מדידת הזדקנות תאית בודדת עם סמן ביולוגי מבוסס דימות של כרומטין והזדקנות אפיגנטית

Kenta Ninomiya; Krystal Ortaleza; Josue A. Lopez; Alexey V. Terskikh

doi:10.3791/69057

מאמר שיטה

מדידת הזדקנות תאית בודדת עם סמן ביולוגי מבוסס דימות של כרומטין והזדקנות אפיגנטית

DOI:

10.3791/69057

⸱

30 בינואר 2026

Kenta Ninomiya^*¹ , Krystal Ortaleza^*² , Josue A. Lopez^*² , Alexey V. Terskikh¹^,²

¹Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, ²Scintillon Institute

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציג את תהליך ההדמיה והחישוב לחילוץ ואימות כרומטין מבוסס הדמיה וגיל אפיגנטי (ImAge).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקדם שירותי בריאות מותאמים אישית ולהעריך אסטרטגיות התחדשות פוטנציאליות, סמנים ביולוגיים המשקפים את הגיל הביולוגי הם חיוניים. הכנסנו כרומטין מבוסס הדמיה וגיל אפיגנטי (ImAge), סמן ביולוגי מבוסס הדמיה שמקורו בארגון מרחבי של כרומטין וסימנים אפיגנטיים בתוך גרעינים בודדים, ולוכד שינויים פנימיים הקשורים לגיל. ImAge לוכדת ומכמת ביעילות את השפעות ההתערבויות המווסתות את הגיל הביולוגי, ומראה רגישות דרך ירידות משמעותיות לאחר אסטרטגיות התחדשות (כגון הגבלת קלוריות ותכנות חלקי באמצעות ביטוי זמני של Oct4, Sox2, Klf4 ו-Myc (OSKM) ועלייה לאחר טיפולים כמו כימותרפיה. יתרה מזאת, ImAge נמוך יותר קשור לפעילות מוטורית גבוהה יותר, מה שמרמז שהוא תופס שיפורים פונקציונליים לצד הפיכת גיל ביולוגית, ומציע כלי חד-תאי מבטיח להערכת התערבויות אריכות ימים. מכיוון ש-ImAge היא שיטה אינטגרטיבית הדורשת הדמיה איכותית וניתוח חישובי קפדני, אנו שואפים לספק הנחיות מעמיקות להוצאתה ואימותה. פרוטוקול מקיף זה יפרט את תהליך העבודה הן להליכי מעבדה רטובים (הכנת דגימה והדמיה) והן את השימוש הנכון בצינור החישובי הפתוח שלנו (הקמת סביבה ועיבוד נתוני ההדמיה) לצורך חילוץ ואימות של ImAge.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדלת תוחלת החיים הממוצעת והזדקנות האוכלוסייה העולמית מדגישים את הצורך הקריטי בסמנים ביולוגיים יעילים לגיל ^1,2,3. סמנים ביולוגיים אלו חיוניים לחיזוי מדויק של סיכון מחלה ותוחלת חיים, מה שיכול לשפר משמעותית את הטיפול בקשישים ולהפחית עלויות נלוות. בעוד ששעוני מתילציה של DNA (DNAm) השיגו התקדמויות משמעותיות במדידת הזדקנות ביולוגית ^4,5,6, הם לעיתים קרובות מסתמכים על רגרסיה ליניארית ודורשים קבוצות גדולות, מה שעלול להתעלם מרכיבים ביולוגיים מורכבים ותלויי הקשר הספציפיים לפרטים ^7,8. יתרה מזאת, טכניקות מבוססות ריצוף אלו דורשות פירוק תאים, הכנת דגימה מורכבת ותגובות יקרות לכל תא, מה שהופך אותן ליקרות ומאתגרות יותר למחקרים בעלי תפוקה גבוהה, בקנה מידה גדול או אורך שבהם הרס הדגימה מהווה חיסרון⁹.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו כרומטין מבוסס הדמיה וגיל אפיגנטי (ImAge), טכניקה חדשנית שנועדה לכמת הזדקנות והתחדשות ברזולוציית תא יחיד. טכניקה זו יושמה ואושרה בדם היקפי של עכבר ובאיברים מוצקים שונים כפי שתואר על ידי אלברז-קוגלן ואחרים^. פרסום זה מתאר בפירוט את הפרוטוקולים האופטימליים כך שניתן יהיה להתאים ולאמץ אותם על ידי חוקרים אחרים ליישומים שונים.

