתי צלחות הזכוכית, והשאירו מקום לג'ל העליון. לאחר מכן, שטח את פני הנוזל עם 1 מ"ל איזופרופנול והשאירו עומדים כ-30 דקות.
    5. שטפו את המסרק להכנת ג'ל במים טהורים, ייבשו באוויר והניחו בצד. לאחר שהג'ל התחתון התקשה לחלוטין, שפוך את האיזופרופנול, שטוף בזהירות 2-3 פעמים במים טהורים, ספג את הנוזל והפך את פלטת הג'ל כדי לנקז את כל הנוזלים שנותר.
    6. הכינו את ג'ל הערימה העליון עם 6 מ"ל מים טהורים, 2.5 מ"ל של 0.5 מטר טריס-HCl (pH 6.8), 0.1 מ"ל של 10% SDS, 1.34 מ"ל של 30% Acry/bis, 50 מיקרוליטר של 10% APS, ו-10 מיקרוליטר TEMED.
    7. מלאו את השכבה העליונה והכניסו בזהירות מסרק בעובי 1.5 מ"מ עם 15 בארים. לאחר 1-2 דקות, ממלאים מחדש את הפערים, תוך הקפדה למזער היווצרות בועות בתהליך. השתמש בג'ל פולימריסטי מלא.
  3. אלקטרופורזה בג'ל חלבון
    1. הגדר מראש את בופר ההפעלה ואת מאגר ההעברה, כאשר מאגר ההעברה מקורר מראש במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. שטוף את ג'ל החלבון במים אולטרה-טהורים, מוציא מיכל אלקטרופורזה נקי, מהדק את שתי הצלחות הקצרות של ג'ל החלבון פנימה והפוך, שפוך פנימה את ה-Running Buffer, ובדוק אם יש דליפה.
    3. הסר בזהירות את המסרק, טען 10 מיקרוליטר לכל באר עם סך של 4 קבוצות דגימה. טעינו 3 קבוצות דגימות לכל ג'ל, מופרדות על ידי סמן חלבון של 4 מיקרוליטר בין כל קבוצה, בסך הכל 15 בארות.
    4. לאחר טעינת הדגימות, שפכו את כל בופר הריצה שנותר למיכל האלקטרופורזה, כסו אותו במכסה, כוונו את המתח ל-140 וולט, ומבצעים אלקטרופורזה במתח קבוע למשך 20 דקות.
    5. כאשר רצועות החלבון נכנסות לג'ל ההפרדה לאחר ריכוז, כוונו את המתח ל-120 וולט לאלקטרופורזה במתח קבוע. במהלך תהליך זה, השרה את ממברנת ה-NC בבופר העברה. עצור את האלקטרופורזה כאשר הברומופנול הכחול מצביע על כך שהדגימה הגיעה לקצה התחתון של הג'ל, והכן את עצמך להעברת ממברנה.
    6. מלא קופסת קצף עד חצי הקרח, מוציא את מהדק ההעברה, את בופר ההעברה המקורר מראש, ואת ממברנת NC הספוגה. שפוך חצי מבופר ההעברה למיכל מרובע שטוח.
    7. הוציאו את ג'ל החלבון, שטפו אותו היטב במים אולטרה-טהורים, הניחו את הצד השחור הפונה כלפי מטה, ואת הצד השקוף כלפי מעלה. באמצע, סדר שכבה אחת של ספוג, שכבה אחת של נייר סינון, את ג'ל החלבון, ממברנת NC, ואז הנח שכבה נוספת של נייר סינון וספוג.
    8. לאחר לחיצה להסרת בועות אוויר, מהדקים את קלטת ההעברה ומניחים אותה במיכל ההעברה. לאחר ששני ג'לי החלבון הוכנסו במלואם, שפכו את כל בופר ההעברה למיכל ההעברה, ואז מוסיפים שתי שקיות קרח לקירור וכסות עם המכסה.
    9. הקיפו את קלטת ההעברה בקרח והעבירו במתח קבוע של 120 וולט למשך 90 דקות. תהליך ההעברה מייצר חום משמעותי, ולכן יש צורך באמבט קרח לקירור.
    10. הוציאו את ממברנת ה-NC, טבלו וצבעו אותה ב-20 מ"ל של תמיסת צביעה Ponceau S, סמנו את גודל הסמן עם עיפרון, וחתכו את הממברנה בעיפרון לפי גודל החלבון המיועד לזיהוי.
