מאמר שיטה

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/69026

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  ,  , 
1Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2The Boyce Thompson Institute for Plant Research, 3Department of Biology, University of Ottawa

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרובים מפרישים מטבוליטים משניים מגוונים מבנית במהלך זיהום בצמחים, חלקם מזוהים על ידי תאי הצמח, שמפעילים תגובות לחץ. בשיטה זו, השראת דליפת יונים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז נמדדת באותו דגימת דיסק עלה. ראשית, דיסקי ארבידופסיס או עלי שעורה מוחדרים בוואקום בלוח של 96 בארות. לאחר 4-6 שעות נמדדת מוליכות, ואחריה פעילות פרוקסידאז והצטברות קלוז ב-24 שעות. הפפטיד flg22 מעורר את שלוש התגובות והוא בקרה חיובית במחיר נגיש. ליפופטידידים מחזוריים של סרפקטין וגרמילין גורמים לפעילות פרוקסידאז ודליפת יונים, בהתאמה, בעוד ש-T-2 טריכוטקן פיטוטוקסי מדכא פעילות פרוקסידאז. בסך הכול, גישה זו מאפשרת השוואות מרובות בין גנוטיפים של צמחים או טיפולי מטבוליטים. גישה זו יכולה להיות מיושמת בגנטיקה כימית או בהגנה ביולוגית לזיהוי תרכובות מווסתות לחץ למחקר נוסף. בגנטיקה של צמחים, גישה זו יכולה לשמש להשוואת תגובות בין אוכלוסיות צמחים למיפוי גנטי ולשיפור הבנתנו את האינטראקציות בין צמחים למיקרובים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצמחים מגיבים למולקולות מיקרוביאליות מגוונות כדי להפעיל תגובות לחץ תאי, שיכולות להוביל לעמידות למחלות. דפוסים מולקולריים הקשורים למיקרובים (MAMPs), כגון פפטיד flg22 מהפלוגלין החיידקי, מזוהים על ידי חלבוני קולטני צמחים כדי ליזום מספר תגובות איתות תאיות. אלה כוללים תגובות מוקדמות כמו מפלי קינאז, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), זינוק סידן, דה-פולריזציה של ממברנה, ותגובות מאוחרות כמו הצטברות קלוז והשראת פעילות פרוקסידאז1. מטבוליטים משניים מיקרוביאליים (MSMs) הם מולקולות קטנות (50-1,500 דלטון), מגוונות מבנית שניתנות להחלפה לצמיחה והתפתחות אך מקדמות את הישרדות המיקרוב. חלק מה-MSM גורמים לתגובות לחץ תאי בצמחים, אם כי המנגנונים המעורבים בהתחלת תגובות אלו נותרו בלתי פתורים 2,3. מנגנונים מוצעים לזיהוי MSM של צמחים כוללים מכנוסנסינג, שינויים חלבונים מונעים מחמצון אדום, או איתות מבוסס ליפידים 4,5. במקרים מסוימים, MSM גורם לתגובות לחץ או גורם לנזק תאי בהתאם לריכוז. לדוגמה, רעלן T-2 גורם לייצור קלוז ו-ROS ב-1 מיקרומולר וגורם למוות תאים ב-10 מיקרומול, ובדרך כלל מתואר כפיטוטוקסין4. MSMs משפיעים על פתוגנזה בחלק מהאינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים ויכולים לגרום לרגישות או לעמידות אצל הצמח. לדוגמה, הליפופטיד המחזורי גראמילין מעורר ייצור ROS, דליפת יונים וייצור קלוז, תוך שיפור הרגישות לשעורה ל-Fusarium graminearum2. הליפופטידידים המחזוריים של סירינגומיצין וסירינגופפטין מעוררים ייצור ROS צמחיים ומקדמים עמידות למארח נגד חיידקי Pseudomonas fluorescens 3. MSM אחרים, כגון סורפקטין ואיטורין, מיוצרים על ידי מיקרובים שאינם פתוגניים ומקדמים עמידות לזיהום פתוגן נוסף על ידי גרימת תגובות לחץ צמחיות 6,7. MSM ביו-מגן אלו מעוררים תגובות תאיות, כולל זרמי יונים, ייצור ROS, שינויים שעתוקיים וייצור קלוז8. הבנת האינטראקציות בין MSM לצמחים יכולה לסייע בקביעת תפקיד MSM בעמידות למחלות ולזהות גנים של מארח שניתן לנצל לשיפור עמידות הגידולים.

השיטות הנוכחיות להערכת תגובות לחץ צמחיות הנגרמות על ידי MSM כוללות בדרך כלל בדיקת תגובת לחץ אחת בכל פעם8. בהינתן ש-MSM משני יכול להיות קשה להפקה וכמות מוגבלת של מטבוליט עשויה להיות זמינה, בדיקת תגובות מרובות בתוך אותה דגימה יכולה לספק ביטחון לכך של-MSM יש השפעה על תאי הצמח. שיטה עתירת תפוקה להערכת התפרצויות ROS אפופלסטיות היא זיהוי זוהר שנוצר על ידי לומינול מחומצן בנוכחות פרוקסידאז9 של חזרת. למרבה הצער, הזוהר המבוסס על לומינול מדכא על ידי קטיון וחלק מממסים, מה שמגביל את השימוש במבחן זה לתמציות המכילות מלחים או למולקולות לא פולריות שיש להמיס ב-DMSO, מה שמחייב שיטה שעובדת עם מזהמים אלו. כדי להתמודד עם בעיות אלו, הרחבנו את השיטות הנוכחיות להערכת שלוש תגובות מאמץ (דליפת יונים, פעילות פרוקסידאז ויבלה) מאותו דגימת עלה במבחן בעל קצב תפוקה גבוהה (איור 1)10,11,12. הגישה שלנו כוללת טיפול בדיסקי עלים עם MSM באמצעות חדירת ואקום בלוח של 96 בארות. לאחר מכן, מתבצעות מדידות מוליכות לאחר 4-6 שעות לאחר הטיפול להערכת דליפת יונים, ואחריהן פעילות פרוקסידאז ומדידות שקיעת קלוז ב-24 שעות. הגישה שלנו מותאמת ל-Arabidopsis ולשעורה, אך ניתן להרחיב אותה למינים נוספים עם אימות ניסיוני. לדוגמה, פעילות פרוקסידאז שעורה מושרה אינה ניתנת לזיהוי בשיטה זו, אך ניתן לזהות דיכוי פעילות על ידי תרכובות רעילות. לכן, מאפייני העלה או עוצמת התגובה המושרה משתנים בין מינים, מה שמגביל את היישום של גישה זו לחלק ממיני הצמחים.