גישה זו שונה מהותית משעוני DNA מסורתיים בכך שהיא לוכדת מסלולים פנימיים הקשורים לגיל בהתבסס על ארגון מרחבי של כרומטין וסימנים אפיגנטיים בתוך^{גרעין יחיד}. שיטות מבוססות הדמיה מציעות יתרונות ברורים: הן מטבען אינן הרסניות, כלומר תאים אינם נהרסים במהלך העיבוד, בניגוד לשיטות מבוססות ריצוף. הטבע הלא-הרסני הזה מאפשר באופן קריטי שימור המבנה המרחבי של כרומטין וסימנים אפיגנטיים ברמת התא היחיד, תוך שמירה על ההקשר המרחבי של התאים בתוך הרקמות – פרספקטיבה שלרוב אובדת בתהליכי ריצוף קונבנציונליים. יתרה מזאת, טכניקות הדמיה בדרך כלל חסכוניות יותר למחקרים רחבי היקף או אורך, שכן הן אינן דורשות תגובות יקרות או הכנה מורכבת של ספרייה לכל תא, מה שהופך אותן למתאימות לתצפיות חוזרות לאורך זמן^10,11.

יתרון מרכזי של ImAge הוא יכולתו לחשוף מסלולים הקשורים לגיל כמאפיינים עיקריים מהותיים של הנתונים עצמם, מבלי לדרוש רגרסיה על גיל כרונולוגי. ImAge הראתה מתאם חזק עם גיל כרונולוגי בתאי דם היקפיים בעכברים, בתאים חד-גרעיניים ואיברים מוצקים שונים.¹. חשוב לציין, ImAge תופס ביעילות הפרעות צפויות לגיל הביולוגי, ומראה עלייה לאחר טיפול כימותרפי וירידה בהגבלת קלוריות ותכנות חלקי על ידי ביטוי OSKM חולף בכבד ובשריר השלד. יתרה מזאת, נצפה כי קריאות ImAge קשורות באופן הפוך לפעילות מוטורית בעכברים זהים כרונולוגית, מה שמעיד על שימושיות במדידת היבטים של גיל ביולוגי ותפקודי.

יישום מתודולוגיית ImAge דורש מומחיות הן בפרוצדורות ניסוי במעבדות רטובות¹² והן בניתוחים חישוביים¹ (איור 1); לכן, מאמר זה מספק פרוטוקולים מקיפים שלב אחר שלב לשני ההיבטים. פרוטוקול אופטימלי זה נועד להקל על אימוץ נרחב של ImAge, ולאפשר לחוקרים לחקור שינויים הקשורים לגיל בכרומטין ובארגון אפיגנטי ברזולוציה של תאים בודדים בסוגי תאים ורקמות שונים. בפרוטוקול זה, H3K27ac ו-H3K27me3, שני סמנים המספקים ניגודיות ורזולוציה מספקת לקביעת ImAge, נבחרו כסימנים מייצגים. חוקרים יכולים לשחזר פרוטוקול זה כדי לכמת הזדקנות ביולוגית, להעריך את השפעת התערבויות לאריכות ימים, ולחקור את ההטרוגניות הטבועה בתהליכי הזדקנות והתחדשות ברמת האורגניזם הבודד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) של מכון המחקר סקריפס (פרוטוקול 09-0004-6). הנתונים שהוצגו במאמר זה התקבלו באמצעות עכברי i4F זכרים, בגילאים שבין 2 ל-14 חודשים. איברים רלוונטיים (כבד ושריר שלד) נלקחו מעכברי ביקורת i4F בני 13.8 חודשים ועכברי משפחה שטופלו במשך שבוע במינון נמוך של דוקסיציקלין (0.2 מ"ג/מ"ל)¹⁴. גרעינים בודדו מדגימות של צעירים (3.2 חודשים), בני גיל (13.8 חודשים) ומבוגרים שטופלו בדוקסיציקלין כדי לבטא יתר על המידה גורמי OSKM (OSKM מבוגר).