    11. השחזר את תמיסת הצביעה Ponceau S. שטוף את תמיסת הצביעה עם PBS ודגר את ממברנת ה-NC עם 20 מ"ל של בופר חסימה, ואז חסם בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות נמוכה למשך שעה-שעתיים.
    12. השליכו את תמיסת החסימה, שטפו במהירות את הממברנה פעמיים עם PBS על שייקר שמבהיר צבע כדי להסיר את תמיסת החסימה לחלוטין, ואז הוסיפו את הנוגדנים המתאימים לפי יחסי השימוש של Western Blot לכל נוגדן בקופסת הדגירה של הנוגדנים, ודגרו לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    13. בנפרד שחזרו את הנוגדנים הראשוניים ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. הממברנות נשטפו במהירות 4 פעמים עם TBST על שייקר שמדהר צבע, 5 דקות בכל פעם, כדי להסיר היטב את הנוגדנים הראשוניים. לאחר מכן, מוסיפים 4 מ"ל של בופר חוסם עם נוגדנים משניים, ודגרו את הממברנות בטמפרטורת החדר על שייקר איטי למשך שעה.
    14. שטפו את הנוגדן המשני ארבע פעמים עם בופר TBST למשך 5 דקות כל פעם, ואז החליפו בבופר PBS כדי להרטיב לחלוטין את ממברנת ה-NC.
    15. לפי מדריך ההוראות לתגובה כימילומינסנציונית של ECL, יש להכין את התמיסה הלומינסצנטית ולהניח אותה על פני הממברנה, ואז לדגור למשך 1-2 דקות לפני הפיתוח באמצעות מערכת הדמיה ג'לית.
    16. לעבד את הנתונים הגולמיים במערכת ההדמיה Image J, ואז להעביר אותם לתוכנת פוטושופ ליצירת דמויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרמקולוגיה רשת ועגינה מולקולרית
זיהוי מטרות פוטנציאליות של CA: בחקירה מקיפה של הפעילות הפרמקולוגית של CA, 60 מטרות פוטנציאליות נבחרו בקפידה מתוך סקירה מקיפה של ספרות רלוונטית. כדי להרחיב עוד את היקף הניתוח, זוהו 12 מטרות פוטנציאליות נוספות הקשורות ל-CA דרך מסד הנתונים של TCMSP. לשיפור הדיוק והיסודיות, נעשה שימוש ביכולות החיזוי המתקדמות של פלטפורמת SwissTargetPrediction, מה שהניב יעד פוטנציאלי נוסף. לאחר אינטגרציה והסרת כפילות קפדנית של כל מקורות הנתונים, נקבע סט סופי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרופטוזיס, שיטת מוות תאי שזוהתה לאחרונה, מאופיינת בהצטברות ברזל תוך-תאי מופרזת ופרוקסידציה של שומן. מורפולוגית, פרופטוזיס מתבטא בהתכווצות מיטוכונדריאלית, אובדן או הפחתה של מבני הקריסטה, ועלייה בצפיפות הממברנה, בעוד שהקרום התא והמורפולוגיה הגרעינית נשארים בלתי מושפעים26. מבחינה מכנית, הפרופטוזיס מונע על ידי דלדול גלוטתיון (GSH) ופגיעה בפעילות GPX4, מה שמונע את חילוף החומרים של פרוקסידי השומן באמצעות תגובת גלוטתיון רדוקטאז המזורזת על ידי GPX4. יוני ברזליים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים פיננסיים לחשוף

תודות

אנו מביעים את תודתנו העמוקה על התנאים המעולים שסיפק בית החולים ומחלקותיו, שאפשרו לנו להשיג תוצאות אלו. במקביל, אנו גם מביעים את תודתנו הכנה לחברי המעבדה הרבים על מאמציהם הבלתי נלאים ותרומותיהם החשובות לאורך השנים. העבודה הקשה של כל משתתף היא חלק בלתי נפרד מההצלחה שלנו, ובעתיד נמשיך לעבוד יחד לקידום ההתקדמות בתחום הרפואה. הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82104838), תוכנית הניצוץ של קרן קידום סין (XH-D001), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של מחוז ליאונינג (2024JH2/102500062), וקרן מדעי הטבע של מחוז ליאונינג (2025-MSLH-490).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  גליציןBiofroxx1275KG001