תכנון ניסוי בשיטה זו צריך לקחת בחשבון את הבקרה, השכפול והריכוז של MSM המשמשים כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר. ביקורת שלילית חיונית לזיהוי MSM שמעוררים רמות תגובה סטטיסטית שונות של לחץ לעומת השפעות הפציעה. באופן אידיאלי, הבקרה השלילית תכיל את אותו ממס כמו ה-MSM אך ללא ה-MSM. ממסים טיפוסיים ל-MSM הידרופובי כוללים DMSO ומתנול, המעוררים תגובות תאיות כגון ייצור ROS בריכוזים גבוהים13,14. במבחן זה, אנו מבחינים בהשפעה על פעילות פרוקסידאז, כאשר 10% או יותר DMSO ומתנול חוסמים פעילות פרוקסידאז הנגרמת על ידי flg22 (איור 2). במקרה של תמציות מורכבות, ייתכן שיהיה קשה לפתח שליטה שלילית ללא MSM כאשר המטבוליטים הרלוונטיים אינם ידועים. במקום זאת, חלוקת התמציות לפי גודל, קוטביות או מטען תאפשר השוואות יחסיות בין שברים כדי לזהות את השבר המאמץ ביותר לניתוח נוסף. בנוסף, הכללת בקרה חיובית, כגון 1 μM flg22 או 10 מיקרומום T-2 רעלן, מבטיחה שהחוקר יוכל להעריך שהבדיקה פועלת. אנו ממליצים לכלול ארבעה שכפולים טכניים בכל טיפול ולכלול בקרות חיוביות ושליליות בכל לוח כאשר מספר פלטות נמדדות במהלך הניסוי.

בסך הכול, גישה זו לוכדת שלוש תגובות לחץ של צמחים הנגרמות על ידי MSM, ומציעה שיטה נגישה וחסכונית לסקר אינטראקציות בין הצמח ל-MSM. הפורמט בעל התפוקה הגבוהה מאפשר לחוקרים ללכוד הבדלים עדינים בין גנוטיפים של צמחים או תמציות מיקרוביאליות בתוך אותה יחידה ניסויית. דבר זה מאפשר גישות ברמת המערכת להבנת משפחות הגנים של הצמחים או לסקור אוכלוסיות צמחים למיפוי גנטי. בצד המיקרובים, גישה זו יכולה לשמש לסינון תרכובות ביולוגיות פוטנציאליות או בגנומיקה כימית לזיהוי תרכובות שמחזקות או מדכאות תגובות לחץ ספציפיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה וטיפול בדגימה

הערה: יש לנקוט בכל אמצעי הזהירות והנהלים הנכונים לטיפול כדי למזער את הסיכון לניסוי ולסביבה.

  1. גידול צמחים
    1. גדלו את הערבידופסיס לשלב של 4-5 שבועות בתערובת הקרקע של קורנל (300 טחב טחב: 630 וריקוליט: 1 דשן שחרור איטי: 4.2 סיד) עם שני צמחים בכל עציץ ב-24 עציצים בכל מגש. השקה את הצמחים לפי הצורך מלמטה על ידי הוספת מים למגש. הגדר את תנאי תא הגידול ל-21 מעלותצלזיוס ברציפות עם 16 שעות אור ו-8 שעות של חושך, ושמור על כ-30-50% לחות. השתמש בעליםהמורחבים במלואם של 5-9 לניסויים ולקציר בבוקר.
    2. גידול שעורה עד שהעלים הראשונים והשניים מתרחבים במלואם ב-75 אדמת עציצים: 24 אדמה שחורה: תערובת אדמת סיד אחת. שתול זרע אחד בכל עציץ ב-24 חלקות בכל מגש, והשקה לפי הצורך. הגדר את תנאי תא הצמיחה ל-21 מעלותצלזיוס עם 16 שעות אור ו-8 שעות חושך בלחות של כ-30-50%. טעמו את העלים הראשונים והשניים המורחבים במלואם וקצרו בבוקר.
  2. אסוף שלושה דיסקי עלים לכל צמח באמצעות קדחן שעם בקוטר 4 מ"מ, תוך הימנעות מהעורק המרכזי. הימנעו מהרסת הרקמה על ידי שימוש בקודר חד עם תנועת סיבוב.
  3. הניחו מיד ובעדינות את דיסקי העלים בתוך באר אחת של לוח עם 96 בארות בנפח 196 מיקרוליטר של Milli-QH 2O סטרילי. המשיכו לאסוף דיסקים עד שמספר הדגימות הנדרש.
  4. הוסף מטבוליטים משניים או טיפולי ממס בריכוז הרצוי לנפח סופי של 200 מיקרו-ליטר לבארות בודדות.
  5. הניחו את לוח ה-96 עם המכסה פתוח בצנצנת פעמון עם פיית ואקום.
  6. חבר את צינור הוואקום לפיה של צנצנת הפעמון והפעל את לחץ הוואקום עד שהוואקום מגיע ל-9.8 פאונד/אינץ' רבוע (בדרך כלל 10 שניות). חזור על התהליך הזה פעם נוספת.
  7. הניחו את המכסה על הלוח ודגרו על רעיד אורביטלי (55 סל"ד) באור (13 וואט, 50 מיקרומול∙מ-2∙ש-1) הממוקם 23 ס"מ מעל הרעידה למשך 4 שעות.