1. הדמיית דגימות

הכנת דוגמאות
1. לאסוף איברים מעניינים (כבד ושרירי שלד) מעכברים שננתקו זה עתה (או מינים אחרים מעניינים) והקפאה מהירה על ידי חנקן נוזלי. אחסן דגימות בטמפרטורה של מינוס 80°C עד שתהיה מוכנה לשימוש.
2. העבר איברים ורקמות למלט מקורר מראש והניח על קרח יבש. שפוך חנקן נוזלי על הרקמה הקפואה וטחן עם עלי מקורר מראש. טחנו את הדגימה באמצעות המלט והעלי המקוררים מראש עד שמתקבל אבקה דקה אחידה.
3. עבירו רקמה טחונה באמצעות מרית מתכתית מקוררת מראש למספר צינורות ואחסנים דגימות לא בשימוש בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  הערה: דגימות רקמה קרקעית בצינורות יכולות להיאחסן בטמפרטורה של -80°C או להמשיך בבידוד גרעינים.
4. חלצו גרעינים מאליקווט קפוא, באמצעות ערכת בופר Nuclei Lysis הזמינה מסחרית לפי הוראות היצרן.
5. ספירת גרעינים באמצעות Trypan Blue. מערבבים גרעינים ו-Trypan Blue ביחס שווה בצינור נפרד. העבר 10 מיקרו-ליטר מתמיסת גרעין-טרייפן בלו להמוסיטומטר או למונה תאים אוטומטי.
6. לדלל דגימות ב-PBS + 0.5% BSA כך שניתן לצפות 10,000 גרעינים בנפח של 20-30 מיקרוליטר/באר.
הכנת ציפוי
1. הזן את כל המטא-דאטה הרלוונטיים להכנת ציפוי וניתוח חישובי במפת הפלט (מסופק בקובץ המשלים 1). רשם את מזהי הדגימה (למשל, מספרים או תווים) באותו פריסה כמו לוחית הבאר בפועל בלשונית sampleID. רשמו תנאי ניסוי, כולל גיל הדגימה, באותו פריסה כמו לוח הבאר בלשונית המצב.
  הערה: המידע המסופק בלשונית המצב ישמש לזיהוי קבוצת הגיל של כל מדגם (כלומר, צעיר או מבוגר). קבוצות הגיל שזוהו ישמשו לאחר מכן כהפניות לבניית מודל חיזוי ההזדקנות (ImAge). לכן, לשונית התנאים חייבת להכיל נתונים שניתן לקשר לגיל, יחד עם תנאים ניסיוניים רלוונטיים נוספים לפי הצורך.
2. רשמו את סמני היעד (למשל, H3K27me3) באותו פריסה כמו לוחית הבאר בלשונית הערוץ# (# מוחלף במספר). ודאו שכל השילובים של מטא-נתונים תואמים ומשתקפים נכון בפורמט טבלה עוקב אחד בלשונית מפת הפלט.
  הערה: כל עמודה בטבלה צריכה להתאים לשם לשונית ייעודי (למשל, "sampleID"). לשונית נוספת בשם "מטא-דאטה" מסופקת לתיעוד מטרות הפרויקט ולפרטים של צביעה; מידע זה לא ישמש בניתוח הנתונים. השתמש בלשונית זו לפי הצורך.
3. ייצוא את מפת הלוח בלשונית כקובץ csv עם שם פרויקט קצר ותיאורי (למשל, project.csv).
  הערה: לשונית המטא-דאטה מספקת תבנית לסיכום מטרות הפרויקט ומידע על חיסונים. השימוש בלשונית המטא-דאטה בתבנית Platemap הוא אופציונלי בתהליך הציפוי עצמו. עם זאת, לשוניות נוספות, כולל sampleID, channel# (# מוחלף במספר), נדרשות לניתוח חישובי.
לוח 10,000 גרעינים/באר בנפח של 20 - 30 מיקרוליטר בלוח באר (למשל, לוחות 384 באר). סובב את לוח הסיבוב ב-1,000 x g (תאוצה תשע, האטה 4) למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