  טריס-בייסביופרוקס1115KG001
0.5  M  בופר Tris-HCl (pH  6.8)ביוראד1610799
1 מטר טריס-HCL (PH 7.5)ביוטייםST775
1.5  M  בופר Tris-HCl (pH  8.8)ביוראד1610798
APSביוטייםST005
ספק כוח בסיסי לאלקטרופורזהBIO-RAD PowerPac Basic
ערכת כימות חלבון BCAביוטייםP0012
נוגדן רקומביננטי בטא אקטיןחואביו81115-1-RR
חממת פחמן דו-חמצניתרמו150 ליטר
ערכת בדיקה CCK-8אפקסביוK1018
ערכת בדיקת פעילות תאים וטקסיות ציטוטוקסיתביוטייםC2015M
סינמלדהיד (קליפורניה)מקליןC805134טוהר 98%
שייקר שמפחית צבעקיילין-בלTS-100
DMEM (הנשר הבינוני המותאם של דולבקו)BasalMediaL110KJ
DMSOסיגמאD2650
גנגליון שורש גב (DRG)ביוגרפיה של פוהנגFH165מספר סידורי: 20211227-1
DRG מדיום מלאביוגרפיה של פוהנגFH-DRG
תמיסת לומינצנטי ECLתרמו34580
ErbB-1פרויטנטק06-8471:2000
Fetal  בובין  סרוםמקליןFO193
גלאי זיהוי יוני ברזל - FerroOrangeדוג'ינדוF374
FTH1טכנולוגיית איתות סלולרי4393S1:1000
מערכת הדמיית ג'לBIO-RAD כימדוק טאץ'
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)סולרביולוגיהH1025
צנטריפוגה מקוררת מהירהאפנדורף5804R
פתרון צביעת תאים חיים Hoechst 33342ביוטייםC1028
ערכת אימונוהיסטוכימיהביושארפBS-24-PB
מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךלייקהLeica Dmi 8
נוגדן מונוקלונלי של ארנב רקומביננטי JAK2 [SY0245]חואביוET1607-351:2000
מיקרוסקופ מנוגד פאזה הפוך במעבדהלייקהלייקה DMI 1
צנטריפוגה במהירות נמוכהאפנדורף5804
ערכת זיהוי תוכן MDAסאנגוןD799762
קורא מיקרופלטזריחה טקאן
קורא מיקרופלט רב-תכליתיBMGLABTECH PHERAstar FS
NF-& kappa; B p65 נוגדן פוליקלונליפרויטנטק10745-1-AP1:1000
פאראפורמלדהידמקליןP804536
תמיסת צביעת פונסוביוטייםP0022
סמן חלבוןתרמו26617
P-STAT3 (Ser727)טכנולוגיית איתות סלולרי9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)טכנולוגיית איתות סלולרי9145S1:2000
נוגדן אנטי-גלוטתיון פרוקסידאז 4 רקומביננטי[EPNCIR144]אבקאםAB1250661:1000
נוגדן אנטי-XCT רקומביננטי[EPR27115-64]אבקאםAB3076011:1000
ערכת מבחן ROSדוג'ינדוR252
בופר טעינת חלבון SDS-PAGE (6X)ביוטייםP0289
אבקת חלב דל שומןביושארפBS102-500g
נתרן דודציל סולפט SDSביופרוקס3250GR500
STAT3 (F-2)סנטה קרוזSc-80191:200
TEMEDסולרביולוגיה    T8090   
TFRCInvitrogen13-68000.5 ומיקרו; g/mL
טווין80סלקS6702
שולחן עבודה אולטרה-נקיHDLDL-CJ-2NDI
מיקרוסקופ זקוףאולימפוסCX 31
אלקטרופורזה אנכיתBIO-RAD מיני פרוטאן טטרה
מיכל העברה רטובBIO-RAD מיני טרנס בלוט
α-Tubulinα-TubulinER130905
פריזמת GraphPadניתוח סטטיסטי
תוכנת ImageJקבל את הערך האפור של כתם החלבון

מקורות

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוירופרוטקציה של Cinnamaldehydeנוירוטוקסיות של Oxaliplatinגנגליון השורש האחורימסלול פרופטוזיססיגנלינג JAK2 STAT3ביטוי GPX4בדיקת פרוקסידציה של ליפידיםמינים פעילים של חמצןאנליזה של ביטוי חלבונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.