2. מדידות דליפת יונים

  1. שטפו את הגשוש במי Milli-Q ומרחו בעדינות על Kimwipe לייבוש. שימו לב לקריאת המוליכות של המים לצורך הפניה.
  2. לאחר 4-6 שעות לאחר הטיפול, יש לדגום ולרשום מוליכות מבארות בודדות על ידי הטבלת הגשוש בנוזל שמקיף את דיסק העלה. החזק את הלוח בזווית של 45° כדי לוודא שהגשוש פתוח לחלוטין.
  3. שטפו את הגשוש בין דגימות על ידי טבילה במי Milli-Q וניקוי ייבוש על Kimwipe. לעיתים, בדקו את מוליכות המים כדי לוודא שקריאות הגשוש נשארות יציבות.
  4. הנח שכבת איטום מפלסטיק על הפלטה והחזר לשייקר האורביטלי לדגירה במהלך הלילה.

3. מדידות פעילות פרוקסידאז

  1. הכינו את מצע הפרוקסידאז טרי מדי יום בתמיסה של 50 מ"ל. חמם 40 מ"ל מים מזוקקים ל-70 מעלותצלזיוס בכוס עם מוט ערבוב והמיס 50 מ"ג חומצה 5-אמינוסליצילית (1 מ"ג/מ"ל) במים המחוממים. הוסף מים עד 50 מ"ל וכיוון את ה-pH ל-6 באמצעות NaOH. התמיסה רגישה לאור, לכן יש לכסות בנייר אלומיניום או להשתמש בצינור ענבר.
  2. בצינור חרוטי ענבר בנפח 50 מ"ל, יש להכין תמיסה של 1% H2O2 על ידי הוספת 1.7 מ"ל של 30% H2O 2 ל-48.3 מ"ל של Milli-Q H2O.
  3. מיד לפני הבדיקה, יש להוסיף 10 מיקרוליטר מתמיסת H2O 2 של 1% לכל מיליליטר של תמיסה 5-אמינוסליצילית הנדרשת ליצירת תווך הבדיקה.
  4. כדי לדגום את דיסקי העלים המטופלים, יש לקחת 50 מיקרוליטר מכל באר בנקודת הזמן הרצויה. העבר לפלטת שטוחה עם תחתית שטוחה עם 96 בארות ומוסיפים 50 מיקרוליטר מדיום הבדיקה, תוך ערבוב על ידי פיפטינג פי 5.
  5. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ועצרו את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של 2 N NaOH, תוך נקישה עדינה לערבוב.
  6. מדוד את ספיגת הבארות ב-595 ננומטר בקורא לוחות.