תיקון עם נפח 1:1 של 8% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
אזהרה: לבצע שלבי PFA עם מכסה אדים ולהיפטר מהפסולת בהתאם לנהלי הבטיחות המוסדיים.
הסר את התמיסה. הוסיפו 30 מיקרוליטר של 0.1 מיליפיקין גליצין ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את התמיסה. שטוף עם 100 מיקרוליטר PBS פעמיים והוסף 30 מיקרוליטר PBS לאחסון.
הערה: ניתן לאחסן תאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או להתחיל מיד בתיוג חיסוני.
תיוג חיסוני
1. הסר את PBS. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (2% BSA ו-0.5% Triton X-100 ב-PBS) ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת החסימה.
2. הוסף 25 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים: אנטי-H3K27ac של עכבר (1:250) ואנטי-H3K27me3 של ראביט (1:250) מדוללים בבופר חסימה (0.4 - 2 מיקרוגרם/מ"ל). דגירה ללילה בטמפרטורה של 4°C.
3. הסר את תמיסת הנוגדנים הראשית. שטוף עם 100 מיקרוליטר PBS 3x למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף 25 מיקרוליטר של נוגדנים משניים: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) ו-Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) מדוללים בבופר חוסם (1 - 10 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C או שעה בטמפרטורת החדר.
5. שטוף עם 100 מיקרוליטר PBS 3x למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. צביעה עם DAPI/Hoechst ב-30 מיקרוליטר בריכוז 0.01 mg/mL. שטוף עם 100 מיקרוליטר של PBS.
  הערה: יש לאחסן צלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בנייר כסף או להמשיך מיד בהדמיה. DAPI/Hoechst נדרש לשלב חלוקת הגרעינים.
הדמיה
1. תאי תמונה במצלמה עם תוכן גבוה לרזולוציה מקסימלית (למערך נתונים זה נעשה שימוש ב-20x, אך מומלץ 63x).
  הערה: למרות שניתן לבצע הדמיה עם כל מדמה עם תוכן גבוה, פרוטוקול זה מניח מבנה תיקייה שטוח של תמונות שנרכשו ופורמט תמונה גנרי (למשל, .tiff) כפלט התמונה שנרכש (איור 2).
2. אסוף מספר שדות בכל באר ומספר ערימות z, רצוי לכסות מלמעלה לתחתית גרעיני התא. כיסוי של 10 מיקרון יחד עם ציר ה-z (למשל, 20 פרוסות z בצעד z של 0.5 מיקרון) מכסה בדרך כלל את רוב גרעיני תאי העכבר. הגודל והכיסוי הנדרש תלויים במין ובסוגי התאים הרלוונטיים. הדמיה מייצגת מוצגת באיור 3.
3. העבר את נתוני ההדמיה למחשב, שם יבוצע ניתוח חישובי, בהתאם למבנה התיקיות המוצג באיור 2.
4. הוסף את הקידומת המובהרת בסוגריים מרובעים של שם הפרויקט שהוגדרה בשלב 1.2.2 למעלה לתיקיית נתוני התמונה (למשל, [project]original_folder_name)