4. הדמיית קלוז וניתוח תמונות

  1. לאחר דגימת הבארות לבדיקת פרוקסידאז, הסרת הנוזל שנותר מהבארות והוספה 100 מיקרוליטר של תמיסת חומצה אצטית:אתנול (1:3) לקיבוע והסרת צביעה. מניחים מכסה על הצלחת ודגרו את הפלטה על שייקר (60 סל"ד) במכסה אדים למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. החלף את תמיסת ההסרה בתמיסה טרייה ודגר עוד 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים את תמיסת ההסרה ומוסיפים 100 מיקרוליטר של 150 mM K2HPO4 לכל באר. מניחים את הצלחת על השייקר ודגרו 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את תמיסת השטיפה K2HPO4 והוסף 100 מיקרוליטר של 150 מ"מ K2HPO4 עם 0.1 מ"ג/מ"ל אנילין כחול. כסו את לוח ה-96 בארות בכיסוי ונייר אלומיניום ודגרו על שייקר לפחות שעתיים (Arabidopsis) או לילה (שעורה).
    הערה: כחול אנילין רגיש לאור ויש להכין אותו מחדש בכל שכפול טכני.
  5. הסר את תמיסת האנילין הכחולה והחלף ב-50% גליצרול. כסו את לוחות 96 הבארים בנייר אלומיניום ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לצילום.
  6. הנח טיפה של תמיסת גליצרול 50% על זכוכית נקייה. הרימו בעדינות דיסק עלה עם פינצטה והניחו אותו בצד האפקסיאלי כלפי מעלה על המגלשה. כסו עם כיסוי 1.5 מדרגה כדי למזער בועות אוויר, והוסיפו גליצרול נוסף 50% אם צריך כדי למלא מתחת לכיסוי.
  7. הביאו את חומר העלה לפוקוס באמצעות אור לבן מועבר (שדה בהיר) מתחת לעדשה יבשה של 20x.
  8. בחר את אורך הגל של העירור ל-370 ננומטר ואת אורך הגל ל-509 ננומטר להדמיה כחולה של אנילין וקבע זמן חשיפה. אופטימיזציה של זמן החשיפה כדי לאפשר אות מספק אך להימנע מרוויה יתר של פיקסלים. לצורך השוואה כמותית של תמונות, יש לוודא שעוצמת הלייזר וזמן החשיפה עקביים עבור כל השכפולים הביולוגיים, הטיפולים והשכפולים הטכניים.
  9. עבור כל דיסק עלה, בחרו שלושה שדות תצוגה שונים ורכוש תמונות לכל אחד מהם באמצעות הפרמטרים שנקבעו בשלב 4.8. לצלם את כל התמונות עם חומר צמחי שממלא את שדה הראייה במלואו עם אזורים מינימליים של רקע (חומר שאינו צמחי). לצלם תמונות על מישור z יחיד על פני העלה.
    הערה: ייתכן שיהיה לך רקע מסוים וניתן לתקן זאת בשלבים מאוחרים יותר של כימות תמונות. בדוגמה זו, התמונות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה זקוף עם מנורת כספית וקוביית מסנן DAPI (עירור 360/40 ננומטר, פליטה 460/50 ננומטר). במקרים שבהם מנורת כספית אינה זמינה, ניתן להשתמש במקור אור LED רב-אורכי גל.
  10. כדי לכמת נקודות קלוזה מהתמונות, הורידו והתקינו את תוכנת עיבוד התמונות של FIJI החינמית באמצעות ההוראות המקוונות בכתובת https://imagej.net/Fiji/Downloads. פתח את FIJI וייבא את תמונות האנילין הכחולות לניתוח. לניתוח זה, השתמש בקבצי .tiff ברזולוציה של לפחות 300 dpi. ייצא קבצי תמונה בפורמט .tiff באמצעות תוכנת המיקרוסקופ לפני הניתוח, או תן ל-FIJI לפתוח את הקבצים.
    הערה: פיג'י יכולה לפתוח את רוב סוגי הקבצים הקנייניים (למשל, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
  11. הגדר את הסקאלה בתמונה (לחץ על ניתוח | Set Scale), תוך שימוש בערכי המרחק מהגדרת המיקרוסקופ.
  12. המרו את התמונה לתמונה בגווני אפור בגודל 32 ביט (לחצו על תמונה | סוג | 32 ביט).
  13. כוון את הסף (לחץ על תמונה | כוון | Threshold) כדי לכלול רק אות פלואורסצנציה שמייצג צביעת כחול אנילין על ידי לחיצה על אוטומטי ואז התאמה ידנית של הערכים המינימליים והמקסימליים על עקומת הסף. לאחר שהסף נקבע, לחץ על הגשת | להמיר למסכה. באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, כתוב את פרמטרי הסף שנבחרו עבור כל תמונה.
    הערה: בשל האוטופלואורסצנציה הטבועה בדגימות צמחים וניקוי רקמת הצמח, הסף עשוי להשתנות בין הדגימות. לצורך שחזוריות, חיוני לרשום את סף כל תמונה ולהיות עקביים בהתאמת ערכי הסף בין הדגימות.
  14. כמת את מספר וגודל הפונקטה הכחולה של אנילין באמצעות ניתוח חלקיקים (לחץ על ניתוח | לנתח חלקיקים) באמצעות ההגדרות ברירת המחדל. לערכים הממוצעים של כל הפנקטות בתמונה, בחר ב-Summarize בתיבת הפופ-אפ, ואז לחץ OK.
  15. העתק והדביק את התוצאות הללו מתיבת הסיכום לגיליון האלקטרוני עם פרמטרי הסף להמשך ניתוח. הערכים הכלולים בכימות זה כוללים את הספירה (מספר הפונקטה הכחולה האנילין), שטח כולל (שטח כולל ביחידות2 של פונקטה כחולה אנילין), גודל ממוצע (גודל ממוצע ביחידות2 של פונקטה כחולה אנילין), אחוז שטח (אחוז כיסוי ממוצע ביחידות2 של פלואורסצנציה כחולה אנילין לעומת שטח כולל), פרימטר (היקף ממוצע של פונקטה), ו-IntDen (אינדיקציה לעוצמת הפלואורסצנציה של צביעת כחול אנילין).
  16. חזור על שלבים 4.11-4.15 עבור כל התמונות שצולמו במהלך הניסוי. בעת סגירת תמונה עם סף מ-FIJI, בחר ב'לא לשמור כדי להימנע משינוי תמונת הנתונים הגולמית' למסכת הסף.
  17. אם יש תמונות שמכילות שטח עם רקע שאינו צמח, מדוד את שטח רקמת הצמח על ידי תיעוד ידני של אזור רקמת הצמח באמצעות כלי הבחירה Polygon או Freehand ומדידת השטח (לחץ על ניתוח | מדידות). העתק את הערך הזה לגיליון האלקטרוני עבור כל תמונה.
  18. בגיליון אלקטרוני, ממוצע את הערכים משלוש תמונות שדה הראייה משכפול ביולוגי אחד. אם חלק מהתמונות מהניסוי מכילות שטח שאינו צמח (ראה שלב 4.17), תקן את כל הערכים לפי שטח רקמת הצמח בכל תמונה. לדוגמה, חלק את ערך הספירה בשטח רקמת הצמח עבור כל תמונה לפני הגרף והשוואות סטטיסטיות.

5. ניתוח נתונים

  1. הערכת איכות הניסוי על ידי השוואת ביקורות חיוביות לשליליות בתוך אותה פלטה באמצעות מבחן t. אם הביקורת החיובית לא יצרה שינויים משמעותיים בתגובות הלחץ, יש להעריך מחדש את תנאי הניסוי כגון בריאות הצמחים, תזמון הטיפול, הבקרה השלילית והפוטנציאל להידרדרות של ה-MSMs.
  2. בדיקות משמעות
    1. אם כל השכפולים הטכניים של טיפול מוערכים באותה פלטה, יש לנתח את ההבדלים בין טיפולים בודדים לבין הביקורת השלילית באמצעות גישות סטטיסטיות סטנדרטיות כמו ANOVA חד-כיווני עם בדיקת טוקי.
    2. אם הוערכו שכפולים טכניים של טיפול על פני מספר פלטות, נרמול כל דגימה ביחס לבקרה השלילית כדי למזער את השפעת שגיאת פלטה-לפלטה. חלק כל ערך בממוצע דגימות הבקרה השליליות מתוך אותה לוחית. הכניסו את הערכים המנורמלים לשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות שיטה זו, ניתן לקבוע אם MSM מפעיל תת-קבוצה של תגובות לחץ תאי צמחיות. תוצאות בדיקה זו מספקות כימות של פעילות פרוקסידאז, דליפת יונים וייצור קלוז כדי לקבוע האם MSM גורם לתגובות שונות לעומת ביקורת שלילית. תוצאה חיובית עבור תרכובת תיראה על ידי הבדל משמעותי מהבקרה השלילית, כפי שמוצג עבור יונופור גרמילין, שגורם לדליפת יון וייצור קלוז (איור 3)2. הוספת בקרה חיובית, כמו 1 מיקרומום flg22, שמעוררת את כל שלוש התגובות, מבטיחה ביצועים שלמים של הצמח ותנאי ניסוי (איור 3)11,15. גרמילין ו-flg22 מומסים במים, בעוד שהסורפקטין ההידרופובי ורעלן T-2 מומסים ב-DMSO. להכנת מולקולות הידרופוביות, אנו מכינים תחילה מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO. מלאי זה משמש ליצירת ריכוז סופי של 10 מיקרומום במי מילי-קיו לטיפול בעלים המכילים 0.1% DMSO. סורפקטין (10 מיקרומון) משרה פעילות פרוקסידאז ויבלה, בעוד שרעלן T-2 (10 מיקרומון) מדכא פעילות פרוקסידאז ומעורר ייצור קלוז, ככל הנראה בשל מוות תאים 2,6,16. שימוש במים או ב-0.1% DMSO כביקורת שלילית מתאים לטיפולים המוצגים, שכן שני הביקורים מניבים תוצאות דומות (איור 2).

בסקרים הראשוניים שלנו של 100 MSM מסחריים זמינים, אנו רואים השראה קלוזית לרוב התרכובות שסקרנו (>70%), בעוד דליפת יונים ופעילות פרוקסידאז מופעלות על ידי פחות תרכובות (30% ו-35%). רוב התרכובות הללו מיוצרות על ידי מיני Fusarium , כולל שבעה טריכוטקנים שונים כגון דאוקסיניבלנול (DON) ורעלן T-2. בעוד ששכפול נוסף נמשך לאישור תוצאות אלו, הן מצביעות על מגמות דומות כפי שנראו אצל הביקורת החיוביות שלנו (איור 3), שבהן קלוז הושרתה על ידי כל הטיפולים ודליפת יונים או פרוקסידאז הופעלה על ידי חלק מהטיפולים אך לא כולם.

figure-results-1
איור 1: סקירה של ההליך להערכת תגובות תאיות הנגרמות על ידי MSM בעלים. דיסקי עלים מונחים בלוח של 96 בארות המכיל את הטיפולים הרלוונטיים, והדיסקים חודרים בוואקום. כל צלחת מכילה ארבעה שכפולים של בקרה שלילית (מים עם ממס) ושליטה חיובית (flg22 או רעלן T-2). לאחר 4-6 שעות, מוליכות הנוזל שמקיף את דיסק העלה נמדדת ככימות של דליפת יונים. לאחר 24 שעות, פעילות הפרוקסידאז נמדדת באמצעות מבחן קולורימטרי באמצעות הנוזל שמקיף את דיסק העלה, ודיסק העלה מוסר ועובד לצורך כימות קלוז. קיצור: MSM = מטבוליט משני מיקרוביאלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: השפעת הממס על דליפת יונים או פעילות פרוקסידאז הנגרמת על ידי flg22. ארבע דגימות Arabidopsis משוכפלות טופלו ב-1 מיקרומום flg22 בשילוב עם DMSO או מתנול (0, 0.01, 0.1, 1, 10%). גרפי עמודות מראים את ההולכה הממוצעת של הדגימה לאחר 4 שעות או את פעילות הפרוקסידאז (OD600) ב-24 שעות לאחר הטיפול בניסוי יחיד (n = 4, SD). הניסוי חזר פעמיים עם תוצאות דומות. ההבדל המשמעותי מבקר המים נקבע על ידי מבחן t וצוין על ידי כוכבית (p < 0.05). קיצורים: DMSO = דימתיל סולפוקסיד; MeOH = מתנול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: השראת דליפת יונים, פעילות פרוקסידאז או הפקדת קלוז בדיסקי עלי ארבידופסיס על ידי מולקולות שמקורן במיקרוביאליה. הטיפולים כללו את הפפטיד האימונוגני והלא רעיל flg22 (1 מיקרומון), הליפופטידים המחזוריים גרמילין וסורפקטין (10 מיקרומון), ורעלן T-2 (10 מיקרומון)2,6. כל הנתונים ננורמו לבקרת DMSO במים + 0.1%. גרפים של קופסה ושפם מראים את מוליכות הדגימה לאחר 4 שעות, פעילות פרוקסידאז (OD600) לאחר 24 שעות, או מספר משקעי הקלוז לאחר 24 שעות מניסוי יחיד (n = 4-16 צמחים). גרפי הקופסאות מציינים 'x' כדי להראות את ערך הממוצע, והקופסאות מציינות את הרבעון הראשון, החציוני והשלישי של הטיפול. התצפיות הגבוהות והנמוכות ביותר שאינן חריגות מסומנות על ידי השפמים (>טווח בין-רבעי פי 1.5, מסומן במעגלים). ההבדל המשמעותי מבקר המים מצוין על ידי כוכבית ונקבע על ידי ANOVA חד-כיווני עם בדיקת טוקי (p < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קהילות מיקרוביאלית המתיישבות בצמחים מפרישים MSMים מגוונים כדי להקל על יצירת ביופילם, לדכא מיקרובים מתחרים ולהשפיע על המארח הצמחי17. בעוד שחלק מה-MSMs אינם משפיעים על הצמח, אחרים גורמים למוות תאי מהיר, לדכא תפקוד תא או לעורר עמידות לצמח17. חלק מה-MSMs משפיעים על עמידות הצמחים למיקרובים שמייצרים MSM, וניתן לבחור גנוטיפים עמידים על בסיס חוסר רגישות ל-MSM 2,3,18. MSMים אחרים גורמים לעמידות מערכתית ומספקים הגנה מפני פתוגנים מיקרוביאליים, אשר שימשו בחקלאות לפיתוח מוצרים ביולוגיים לדיכוי מחלה8. כדי לפתח אסטרטגיות יעילות וברות קיימא לשיפור גידולים, חשוב לזהות MSM מועילים ואת הגנים של הצמחים שמאפשרים תגובתיות מיטבית ל-MSM.