2. ניתוח חישובי של נתוני הדמיה

הכנת דרישות תוכנת מערכת (נדרש רק להגדרה ראשונית)
1. התקן את מערכת המשנה של Windows ללינוקס (WSL) אם פועל על מחשב Windows על ידי מעקב אחרי ההוראות ב-https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. התקן את Anaconda או Miniconda על ידי ביצוע ההוראות https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
הכנת סביבה חישובית (נדרש רק להגדרה ראשונית)
1. הורד את סקריפטים של זרימת העבודה מ-github repository https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. פתח את הקובץ שהורד.
  הערה: מיקום אחסון הנתונים עשוי להיות מוגדר באופן שרירותי; עם זאת, מומלץ לבחור תיקייה נפרדת ממיקום אחסון קבצי המערכת (למשל, כונן C ב-Windows).
2. ארגן את מאגר ImAge המשובט כך שיתאים למבנה התיקייה המשוער לביצוע תקין של סקריפטים (איור 2).
3. פתח את אפליקציית הטרמינל אם פועל על לינוקס או macOS. פתח את אפליקציית WSL אם אתה פועל על Windows.
4. שנה את התיקייה לקובץ המאגר המשובלט. מעתה ואילך, המונח פקודה: מציין הוראה להעתיק ולהדביק את הקוד הבא לאפליקציית הטרמינל, ואחריה לחיצה על מקש אנטר .
  פקודה: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
  הערה: החלף את "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" בהגדרה הספציפית למשתמש. לדוגמה, כאשר המאגר נפתח בתיקיית "analysis" של כונן D וניגש אליו מ-WSL, אז זה יהיה "/mnt/d/analysis".
5. צור סביבה חישובית חדשה עם Python גרסה 3.10 באמצעות conda (אפליקציית שורת פקודה מותקנת עם Anaconda/miniconda).
  פקודה: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
6. הפעל את הסביבה החדשה שנוצרה.
  פקודה: conda activate ImAge_workflow
7. התקן פואטרי (מנהל חבילות פייתון) באמצעות pip installer (מתקין חבילות פייתון מותקן בעת יצירת סביבת ImAge_workflow).
  פקודה: pip install poetry
8. התקן חבילות פייתון מוקדמות באמצעות poetry.
  פקודה: התקנת שירה
  אזהרה: ודא שהתיקייה הנוכחית היא תיקיית ImAge_workflow, שניתן לאמת אותה על ידי הרצת פקודה: pwd.
9. הגדר את CUDA בסביבת Conda כדי לאפשר פונקציונליות יחידת עיבוד גרפי (GPU) בשלב הסגמנטציה לחישוב מהיר יותר (רלוונטי רק למחשבי Linux או Windows עם כרטיס Nvidia).
  פקודה: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
  echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "ייבוא Nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
  echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; לעשות אם [ -d "$dir/lib" ]; ואז ייצא LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/וכו'/conda/activate.d/env_vars.sh
  הערה: הסקריפטים מזהים אוטומטית זמינות GPU בשרת. אם אין כרטיסי מסך זמינים, הוא ירוץ כברירת מחדל על המעבד.
הרץ חישובים כפי שמתואר להלן.
הערה: הניתוח החישובי מורכב מארבעה שלבים: סגמנטציה של גרעינים, חילוץ תכונות תמונה, בניית ציר הזדקנות (ImAge), וחיזוי ImAge. כל תהליך מתבצע באמצעות סקריפטים של פייתון; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features ו-o4_ImAge_validation. כל השלבים הללו כלולים בסקריפט פייתון אחד, main.py. הקריאות שהופקו ב-ImAge ניתנות להמחשה באמצעות תרשים קופסה וכינור כפי שמוצג ב- איור 4. ניתן גם לחלץ את קריאת ImAge בפורמט טבלה פשוט (פורמט קובץ סטנדרטי .csv), כאשר דגימות מיוצגות כשורות, קריאות תואמות ומטא-דאטה כעמודות. למשתמשים יש גמישות לבצע ניתוחים נומריים נוספים על קריאות ImAge לפי הצורך. גרפים אלו וקובץ CSV ניתנים להשגה באמצעות סקריפט פייתון אחד, visualization.py. תהליך החיזוי של ImAge משתמש באותות בוטסטרפ המתקבלים מתאים בודדים באותה רקמה. אותות הבוטסטרפ הללו הם אותות ממוצעים שמקורם בדגימה אקראית ואיטרציות חוזרות. גישה זו שואפת להבטיח שהניתוח תופס את הקריאות האמינות והמייצגות ביותר, כאשר אי-הוודאות בניתוח תהיה פרופורציונלית להטרוגניות הטבועה ברקמה.