מציאת MSMs מועילים מסובכת בשל העובדה שתרכובות אלו מיוצרות אנזימטית, כאשר נדרשים מספר אנזימים למוצר המוגמר2. דבר זה מקשה לקבוע איזה גן לכוון כדי לבטל את ייצור MSM למחקרים גנטיים. ביוסינתזה אנזימטית גורמת לשינויים מבניים מרובים של אותו MSM עם פעילות ביולוגית פוטנציאלית שונה19. הפרדה וטיהור של ה-MSM הללו כדי למצוא את המולקולות הביואקטיביות יכולה להיות גוזלת זמן או בלתי אפשרית. במקרים מסוימים, ניתן לטהר רק ריכוזים נמוכים של MSM בודדים, תוך צורך במספר סבבים של טיהור2. לאחר שמקבלים תרכובת ביואקטיבית או תמצית, ניתן להשתמש במספר גישות כדי להבין כיצד המיקרוב עשוי להשפיע על הצמח.

מאמצים קודמים התמקדו במעקב אחר השפעת ה-MSM על תכנות מחדש של שעתוק או הגנה ביולוגית בצמחי מודל20. כדי להעריך תגובות MSM מעבר למפעלי מודל, בדיקות בעלות תפוקה גבוהה שתופסות תגובות ל-MSMs מגוונים ודורשות מינימום MSMs הן פוטנציאליות שימושיות. מחקרים עדכניים מצביעים על כך שהתפרצויות ROS הן תגובה מוקדמת נפוצה ל-MSM, כולל גרמילין, סורפקטין, סירינגומיצין וסירינגופטין 2,3,7. בדיקה מבוססת לומינול מזהה את התפרצות ה-ROS האפופלסטית שנוצרה על ידי פרוקסידאזות ו-NADPH אוקסידאזות וניתנת לבדיקה בתפוקה גבוהה21. למרבה הצער, ROS תוך-תאי המושר על ידי MSMs, כמו סורפקטין, אינו ניתן לזיהויבשיטה זו. כימות פעילות פרוקסידאז מספק אלטרנטיבה רגישה יותר מהבדיקה מבוססת הלומינול לזיהוי הפעלה חולפת של אנזימי ROS בזמן לחץ11. התצפית שלנו שסורפקטין משרה פעילות פרוקסידאז תואמת את המחקרים העדכניים המראים שפעילות פרוקסידאז מופעלת על ידי סורפקטין ובובריצין באראבידופסיס (איור 3)2. בנוסף, הראינו כי flg22 והגרמילין היונופורי גורמים לדליפת יונים, וכל התרכובות שנבדקו, כולל flg22, T-2 רעלן, סורפקטין וגרמילין, מעוררות קלוז כמצופה (איור 3)2,4,7.

על ידי הערכת תגובות מרובות בתוך אותו מדגם, אנו ממזערים שונות ניסיונית בהערכת כל אחת מהתכונות בנפרד ומאפשרים קורלציה בין תכונות במחקרים ברמת המערכת על תגובות לחץ לצמחים. הערכת מספר טיפולים או גנוטיפים באותה יחידה ניסויית מאפשרת גם פנוטיפינג ברמת האוכלוסייה בגנטיקה של אוכלוסייה. לדוגמה, גישה דומה שימשה לזיהוי QTL הבסיסי לייצור ROS המושרה על ידי flg22 בשעורה22. בדיקה זו יכולה לשמש גם לסריקות גנטיקה כימית למציאת מודולטורים לתגובות לחץ צמחיות או לזיהוי MSMים ביו-מגנים פוטנציאליים מתמציות מיקרוביאליות.

כדי להבטיח שהשיטה הניסויית פועלת במסגרת מערכת העניין, על החוקרים לשקול את הגורמים והמגבלות הבאים:

איכות רקמת העלה
ודאו שרקמת העלים של הצמח אינה נתונה ללחץ לפני הקציר. הסימנים לכך שצמחים נמצאים במתח משתנים בין מינים אך בדרך כלל כוללים נבילות, צהבהבה, אדמומיות, כתמים, עיגול עלים מופרז או התגלגלות. דגימת רקמת העלה גורמת לפציעה, ולכן הימנעות מהרסיה מופרזת של הרקמה תקטין את שגיאות הרקע הנגרמות בטיפול.

מיני צמחים
פרוטוקול זה מותאם לשימוש עם עלי שעורה וערבידופסיס. עלי שעורה דורשים זמן צביעה ארוך יותר לקלוזה מאשר אראבידופסיס, ככל הנראה בגלל השעווה הקוטיקולרית העבה יותר בדשא, שמגבירה הידרופוביות ומגבילה את הפיזיה של הטיפולים אל תוך העלה. ייתכן שזה גם מסביר חלקית את היעדר השראת פעילות פרוקסידאז בשיטה שלנו, אם כי הצלחנו לראות דיכוי פעילות פרוקסידאז על ידי תרכובות רעילות, בדומה למה שהצגנו ב-Arabidopsis (איור 3). ניסינו להגדיל את מספר דיסקי העלים לכל דגימה ל-5, התאמנו את ה-pH ל-5, 6 או 7, הגדלת מספר החדירות בוואקום ל-10, ושונינו את ריכוז המצע או החלפנו את המצע ל-guaiacol24. בעוד שראינו עלייה בפעילות פרוקסידאז עם יותר דיסקי עלים וסבבי חדירה, ההבדלים בין הביקורת השלילית ל-flg22 נותרו קטנים (עלייה של 10% עם flg22) או לא משמעותיים בין הניסויים. ידוע לנו ששעורה מגיבה ל-flg22 על ידי גרימת ייצור ROS, ייצור קלוז וביטוי פרוקסידאז25,26. בשורשי תירס, תמציות חלבון הציגו פעילות פרוקסידאז המושרה על ידי MAMP, מה שמרמז כי ייתכן שיהיה צורך בהפקת חלבון כדי לראות את ההשראה, בניגוד לזיהוי פעילות החלבון הנשפכת מדיסקות העלים, כפי שנעשה במבחן24 שלנו. במבחן שלנו, פציעה גורמת בבירור לפעילות פרוקסידאז בדגימת ביקורת שלילית, מכיוון שפעילות זו נעלמת כאשר התאים מתים מחשיפה לרעלן. ייתכן שהטיפול ב-flg22 יגרום לאותם פרוקסידאזות כמו הפציעה, כך שייראה כי לא התרחש אינדוקציה. חלופה נוספת היא שהבדיקה שלנו אינה רגישה מספיק כדי לזהות שינויים עדינים, או שהפרוקסידאזות אינן מתפשטות היטב לתמיסה.

כדי ליישם פרוטוקול זה על מיני צמחים אחרים, נציע להשתמש בשיטה כפי שתוארה ולכלול את Arabidopsis לצד זה כבקרה כדי להבטיח שהפרוטוקול פועל. אם פעילות הפרוקסידאז נראית נמוכה, אז הגדלת מספר דיסקי העלים לדגימה, הגדלת מספר החדירות ל-5 או 10, וניסיון טיפולים שונים, כולל MAMPs אחרים, יונופורים או רעלן T-2, עשויים להניב תוצאה חיובית.

טיפולי שליטה שלילית
שיטה זו תלויה בבקרה שלילית יעילה ומתאימה להשוואות. באופן אידיאלי, בקרה שלילית תכיל את אותו ממס רקע כמו בטיפול ה-MSM הרלוונטי, אך ללא MSM. הממס הרקע יהיה מים או שיהיה לו אותו השפעה על המתחים הנמדדים כמו מים. זו גישה מעשית במקרים שבהם ה-MSM כבר טוהר וניתן להמיס אותו בממס מועדף. בהשוואה בין תמציות מיקרוביאליות, בקרה שלילית עשויה להיות תוצר לוואי של טיהור חלקי של ה-MSM, המכיל את אותו מדיה רקע אך עם ריכוז MSM מופחת לאחר הפריקה. או שהניסוי יכול להשתמש במדיה הגידול המשמשת ליצירת התמצית המכילה MSM כבקרה שלילית. בדגימות מורכבות אלו, הביקורת השלילית עלולה להכיל מלחים שמנפחים את מדידת ההולכה, או שממסים יכולים לדכא את פעילות הפרוקסידאז (איור 2). כדי לקבוע אם מלחים משפיעים על תוצאות דליפת היונים, הניסוי יכול לבדוק את מוליכות הבקרה השלילית והדגימה בהיעדר דיסק עלה, כדי לקבוע אם הדגימה או העלה יוצרים שינויים במוליכות. כדי לקבוע אם הממסים משפיעים על תגובות הפרוקסידאז, הניסוי יכול להוסיף flg22 לבקר השלילי ולהשוות את התוצאה ל-flg22 המומס במים כדי לקבוע אם יש הבדל. ייתכן שממסים, תרכובות כהות או מלחים מופרזים בשליטה שלילית עלולים לטשטש את השפעות ה-MSM על תגובות הלחץ של הצמח המתוארות, ולכן גישה זו לא תתאים בכל התרחישים.

זמן דגימה
חשוב להתחיל טיפולים בבוקר, שכן תגובות הגנה מושרות עוקבות אחרי מחזור צירקדי ויש להן את המשרעת הגבוהה ביותר מוקדםבבוקר. מניסיוננו, ארבידופסיס גורם לדליפת יונים בתגובה לגראמילין מהר יותר (4 שעות) מאשר שעורה ותירס (4-7 שעות), ולכן ייתכן שיידרש מסלול זמן לקביעת פרמטרים ניסיוניים 2,28. תגובתיות התאים יורדת עם הזמן, ולא נמליץ לבדוק תגובות לחץ מעבר ל-30+ שעות לאחר הטיפול.