1. פתח את אפליקציית הטרמינל אם פועל על לינוקס או macOS. פתח את אפליקציית WSL אם אתה פועל על Windows.
  פקודה: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
  אזהרה: ודא שהתיקייה הנוכחית היא תיקיית ImAge_workflow, שניתן לאמת אותה על ידי הרצת פקודה: pwd.
2. הפעל את הסביבה.
  פקודה: conda activate ImAge_workflow
3. הגדר את פרמטרי הניתוח בקובץ זרימת עבודה/main.py בעורך הקוד או הטקסט (למשל, אפליקציית Notepad, Microsoft Visual Studio Code וכו').
  1. הגדר את שם הפרויקט במשתנה p למזהה קצר ובטוח במערכת הקבצים המשמש לארגון פלטים (למשל, p = brain_3ages_k27me3).
  2. הגדר רשימת ערוצים לחילוץ תכונות ב-chs. כלול את ערוץ הסגמנטציה אם נדרשות תכונות מהערוץ הזה לניתוח (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
  3. מפה מזהי ערוצי תמונה משמות קבצים לעמודות מפת הלוחות באמצעות imageIndex. קבעו את פורמט תווית הערוץ שבו משתמשת מערכת ההדמיה לאיסוף נתוני תמונה והשתמשו בתווית זו כמפתח. מפות כל תווית לכותרת עמודה המדויקת והרגישה לאותיות במפת הלוחות שנשמרה בשלב 1.2.2 (למשל, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
    אזהרה: שמות העמודות רגישים לאותיות וחייבים להתאים לקובץ מפת הלוחית שלך.
  4. הגדר מיקומי נתונים: orgDataLoadPath לשורש המערך, orgDataSubFolder לתיקיית התמונה אם צריך, ו-resultsSavePath לשורש הפלט.
  5. אשר את סיומת שם הקובץ ב-imageFileFormat וערוך את imageFileRegEx לשימוש בקבוצות לכידה בשם פייתון לכל החלקים הנדרשים: שורה, עמוד, שדה, zposition וערוץ. השתמש בתחביר הבא: (? P\d+), כאשר GROUP מוחלפת בשורה, קול, שדה, zposition או ערוץ.
    הערה: עדכן את ה-regex אם שמות הקבצים שונים; כל קבוצות השם חייבות לנתח נכון. לדוגמה, שם הקובץ r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff צריך להיות מומר ל-r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
  6. הגדר את ערוץ הסגמנטציה ב-segmentation_ch לערוץ הגרעיני המשמש לזיהוי עצמים (למשל, segmentation_ch = 'DAPI').
  7. החליטו האם להשתמש בתיקון תאורה על ידי הגדרת illumiCorrection. הגדר ל-True לחישוב ויישום מודלים של BaSiC; הגדרה ל-False לעיבוד תמונות גולמיות.
    הערה: עבור לוחות עם ≥ 25 בארות, מומלץ תיקון תאורה להפחתת הטיה שיטתית.
  8. הגדר את גודל הווקסלים הפיזיים במיקרומטרים ב-voxel_dim כ-[z, y, x]. השתמש במטא-דאטה של מיקרוסקופ כדי לקבוע מרווחים (למשל, voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]). שמור את הקובץ וסגר את העורך לאחר אימות כל פרמטר
4. הרץ סקריפטים לקבלת קריאות ImAge ולבצע אימות. בזמן הרצת הסקריפט, אל תסגור את הטרמינל או את אפליקציית WSL.
  פקודה: זרימת עבודה/main.py פייתון
  הערה: הסקריפט (main.py) כולל את כל השלבים, כולל סגמנטציה, חילוץ תכונות, בניית ציר ImAge וחיזוי כברירת מחדל. הסקריפט ייצור זמן סיום משוער לכל שלב (למשל, סגמנטציה של גרעינים). כל תהליך (למשל, o1_illumination_correction) ייצור קבצי ביניים בפורמט .pickle המכילים תוצאות מכל תהליך. עם זאת, זה מיועד אך ורק להעברת נתונים בין תהליכים כדי להבטיח עיבוד סטנדרטי ואינו מיועד למניפולציה של המשתמש במאמר זה. עם זאת, אם המשתמשים צריכים לעבד או לאמץ את הקבצים הללו, ראו את התיעוד הכלול בכל פונקציית פייתון עבור צורת הנתונים וסוגי^{הנתונים 13}.
5. המחישו תוצאות וייצאו קריאות גולמיות של ImAge לניתוח נוסף על תוכנה חיצונית. פקודה: Python workflow/visualization.py
  הערה: שלב זה יוצר נתונים וטבלאות של קריאות ImAge, והקבצים ממוקמים ב-fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN וב-export_o4_ImAge_validation, בהתאמה (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונות מייצגות צריכות להיות מאוכלסות היטב כדי לקבל תאים בודדים, אך גרעינים בודדים לא צריכים לגעת זה בזה, שכן זה יפגע באיכות הפיצול של גרעיני התא. איור 3 מציג את ההדמיה המייצגת לקבלת תוצאות ניתוח חישובי חזקות.