ריכוז
ריכוז MSM יכול להשפיע באופן לא ליניארי על גרימת תגובות לחץ בצמח, תופעה הנקראת הורמזיס20. בהתאם לזמינות ולמסיסות של ה-MSM, הניסיונאים היו בודקים באופן אידיאלי את תגובות הלחץ של הצמח בטווח ריכוזי MSM. הריכוזים הטיפוסיים נעים בין 100 ננומטר ל-1,000 מיקרומום כנקודת התחלה 2,11,20.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיכה כספית ניתנה במסגרת שותפות חקלאית קנדית בת-קיימא (#20230098), יוזמה פדרלית-פרובינציאלית-טריטוריאלית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה 5-אמינוסליציליתמיליפור סיגמא A79809
משאבת ואקום ברנרטקבוצת הטכנולוגיה האומנית400-3910
בדיקת מיקרו-מוליכות COND-905Lazar Research Laboratories Inc.
פפטיד FLG22AnaSpecAS-62633
אינפיניט 200PRO Fקבוצת TeCan בע"מ30190086
סרפקטיןסיגמא-אלדריץ'S3523
רעל T-2חברת קיימן כימיקלים בע"מ20433

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annu Rev Phytopathol. 55 (1), 109-137 (2017).
  2. Brauer, E. K., et al. A cyclic lipopeptide from Fusarium graminearum targets plant membranes to promote virulence. Cell Rep. 43 (7), 114384(2024).
  3. Thoms, D., et al. Innate immunity can distinguish beneficial from pathogenic rhizosphere microbiota. bioRxiv. , (2023).
  4. Nishiuchi, T., et al. Fusarium phytotoxin trichothecenes have an elicitor-like activity in Arabidopsis thaliana, but the activity differed significantly among their molecular species. Mol Plant Microbe Interact. 19 (5), 512-520 (2006).
  5. Schellenberger, R., et al. Apoplastic invasion patterns triggering plant immunity: plasma membrane sensing at the frontline. Mol Plant Pathol. 20 (11), 1602-1616 (2019).
  6. Henry, G., Deleu, M., Jourdan, E., Thonart, P., Ongena, M. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses. Cell Microbiol. 13 (11), 1824-1837 (2011).
  7. Pršić, J., et al. Mechanosensing and sphingolipid-docking mediate lipopeptide-induced immunity in Arabidopsis. bioRxiv. , (2023).
  8. Crouzet, J., et al. Biosurfactants in plant protection against diseases: rhamnolipids and lipopeptides case study. Front Bioeng Biotechnol. 8, 1014(2020).
  9. Khan, P., et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 173, 333-355 (2014).
  10. Schenk, S. T., Schikora, A. Staining of callose depositions in root and leaf tissues. Bio-protoc. 5 (6), e1429(2015).
  11. Mott, G. A., Desveaux, D., Guttman, D. S. A high-sensitivity, microtiter-based plate assay for plant pattern-triggered immunity. Mol Plant Microbe Interact. 31 (5), 499-504 (2018).
  12. Hatsugai, N., Katagiri, F. Quantification of plant cell death by electrolyte leakage assay. Bio-protoc. 8 (5), e2758(2018).
  13. Zhang, X. H., Yu, X. Z., Yue, D. M. Phytotoxicity of dimethyl sulfoxide (DMSO) to rice seedlings. Int J Environ Sci Technol. 13, 607-614 (2016).
  14. Mannan, A., et al. DMSO triggers the generation of ROS leading to an increase in artemisinin and dihydroartemisinic acid in Artemisia annua shoot cultures. Plant Cell Rep. 29, 143-152 (2010).
  15. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant J. 18 (3), 265-276 (1999).
  16. Jourdan, E., et al. Insights into the defense-related events occurring in plant cells following perception of surfactin-type lipopeptide from Bacillus subtilis. Mol Plant Microbe Interact. 22 (4), 456-468 (2009).
  17. Raaijmakers, J. M., De Bruijn, I., Nybroe, O., Ongena, M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1037-1062 (2010).
  18. vábová, L., Lebeda, A. In vitro selection for improved plant resistance to toxin-producing pathogens. J Phytopathol. 153 (1), 52-64 (2005).
  19. Mousa, W. K., Raizada, M. N. The diversity of antimicrobial secondary metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 4, 65(2013).
  20. Bektas, Y., Eulgem, T. Synthetic plant defense elicitors. Front Plant Sci. 5, 804(2015).
  21. Saeed, B., Trujillo, M. Analysis of immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Environ Responses Plants: Methods Protoc. , 339-346 (2022).
  22. Brauer, E. K., et al. Transcriptional and hormonal profiling of Fusarium graminearum-infected wheat reveals an association between auxin and susceptibility. Physiol Mol Plant Pathol. 107, 33-39 (2019).
  23. Taylor, P. The wetting of leaf surfaces. Curr Opin Colloid Interface Sci. 16 (4), 326-334 (2011).
  24. Mika, A., Boenisch, M. J., Hopff, D., Lüthje, S. Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. J Exp Bot. 61 (3), 831-841 (2010).
  25. Brauer, E. K., et al. Transcriptional profiling and genetic mapping of barley responses to bacterial flagellin. Mol Plant Microbe Interact. 38 (2), 344-352 (2025).
  26. Takáč, T., et al. TALEN-based HvMPK3 knock-out attenuates proteome and root hair phenotypic responses to flg22 in barley. Front Plant Sci. 12, 666229(2021).
  27. Kim, M. G., Macoy, D. M., Lee, J. Y., Cha, J. Y., Kim, W. Y. Interactions between plant immunity, temperature, light, and circadian rhythm. J Plant Biochem Physiol. 9, 260(2021).
  28. Bahadoor, A., et al. Gramillin A and B: cyclic lipopeptides identified as the nonribosomal biosynthetic products of Fusarium graminearum. J Am Chem Soc. 140 (48), 16783-16791 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96Arabidopsis

מאמרים קשורים