התוצאות המתוארות בכתב היד של שיטה זו מותאמות מכתב היד של ImAge מאת אלברז-קוגלן ואחרים^. ImAge זיהתה בהצלחה את ההיפוך ההזדקנות באמצעות תכנות מחדש חלקי שנגרם על ידי OSKM in vivo (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת דוגמאות
להכנת דגימות, קצור במהירות רקמות מעניינות והקפא אותן מיד בחנקן נוזלי. בעת טחינת רקמה עם טיט ועלי, ניתן להשתמש בכיסוי סיליקון למלט כדי למנוע אובדן דגימה. הוסף יותר חנקן נוזלי אם קשה לטחינה את הרקמה. לרקמות עדינות יותר, ניתן גם לעבד דגימות טריות (ולא קפואות) כדי להפחית הפרעות מכניות או נזק לרקמות. פרוטוקולי בידוד גרעינים עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם לסוג הרקמה; עיין בהנחיות היצרן. לאחר בידוד וספירת גרעינים, יש להבטיח נפח ציפוי מינימלי של 20 מיקרוליטר לבאר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי המעבדה הנוכחיים והלשעבר של Terskikh על עזרתם בהקמת הפרוטוקולים והמסגרת החישובית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות R21 AG068913, R21 AG075483, R21 AG083782, וקרן המחקר והחדשנות העתידית של משרד הבריאות של מערב אוסטרליה, BU/PG: 01760/47004300 to A.V.T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג
אלבומין סרום בקר	סיגמא-אלדריץ'	A9647
נוגדן משני מסוג Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) בעל ספיגת צולב גבוהה, Alexa 488	Invitrogen	A-21202
נוגדן משני מסוג Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) שנספח מאוד, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
גליצין	ביו-ראד	161-0718
נוגדן Histone H3K27ac (mAb)	מוטיב פעיל	39685
נוגדן Histone H3K27me3 (pAb)	מוטיב פעיל	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ Prep	סיגמא-אלדריץ'	NUC101
מצלם תוכן גבוה של אופרה CLS	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
פרפורמלדהיד 16% תמיסה מימית בדרגת EM	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	15710-S
PBS	תרמו פישר	AM9624
מיקרופלטה 384-באר פנופלייט	Revvity	6057302
טריטון-X	סיגמא	T8787
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

מדידת הזדקנות תאית בודדת עם סמן ביולוגי מבוסס דימות של כרומטין והזדקנות אפיגנטית

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים